CN110396132B

CN110396132B - 具有细胞穿膜性的锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质

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Publication number: CN110396132B
Application number: CN201810360718.XA
Authority: CN
Inventors: 刘佳; 姜标; 马培翔
Original assignee: ShanghaiTech University
Current assignee: ShanghaiTech University
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: CN110396132A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有细胞穿膜性的锌指蛋白‑超氧化物歧化酶融合蛋白质及其制备与应用。本发明所述融合蛋白质的结构域中包括锌指蛋白和超氧化物歧化酶，能进入细胞发挥抗氧化活性。

Description

具有细胞穿膜性的锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有细胞穿膜性的锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质及其制备与应用。

背景技术

细胞膜的选择通透性将细胞内组分与外源分子分开。这将是治疗药物递送到细胞的主要挑战。如基因，蛋白质和病毒等各种生物活性物质可有效地进入到细胞中。在这些药物中，由于功能性蛋白质直接递送的安全性和有效性，使其有希望应用到治疗中。蛋白质递送不依赖于注入核酸的转录和翻译。因此，递送的蛋白质可以迅速发挥作用，然后被蛋白酶体降解，降低脱靶效应。细胞膜的选择性是蛋白质递送的主要障碍。在研的许多膜微扰技术，如显微注射和电穿孔，可加速蛋白质递送。然而，这些膜破裂技术通常效率差，毒性大，生物利用度低和特异性差。除了物理膜穿刺方法之外，还开发了许多生物化学试剂以促进蛋白质递送，例如超荷电转导结构域，纳米粒，脂质体，病毒样颗粒和聚合物微球。在临床前或临床实践中，这些策略可能与诸如细胞摄取低效、稳定性差、无细胞特异性、溶酶体逃逸率低或毒性大等缺点相关。在20世纪80年代后期，一种来源于人类免疫缺陷病毒(HIV)的TAT反式激活因子的天然肽被发现具有固有的细胞穿透能力。在随后的几年中，一系列被认为是细胞穿透肽(CPP)的具有相似细胞通透性的天然肽被确定。基于天然存在的CPP的特征，人造或嵌合CPP被设计出来。CPPs通常具有最小的细胞毒性，并且可以应用于各种细胞类型以递送具有不同分子量的各种货物分子。这些CPP可以与货物蛋白基因融合或化学缀合。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种具有细胞穿膜性的锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质及其制备与应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种融合蛋白质，其结构域中包括锌指蛋白和超氧化物歧化酶。

进一步地，所述锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：

EKPYKCPECGKSFSASAALVAHQRTHT。

进一步地，所述超氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：

MATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ。

进一步地，所述锌指蛋白和超氧化物歧化酶之间通过连接肽连接。

进一步地，所述连接肽的氨基酸数量为≥2个，所述连接肽由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)组合而成，采用以G2S(即氨基酸序列GGS)为单位的多单位连接实现。

进一步地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：GGS。

本发明对于连接顺序没有特殊要求，只要不限制本发明的目的即可。例如，所述锌指蛋白的C末端可以与所述超氧化物歧化酶的N末端连接。或者超氧化物歧化酶的C末端可以与所述锌指蛋白的N末端连接。

亦即，所述融合蛋白的结构域的通式为：锌指蛋白-连接肽-超氧化物歧化酶或者超氧化物歧化酶-连接肽-锌指蛋白。

优选地，所述融合蛋白的结构域从N端到C端依次包括锌指蛋白、连接肽、超氧化物歧化酶。

进一步地，在本案的较佳案例中，列举了所述融合蛋白的结构域氨基序列如SEQID NO.12所示，具体为：

EKPYKCPECGKSFSASAALVAHQRTHTGGSMATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ。但不限于本发明较佳案例中所列举的具体形式。

进一步地，所述融合蛋白还可含有标签。所述标签用于蛋白质的纯化。

例如，所述标签可以是His标签、MBP标签、GST标签、FLAG标签等亲和纯化标签。

所述标签可以连接在所述融合蛋白的结构域N端或C端，只要不影响标签和融合蛋白结构域发挥作用即可。

在本案的较佳案例中，列举了带有标签的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，具体为：

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSPKKKRKVLEPGEKPYKCPECGKSFSASAALVAHQRTHTGGSMATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ。但不限于本发明较佳案例中所列举的具体形式。

本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸(亦即DNA分子)，其编码前述融合蛋白。

本发明的编码所述融合蛋白的多核苷酸，可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。

本发明的编码所述融合蛋白的多核苷酸，可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等，科学出版社，1995)。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法；例如采用重叠延伸PCR法。

例如，编码所述锌指蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

gaaaaaccatacaaatgcccagaatgcggaaaatcttttagtgcctcagctgccctcgtcgcccatcaaagaacacatacc。

编码所述超氧化物歧化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：

atggccaccaaagcggtctgcgttttaaaaggggatggcccggtgcaaggcattattaatttcgaacaaaaagagagcaatggtccggttaaagtgtggggtagtatcaaaggcctgaccgagggtctgcatggctttcatgtgcatgaatttggcgataacaccgctggttgcacgtcagccggcccgcactttaatcctctgtcccgtaagcacggcggcccgaaggatgaggagcgtcacgtcggcgatctgggtaatgttactgccgataaggatggggtggccgatgtttccattgaagattctgtcatctcattgagtggggaccactgtatcattgggcgtaccttagtggtccatgaaaaggcagacgacctgggtaagggcggaaatgaagaatccaccaaaacgggcaatgctggttcacgtttagcgtgtggtgtgattggtatcgcccaa。

编码所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：ggtggatcc。

编码所述融合蛋白结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：

gaaaaaccatacaaatgcccagaatgcggaaaatcttttagtgcctcagctgccctcgtcgcccatcaaagaacacataccggtggatccatggccaccaaagcggtctgcgttttaaaaggggatggcccggtgcaaggcattattaatttcgaacaaaaagagagcaatggtccggttaaagtgtggggtagtatcaaaggcctgaccgagggtctgcatggctttcatgtgcatgaatttggcgataacaccgctggttgcacgtcagccggcccgcactttaatcctctgtcccgtaagcacggcggcccgaaggatgaggagcgtcacgtcggcgatctgggtaatgttactgccgataaggatggggtggccgatgtttccattgaagattctgtcatctcattgagtggggaccactgtatcattgggcgtaccttagtggtccatgaaaaggcagacgacctgggtaagggcggaaatgaagaatccaccaaaacgggcaatgctggttcacgtttagcgtgtggtgtgattggtatcgcccaa。

编码带有标签的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：

Atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagcccgaaaaagaaacgcaaagtgctcgagcccggggaaaaaccatacaaatgcccagaatgcggaaaatcttttagtgcctcagctgccctcgtcgcccatcaaagaacacataccggtggatccatggccaccaaagcggtctgcgttttaaaaggggatggcccggtgcaaggcattattaatttcgaacaaaaagagagcaatggtccggttaaagtgtggggtagtatcaaaggcctgaccgagggtctgcatggctttcatgtgcatgaatttggcgataacaccgctggttgcacgtcagccggcccgcactttaatcctctgtcccgtaagcacggcggcccgaaggatgaggagcgtcacgtcggcgatctgggtaatgttactgccgataaggatggggtggccgatgtttccattgaagattctgtcatctcattgagtggggaccactgtatcattgggcgtaccttagtggtccatgaaaaggcagacgacctgggtaagggcggaaatgaagaatccaccaaaacgggcaatgctggttcacgtttagcgtgtggtgtgattggtatcgcccaa。

本发明的第三方面，提供一种重组表达载体，其含有前述分离的多核苷酸。

发明的所述表达载体含有编码所述融合蛋白的多核苷酸。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述表达载体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码所述融合蛋白的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。本发明的较佳案例中，所述表达载体可采用pET28、pMAL、pcDNA等。

本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，所述细胞含有前述重组表达载体或基因组中整合有外源的前述分离的多核苷酸。

本发明的较佳案例中，所述宿主细胞可采用BL21大肠杆菌、昆虫细胞、CHO细胞、HEK293细胞等。

本发明的第五方面，提供一种制备前述融合蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)构建含有所述融合蛋白编码多核苷酸的重组表达载体，然后将所述重组表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述融合蛋白；

或者

(2)在合适的条件下培养前述宿主细胞，使之表达所述融合蛋白，而后分离及纯化获得所述融合蛋白。

本发明的较佳案例中，所述表达载体可采用pET28、pMAL、pcDNA。

所述宿主细胞可采用BL21大肠杆菌、昆虫细胞、CHO细胞、HEK293细胞等。

本发明的第六方面，提供前述融合蛋白、分离的多核苷酸、重组表达载体、或宿主细胞在制备抗氧化相关产品中的用途。

优选地，所述抗氧化产品选自脑缺血治疗产品、癌症治疗产品、艾滋病治疗产品、渐冻症治疗产品、抗炎症反应产品、帕金森综合症治疗产品、面部美容产品

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1).本发明的融合蛋白比传统细胞穿膜肽融合的SOD蛋白质更容易表达纯化

(2).本发明的融合蛋白有更低的风险引起免疫反应。锌指蛋白和SOD都是人体内天然存在的蛋白质。

(3).本发明的融合蛋白能将有活性的SOD酶递呈到细胞中，传统方法往往造成酶的失活。

附图说明

图1：ZFP-SOD1蛋白纯化，(a)ZFP-hSOD1构建体的示意图；(b)纯化的ZFP-hSOD1蛋白的SDS-PAGE，箭头表示目标蛋白带。

图2：通过SOD活性测定的Hela细胞中的内化SOD1蛋白，n.s.表示无统计学意义。*表示P<0.05。

具体实施方式

本发明的发明人鉴定出Cys₂-His₂锌指蛋白(ZFPs)为新的蛋白质递送系统。由于蛋白质表面带有6个带正电荷的残基，ZFP具有固有的细胞渗透性。我们通过突变α--螺旋中负责DNA结合的残基来消除ZFP的DNA结合能力。工程化的锌指蛋白(ZFP)保留了细胞通透性，可以用作融合标签来递送货物蛋白。通过调节串联ZFP结构域的数量可调节细胞摄取功效，以适应不同应用。ZFP结构域可以有效介导蛋白质如绿色荧光蛋白(GFP)和Fok I核酸酶的细胞内递送。除了转化的细胞系之外，ZFP可以促进货物蛋白质向原代细胞和干细胞的递送，这对于治疗应用非常重要。

超氧化物歧化酶(SOD)家族包括一组经过充分研究的抗氧化酶，即SOD1，SOD2和SOD3。SOD在减弱来自细胞活性氧(ROS)的氧化应激中起基础作用。ROS的紊乱可以导致各种疾病的发生和发展。临床前和临床研究表明SODs具有很好的治疗潜力。SOD已被用于广泛的医学适应症，例如缺血再灌注损伤，移植诱导再灌注损伤，炎症，帕金森病，肿瘤和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。

本发明首次提供了ZFP-SOD1融合蛋白的构建、表达、纯化及细胞活性测试方式，并证明了ZFP-SOD1能穿透细胞膜、并在细胞内部发挥SOD1抗氧化活性。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

一、材料

(一)质粒构建

1、大肠杆菌表达优化的编码人SOD1基因的pET28a质粒(可从商业基因合成服务供应商获得)。

2、含有ZFP编码基因序列的质粒。

3、DNA聚合酶。

4、脱氧核苷酸混合物，包括dATP，dCTP，dGTP和dTTP。

5、PCR反应缓冲液。

6、无菌水。

7、DNA染色试剂。

8、同源重组酶。

9、DH5α大肠杆菌感受态。

10、溶血肉汤(LB)培养基。

11、琼脂，细菌学等级。

12、质粒DNA抽提试剂盒。

13、用于PCR的梯度热循环仪。

14、琼脂糖凝胶电泳试剂和设备。

15、UV透射照胶仪。

16、离心机。

17、水浴锅。

(二)蛋白表达和纯化

1、编码重组ZFP-SOD1蛋白质的质粒。

2、BL21(DE3)感受态大肠杆菌细胞。

3、琼脂，细菌学等级。

4、50mg/mL卡那霉素储备溶液

5、1M IPTG(异丙基-β-D-1-噻谷氨酰吡喃糖苷)。

6、Ni-NTA琼脂糖。

7、1M Tris-HCl pH 8.0。

8、4M咪唑储备液。

9、100mM ZnCl2原液。

10、100mM MgCl2储备溶液。

11、苯甲基磺酰基氟化物(PMSF)(100mM乙醇溶液)。

12、裂解缓冲液：50mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM NaCl，100M ZnCl₂，1mM MgCl₂，1mMPMSF和5mM咪唑。

13、洗涤缓冲液：50mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM NaCl，100M ZnCl2，1mM MgCl₂和30mM咪唑。

14、洗脱缓冲液：50mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM NaCl，100MZnCl2，1mM MgCl₂和300mM咪唑。

15、储存缓冲液：50mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM NaCl，100MZnCl2，1mM MgCl₂和10％甘油。

16、细胞培养瓶。

17、集中器。

18、4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE。

19、SDS蛋白上样缓冲液。

20、BCA蛋白质测定试剂盒。

21、液氮。

(三)蛋白转导

1、纯化ZFP-SOD1蛋白。

2、二类生物安全柜。

3、细胞培养箱。

4、明场相差显微镜。

5、达尔伯克改良鹰的培养基(DMEM)。

6、胎牛血清(FBS)。

7、青霉素和链霉素溶液。

8、磷酸盐缓冲液(PBS)。

9、9mM ZnCl2。

10、Triton X-100。

11、0.05％含酚红的胰蛋白酶-EDTA溶液。

12、Hela细胞。

13、组织培养瓶。

14、24孔平底组织培养板。

15、离心机。

16、SOD分析试剂盒。

二、方法

(一)表达ZFP-SOD1蛋白质(锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质)的质粒的构建

1、使用商业基因合成服务，小量制备编码ZFP的质粒(pET28-ZiF1-EmGFP)并在pET28a载体(pET28a-hSOD1)中合成人类SOD基因(超氧化物歧化酶基因)。

2、从质粒pET-1F-ZiF中用引物：

ZFP-Fwd(5’-gcctggtgccgcgcggcagcccgaaaaagaaacgcaaagtgc-3’SEQ ID NO.1)

和ZFP-SOD1-Rev(5’-gctttggtggccatggatccaccggtatgtgttctttgatgg-3’SEQ IDNO.2)

PCR扩增ZFP基因(锌指蛋白基因)。

3、准备PCR混合物以扩增编码ZFP结构域的基因：在50μL的反应体系中使用5ng模板DNA、5μL10X聚合酶缓冲液、1单位(U)Taq DNA聚合酶、0.2mM dNTP混合物和各0.2μM正向和反向引物。使用以下条件设置循环PCR：95℃5分钟，95℃30秒，58℃30秒和72℃1分钟的30个循环，以及72℃最后延伸10分钟。通过凝胶提取纯化PCR产物，并使用分光光度计测量Abs260x 50ng/μL来确定DNA浓度。

4、在37℃条件下，用10U各NdeI和BamHI在推荐缓冲液中消化1g pET28a-hSOD1质粒3h。通过经DNA染料(例如凝胶红)染色的琼脂糖凝胶电泳观察DNA。

5、通过凝胶提取试剂盒纯化消化的质粒，并通过分光光度计测量Abs260x 50ng/μL来确定DNA浓度。

6、按如下条件进行同源重组反应构建ZFP-SOD1融合蛋白：在20μL的反应体系加入0.06pmol ZFP PCR产物、0.03pmol线性化pET28a-hSOD1质粒DNA、2μL重组酶如Exnase II、4μL5x重组缓冲液和去离子水，在37℃孵育30分钟。

7、在冰上解冻200微升化学感受态DH5α大肠杆菌细胞，与20微升重组产物轻轻混合，然后在冰上孵育30分钟。

8、将混合物在42℃下震荡45-90s，用LB培养基900μL复苏细胞并在37℃振荡1h。

9、在补充有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上铺100μL复苏的细胞，并在37℃孵育过夜。

10、次日，将单个菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基中并在37℃下培养过夜。

11、小量制备pET28a-ZFP-SOD1质粒，并使用引物(5'-taatacgactcactataggg-3')与T7启动子结合，通过DNA测序确认构建体【ZFP-hSOD1构建体的示意图如图1中(a)所示】。

结果可知：ZFP-SOD1蛋白质(锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质)的结构域中从N端到C端依次包括锌指蛋白、连接肽、超氧化物歧化酶，所述融合蛋白结构域的全长基因均序列正确，均与预期相符。

亦即，融合蛋白结构域中，锌指蛋白的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：gaaaaaccatacaaatgcccagaatgcggaaaatcttttagtgcctcagctgccctcgtcgcccatcaaagaacacatacc。连接肽的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：ggtggatcc。超氧化物歧化酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：

ZFP-SOD1蛋白质(锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质)结构域的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：

为了纯化方便，ZFP-SOD1蛋白质(锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质)在结构域N端添加了His标签。

His标签的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：catcatcatcatcatcac。

带有His标签的ZFP-SOD1蛋白质的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：

(二)ZFP-SOD1蛋白质(锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质)的表达与纯化

1、将50μL化学感受态BL21大肠杆菌细胞放在冰上，并与100ng pET28a-ZFP-SOD1质粒轻轻混合。执行本实施例章节二(一)中步骤7-9所述的热击转化。

2、次日，将单个菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的10mL LB培养基中并在37℃下培养过夜。

3、次日，将10mL过夜培养物稀释到1L补充有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中。在37℃振荡培养至600nm光密度(OD600)为0.6-0.8，并用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。在37℃下表达6小时后，4℃以5,000xg离心20分钟收获细胞。

4、将1g细胞沉淀重悬于5mL裂解缓冲液中。用细胞分散器或超声处理溶解冰上的细胞。

5、在4℃下将细胞裂解液在40,000x g下离心30分钟，并将上清液转移到新收集管中。为获得最佳结果，请在4℃下执行以下所有步骤。

6、将上清液通过预装有1mL平衡的Ni-NTA琼脂糖的柱子。用20毫升洗涤缓冲液清洗树脂。

7、用5mL洗脱缓冲液洗脱蛋白质。

8、用储存缓冲液置换洗脱的蛋白质，并按照制造商的说明使用旋转浓缩器将蛋白质浓缩至少40μM。

9、通过BCA或Bradford确定蛋白质浓度。

10、用2μL 2×SDS-PAGE上样缓冲液混合2μL纯化的蛋白质，在95℃煮沸10分钟，然后在4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE上分离以评估蛋白质纯度，结果如图1中(b)所示，说明：ZFP-SOD1蛋白质(锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质)能成功在体外重组表达，并可以获得纯度较高的融合蛋白。

经N/C末端序列分析，结果表明ZFP-SOD1蛋白质(锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质)结构域中从N端到C端依次包括锌指蛋白、连接肽、超氧化物歧化酶，所表达的融合蛋白均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致。

亦即：融合蛋白结构域中，锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为EKPYKCPECGKSFSASAALVAHQRTHT。连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：GGS。超氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：

MATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ。ZFP-SOD1蛋白质(锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质)的结构域氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，具体为：

EKPYKCPECGKSFSASAALVAHQRTHTGGSMATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ。

His标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：HHHHHH。带有His标签的ZFP-SOD1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，具体为：

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSPKKKRKVLEPGEKPYKCPECGKSFSASAALVAHQRTHTGGSMATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ。

11、浓缩蛋白质，在液氮中快速冷冻并储存在-80。

(三)ZFP-SOD1蛋白质(锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质)转导

1、在含有5％CO₂的完全湿化的气氛中，在37℃下用补充有10％(v/v)FBS，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM培养基培养HeLa细胞。

2、在25℃下预先用50μg/mL聚赖氨酸500μL预涂24-60孔板30至60分钟。Hela细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度铺在预涂板上。

3、接种24小时后，从各孔中取出培养基，并用500μL预热的无血清DMEM洗涤。

4、.每孔加入250μL含2μM ZFP-SOD1蛋白质和100μM ZnCl2的SFM。37℃孵育1小时。

5、从细胞中吸出培养基，用500μL不含钙和镁补充0.5mg/mL肝素的PBS洗涤三次。

6、用0.05％胰蛋白酶-EDTA洗涤细胞，去除胰蛋白酶溶液，然后在37℃孵育2分钟。

7、使用含有0.1％(v/v)Triton X-100的250μLPBS裂解细胞。

8、使用SOD测定试剂盒如SOD测定试剂盒(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)以确定细胞内的SOD蛋白质。结果如图2所示，ZFP-SOD1蛋白质(锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质)能进入细胞发挥抗氧化活性。ZFP-SOD1蛋白质能够穿过细胞膜进入到细胞内，从而提升细胞自身的抗氧化活性(从30提升至40，提升约1/3)。

对比例

Kwon等人的文章(参考文献：Transduction of Cu,Zn-superoxide dismutasemediated by an HIV-1Tat protein basic domain into mammalian cells)证明，细胞穿膜肽Tat介导的SOD的细胞递呈只能对变性的SOD起到作用，而对生理条件下的SOD不起作用。而我们的结果证明锌指蛋白能将生理状态下的SOD递呈到细胞中。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海科技大学

<120> 具有细胞穿膜性的锌指蛋白-超氧化物歧化酶融合蛋白质

<130> 182176

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcctggtgcc gcgcggcagc ccgaaaaaga aacgcaaagt gc 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctttggtgg ccatggatcc accggtatgt gttctttgat gg 42

<210> 3

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaaaaccat acaaatgccc agaatgcgga aaatctttta gtgcctcagc tgccctcgtc 60

gcccatcaaa gaacacatac c 81

<210> 4

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggatcc 9

<210> 5

<211> 462

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggccacca aagcggtctg cgttttaaaa ggggatggcc cggtgcaagg cattattaat 60

ttcgaacaaa aagagagcaa tggtccggtt aaagtgtggg gtagtatcaa aggcctgacc 120

gagggtctgc atggctttca tgtgcatgaa tttggcgata acaccgctgg ttgcacgtca 180

gccggcccgc actttaatcc tctgtcccgt aagcacggcg gcccgaagga tgaggagcgt 240

cacgtcggcg atctgggtaa tgttactgcc gataaggatg gggtggccga tgtttccatt 300

gaagattctg tcatctcatt gagtggggac cactgtatca ttgggcgtac cttagtggtc 360

catgaaaagg cagacgacct gggtaagggc ggaaatgaag aatccaccaa aacgggcaat 420

gctggttcac gtttagcgtg tggtgtgatt ggtatcgccc aa 462

<210> 6

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaaaaccat acaaatgccc agaatgcgga aaatctttta gtgcctcagc tgccctcgtc 60

gcccatcaaa gaacacatac cggtggatcc atggccacca aagcggtctg cgttttaaaa 120

ggggatggcc cggtgcaagg cattattaat ttcgaacaaa aagagagcaa tggtccggtt 180

aaagtgtggg gtagtatcaa aggcctgacc gagggtctgc atggctttca tgtgcatgaa 240

tttggcgata acaccgctgg ttgcacgtca gccggcccgc actttaatcc tctgtcccgt 300

aagcacggcg gcccgaagga tgaggagcgt cacgtcggcg atctgggtaa tgttactgcc 360

gataaggatg gggtggccga tgtttccatt gaagattctg tcatctcatt gagtggggac 420

cactgtatca ttgggcgtac cttagtggtc catgaaaagg cagacgacct gggtaagggc 480

ggaaatgaag aatccaccaa aacgggcaat gctggttcac gtttagcgtg tggtgtgatt 540

ggtatcgccc aa 552

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

catcatcatc atcatcac 18

<210> 8

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagcccg 60

aaaaagaaac gcaaagtgct cgagcccggg gaaaaaccat acaaatgccc agaatgcgga 120

aaatctttta gtgcctcagc tgccctcgtc gcccatcaaa gaacacatac cggtggatcc 180

atggccacca aagcggtctg cgttttaaaa ggggatggcc cggtgcaagg cattattaat 240

ttcgaacaaa aagagagcaa tggtccggtt aaagtgtggg gtagtatcaa aggcctgacc 300

gagggtctgc atggctttca tgtgcatgaa tttggcgata acaccgctgg ttgcacgtca 360

gccggcccgc actttaatcc tctgtcccgt aagcacggcg gcccgaagga tgaggagcgt 420

cacgtcggcg atctgggtaa tgttactgcc gataaggatg gggtggccga tgtttccatt 480

gaagattctg tcatctcatt gagtggggac cactgtatca ttgggcgtac cttagtggtc 540

catgaaaagg cagacgacct gggtaagggc ggaaatgaag aatccaccaa aacgggcaat 600

gctggttcac gtttagcgtg tggtgtgatt ggtatcgccc aa 642

<210> 9

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ala Leu Val Ala His Gln Arg Thr His Thr

20 25

<210> 10

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Gly Ser

1

<210> 11

<211> 154

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln

1 5 10 15

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val

20 25 30

Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val

35 40 45

His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His

50 55 60

Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg

65 70 75 80

His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala

85 90 95

Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys

100 105 110

Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly

115 120 125

Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg

130 135 140

Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln

145 150

<210> 12

<211> 184

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ala Leu Val Ala His Gln Arg Thr His Thr Gly Gly Ser Met Ala

20 25 30

Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly Ile

35 40 45

Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp Gly

50 55 60

Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His Glu

65 70 75 80

Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe Asn

85 90 95

Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His Val

100 105 110

Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp Val

115 120 125

Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys Ile Ile

130 135 140

Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys Gly

145 150 155 160

Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu Ala

165 170 175

Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln

180

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

His His His His His His

1 5

<210> 14

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu Glu Pro Gly Glu Lys

20 25 30

Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Ala Ser Ala Ala

35 40 45

Leu Val Ala His Gln Arg Thr His Thr Gly Gly Ser Met Ala Thr Lys

50 55 60

Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly Ile Ile Asn

65 70 75 80

Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp Gly Ser Ile

85 90 95

Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly

100 105 110

Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe Asn Pro Leu

115 120 125

Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His Val Gly Asp

130 135 140

Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp Val Ser Ile

145 150 155 160

Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys Ile Ile Gly Arg

165 170 175

Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn

180 185 190

Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu Ala Cys Gly

195 200 205

Val Ile Gly Ile Ala Gln

210

Claims

1.一种融合蛋白质，其结构域中包括锌指蛋白和超氧化物歧化酶，所述锌指蛋白和超氧化物歧化酶之间通过连接肽连接，所述融合蛋白的结构域中从N端到C端依次包括锌指蛋白、连接肽、超氧化物歧化酶，所述锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述超氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括标签。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白质结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

4.一种分离的多核苷酸，其编码如权利要求1～3任一项所述的融合蛋白。

5.一种重组表达载体，其含有如权利要求4所述的分离的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，所述细胞含有如权利要求5所述重组表达载体或基因组中整合有外源的如权利要求4所述的分离的多核苷酸。

7.一种制备如权利要求1～3任一项所述融合蛋白的方法，包括如下步骤：（1）构建含有所述融合蛋白编码多核苷酸的重组表达载体，然后将所述重组表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述融合蛋白；或者（2）在合适的条件下培养如权利要求6所述宿主细胞，使之表达所述融合蛋白，而后分离及纯化获得所述融合蛋白。

8.如权利要求1～3任一项所述融合蛋白在制备抗氧化相关产品中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述抗氧化产品选自脑缺血治疗产品、癌症治疗产品、艾滋病治疗产品、渐冻症治疗产品、抗炎症反应产品、帕金森综合症治疗产品、面部美容产品。