KR101666934B1 - 개량형 TAT 펩타이드가 융합된 EGF, 티모신β4, hGH 단백질의 생산방법 및 이들 단백질을 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents
개량형 TAT 펩타이드가 융합된 EGF, 티모신β4, hGH 단백질의 생산방법 및 이들 단백질을 포함하는 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 EGF, 티모신β4, hGH 단백질의 효과적인 생산방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 개량형 TAT 펩타이드가 융합된 EGF, 티모신β4, hGH 단백질을 각각 대량으로 생산할 수 있으며, 화장료 조성물에 첨가하여 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 서열번호 2의 서열을 갖는 개량형 TAT 펩타이드를 사용함으로써, EGF, 티모신β4, hGH 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 피부는 표피, 진피, 피하지방으로 구성되어 있다. 피부는 보호기능, 장벽기능, 온도조절기능, 배설기능, 호흡기능 등 다양한 역할을 담당하고 있는 매우 중요한 기관이다 [Proksch E, Brandner JM, Jensen JM. (2008).The skin:an indispensable barrier. Exp Dermatol . 17(12):1063-72].
이중 보호기능은 외부 자극 및 물질에 대해 신체를 보호하게 되며 이러한 보호기능 때문에 약물 전달에 어려움이 따르게 된다. 결과적으로 기존에 상피세포 성장인자만을 이용한 제제들은 피부의 보호기능 때문에 효율적으로 피부에 작용하지 못하는 단점이 있다. 이러한 재조합 상피세포 성장인자의 전달에 따른 문제점을 해결하기 위한 다양한 전달방법이 개발되었으나, 여전히 효과적인 피부 침투에는 한계를 드러내고 있다.
치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는데 있어 목적 단백질을 세포막을 거쳐 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나, 단백질은 크기나 여러 가지 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.
최근에는 거대분자를 세포 안으로 운반시킬 수 있는 운반체 역할을 하는 펩타이드가 개발됨으로써 이를 이용하여 세포 내로 약물전달을 시도하고 있다. 현재 잘 알려져 있는 펩타이드는 단백질수송도메인(protein transducing domain, PTD)으로 알려져 있는 TAT 펩타이드, 세포투과성 펩타이드의 일종인 Pep-1 펩타이드가 있다.
한편, 모든 단백질이 단백질수송도메인과 융합 단백질을 이루어 세포 내로 투과될 수 있는 것은 아니다. 2001년, 2004년 그리고 2007년에, Tat 형질도입부위와 결합시킨 단백질이 세포 내로 도입은 되었으나 활성을 나타내지 않는다는 연구결과가 논문으로 발표된 사실이 있다 [Sengoku, T. et al. Experimental Neurology 188(2004) 161-170, Falnes P.O. et al. Biochemistry 2001 Apr 10;40(14):4349-4358, Daniele Peroni et al., Neuroscience letters 421(2007) 110-114 등]. 즉, 세포도입이 용이하지 않은 단백질에 단백질수송도메인을 융합시킨다고 해서 융합된 모든 단백질이 세포 내로 도입된 후 원활한 활성을 나타낸다고 단정할 수는 없는 것이다.
또한, 단백질수송도메인을 목적단백질에 융합시킬 경우, 목적단백질이 산업적으로 이용이 가능할 만큼 대량으로 발현된다고도 단정할 수 없다. 따라서, 단백질수송도메인을 목적단백질에 융합시킬 경우, 발현 여부 및 대량으로 발현되는지 여부를 반드시 확인해 봐야 한다.
본 발명은 EGF(epidermal growth factor, EGF), 티모신β4(Thymosinβ4, Tβ4), hGH(human growth hormon)에 단백질수송도메인(protein transducing domain)을 융합시키되, 대량으로 발현할 수 있는 기술을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 세포성장인자(epidermal growth factor, EGF)에 융합된 것을 특징으로 하는 개량형 TAT 펩타이드 융합 EGF 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 티모신β4(Thymosinβ4, Tβ4)에 융합된 것을 특징으로 하는 개량형 TAT 펩타이드 융합 티모신β4 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 인간성장호르몬(human growth hormon, hGH)에 융합된 것을 특징으로 하는 개량형 TAT 펩타이드 융합 hGH 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 세포성장인자(epidermal growth factor, EGF)에 융합되어 형성된 개량형 TAT 펩타이드 융합 EGF 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 이때, 상기 화장료 조성물은 일 예로, 피부 주름 개선용 또는 피부 노화 방지용 또는 피부 재생용인 것일 수 있다. EGF는 피부 주름 개선, 피부 노화 방지, 피부 재생에 효과가 있는 것으로 알려져 있기 때문이다 (Fallon JH, Seroogy KB, Loughlin SE, Morrison RS, Bradshaw RA, Knaver DJ, Cunningham DD (June 1984). "Epidermal growth factor immunoreactive material in the central nervous system: location and development". Science 224 (4653): 11079).
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 티모신β4(Thymosinβ4, Tβ4)에 융합되어 형성된 개량형 TAT 펩타이드 융합 티모신β4 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 이때, 상기 화장료 조성물은, 일 예로, 피부 노화 방지용 또는 피부 재생용 또는 모발생장촉진용인 것일 수 있다. 티모신β4는 피부 노화 방지, 피부 재생, 모발생장촉진에 효과가 있는 것으로 알려져 있기 때문이다 (Crockford D, Turjman N, Allan C, Angel J (April 2010). "Thymosin beta4: structure, function, and biological properties supporting current and future clinical applications". Ann. N. Y. Acad. Sci. 1194: 17989).
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 인간성장호르몬(human growth hormon, hGH)에 융합되어 형성된 개량형 TAT 펩타이드 융합 hGH 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 이때, 상기 화장료 조성물은, 일 예로, 피부 주름 개선용 또는 피부 노화 방지용 또는 피부 재생용인 것일 수 있다. hGH는 피부 주름 개선, 피부 노화 방지, 피부 재생에 효과가 있는 것으로 알려져 있기 때문이다 (Hyun-Joo Cho etc (2007), "Analysis of the Effects of hGH Using Living Skin Equivalents". Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Vol. 4, No. 3, pp 406-410) .
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 세포성장인자(epidermal growth factor, EGF)에 융합되어 형성된 개량형 TAT 펩타이드 융합 EGF 단백질을 암호화하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계 (a); 상기의 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 대장균을 형질전환시킴으로써 재조합 대장균을 제조하는 단계 (b); 상기 재조합 대장균을 배양한 후, 재조합 대장균 균체 또는 그 배양액으로부터 개량형 TAT 펩타이드 융합 EGF 단백질을 분리하는 단계 (c); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 개량형 TAT 펩타이드 융합 EGF 단백질의 생산방법을 제공한다. 개량형 TAT 펩타이드를 융합시킬 경우, 야생형 TAT 펩타이드를 융합시키는 경우에 비해 TAT 융합 EGF 단백질을 대량으로 생산할 수 있음이 하기 본 발명의 실험을 통해 확인되었다.
본 발명은 유비퀴틴 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 세포성장인자(epidermal growth factor, EGF)에 융합되어 형성된 유비퀴틴 및 개량형 TAT 펩타이드 융합 EGF 단백질을 암호화하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계 (a); 상기의 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 대장균을 형질전환시킴으로써 재조합 대장균을 제조하는 단계 (b); 상기 재조합 대장균을 배양한 후, 재조합 대장균 균체 또는 그 배양액으로부터 유비퀴틴 및 개량형 TAT 펩타이드 융합 EGF 단백질을 분리하는 단계 (c); 상기에서 분리한 유비퀴틴 및 개량형 TAT 펩타이드 융합 EGF 단백질로부터 유비퀴틴을 제거하는 단계 (d);를 포함하는 것을 특징으로 하는 개량형 TAT 펩타이드 융합 EGF 단백질의 생산방법을 제공한다. 유비퀴틴은 목적단백질의 발현을 도와주는 발현유도체로 알려져 있는 단백질인데, 본 발명에서 발현을 유도하기 위해 사용할 수 있는 것이다. 본 발명에서 유비퀴틴은 전체 시퀀스 외에 일부 시퀀스만을 사용할 수도 있다. 유비퀴틴은 정제공정 중 유비퀴틴 특이 프로테아제 (Ubiquitin Specific Protease, USP)에 의하여 절단되어 제거된다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 티모신β4(Thymosinβ4, Tβ4)에 융합되어 형성된 개량형 TAT 펩타이드 융합 Tβ4 단백질을 암화화하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계 (a); 상기의 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 대장균을 형질전환시킴으로써 재조합 대장균을 제조하는 단계 (b); 상기 재조합 대장균을 배양한 후, 재조합 대장균 균체 또는 그 배양액으로부터 개량형 TAT 펩타이드 융합 Tβ4 단백질을 분리하는 단계 (c); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 개량형 TAT 펩타이드 융합 Tβ4 단백질의 생산방법을 제공한다. 개량형 TAT 펩타이드를 융합시킬 경우, 야생형 TAT 펩타이드를 융합시키는 경우에 비해 TAT 융합 Tβ4 단백질을 대량으로 생산할 수 있음이 하기 본 발명의 실험을 통해 확인되었다.
본 발명은 유비퀴틴 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 티모신β4(Thymosinβ4, Tβ4)에 융합되어 형성된 유비퀴틴 및 개량형 TAT 펩타이드 융합 Tβ4 단백질을 암화화하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계 (a); 상기의 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 대장균을 형질전환시킴으로써 재조합 대장균을 제조하는 단계 (b); 상기 재조합 대장균을 배양한 후, 재조합 대장균 균체 또는 그 배양액으로부터 유비퀴틴 및 개량형 TAT 펩타이드 융합 Tβ4 단백질을 분리하는 단계 (c); 상기에서 분리한 유비퀴틴 및 개량형 TAT 펩타이드 융합 Tβ4 단백질로부터 유비퀴틴을 제거하는 단계 (d);를 포함하는 것을 특징으로 하는 개량형 TAT 펩타이드 융합 Tβ4 단백질의 생산방법을 제공한다. 유비퀴틴은 목적단백질의 발현을 도와주는 발현유도체로 알려져 있는 단백질인데, 본 발명에서 발현을 유도하기 위해 사용할 수 있는 것이다. 본 발명에서 유비퀴틴은 전체 시퀀스 외에 일부 시퀀스만을 사용할 수도 있다. 유비퀴틴은 정제공정 중 유비퀴틴 특이 프로테아제 (Ubiquitin Specific Protease, USP)에 의하여 절단되어 제거된다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 인간성장호르몬(human growth hormon, hGH)에 융합되어 형성된 개량형 TAT 펩타이드 융합 hGH 단백질을 암화화하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계 (a); 상기의 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 대장균을 형질전환시킴으로써 재조합 대장균을 제조하는 단계 (b); 상기 재조합 대장균을 배양한 후, 재조합 대장균 균체 또는 그 배양액으로부터 개량형 TAT 펩타이드 융합 hGH 단백질을 분리하는 단계 (c);를 포함하는 것을 특징으로 하는 개량형 TAT 펩타이드 융합 hGH 단백질의 생산방법을 제공한다. 개량형 TAT 펩타이드를 융합시킬 경우, 야생형 TAT 펩타이드를 융합시키는 경우에 비해 TAT 융합 hGH 단백질을 대량으로 생산할 수 있음이 하기 본 발명의 실험을 통해 확인되었다.
본 발명은 유비퀴틴 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 인간성장호르몬(human growth hormon, hGH)에 융합되어 형성된 유비퀴틴 및 개량형 TAT 펩타이드 융합 hGH 단백질을 암화화하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계 (a); 상기의 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 대장균을 형질전환시킴으로써 재조합 대장균을 제조하는 단계 (b); 상기 재조합 대장균을 배양한 후, 재조합 대장균 균체 또는 그 배양액으로부터 유비퀴틴 및 개량형 TAT 펩타이드 융합 hGH 단백질을 분리하는 단계 (c); 상기에서 분리한 유비퀴틴 및 개량형 TAT 펩타이드 융합 hGH 단백질로부터 유비퀴틴을 제거하는 단계 (d);를 포함하는 것을 특징으로 하는 개량형 TAT 펩타이드 융합 hGH 단백질의 생산방법을 제공한다. 유비퀴틴은 목적단백질의 발현을 도와주는 발현유도체로 알려져 있는 단백질인데, 본 발명에서 발현을 유도하기 위해 사용할 수 있는 것이다. 본 발명에서 유비퀴틴은 전체 시퀀스 외에 일부 시퀀스만을 사용할 수도 있다. 유비퀴틴은 정제공정 중 유비퀴틴 특이 프로테아제 (Ubiquitin Specific Protease, USP)에 의하여 절단되어 제거된다.
본 발명에서와 같이, 개량형 TAT를 융합시키면, 야생형의 TAT를 융합시키는 것에 비해 EGF(epidermal growth factor), 티모신β4(Thymosinβ4, Tβ4), hGH(human growth hormon, hGH)를 대량으로 생산할 수 있다. 또한, 본 발명을 통해 대량 생산된 개량형 TAT 융합 EGF, 티모신β4, hGH는 화장품 등에 첨가되어 사용될 수 있다.
도 1은 융합단백질 6종에 대해 E. coli 에서 발현 여부를 확인 결과이다.
도 2는 융합단백질 2종에 대해 유가식 배양 후 발현 여부를 확인한 결과이다 ( 5L jar fermenter scale).
도 3은 H6Ub-TATm-TB4 단백질의 SP FF 정제 결과이다.
도 4는 H6Ub-TATm-TB4 단백질의 Ni FF 및 SP FF 정제 결과이다.
도 5는 H6Ub-TATm-hGH SP FF 정제 결과이다.
도 6은 H6Ub-TATm-hGH Ni FF 정제 결과이다.
도 7은 H6Ub-TATm-hGH SP FF 정제 결과이다 (1st).
도 8은 H6Ub-TATm-hGH SP FF 정제 결과이다 (2nd).
도 9는 H6Ub-TATm-hGH SP FF 정제 결과이다 (3rd).
도 10는 내포체(inclusion body) 형태로 발현된 불용성 H6Ub-TATm-EGF의 리폴딩(Refolding) 후, SP FF 및 Ni FF 정제 결과이다.
도 11은 내포체(inclusion body) 형태로 발현된 불용성 H6Ub-TATm-EGF 단백질의 높은 pH 조건에서의 리폴딩 및 정제 결과이다.
도 12는 내포체(inclusion body) 형태로 발현된 불용성 TATm-EGF의 정제 과정을 보여주는 흐름도이다.
도 13은 내포체(inclusion body) 형태로 발현된 불용성 TATm-EGF의 Q FF를 이용한 정제 결과이다.
도 14는 내포체(inclusion body) 형태로 발현된 불용성 TATm-EGF의 SP FF를 이용한 정제 결과이다.
도 2는 융합단백질 2종에 대해 유가식 배양 후 발현 여부를 확인한 결과이다 ( 5L jar fermenter scale).
도 3은 H6Ub-TATm-TB4 단백질의 SP FF 정제 결과이다.
도 4는 H6Ub-TATm-TB4 단백질의 Ni FF 및 SP FF 정제 결과이다.
도 5는 H6Ub-TATm-hGH SP FF 정제 결과이다.
도 6은 H6Ub-TATm-hGH Ni FF 정제 결과이다.
도 7은 H6Ub-TATm-hGH SP FF 정제 결과이다 (1st).
도 8은 H6Ub-TATm-hGH SP FF 정제 결과이다 (2nd).
도 9는 H6Ub-TATm-hGH SP FF 정제 결과이다 (3rd).
도 10는 내포체(inclusion body) 형태로 발현된 불용성 H6Ub-TATm-EGF의 리폴딩(Refolding) 후, SP FF 및 Ni FF 정제 결과이다.
도 11은 내포체(inclusion body) 형태로 발현된 불용성 H6Ub-TATm-EGF 단백질의 높은 pH 조건에서의 리폴딩 및 정제 결과이다.
도 12는 내포체(inclusion body) 형태로 발현된 불용성 TATm-EGF의 정제 과정을 보여주는 흐름도이다.
도 13은 내포체(inclusion body) 형태로 발현된 불용성 TATm-EGF의 Q FF를 이용한 정제 결과이다.
도 14는 내포체(inclusion body) 형태로 발현된 불용성 TATm-EGF의 SP FF를 이용한 정제 결과이다.
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[
실시예
1: 야생형
TAT
또는 개량형
TAT
펩타이드가
각각 융합된
EGF
, Tβ4, hGH 발현용 재조합 균주 제작 및 발현 여부 확인]
(1) 재조합 균주 제작
본 발명에서는 EGF, Tβ4, hGH 단백질의 피부투과 효율 향상을 위해 단백질수송도메인(PTD)인 TAT 펩타이드를 EGF, Tβ4, hGH 단백질에 각각 결합(융합)시켜 발현시키고자 하였다. 이를 위해 EGF, Tβ4, hGH 각각의 유전자 시퀀스에 TAT 유전자 시퀀스를 오버랩 PCR 증폭 (MJ MiniTM from Bio-RAD, USA)을 이용하여 결합(융합)시켰다.
EGF( Bell GI, Fong NM, Stempien MM, Wormsted MA, Caput D, Ku LL, Urdea MS, Rall LB,Sanchez-Pescador R. Human epidermal growth factor precursor: cDNA sequence,expression in vitro and gene organization. Nucleic Acids Res. 1986 Nov11;14(21):8427-46.), Tβ4(Yang SP, Lee HJ, Su Y. Molecular cloning and structural characterization ofthe functional human thymosin beta4 gene. Mol Cell Biochem. 2005Apr;272(1-2):97-105.), hGH(Roskam WG, Rougeon F. Molecular cloning and nucleotide sequence of the humangrowth hormone structural gene. Nucleic Acids Res. 1979 Sep 25;7(2):305-20.)는 문헌을 참조하여 확보된 유전자 서열을 사용하였고, 일부 목적단백질에 대해서는 발현을 유도하기 위한 융합파트너로 H6Ub 단백질을 사용하기도 하였다. H6Ub 단백질은 히스티딘 6개 (H6)가 유비퀴틴(Ubiquitin) 단백질에 결합되어 있는 형태인데, 유비퀴틴은 목적단백질의 발현을 도와주는 발현유도체로 알려져 있는 단백질이다. 유비퀴틴은 정제공정 중 유비퀴틴 특이 프로테아제 (Ubiquitin Specific Protease, USP)에 의하여 절단되어 제거된다. 본 실험에 사용된 EGF, Tβ4, hGH의 아미노산 서열은 서열번호 3, 4, 5에 각각 기재하였다. 또한, 본 실험에서는 사카로마에이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래 유비퀴틴을 사용하였는데, 이를 서열번호 6에 기재하였다.
한편, 본 발명에서는 목적단백질의 세포투과성을 높여주기 위한 단백질수송도메인(PTD)으로 TAT를 선정하였는데, TAT는 야생형 시퀀스 (YGRKKRRQRRR) (서열번호 1)를 그대로 사용한 샘플군과, 개량형 시퀀스 (YGRKKRRRQRRR) (서열번호 2) -야생형 TAT에 'R'이 하나 더 추가됨-를 사용한 샘플군을 대비하여 사용하였다.
이상의 과정을 종합한 실험 샘플을 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1에서 1, 2, 3, 7은 개량형 TAT를 사용한 것('+ R protein' 표시는 'R'이 하나 더 추가된 개량형 TAT임을 의미함)이다. 이하에서는 야생형 TAT는 TAT로, 개량형 TAT는 TATm 또는 '+R'로 표시하기도 한다.
| Name | M.W. (Dalton) | A.A. | pI | |
| 1 | TAT-EGF(+ R protein) | 7920.0 | 65 | 9.02 |
| 2 | H6Ub-TAT-Tβ4 (+ R protein) | 15849.9 | 136 | 9.63 |
| 3 | H6Ub-TAT-hGH (+ R protein) | 33057.4 | 284 | 8.77 |
| 4 | TAT-EGF | 7763.8 | 64 | 8.83 |
| 5 | H6Ub-TAT-Tβ4 | 15693.7 | 135 | 9.52 |
| 6 | H6Ub-TAT-hGH | 32901.3 | 283 | 8.57 |
| 7 | H6Ub-TAT-EGF(+R protein) | 17150.45 | 146 | 8.91 |
상기 표 1과 같은 유전자 배열을 갖는 DNA 절편을 표 2에 기재된 프라이머를 이용하여 오버랩 PCR을 통해 얻고, 이를 pAPT (APTech's expression vector)에 삽입하여 발현벡터를 제조하였다.
| product | Primer |
| TAT-EGF (+ R protein) |
F-TAT-EGF : CGT AAA AAA CGT CGT CAG CGT CGT CGT AAT AGT GAC TCT GAA R-BamHI-EGF : CAG CCG GAT CCT CAG CGC AGT TCC CAC CAC |
| H6Ub-TAT-Tβ4 (+ R protein) | F-H6Ub-NdeI : AGA TAT ACA TAT GCA TCA TCA TCA TCA TCA TCA GAT TTT CGT CAA R-TAT : ACG ACG ACG CTG ACG ACG ACG TTT TTT ACG F-TAT-TB4 : CGT CAG CGT CGT CGT TCT GAC AAA CCC GAT R-Tb4-BamHI : TCA GCC GGA TCC TTA CGA TTC GCC TGC TTG |
| H6Ub-TAT-hGH (+ R protein) | F-H6Ub-NdeI : AGA TAT ACA TAT GCA TCA TCA TCA TCA TCA TCA GAT TTT CGT CAA R-TAT : ACG ACG ACG CTG ACG ACG ACG TTT TTT ACG F-TAT-hGH : CGT CAG CGT CGT CGT TTT CCA ACC ATT CCA R-hGH-BamHI : GTT AGC AGC CGG ATC CTT AAA AAC CAC AAG AAC CTT CAA CAG AAC G |
| TAT-EGF | F-TAT-NdeI : AGA TAT ACA TAT GTA CGG TCG TAA AAA ACG R-BamHI-EGF : CAG CCG GAT CCT CAG CGC AGT TCC CAC CAC |
| H6Ub-TAT-Tβ4 | F-H6Ub-NdeI : AGA TAT ACA TAT GCA TCA TCA TCA TCA TCA TCA GAT TTT CGT CAA R-TAT(ori) : ACG ACG ACG CTG ACG ACG TTT TTT ACG ACC GTA F-TAT-TB4 : CGT CAG CGT CGT CGT TCT GAC AAA CCC GAT R-Tb4-BamHI : TCA GCC GGA TCC TTA CGA TTC GCC TGC TTG |
| H6Ub-TAT-hGH | F-H6Ub-NdeI : AGA TAT ACA TAT GCA TCA TCA TCA TCA TCA TCA GAT TTT CGT CAA R-TAT(ori) : ACG ACG ACG CTG ACG ACG TTT TTT ACG ACC GTA F-TAT-hGH : CGT CAG CGT CGT CGT TTT CCA ACC ATT CCA R-hGH-BamHI : GTT AGC AGC CGG ATC CTT AAA AAC CAC AAG AAC CTT CAA CAG AAC G |
| H6Ub-TAT-EGF(+R protein) | R-TAT : ACG ACG ACG CTG ACG ACG ACG TTT TTT ACG F-TAT-EGF : CGT AAA AAA CGT CGT CAG CGT CGT CGT AAT AGT GAC TCT GAA F-H6Ub-NdeI: AGA TAT ACA TAT GCA TCA TCA TCA TCA TCA TCA GAT TTT CGT CAA R-BamHI-EGF : CAG CCG GAT CCT CAG CGC AGT TCC CAC CAC |
상기에서 제조된 발현벡터로 E. coli MC1061(F-Δ(ara-leu)7697 [araD139]B/r Δ(codB-lacI)3 galK16 galE15 λ- e14- mcrA0 relA1 rpsL150(strR) spoT1 mcrB1 hsdR2(r-m+))를 형질전환하고, 해당 DNA가 잘 삽입되었는지를 확인한 후, 유전자의 염기서열을 분석하였다 (cosmogenetech, Korea).
유전자 분석결과, 예측대로 각각의 유전자가 표 1과 같이 잘 삽입된 것을 확인할 수 있었다.
(2)
융합단백질의
발현 확인
E. coli BL21(DE3)(F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]))와 E. coli TG1(F' [traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]supE thi-1 Δ(lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5, (rK-mK-))를 상기에서 구축한 벡터로 각각 형질전환하였다. 다만, 하기 실험에서는 두 종의 형질전환체 중 재조합 E. coli TG1 균주로부터의 목적단백질 발현 여부를 확인하였다.
발현의 확인을 위한 배지로는 LB 배지 (Luria Bertani Broth (Tryptone 0.1%, Yeast extract 0.05%, NaCl 0.1%: all from Duksan, Korea)를 이용하였으며, 선택마커로는 항생제인 카나마이신(100 ㎍/ml)을 사용하였다. 발현된 단백질을 분석하기 위하여 4~12% 그래디언트 겔 (gradient gel, KOMA Biotech, Korea)을 이용하였다.
실험결과는 도 1에 나타냈다. 표 1의 샘플 중 EGF 샘플(1번, 4번 샘플)은 야생형 TAT 펩타이드 또는 개량형 TATm 펩타이드가 융합된 경우, 모두 불용성의 내포체(inclusion body) 형태로 발현이 되었다. 다만, 밴드 굵기 측정을 통한 발현량의 비교 결과, 개량형 TATm 펩타이드가 융합된 경우가 야생형 TAT가 융합된 경우에 비해 발현량이 증가하였음을 알 수 있었다. EGF 단백질의 총 발현량은 개량형 TATm 펩타이드가 융합된 경우가 야생형 TAT 펩타이드가 융합된 경우에 비해 4% 정도 증가하였고, 내포체 형태로 발현된 양은 개량형 TATm 펩타이드가 융합된 경우가 야생형 TAT 펩타이드가 융합된 경우에 비해 23% 정도 증가하였다.
한편, 표 1의 샘플 중 Tβ4 샘플(2번, 5번 샘플)은, 야생형 TAT 펩타이드가 융합된 경우 많이 발현되지 않았으나, 개량형 TATm 펩타이드가 융합된 경우 대량 발현됨을 확인할 수 있었다. 이때, 발현된 단백질은 거의 모두 수용성 형태로 발현됨을 확인할 수 있었다. 밴드 굵기 측정을 통한 발현량의 비교 결과, 개량형 TATm 펩타이드가 융합된 경우가 야생형 TAT가 융합된 경우에 비해 발현량이 증가하였음을 알 수 있었다. Tβ4 단백질의 총 발현량은 개량형 TATm 펩타이드가 융합된 경우가 야생형 TAT 펩타이드가 융합된 경우에 비해 86% 정도 증가하였고, 수용성 형태로 발현된 양은 개량형 TATm 펩타이드가 융합된 경우가 야생형 TAT 펩타이드가 융합된 경우에 비해 94% 정도 증가하였다.
한편, 표 1의 샘플 중 hGH 샘플(3번, 6번 샘플)은, 야생형 TAT 펩타이드가 융합된 경우와 개량형 TATm 펩타이드가 융합된 경우 모두 발현됨을 확인할 수 있었다. 이때, 발현된 단백질은 수용성 형태 및 불용성 내포체로 모두 발현됨을 확인할 수 있었다. 밴드 굵기 측정을 통한 발현량의 비교 결과, 개량형 TATm 펩타이드가 융합된 경우가 야생형 TAT가 융합된 경우에 비해 발현량이 증가하였음을 알 수 있었다. hGH 단백질의 총 발현량은 개량형 TATm 펩타이드가 융합된 경우가 야생형 TAT 펩타이드가 융합된 경우에 비해 32% 정도 증가하였고, 수용성 형태로 발현된 양은 개량형 TATm 펩타이드가 융합된 경우와 야생형 TAT 펩타이드가 융합된 경우 사이에 거의 차이가 없었다. 다만, 내포체 형태로 발현된 양은 개량형 TATm 펩타이드가 융합된 경우가 야생형 TAT 펩타이드가 융합된 경우 비해 12% 정도 증가하였다.
[
실시예
2:
유가식
(
Fed
-
Batch
) 배양을 통한 대량 생산]
상기의 융합단백질에 대해 고농도 배양 가능성을 확인하기 위하여 유가식 배양 수행하였다. 상기 실시예 1에서 구축한 재조합 E. coli TG1(F' [traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]supE thi-1 Δ(lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5, (rK-mK-)) 균주 각각을 호스트 균주로 사용하여 유가식 배양을 수행하였다. 발효에 사용된 배지 조성은 하기 표 3과 같았고, 피딩액(Feeding media) 조성은 하기 표 4와 같았다.
H6Ub-TATm-Tβ4, H6Ub-TATm-hGH 생산은 5L jar 발효기를 이용하였고, H6Ub-TATm-Tβ4 단백질은 O.D.660 nm 60 내외에서 1mM IPTG 농도로 융합단백질의 발현을 유도하였으며, H6Ub-TATm-hGH는 O.D.660 nm 30 내외에서 발현을 유도하여 4~5시간 후에 배양을 종료하였다. 실험결과는 도 2와 같이 나타났는데, 유가식 배양을 통해서도 융합단백질이 잘 발현됨을 확인할 수 있었다.
[
실시예
3: 수용성 형태로 발현되는
H6Ub
-
TAT
m
-Tβ4 및
H6Ub
-
TAT
m
-
hGH
의
분리 및 정제]
1)
H6Ub
-
TAT
m
-Tβ4 단백질의 분리 및 정제
상기 실험을 통해 H6Ub-TATm-Tβ4 및 H6Ub-TATm-hGH가 수용성 형태로 발현됨을 확인할 수 있었다. 수용성 형태의 발현은 활성형 상태로 발현될 수 있기 때문에 단백질의 기능 발휘 측면에서는 바람직하나, 세포 내 다른 수용성 단백질로부터 분리하고 정제해야 하는 과정을 수반하는 번거로움이 있다. 하기에서는 이들 융합단백질의 분리, 정제에 관한 실험을 수행하였다.
상기 실시예 2에서 유가식 배양으로 발현된 H6Ub-TATm-Tβ4 단백질의 분리, 정제를 위하여 12g 의 균체(wet cell)를 60ml 라이시스 버퍼 (Lysis buffer, 30mM Sodium phosphate, 0.5% Triton X-100, 0.1M NaCl, 5mM EDTA, pH 7.0)에 현탁하였다.
현탁액에 소니케이터(SONOSMASHER from UL SSO HI-TECH, Korea)를 처리하여 균체를 파쇄한 후, 원심분리하여 (9,000rpm, 50 min., Mega21R from Hanil, KOREA), 수용성 세포추출액인 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액을 'Sepharose Fast Flow resin (SP-FF, GE, Sweden)' 컬럼에 주입한 후, UV값이 평형화될 때가지 'A buffer'를 흘려주고, 0~60%의 'B buffer'를 사용하여 용출한 후, SDS-PAGE로 분석하였다.
<정제 조건>
- Column : SP Sepharose FF, 10ml (HiTrap)
- Loading sample: 셀 파쇄후 상등액, 60ml
- A Buffer : 30mM NaPi, pH 7.6
B Buffer : 30mM NaPi, 1M NaCl, pH 7.6
- Grandient Elution : 0~60%B, 6CV
- Elution Fraction : F4, 40ml (Conductivity 52ms/cm)
실험결과, 0.5~6M NaCl에서 H6Ub-TATm-Tβ4 단백질과 불순 단백질이 용출됨을 확인하였다 (도 3).
한편, 목적단백질의 순도 개선을 위하여 SP FF 컬럼에서 용출받은 fraction 4를 UBP로 자른 후, Ni FF을 이용하여 TATm-Tβ4 단백질을 'flow through' 방법으로 회수하였다. 이후, SP FF를 이용하여 추가적인 정제를 수행한 후 SDS-PAGE로 확인하였다.
<정제 조건>
- Column : SP Sepharose FF
- Loading sample: Ni FF sample, 30ml + A buffer 30 ml
- A Buffer : 30mM NaPi, pH 7.6
B Buffer : 30mM NaPi, 1M NaCl, pH 7.6
- Wash : 0~60%B 12CV, and then 70%B buffer
- Grandient Elution : 100%B
- Elution Fraction : F3, 7.5ml, 0.3mg/ml: 2.3mg
실험결과, 순도 높은 TATm-Tβ4 단백질을 회수할 수 있었으며, TATm-Tβ4 단백질은 0.2 mg / g (wet cell) 의 생산성을 나타냈다 (도 4).
2)
H6Ub
-
TAT
m
-
hGH
단백질의 분리, 정제
① H6Ub - TAT m - hGH 의 1차 분리, 정제 실험
상기 실시예 2에서 유가식 배양으로 발현된 H6Ub-TATm-hGH 단백질의 분리, 정제를 위하여 12g의 균체(wet cell)를 60ml 라이시스 (30mM Sodium phosphate, 0.5% Triton X-100, 0.1M NaCl, 5mM EDTA, pH 7.0)에 현탁하였다. 현탁액에 소니케이터(SONOSMASHER from UL SSO HI-TECH, Korea)를 가하여 균체를 파쇄한 후, 원심분리하여 (9,000rpm, 50 min., Mega21R from Hanil, KOREA), 수용성 세포추출액인 상등액을 회수하였다.
회수한 상등액을 'Sepharose Fast Flow resin (SP-FF, GE, Sweden)' 컬럼에 주입한 후, UV값이 평형화될 때까지 'A buffer'를 흘려주고, NaCl로 용출하여 SDS-PAGE로 분석하였다.
<정제 조건>
- Column : SP Sepharose FF, 10ml
- Loading sample: 셀 파쇄 후, 상등액
- A Buffer : 30mM NaPi, pH 7.6
B Buffer : 30mM NaPi, 1M NaCl, pH 7.6
- Grandient Elution : 0~50%B, 6CV
- Elution Fraction : F4, 25ml
분석 결과, 1M NaCl에서 H6Ub-TATm-hGH 단백질이 일부의 불순 단백질과 함께 용출됨을 확인하였다 (도 5).
한편, SP FF에서 용출된 H6Ub-TATm-hGH에 UBP을 처리하여 절단 유무를 확인하고, 절단이 확인된 샘플을 Ni FF에 결합시켜 이미다졸(imidazole)로 용출하고, SDS-PAGE로 분석하였다.
<정제 조건>
- Column : Ni2 + SP Sepharose FF
- Loading sample: SP FF elution F4 + UBP 1mg + A buffer 15ml
- A Buffer : 20mM Tris, pH 7.5
B Buffer : 20mM Tris, 0.5M Imidazole, pH 7.3
- Grandient Elution : 0~50%B & 100%B
분석결과, TATm-hGH 단백질은 모두 컬럼에 흡착되어 용출되지 않음을 확인하였다 (도 6).
②
H6Ub
-
TAT
m
-
hGH
의 2차 분리 정제 실험
상기에서 TATm-hGH 융합단백질이 Ni FF 레진에 흡착되어 용출되지 않았으므로, pH를 높여 실험을 진행하고자 하였다. 우선 1차 정제 실험과 동일하게 균체를 파쇄한 후, 컬럼 내 pH 조건만 pH 8로 높여 SP FF 컬럼을 진행한 후 SDS-PAGE로 확인하였다. 확인결과, 0.5M NaCl 이상에서 H6Ub-TATm-hGH 단백질이 용출됨을 확인하였다 (도 7).
한편, 용출된 H6Ub-TATm-hGH 단백질의 다음 정제를 위하여, UBP로 절단하였으나, 단백질이 뭉치는 현상이 일어났다. 이는 단백질의 이론적 PI 값인 8.6 내외에서의 정제공정은 단백질 안정성에 문제를 발생할 수 있음을 의미하는 것으로 해석할 수 있었다.
③ H6Ub - TAT m - hGH 의 3차 분리정제 실험
1차, 2차 정제 실험에서 'Ni FF에서의 흡착 문제' 및 'pH8 조건에서 UBP 절단 후 단백질의 뭉침 문제'가 나타나, Ni FF 컬럼 운용을 배제하고, UBP 절단 pH를 pH 7 조건에서 진행한 후, 정제를 시도하였다.
<정제 조건>
- Column : SP Sepharose FF, 10ml (HiTrap)
- Loading sample: 셀 파쇄후 상등액
- A Buffer : 30mM NaPi, pH 7.6
B Buffer : 30mM NaPi, 1M NaCl, pH 7.6
- Method
1. Column Equilibration (A buffer)
2. Loading (loding sample 80ml)
3. Column Wash (0~40%B)
4. Elution : 55%B
- Elution Fraction : F4, 46ml
SDS-PAGE 확인 결과, 55%B NaCl에서 H6Ub-TATm-hGH 단백질이 용출되는 것을 확인하였다(도 8). 이후, 1차 SP FF에서 용출된 H6Ub-TATm-hGH에 절단효소인 UBP을 처리하여 융합단백질의 절단을 진행하였고, 절단 단백질은 SP FF 컬럼을 사용하여 정제를 시도하였다.
<정제 조건>
- Column : SP Sepharose FF, 10ml (HiTrap)
- Loading sample: 1st SP FF elution + A buffer(pH6.1) + 0.6mg UBP
- A Buffer : 30mM NaPi, pH 7.6
B Buffer : 30mM NaPi, 1M NaCl, pH 7.6
- Method
1. Column Equilibration (A buffer)
2. Loading (loding sample 80ml)
3. Column Wash (40%B)
4. Elution : 40~80%B, 100%B
- Elution Fraction : F4, 10.5ml, 0.33g/L: 3.5mg
UBP 절단 후 SP FF 정제결과, 불순물 단백질은 40~80% NaCl에서 용출되었고, TATm-hGH 목적단백질은 1M NaCl에서 높은 순도로 융출되었다. 이때, TATm-hGH 단백질은 0.2mg / g (wet cell)의 생산성을 보였다 (도 9).
[
실시예
4: 불용성
내포체
형태로 발현되는
TAT
m
-
EGF
의 리폴딩(
refolding
)]
(1)
TAT
m
-
EGF
리폴딩
실험의 개요
도 2에서 보는 바와 같이, TATm-EGF는 불용성의 내포체 형태로 발현되기 때문에 분리 정제는 수용성 형태로 발현되는 경우에 비해 용이하다. 다만, 불용성 내포체 단백질은 활성을 나타내지 않기 때문에, 언폴딩(unfolding) 및 리폴딩(refolding) 과정을 수행해 활성 형태로 바꿔 주어야 한다. 하기에서는 이에 관한 실험을 수행하였다.
(2)
H6Ub
-
TAT
m
-
EGF
융합단백질의
리폴딩
우선, 본 실험에서는 유비퀴틴이 붙은 H6Ub-TATm-EGF 융합단백질에 대해 리폴딩 실험 조건을 탐구해 보았다. 언폴딩 및 리폴딩(Unfolding & refolding) 조건을 하기 표 5 내지 7과 같이 다양한 조건에서 수행하여 적합한 리폴딩 조건을 탐색하였다.
리폴딩 샘플을 각각 컬럼에 결합시켜 용출버퍼(elution buffer)로 용출을 시도하였다. 그런데, 대다수의 융합단백질이 용출되지 않고, 컬럼 내 흡착되었으며, 융합단백질은 NaOH에서 용출되었다. 이때, 융합단백질은 UBP 절단도 이루어지지 않았다. 이와 같은 현상은 리폴딩이 제대로 이루어 지지 않아, 구조적으로 적합하지 않은 형태로 존재하였기 때문에 발생한 것으로 판단되었다 (도 10).
따라서, 언폴딩 및 리폴딩의 pH를 보다 높게 조정하여 추가 실험을 진행하였다. pH 12에서 언폴딩 및 리폴딩을 수행한 후, 음이온 교환 크로마토그래피 (Anion exchange chromatography)를 진행한 결과, 융합단백질이 용출되는 것을 확인하였다. 이후, UBP 절단을 하고, 양이온 교환 크로마트그래피 (Cation exchange chromatography)를 진행하였다.
그 결과, TATm-EGF 융합단백질이 1M NaCl에서 용출되어짐을 확인하였다 (도 11). 다만, 확인된 단백질은 SDS-PAGE에서 순도가 높지 않았으며, 용출되는 단백질 또한 매우 낮은 수율을 나타내었다.
(3)
TAT
m
-
EGF
단백질의 리폴딩
상기 실험에서 H6Ub-TATm-EGF 형태의 융합단백질 발현을 통한 TATm-EGF의 리폴딩이 적합하지 않다고 판단되어, 유비퀴틴이 융합되지 않은 TATm-EGF 단백질에 대한 언폴딩 및 리폴딩을 진행하고, 이온 크로마토그래피 (ion chromatography)를 이용하여 단백질을 분리, 정제하였다 (도 12 참조). 이때, Q sepharose FF와 SP sepharose FF를 이용하였으며, 조건은 하기와 같았다.
<Q sepharose FF 조건>
- Buffer composition ; Equilibrium buffer (A1) : 20mM Tris, pH 10.2
; Elution Buffer (B1) : 20mM Tris, 1M NaCl, pH 10.2
- sample Loading ; Refolding sample
- Elution condition ; 0~100%, Q-B buffer, 10CV, gradient
<SP sepharose FF 조건>
- Buffer composition ; Equilibrium buffer (A) : 30mM Tris, NaPi, pH 7.2
; Elution Buffer (B): 30mM NaPi, 1M NaCl, pH7.2
- sample Loading; QFF elution sample/ A buffer-> 1:1 mixture
- Elution condition ; 0~100%, SP-B buffer, 10CV, gradient
실험결과, Q FF를 사용 0~100%, Q-B, 10CV, gradient 조건으로 20%(B)에서, 불순물이 다소 포함된 TATm-EGF를 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 13). 그런데, 추가공정으로 SP FF를 사용 0~100%, SP-B, 10CV, gradient 조건으로 50%(B)에서, 순도 높은 TATm-EGF 단백질을 회수할 수 있었다(도 14). 이때, TATm-EGF 단백질은 0.6 mg / g (wet cell)의 생산성으로 생산되었음을 확인하였다.
<110> UNION KOREA PHARM CO.,LTD.
<120> Method for production of EGF, thymosinbeta4, hGH fused with
advanced TAT peptide and cosmetic composition thereof
<130> AP-2014-0279
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> HIV virus
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> advanced TAT peptide
<400> 2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 53
<212> PRT
<213> Homo sapiens sapiens
<400> 3
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<210> 4
<211> 43
<212> PRT
<213> Homo sapiens sapiens
<400> 4
Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys
1 5 10 15
Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu
20 25 30
Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser
35 40
<210> 5
<211> 191
<212> PRT
<213> Homo sapiens sapiens
<400> 5
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
<210> 6
<211> 75
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 6
Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val
1 5 10 15
Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ser Lys Ile Gln Asp Lys
20 25 30
Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln
35 40 45
Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser
50 55 60
Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
65 70 75
Claims (15)
- 삭제
- 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 티모신β4(Thymosinβ4, Tβ4)에 융합된 것을 특징으로 하는 개량형 TAT 펩타이드 융합 티모신β4 단백질.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 티모신β4(Thymosinβ4, Tβ4)에 융합되어 형성된 개량형 TAT 펩타이드 융합 Tβ4 단백질을 암화화하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계 (a);
상기의 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 대장균을 형질전환시킴으로써 재조합 대장균을 제조하는 단계 (b);
상기 재조합 대장균을 배양한 후, 재조합 대장균 균체 또는 그 배양액으로부터 개량형 TAT 펩타이드 융합 Tβ4 단백질을 분리하는 단계 (c); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 개량형 TAT 펩타이드 융합 Tβ4 단백질의 생산방법.
- 유비퀴틴 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 개량형 TAT 펩타이드가 티모신β4(Thymosinβ4, Tβ4)에 융합되어 형성된 유비퀴틴 및 개량형 TAT 펩타이드 융합 Tβ4 단백질을 암화화하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계 (a);
상기의 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 대장균을 형질전환시킴으로써 재조합 대장균을 제조하는 단계 (b);
상기 재조합 대장균을 배양한 후, 재조합 대장균 균체 또는 그 배양액으로부터 유비퀴틴 및 개량형 TAT 펩타이드 융합 Tβ4 단백질을 분리하는 단계 (c);
상기에서 분리한 유비퀴틴 및 개량형 TAT 펩타이드 융합 Tβ4 단백질로부터 유비퀴틴을 제거하는 단계 (d);를 포함하는 것을 특징으로 하는 개량형 TAT 펩타이드 융합 Tβ4 단백질의 생산방법.
- 삭제
- 삭제
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| KR1020150031153A KR101666934B1 (ko) | 2015-03-05 | 2015-03-05 | 개량형 TAT 펩타이드가 융합된 EGF, 티모신β4, hGH 단백질의 생산방법 및 이들 단백질을 포함하는 화장료 조성물 |
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|---|---|---|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030229034A1 (en) | 2000-07-21 | 2003-12-11 | Essentia Biosystems, Inc. | Multi-component biological transport systems |
| KR100789342B1 (ko) | 2001-07-20 | 2007-12-28 | 주식회사 엘지생활건강 | Ｔａｔ 펩타이드가 결합된 레티놀 유도체 및 이를포함하는 피부노화 방지용 화장료 조성물 |
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (2)
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| Title |
|---|
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Also Published As
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