JPH04144684A - エンドセリン受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、哺乳類の血管収縮因子の受容体、さらに詳し
くはエンドセリン受容体に関する。

［発明の背景］ エンドセリンは、２１個のアミノ酸からなる強力なペプ
チド性血管収縮因子である。

エンドセリンは、冠動脈、肺動脈等の種々の動脈を収縮
させる作用を有する。その冠動脈収縮のＥＣｓ、は、４
ｘｌＯ−”Ｍ程度で、極めて強力かつ持続性がある。ま
た、エンドセリンは、内皮細胞において多くの神経ペプ
チドやペプチドホルモンと同様の様式でｄｅ　ｎｏｖａ
合成されることも判明している。このような特徴から、
エンドセリンは噴孔類のこれまで知られていなかった循
環調節系を構成する内因性因子と考えられるに至った。

例えば、高血圧症においては、エンドセリンの放出量が
多いこと、あるいはエンドセリン感受性が高いことがそ
の一因であることが予想される。逆に、低血圧症では、
エンドセリンの放出量が少ないこと、あるいはエンドセ
リン感受性の低下かその一因であることが予想される。

最近、ブタの大動脈内皮細胞の培養においてエンドセリ
ンが単離、精製され、下記の構造か決定されテレ）る（
Ｍ、　Ｙａｎａ、ｇｉｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａ
ｔｕｒｅ。

３３２、４１１　＜１９８８）　）。

Ａｓｐ−１１ｅ−１１ｅ−Ｔｒｐ また、ヒトのエンドセリンも同じアミノ酸配列を有する
ことか明らかとなった（Ｙ、　Ｉｔｏｈ　ｅｔａｔ、、
　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ−、２３１，４４０（１９８８）
　）。

さらに、エンドセリンについて３種のイソペプチドの存
在が明らかとなった。すなわち、上記のアミノ酸配列を
有するエンドセリン（エンドセリン−１）に加えて、エ
ンドセリン−２（ＴｒｐＦ′Ｌｅｕ’）およびエンドセ
リ：／−３（Ｔｈｒ２．　Ｐｈｅ’Ｔｈｒ５．　Ｔｙｒ
’、　Ｌｙｓ’、　Ｔｙｒ”　）が存在することが報告
されている（Ａ、　Ｉｎｏｕｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υＳＡ、　８６．２８６３　（＋
９８９＞　）。

また、へび毒としてサラフォトキシン−５６ｂなどが知
られており（Ｃ，Ｔａｋａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｔｏｘｉｃｏｎ　２６．５４３（１９８８）　）　、　
ｘンドセリントソノ構造がきわめてよく似ており、これ
らもエンドセリン類の物質と考えられる。

これらのエンドセリンのイソペプチドは細胞膜上の特異
的受容体を介して作用を発現することか知られている。

哺乳類エンドセリン受容体には、エンドセリンイソペプ
チドに対して異なる親和性序列（ｐｏｔｅｎｃｙ　ｒａ
ｎｋ　ｏｒｄｅｒ）を示す、少なくとも２種類のサブタ
イプの存在することが知られている（Ａ、　Ｉｎｏｕｅ
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　８６．２８６３（＋９８９）、　Ｔ、Ｄ、　
Ｗａｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　１５９．３２
５（１９８９））。

しかし、エンドセリン受容体の構造、すなわちアミノ酸
配列は解明されていなかった。

［発明の要旨］ 本発明の目的は、エンドセリンの受容体の構造を解明し
、これによりエンドセリンの受容体をコードするＤＮＡ
配列を提供することである。

また、本発明の目的は、エンドセリン受容体またはその
類似体を生産する方法を提供することでもある。

さらに、本発明の目的は、エンドセリン受容体またはそ
の類似体を含むタンパク質組成物を提供することでもあ
る。

本発明者等の研究により、エンドセリン受容体の構造が
明らかとなった。エンドセリン受容体は、下記のアミノ
酸配列を有している。

Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−＾１ａＬｅｕ−Ｖａｌ
−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＶａＩ−Ｔｒｐ−Ｇ
ｌｙ−ＧＩｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｒ。

ＡＩａ−ＧＩｎ−ＡＩａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−ＧＩｙ−Ｔｈｒ−ＬｙｓＧｌｕ−Ｖａｌ
−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−
Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＧＩｙ−３
ｅｒ−Ａｓｎ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒ
ｇ−ＰｈｅＡｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ
−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−
Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ＰｈｅＬｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓ
ｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ
−ＶａＩ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−
１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓ
ｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｎｅｔ−ＡｒｇＡｓｎ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−３
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−１１ｅ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ
−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＧＩｙ−ＡｓｐＴｒ
ｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ
−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−ＡＩａ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−ｒｌｅ−Ｔ’ｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｃｙｓ−ＡＩａ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−１１ｅ−Ａｓ
ｐ−ＡｒｇＴｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−
３ｅｒ−Ｔｒｐ−３ｅｒ−Ａｒｇ−丁１ｅ−ＬｙｓＧｌ
ｙ−Ｉｌｅ−ＧＩｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ
−Ｔｈｒ−Ａｌａ−ＶａｉＧｌｕＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｖａｌ
−ＶａｌＬｅｕＡｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＡＩ
ａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−Ｉｌ
ｅ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−ＶａｉＣｙｓ−Ｍ
ｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙ
ｓ−Ｔｈｒ−＾１ａ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ
−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−＾１ａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−＾１
ａ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ
−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｎｅｔ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−
Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｎ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａ　ｌ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−
Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ｔｙｒ−＾ｓｐ−Ｇｌｎ−Ｓ６ｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−
ＧＩｎ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓ
ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｎｅｔ
−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−
１１ｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−１１ｅ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−３ｅｒ
−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｎ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−
Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａ
ｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ｓｅｒ 本発明は、哺乳類のエンドセリン受容体をコトする領域
から実質的になるＤＮＡ配列を提供するものである。

上記ＤＮＡ配列は、天然の哺乳類のエンドセリン受容体
遺伝子のオーブンリーティングフレームに由来するｃＤ
ＮＡクローンであってもよい。また、上記ＤＮＡ配列は
、上記ｃＤＮＡクローンとパイプリダイズできて、かつ
生物学的活性を有する哺乳類のエンドセリン受容体をコ
ードしているＤＮＡ配列であってもよい。さらに、以上
述べたようなりＮＡ配列について、遺伝暗号の縮重の結
果として、同じエンドセリン受容体をコードしているＤ
ＮＡ配列であってもよい。

本発明か提供するＤＮＡ配列は発現ベクターに組込んで
用いることができる。これにより、本発明は、この組換
え発現ベクターを宿主細胞に挿入し、宿主細胞を発現を
引き起こす条件下で培養することからなる哺乳類のエン
ドセリン受容体またはその類似体を生産する方法も提供
する。

さらに、本発明は、以上のように生産された生物学的活
性を有する哺乳類のエンドセリン受容体またはその類似
体を含むタンパク質組成物も提供する。

このように生産された、哺乳類のエンドセリン受容体、
その類似体およびそれらを含むタンパク質組成物は、哺
乳類のエンドセリンのアッセイに有用であり、また診断
で用いるエンドセリン受容体に対する抗体を調製する上
でも有用である。

また、この薬剤が高血圧症あるいは低血圧症等の疾患の
診断に有効であることは、前述したエンドセリンおよび
その受容体の生物学的活性から明らかである。

［発明の詳細な記述］ 本明細書において、「エンドセリン受容体」とは、エン
ドセリン分子に結合することができ、哺乳類の細胞膜タ
ンパク質と同様な本来の立体配置をとる際に、エンドセ
リン分子によって与えられる情報を細胞内に伝達する役
割を持っているタンパク質を意味する。本明細書におい
て用いる場合、この用語は、エンドセリン分子に結合す
るか、あるいは情報伝達活性を有する天然タンパク質の
類似物を含んでいる。

「エンドセリン受容体のサブタイプ」とは、エンドセリ
ン受容体のうちでエンドセリンあるいはサラフォトキシ
ンの各イソペプチドに対して、異なる選択性、すなわち
薬理学的親和性序列を示す各々の分子をいう。

本明細書において、ＤＮＡ配列等において用いられる「
コードする領域から実質的になる配列」等におけるｒ実
質的に１の表現は、特定の対象となる配列、例えば変位
配列で、本来の参照配列の１つ以上の置換、欠失あるい
は付加によって変化したものであって、その全体として
の作用が、参照配列と比較して不利な機能的相違をもた
らさない配列も含むとの主旨で用いられる。具体的には
、本発明の目的から、３０％以上の相似性のあるような
類似した配列を含む。なお、この相似性は、５０％以上
であることが好ましく、８０％以上であることがさらに
好ましい。類似性を決定する目的においては、参照配列
の短縮あるいは内在的欠失は兼視して良、い。配列の相
似性が低い場合でも、同程度の生物学的活性を存し、同
等の発現特性を有する配列は、実質的に同等な配列とみ
なす。

「生物学的に活性を有する」という用語は、エンドセリ
ン受容体の特性として用いられる場合、特定の分子が、
エンドセリンを結合可能であることが明らかにされてい
る本発明の態様と充分なアミノ酸配列の類似性を有する
か、あるいは混成受容体構成物の構成要素として細胞に
エンドセリンの刺激を伝達するために充分なアミノ酸配
列の類似性をエンドセリン受容体に対して有しているこ
とを意味する。具体的には、特定の分子のエンドセリン
−１，２あるいは３に対する親和性（解離定数）が１マ
イクロモル以下であることを意味する。本発明において
は、その親和性か０，１マイクロモル以下であることが
好ましく、０．０１マイクロモル以下であることがさら
に好ましい。

あるいは、エンドセリンの結合に際して、細胞質内カル
シウムイオン濃度を上昇させるに充分なイノシトール−
１，４，５−３リン酸の産生を促すことができることを
意味する。

ｒＤＮＡ配列」は、大きなりＮＡ構成物から分離した断
片あるいは構成要素として存在するＤＮＡポリマーを示
しており、それらは少なくとも一度は実質的に純粋な形
に単離されたＤＮＡを起源とする。すなわち、内在性物
質の混入がない形で単離され、かつ同定、操作及び標準
的な生化学的方法、例えば、クローニングベクターを用
いて、配列及びその構成要素である塩基配列が回収可能
な程度の量あるいは濃度で存在する。こうした配列は、
真核細胞遺伝子に典型的な内在性非翻訳配列（イントロ
ン）によって中断されていないオープンリーディングフ
レームを持つ形で供給されることが好ましい。しかし、
関連した配列を含んだ染色体ＤＮＡも用いられることは
明らかである。

非翻訳ＤＮＡは、オープンリーディングフレームの５°
あるいは３°にあり、その場合、非翻訳配列はコード領
域の操作あるいは発現の妨げとはならない。

［組換え発現ベクター」は、（ａ）遺伝子発現における
調節の役割を持つ要素、例えばプロモーターあるいはエ
ンハンサ−のような単独または複数の遺伝的要素、（ｂ
）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造あ
るいはコード配列、及び（Ｃ）適当な転写および翻訳開
始および終止配列の集合を含む転写等位からなるプラス
ミドを示す。酵母の発現系で用いるための構造要素は、
翻訳されたタンパク質が宿主細胞によって細胞外に分泌
されるためのリーダー配列を含んでいることが好ましい
。組換え体タンパク質がリーダーあるいは輸送配列を持
たずに発現された場合、そのタンパク質はＮ−末端にメ
チオニン残基を含んでいる可能性がある。続いて、その
残基は発現された組換えタンパク質から随意に切断され
、最終産物を与える。

次に、エンドセリン受容体をコードするｃＤＮＡの単離
、およびＤＮＡ配列の決定について説明する。

ラット肺から単離したＰｏ１ｙ　（Ａ）”　ＲＮ　Ａの
逆転写によって調製されたｃＤＮＡライブラリーから、
ラットエンドセリン受容体をコードするＤＮＡ配列か単
離された。このライブラリーは、ＳＶ４０、ポリオーマ
ウィルス、およびサイトメガロウィルス由来の調節配列
を持った哨乳類発現ベクター（ｐＣＤＭ８）を用いて、
サルのＣ０Ｓ７細胞に蓄積されたＤＮＡ断片よりｍＲＮ
Ａを直接発現させることによフてスクリーニングした。

生物学的に活性なエンドセリン受容体を発現している細
胞は形質導入されたＣＯ５−７細胞を［”５ｒ　−Ｔ　
ｙ　ｒ　１３］　エンドセリン−１を含む培地とともに
インキュベートし、結合しなかった標識エンドセリン−
１を除くために洗浄し、そしてその細胞単層をエンドセ
リン−１との結合を検出するためにＸ−線フイルムと接
触させることによって同定された。このようにして検出
された形質導入体は、フィルム上に黒い点として見るこ
とかできる。

この方法を用いることにより、一つの形質導入体のプー
ルについてのア・ンセイがエンドセリン−１結合を示す
黒い点を検出するまでに、約２０．０００個のｃＤＮＡ
が約４０プール中てスクリーニングされた。この陽性の
プール由来の細菌の凍結保存品を培養液中で増殖させ、
寒天培地上で単コロニーを作らせ、これについて、検出
可能なエンドセリン−１結合活性を持った表面タンパク
質を合成させることかできる一つのクローンか同定され
るまでスクリーニングを行なった。このクローンは単離
され、ラットのエンドセリン受容体のｃＤＮＡ配列を決
定するために挿入断片の配列が調べられた。

単離されたｃＤＮＡクローンをＣＯ５−７細胞に導入し
発現させたところ、この細胞はエンドセリン−１、−２
、−３およびサラフォトキシンＳ６ｂ、Ｓ６ｃに対する
特異的結合活性を獲得し、エンドセリンの刺激は、イノ
シトール−１゜４．５−３リン酸の産生および細胞質内
カルシウム濃度の上昇という形で細胞内へ伝達された。

さらにこの時、この細胞はエンドセリン−１とエンドセ
リン−３に対してほぼ等しい親和性、′１−なわちエン
ドセリン−１とエンドセリン−３に対する差か１０倍以
内である親和性を示した。従って、このｃＤＮＡはこれ
までに予測されているエンドセリン受容体サブタイプの
うち、エンドセリン−１とエンドセリン−３に関して非
選択性のサブタイプをコードしていると考えられる。

以上のように決定されたエンドセリン受容体をコードす
るＤＮＡ配列および相当するアミノ酸配列を以下にボす
。

以下余白 ２０２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ＴＴＧＧＣＧＣＧＣ＾＾＾ＣＴ丁ＡＡＣＴ丁
＾−１５７Ｃ丁ＧＴＴＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＴｋＧＡＧ
ＡＣ＾＾ＣＣＣＧＧＣＴＡＧＧＣ，ＴＧＡＧＴＧＴ丁Ｔ
Ｔ１＋２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＾
ＧＣＴＧＡＣＴｋＡＡＧ丁ＡＣＣＣＴＣＴＣｎＣｋＴＴ
Ｃ−６７ＡＣＣＧＩＩ；ＡＣＴ ６８Ｇτ＾ ＶａＩＴｒｐＧｌｙＣ１ｕＬｙｓＡｒｇＧＩｙＰｈ＠Ｐ
ｒｏＰｒｏＡｌａＧｌｎＡｌａＴｈｒＰｒ。

１＋３　ＴＣＴＣＴＴＣＴＣＣＧＧＡＣτＡＡＡＧＡＡ
ＧＴＴＡＴＣＡＣＩＩ；ＣＣＡＣＣＣＡＣＴ＾＾ＧｋＣ
Ｃ３ｔｒＬ＠ｕＬｔｕＧｌｙＴｈｒＬｙｓＧｌｕＶａ１
ＭｅｔＴｈｒＰｒｏＰｒｏ丁ｈ（ＬｙｓＴｈｒ１５８　
　ＴＣＣＴＧＧＡＣＴ　　　　　　　、　　　　　　　
　　　　　　　　　　丁ＧＣＣ，ＴＴＴＣＣＧＣＡＣ丁
５ａｒＴｒｐＴｈｒ＾ｒｇＧｌｙＳ＊ｒＡｓｎＳｅｒＳ
＠ｒＬｅｕＭｅ＋＾ｒｇＰｈｔ＾ｒｇ丁ｈｒ＾１ａＧＩ
ｕＶａｌＴｈｒＬｙｓＧｌｙＣ１ｙＡｒｚＶａｌ＾ｌａ
ＧｌｙＶａｌＰｒｏＰｒｏＡｒｇ２４８　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　ＴＴＧＡＧＡＴＣＡＡ
ＣＡＡにＡＣＴＳ＠ｒＰｈｅＰｒｏＰｒｏＰｒｏＬ；ｙ
ｓＧｌｎＡｒｔＬｙｓＩｌｅＧｌｕＩｌｓＡｓｎＬｙｇ
Ｔｈｒ２９３　　ＴＴ丁ＡＡＡＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＣ
ＣＡＴＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＣＴＣにＴＧτＴＣＧＴＧ
ＣＴＡＰｈａＬｙｓＴｙｒＩｌｅＡｓｉＴｈｒＩｌｅＶ
ａ＋５ｅｒｃ４ＬｅｕＶａｌＰｈｇＶａＩＬ＊ｕりＲ３
ＡＡＧＴＧＣＡＴＧＡＣ，ＡＡＡＴＣＧ丁ＣＣＣＡＡＴ
ＡＴＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＬｙｘＣ
ｙｓＭ＠ｔ＾ｒｇＡｓｎｃｌｙＰｒｅＡｓｎ目ａＬｅｕ
１１＠＾１ａ５ａｒＬａｕ＾１１Ｆ記のＤＮＡ配列およ
びアミノ酸配列について説明する。

最初のＡＴＧ　（メチオニンをコードする開始コドン）
からＴ　Ｇ　Ａ　（＋：］２４−１３２６）のストップ
コドンまで１３２３ｂのオーブンリーディングフレーム
が存在し、４４１アミノ酸残基がコードされてしする。

このｃＤＮＡがコードしているエンドセリン受容体ｍＲ
ＮＡには過渡的に発現されるサイト力インや成長因子と
同様に３゛非翻訳領域にＡＵＵＵＡというｍＲＮＡを不
安定化する配列が存在する。このポリペプチドは、フオ
ンノ＼イジーンアルコ゛リズム（ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｉｎ
ｅ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　八ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、。

１４．４６８３　（１９８９））で予想される２６アミ
ノ酸残基のシグナル配列から始まり、４１５アミノ酸残
基で構成され、分子量４６９０１と計算される。

このポリペプチドには、７ケ所におし＼て２４〜２８個
の疎水性アミノ酸からなる膜貫通領域と思われる部分か
あり、予想される第１膜貫通部分のＮ末端に２つの糖鎖
付加部位が見出された。これらは、光受容体ロドプシン
や他のＧタンノ＼り質（グアニンヌクレオチド結合性調
節タンパク質）と共役する受容体に共通する特徴である
。膜貫通部分と第１、第２細胞外部分と予想される部分
は、これらの受容体スーパーファミリーと比へてアミノ
酸配列かよく保存されている。第３細胞内部分とＣ末端
部分は、他の多くのＧタンパク質と共役する受容体と同
様、リジンやアルギニンの近くにセリンやスレオニンが
豊富な部位か存在し、これらの部位は、セリン／スレオ
ニンキナーゼによるリン酸化がおきる可能性がある。ま
た、Ｎ−末端の細胞内部分は比較的長く（７４残基）、
第３細胞内部分は短い（３１残基）ことや、３番目の膜
貫通部分にアスパラギン酸がないこと、Ｎ−末端にシグ
ナル配列があることなどの特徴がみられ、それぞれサイ
ロトロピン受容体、ＬＨ−ＣＧ受容体、タキキニン受容
体などとの共通性が部分的に見出される。

本発明は、以上述べたエンドセリン受容体をコードする
ＤＮＡ配列を提供する。このＤＮＡ配列は、哨乳類、微
生物による調節を受ける組換え体転写単位、またはウィ
ルスの転写あるいは翻訳調節要素内で発現され得る形で
提供されることが好ましい。例えば、微生物内で発現さ
れる配列は、イントロンを含まないものである。好まし
い態様ては、本ＤＮＡ配列は少なくとも１つ、しかし随
意に１つ以上のｃＤＮＡ配列あるいはそれについての複
製由来の配列成分からなる。

このような配列は、合成オリゴヌクレオチドを組み上げ
ることにより調製されたＤＮＡ配列に連結しているか、
あるいは隣接している。しかし、主にオリゴヌクレオチ
ドから組み上げられた合成遺伝子は、ここで学えられる
配列情報を用し）ることにより構築することができる。

典型的な配列は、前述したものと実質的に同一な配列を
含んでいる。コード配列は、Ｎ−末端に位置する、例え
ばヌクレオチド配列上で翻訳フレームと連結したメチオ
ニンを特定するＮ−末端のＡＴＧコドンのような、１つ
以上の付加的アミノ酸をコードするコドンを含むことが
できる。遺伝子コードの縮重のため、同じアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列にも相当の多様性がある
。前述した典型的なりＮＡ配列以外の態様には、中等度
にストリンジェットな条件（４２℃、２０％（Ｖ／Ｖ）
ホルムアミド存在下）で、典型的なりＮＡ配列にハイブ
リダイズすることかできる配列が含まれる。その他の配
列は生物学的な活性を有するエンドセリン受容体ペプチ
ドをコードする上記の配列に縮重している。

本発明はまた、有用な量の特製されたエンドセリン受容
体を生産するための発現ベクターを提供する。本発明の
ベクターは、ｆｆ＃乳類、微生物、酵母、バタテリオフ
ァージあるいはウィルス遺伝子由来の調節要素に使用可
能な状態に連結された噴孔類のエンドセリン受容体、あ
るいは生物学的に等価な類似物をコードする合成あるい
はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片からなることができる。使
用できる調節要素は以下に詳細に述べる。適当な細胞系
列への形質転換、形質導入あるいは感染によって、この
ようなベクターは組換え体タンパク質の発現を誘導する
ことができる。

噴孔類のエンドセリン受容体は、適当なプロモーターの
調節の下、補乳類細胞、酵母、細菌、あるいはその他の
細胞中で発現することができる。

簾細胞翻訳系によっても、本発明のＤＮＡ構成物由来の
ｍＲＮＡを用いて噴孔類のエンドセリン受容体を生産す
ることができる。細菌、真菌、酵母および哨乳類細胞宿
主に用いるための適当なりローニングおよび発現ベクタ
ーは、ボウエル（ＰｏｕｗｅＩ　）　　ら　（Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ　　Ｖｅｃｔｏｒｓ：　　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＭａｎｕａｌ、エルスピユー社、ニューヨーク州
、（＋９８５）　）によって述べられている。

種々の補乳類細胞培養系を、組換え体タンパク質の発現
に用いることができる。適当な哨乳類宿主細胞系列とし
ては、グルラマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）（（：ａｌｌ、　
２３．１７５　（＋９８１））により述べられたサル腎
臓細胞のＣＯ５−７系列及び、例えば、Ｃ１２７，３Ｔ
３、ＣＨＯ，ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系列なとのベク
ターを発現可能な細胞系列が含まわる。補乳類発現ベク
ターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハ
ンサ−のような非転写要素、５゛あるいは３′に隣接す
る非転写配列、また必須のりホソーム結合部位、ボリア
テニル化部位、スプライストナー（ｓｐｌｉｃｅ　ｄｏ
ｎｏｒ）およびアクセプタ一部位のような５゛あるいは
３′の非翻訳配列、および終止配列等を含んでいる。例
えば、ＳＶ４０複製開始点、初期プロモーター、エンハ
ンサ−、スプライスおよびポリアデニル化部位等のＳＶ
４０ウィルスゲノム由来のＤＮＡ配列は、異種ＤＮＡ配
列の発現に必要とされるその他の遺伝的要素を与えるた
めに用いられる。典型的なベクターは、岡山とハーグ（
Ｂｅｒｇ）（Ｍｏ１．　　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ＋、、　
３−、２８０　（１９８３））によって明らかにされた
通りに構築することができる。

Ｃ１２７ネズミ乳腺表皮細胞で、哨乳類受容体ｃＤＮＡ
を安定かつ高レベルに発現するために有用な系は、コス
マン（Ｃｏｓｍａｎ）ら（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕ
ｎｏｌ、、　２３．９３５　（１９８６））により述べ
られていることに従って構築することができる。

酵母の系では、サツカロミセス・セレビシェのようなサ
ツカロミセス属の種を用いることか好ましい。ピキア（
Ｐｉｃｈｉａ）あるいはフリユベロミセス（Ｋ　ＩＩＪ
ｙｖｅｒｏｌｙｃｅｓ　）等の、他の属の酵母も、組換
え体タンパク質の生産株として用いることかてきる。

般に、有用な酵母ベクターは複製開始点と、例えば大腸
菌のアンピシリン耐性Ａｍρ１遺伝子とサツカロミセス
・セレビシェのＴＲＰ　１遺伝子のような、酵母と大腸
菌の両方て形質転換に用いることが可能な選択マーカー
および下流の構造遺伝子の転写を誘導する酵母の高発現
遺伝子由来のプロモーターを含んでいる。このようなプ
ロモーターは３−ホスホグリセリン酸リン酸化酵素で、
α−因子、酸性ホスファターゼおよび熱ショックタンパ
ク質等高率で発現される遺伝子をコードする酵母の転写
単位に由来する。この異種構造配列は、翻訳開始および
終止配列並びに好ましくは、翻訳されたタンパク質を細
胞外の培地中へ分泌することを可能にするリーダー配列
とともに適当なフレームに組み上げられる。上記の異質
配列は、Ｎ−末端の同定可能なペプチドまたは、例えば
発現された組換え体産物の安定化を行う、あるいは精製
か単純になるような所望の特徴を与える配列を含む融合
タンパク質をコードすることも任意に可能である。

有用な酵母ベイヤーは、大腸菌内での選択および複製の
ためにｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐ’遺伝子
と複製開始点）およびグルコースによって抑制されるア
ルコール脱水素酵素２（ＡＤ）１２）プロモーターを含
む酵母のＤＮＡ配列を用いることにより組み上げること
ができる。

ＡＤＨ２プロモーターはルッセル（Ｒｕ５ｓｅｌｌ　）
ら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５８．２６７
４　（１９８２））　　とベイヤー　（Ｂｅｉｅｒ　）
ら（Ｎａｔｕｒｅ、　３００．７２４　（１９８２））
によって開示されている。これらのベクターはまた、酵
母ＴＲＰＩ遺伝子を選択マーカーとして持ち、酵母２μ
複製開始点を含んでいる。酵母リーダー配列、例えば酵
母宿主からの異種タンパク質の分泌を導くα−因子のリ
ーダーは、プロモーターと発現される構造遺伝子との間
に挿入することができる（Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎ
ｏ、　４，５４６．０８２　　；にｕｒｉａｎｅｔ、　
ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　３０．９３３　（１９８２）　
；およびＢｉｔｔｎｅｒｅｔ　　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａ１１．　　＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８１，９８
３（＋９８４））　　。

リーダー配列はその３°末端付近に、外来の遺伝子とそ
のリーダー配列の融合を促進するための、１つ以上の有
用な制限酵素切断部位を含むように修飾することかでき
る。

以下余白 適当な酵母の形質転換法は当業者にはよく知られている
：典型的な技法は、ヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら（Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ　
７５，１９２！ｌ（＋９７８））によって述へられてお
り、トリプトファン陽性となった形質転換体を、０．６
７％酵母窒素源、０゜５％カザアミノ酸、２％ブドウ糖
、１０μｇ／ｍＵアデニン、２０μｇ　／　ｍ　ｌウラ
シルからなる選択培地上で選択する。

ＡＤＨ２プロモーターからなるベクターによって形質転
換された宿主株は、１％酵母抽出物、２％ペプトン、１
％ブドウ糖、８０μｇ　／　ｍ　１１アデニン、８０μ
ｇ　／　ｍ　１１ウラシルを含む栄養豊富な培地で発現
のために生育させる。ＡＤＨ２プロモーターの親制御は
培地中のブドウ糖が消費されてしまったときに起きる。

粗酵母上清は濾過によって集められ、続いての精製の前
に４℃に保つ。

細菌で使用する有用な発現ベクターは、補乳類エンドセ
リン受容体をコードするＤＮＡ配列を適当な翻訳開始お
よび終止信号とともに機能を持つプロモーターにフレー
ムを合わせて挿入することによって構築される。このベ
クターは、一つ以上の表現型の選択マーカーと宿主内で
の増殖を保証する複製開始点を含んでいる。形質転換に
適した原核生物宿主には、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）　、サルモネラ・ティフィム
リウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔ　　ｈｉｍｕｒｉｕ
＊）、及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ＝ｏｎａｓ）
属に含まれる様々な種、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
　ｔｏｗ　ｃｅｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａ　ｈ
　Ｉｏｃｏｃｃｕｓ）などが含まれるが、他ノモノモ選
択の対象として取ることもできる。

発現ベクターは、成熟タンパク質のＮ−末端残基をコー
ドするコドンに近い部位でｃＤＮＡを切断することによ
って都合良く構築される。次いで、コード領域の欠失し
た部分を「埋め合わせる」ため、あるいは発現ベクター
中の適当なフレームや開始メチオニンを特定するコドン
となるようにコード断片を連結するための連結配列を提
供するために、合成オリゴヌクレオチドを用いることも
随時可能である。

制限的な例としてではなく典型的なものとじては、細菌
で用いる有用な発現ヘクターは、良く知られたクローニ
ンクヘクターであるｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７
）の遺伝的要素からなる市販のプラスミド由来の選択マ
ーカー及び細菌の複製開始点を含むことができる。こう
した市販のヘクターは、例えばｐＫに２２３−３Ｐ　（
ファルマシア・ファインケミカルズ、ウプサラ、スウェ
ーデン）及びｐＧＥＭｌ　（ブロジェマ・バイオチック
、マジソン、ワイオミング州、米国）などを含んでいる
。これらのｐＢＲ３２２の「主鎖１部分は、適当なプロ
モーター及び発現される構造配列と結合している。

特に有用な細菌の発現系は、λファージのＰｌ。

プロモーターとｃ　１８５７熱不安定なリプレッサーを
用いている。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションから得られるλＰＬ由来のプロモーターを取り入
れたブラスミドヘクターには、大腸菌株ＪＭＢ９　（Ａ
ＴＣＣ３７０９２）に内在した形のｐＨＵＢ２プラスミ
ドと大腸菌株ＲＲＩ（ＡＴＣＣ５３０８２）に内在した
形のｐＰＬｃ２８かある。大腸菌内での発現に有用なそ
の他のプロモーターとしては、スツデエ−（ＳＬｕｄｉ
ｅｒ）ら（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８９．１１
３　（＋９８６））によって述へられているＴ７ＲＮＡ
ポリメラーセのプロモーター、ラウｘ−（Ｌａｕｅｒ）
（Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　ｌ、１３９（＋９
８１））によって記載されておりＡＴＣＣ３７１２１と
して得られる１ａｃＺプロモーター、及びマニアチス（
Ｍａｎｉａｔｉｓ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａしｏ
ｒｙ、　１９８２．ｐ、４１２）によって述べられてい
るＡＴＣＣ３７１３８として得られるｔａｃプロモータ
ーがある。

適当な宿主株を形質転換し適当な細胞濃度までその宿主
株を増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方
法（例えば、温度シフトあるいは化学的誘導）で脱抑制
し、細菌を更に短期間培養する。細胞は普通遠心により
集め、物理的あるいは化学的方法で破砕し、その結果生
じた粗抽出液をその後の精製のために残しておく。例え
ば、細胞を最大の通気と激しい攪拌を行なう条件下で、
１０リツトルの培養器中で増殖させる。消泡剤（Ａｎｔ
ｉｆｏａｍ　Ａ）を用いるのが好ましい。培養はモット
　（Ｍｏｔｈ）　ら　（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　
Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　８２　、８８（
＋９８５））によって開示された超誘導培地中３０　”
Ｃで行なうか、あるいはそれに代るものとしては、抗生
物質を含んだ培地で培養し、ＡＢＯ３が０．４〜０．５
に相当する細胞濃度で温度を４２℃にあげることによフ
て脱抑制し、次いで温度シフト後、３−６時間が好まし
いか、２−２０時間の間に細胞を集める。細胞は、初め
濾過あるいはその他の方法で濃縮し、次に１０．ＯＯＯ
ｘｇで１０分間、４℃で遠心後、直ちに細胞のベレット
を凍結する。

好ましくは、精製されだ補乳類のエンドセリン受容体あ
るいは生物学的に等価な類似体は、培養液から精製され
る本発明の合成遺伝子の組換え体翻訳産物を発現するた
めに適した宿主／ヘクター系を培養することによって調
製される。

精製されたエンドセリン受容体を生産する別の方法は、
細胞培養上清あるいは抽出液からの精製を含んでいる。

この方法では、有用な量のタンパク質を作る細胞系列を
用いる。そのような細胞系列からの上清は、例えばアミ
コン社あるいはミリポア・ファルコン社の限外濾過装置
といった市販のタンパク質濃縮濾紙を用いて随時濃縮す
ることかできる。濃縮操作に続き、濃縮液を既に述へた
ような適当な精製用マトリックスにかける。例えば、適
当なアフィニティーマトリックスは、適当な支持体に結
合したエンドセリン−１あるいはレクチンまたは抗体分
子などから成っている。それに代るものとして、例えば
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を持つ担体あるい
はマトリックスのような陰イオン交換樹脂か用いられる
。マトリックスとしては、アクリルアミド、アカロース
、デキストラン、セルロースあるいはその他のタンパク
質精製に通常用いられているようなものが使用可能であ
る。また、その代りとして、陽イオン交換樹脂を用いる
ことも可能である。適当な陽イオン交換体としては、ス
ルフォブロビル基あるいはカルホキジメチル基からなる
種々の不溶性マトリックスを含んでいる。

最後に、メチルあるいはその他の脂肪族基を有するシリ
カケルなとの疎水性充填剤を用いた一種以」−の逆相系
高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を、エ
ンドセリン受容体組成物をさらに精製するために用いる
ことか可能である。−Ｆ述の特製段階のいくつかあるい
は全てを様々に組み合わせることにより、均一な組換え
体タンパク質を得ることか可能だろう。

細菌の培養で生産された組換え体タンパク質は通常細胞
ベレットからの抽出を始めとして、−工程以上の濃縮、
塩析、水相のイオン交換あるいはケル濾過クロマトフラ
フィーの段階を経て単離される。最後に、高速液体クロ
マロクラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製段階として用い
ることかできる。組換え体哨乳類エンドセリン受容体の
発現に用いられた微生物細胞は、凍結−融解の繰り返し
、超音波処理、物理的破砕、あるいは細胞溶解試薬を用
いるなど、とのような都合の良い方法によっても破壊す
ることかできる。

補乳類のエンドセリン受容体を分泌タンパク質として発
現１−る酵母の発酵は、精製を大いに容易にする。大規
模な発酵の結果前られる分泌された組換え体タンパク質
はウルダル（Ｕｒｄａｌ）ら（Ｊ。

ＣｈｒｏＬＩＩａｔｏｇ、　２９６．１７１（１９８４
））によって明らかにされた方法と類似した方法によっ
てＭ製することか可能である。この引用文献には、組換
え体ヒト０００Ｍ−ＣＳＦの精製のための調製用ＨＰＬ
Ｃカラムにおける、二段階の連続した逆相系ＨＰＬＣ処
理が述べられている。

種々の態様において、本発明は内在性物質の混入なしに
、実質的に均一な組換え体である噴孔類のエンドセリン
受容体ポリペプチドを提供している。

本発明における組換え体であるエンドセリン受容体タン
パク質には、微生物中での発現あるいは微生物によって
発現されたタンパク質の特製を助けるような適当なペプ
チドあるいはタンパク質配列と融合されたタンパク質と
して発現した噴孔類のエンドセリン受容体も本発明によ
り意図されているものである。

本発明のタンパク質の生物学的に等価な類似体とは、ｌ
ｔ物物的的活性不要な末端、あるいは細胞内側の残基ま
たは配列か削られたエンドセリン受容体のような短縮さ
れた種々の類似体を含んている。

ここて用いられている「変異アミノ酸配列」とは、天然
の配列から故意に作られた変種のヌクレオチド配列によ
ってコードされるポリペプチドを示している。「変異タ
ンパク質」あるいは「類似体」は、変異アミノ酸配列を
含むタンパク質を意味している。「天然の配列」は野生
型あるいは天然の形の遺伝子またはタンパク質と同一な
アミノ酸配列あるいはヌクレオチド配列を示している。

本発明を、以下の実施例により、さらに説明する。

［実施例１］ チャーゲイン（Ｃ：ｈｉｒｇｗｉｎ）ら（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、、１８゜５２９４　（１９７９）　）と同様の手法
を用いてラット肺より抽出した全ＲＮＡから東離したＰ
ｏ１ｙ　（Ａ　）＋の付加したｍＲＮＡを逆転写するこ
とによりｃＤＮＡライブラリーを作製した。具体的には
、細胞をイソチオシアン酸グアニジウム溶液中で溶かし
、溶解物をＣ５Ｃｎのバットの上に重層し、ＲＮＡか沈
澱するまで遠心分離した。ＲＮＡのヘレットは再懸濁し
、タンパク質分解酵素による分解、有機溶媒による溶出
、およびアルコール沈澱によりさらに精製した。オリゴ
ｄＴセルロースクロマトグラフィーによりｐｏｌｙ（Ａ
）“ＲＮＡを単離し、二本鎖ｃＤＮＡは、グブラー（Ｇ
ｕｂｌｅｒ）とホフｖン（Ｈｏｆｆｍａｎ）（Ｇｅｎｅ
、　２５．２６３　（１９８３）　）と同様の方法で調
製した。具体的には、ＲＮＡはオリゴｄＴまたはランダ
ムオリゴヌクレオチドをブライマーとして用いて逆転写
酵素により、ｃＤＮＡに複製した。ｃＤＮＡを大腸菌Ｄ
ＮＡポリポリーゼエとＲＮａｓｅＨと共にインキュベー
ションすることにより二本鎖にし、その末端はざらにＴ
４ＤＮＡポリメラーゼとインキュベーションすることに
より平滑化した。平滑末端を持つこれらのｃＤＮＡに、
ＢｓｔＸＩリンカ−を付加した後、セ７７０−ス（ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）　ＣＬ　−２Ｂによるゲル濾過クロマ
トグラフィーにより短いものを排除した。干して哺乳動
物細胞用高発現プラスミドヘクタ−ｐＣＤＭ８に結合さ
せた。このｐＣＤＭ８の模式図を第１図に示す。

ｐＣＤＭ８ベクターはＳＶ４０とボ！Ｊ、ｔ−７＋７）
複製起点、サイトメカロウイルス／Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼプロモーター及びＭ１３複製起点を含んで創製され
た４、８ｋｂのブラスミトヘクターである（Ｓｅｅｄ、
　Ｎａｔｕｒｅ、　３２９．８４０　（１９８７））。

以上のようにしてできたｐＣＤＭＢ上のラット肺ｃＤＮ
Ａライブラリーを大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ、　Ｍｃ世田
ム）を形質転換するのに用い、約５ｘｌＯ５のコロニー
を得た。これらの組換え体を５００コロニーずつにわけ
てプールしておき、プラスミドＤＮＡを各々のプールか
ら調製した。次にプルしたＤＮＡをシート（５ｅｅｄ）
ら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４．３３６５（１９
８７））と同様のＤＥＡＥ−テキストランとクロロキン
処理を用し１てサルのＣＯ５−７細胞の集密的になって
いない（サブコンフルエント）細胞単層にトランスフェ
クトするのに用いた。次に導入された配列が過渡的な発
現をできるように細胞を３日間培養し、各プレートの細
胞の単層を以下のようにエンドセリン−１結合に関して
アッセイした。各プレートに、２、　５ｘ　１０−”　
Ｍ　［＋２５Ｉ　−Ｔｙ　ｒＩ３］　エンドセリン−１
を含む０．３％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地２ｍｆｆ１を加
え、３７℃、５％ＣＯ２下で２時間インキユヘートした
。次にこの培地を除き、［１２ＳＴ−Ｔｙ　ｒ１３］　
エンドセリン−１を含マナい上記培地で１回、ＰＢＳ　
（ｐＨ７，４）で２回それぞれ洗浄後、２．５％ゲルタ
ールアルデヒド含有ＰＢＳによって固定した。各プレー
トは空気中で乾燥後、縁を壊して平らな板だけにし、−
８０℃で８〜７２時間Ｘ線フィルムと重ねた。

エンドセリン−１結合活性は露光したフィルム上に黒い
点として見ることがてきた。このようにしてライブラリ
ーから約２Ｘ１０’の組換え体をスクリーンした後、エ
ンドセリン受容体の発現を誘導することのできる単一の
クローンｐ　ｒ　Ｅ　Ｔ　Ｒ−７か導入されたＣＯ３−
７組換え体を得た。

クローンｐｒＥＴＲ−７の挿入断片はｐＵＣ１１８／１
１９プラスミドにサブクローンし、ダイデオキシ法によ
ってＤＮＡ配列を決定した（Ｓａｎｇｅｒｃｔ　ａｌ、
、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ。

７４、５４６３（１９７７））。

［実施例２］ ｉ）イノシトールリン酸類の生成 ｐｒＥＴＲ−７を導入したＣＯ５−７細胞を３日間培養
した後、０．０２５％トリプシン１０．０５％ＥＧＴＡ
で剥離し、大豆トリプシンインヒビターを加えてトリプ
シン作用を止め、遠心して細胞を集めた。Ａ溶液（１４
０ｍＭ塩化ナトリウム、４ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭリ
ン酸２ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１．２５
ｍＭ塩化カルシウム、１１ｍＭグルコース、５ｍＭへベ
ス（ＰＨ７，４）、０．２％ＢＳＡ）で２回洗浄後、８
０μＣｉ／ｍｆｆ１　３Ｈ−ミオイノシトールを加えた
Ａ溶液で３時間インキユヘートした。その後、１０ｍＭ
塩化リチウム存在下で３０分間１０−’Ｍエンドセリン
ー１またはエンドセリン−３で刺激し、全イノシトール
リン酸類をＡＧ１×８陰イオン交換クロマトグラフィー
で分離後、放射活性を測定し定量化した。

結果を第２図に示す。

ｉｉ）細胞質内カルシウム濃度上昇 上記のように集めて洗浄したＣＯ３−７細胞を４　μＭ
　ｆ　ｕ　ｒ　ａ　−２７Ａ　Ｍを加えたＡ溶液で２０
℃で６０分間インキユヘートした。２回洗浄後、Ａ溶液
（ｆ　ｕ　ｒ　ａ　−２／　Ａ　Ｍを含まない）中で２
０℃で保持した。１回の実験には約１０６個／　ｍ　ｌ
の細胞を使い、キュヘット中で常に攪拌しながら励起波
長３４０と３８０ｎｍ、蛍光波長５００ｎｍで測定を行
なった。種々の濃度のエンドセリン−１、−２あるいは
−３を、ゴム族のセプタムを通してマイクロシリンジに
より注入した。カルシウム濃度は蛍光強度の比から、グ
リンキーヒ゛クス（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ）ら（Ｊ、
　［１ｉｏ１．　Ｃｈｃｍ２６０　、：１４４０　（１
９８５））の方法により計算して求めた。

ＣＯ５−７細胞トに発現したエンドセリン受容体におけ
るＥＣ６゜は２Ｘ１０−”Ｍ程度でありエンドセリン−
１、−２及び−３と同程度の効力を示した。

以トの結果を第３図に示す。

！！り　［１２５Ｉ　−Ｔ　ｙ　ｒ　１３］エンドセリ
ン−１の結合実験 ｐｒＥＴＲ−７を導入したＣＯ３−７細胞を１２六のプ
レートで培養し、Ａ溶液で１回洗浄後、［”５１−　Ｔ
　ｙ　ｒ　１３］　ｘシトセリン−１（２ｘ　１ｏ−”
　Ｍ）とさまざまの濃度のエンドセリン−１−２あるい
は−３を含んだＡ溶液１ｍｕを３７℃で６０分間インキ
ュベートした。充分に洗浄後、細胞に結合した放射活性
を測定した。

ＣＯ３−７細胞上に発現したエンドセリン受容体におけ
る結合親和性は、約２Ｘ１０−９Ｍ程度でありエンドセ
リン−１、−２、−３か同等の親和性を示した。

結果を第４図に示す。

［実施例３］ 前記のような方法でラット各組織からｐｏｌｙ（Ａ）”
ＲＮＡを抽出し、それぞれ１０μｇずつをホルムアルデ
ヒド／１．１％アガロースゲル電気体動で分離した後、
シーンスクリーンプラス膜（ＮＥＮ、　ＤｕＰｏｎｔ）
に転写した。２ｋｂのｃＤＮＡ断片をランダムプライム
法によってα−３２Ｐ−ｄＣＴＰで８ｘ　１０８ｃ、ｐ
、ｍ、／ｍＨになるようにラヘルしプローブとして用い
た。ハイブリダイゼーションはＩＭ塩化ナトリウム１５
０％ホルムアミド／１％ＳＤＳ、２５０　ｕ　ｇ　／　
ｍ　１１サケ精子ＤＮＡ溶液中で４２℃で行ない、２Ｘ
ＳＳＣ／１％ＳＤＳにより２２℃で５回、６５℃で１回
、０．１ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳにより５０℃で１回
洗浄した。オートラジオフラフイーは１０時間行なりた
。

１４のラット組織から抽出したｐｏｌｙ　（Ａ　）ゝＲ
ＮＡに対してノーザンプロットを行なったところ、薬理
学的検討によってエンドセリンの作用か報告されている
組織で、５．０ｋｂのエンドセリン受容体ｍＲＮＡか検
出された。多看の発現がみられたのはエンドセリン受容
体ｍＲＮＡ含量の多い順に脳、肺、腎臓、心臓、眼球、
肝臓、胃、副腎で子宮、小腸、顎下腺にも比較的多く存
在したか、特集、骨格筋にはごくわずかしか存在せず、
牌臓、大動脈平滑筋には発現がみられなかった。

［実施例４］ エンドセリン受容体ｃＤＮＡ挿入断片を、ｄｈｆｒ（ｄ
ｉｈｙｄｒｏｆｏｒａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　）遺
伝子とＳＶ４０ウィルス由来のプロモーターを含む発現
ベクター（Ｒ，八、　　Ｐｏｏｖｍａｎ、　　ｅｔ　　
ａｌ、、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　　Ｌ　　１３９（１９８
６））　ｐ　Ｓ　Ｖ　Ｄ　（１’）プロモー　’；ｒ　
−下ａ　ニｌｌｉ　ミコみ、エンドセリン受容体発現プ
ラスミドｐＳＶＤｒＥＴＲを創製した。

このエンドセリン受容体発現プラスミドを第５図に示す
。

ＣＨＯ（ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｏｖａｒｙ
　）　ｄｈｆｒ　　細胞（Ｇ、　Ｕｒｌａｕｂ、　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ口、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ
。

ＩＩｓ八７へ、　４２＋６　（＋９８０）　’）は、１
０％ＦＢＳ含有ＨａｍＦ１２培地で、サブコンフルエン
ト（５ｕｂｃｏｎｆ　１ｕｅｎｔ）に単層培養した。

エンドセリン受容体発現プラスミドｐＳＶＤ。

ＥＴＲをリン酸カルシウム法およびグリセロール処理に
より、ＣＨＯｄｈｆｒ　　１ｍ胞にトランスフェクトし
た。トランスフェクトした細胞を２４時間後、約２０倍
の培養面積にまき直し、さらに２４時間待って細胞が充
分接着した後、培地を１０％透析ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培
地に替えた。

これによって、トランスフェクションされたｄｈｆｒ遺
伝子がケノムに組み込まれた細胞のみが増殖し、コロニ
ーを形成した。

充分に成長したコロニーをペニシリンカップ法によりト
リプシンにてはがし、１２穴プレートにまき直して同し
培地で増殖させた。

こうして単離したクローナルな細胞が、実際にエンドセ
リン受容体を発現していることを、前記のようにエンド
セリン投与による細胞質内カルシウム濃度上昇をｆｕｒ
ａ−２を用いて観察すること、おヨＴｊ　［”５Ｉ　−
Ｔ　ｙ　ｒ　１３］　エンドセリン−１による結合実験
により確認した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＣＤＭ８を示す模式図である。 第２図は、イノシトールリン酸類の生成における本発明
に従うエンドセリン受容体の生物学的活性を示すグラフ
である。 第３図は、細胞質内カルシウム濃度上昇における本発明
に従うエンドセリン受容体の生物学的活性を示すグラフ
である。 第４図は、エンドセリンとの結合における本発明に従う
エンドセリン受容体の生物学的活性を示すグラフである
。 第５図は、本発明に従うエンドセリン受容体の発現プラ
スミドを示す模式図である。 第 図 エンドセリン受容体ｃＤＮＡ 第 図 Ｐ−１ Ｐ−２ １１’−３ 第 図 エンドセソンベブヂト濃度（Ｍ） 缶ち 図 エンドセリンベプチト濃度（Ｍ） 第 図 手糸売ネ甫正書 （自発） 平成 ３年１２月２０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １。哺乳類のエンドセリン受容体をコードする領域から
   実質的になるＤＮＡ配列。 ２。哺乳類のエンドセリン受容体でエンドセリン−１と
   エンドセリン−３に対する薬理学的親和性の差が１０倍
   以内である受容体をコードする特許請求の範囲第１項の
   ＤＮＡ配列。 ３。（ａ）天然の哺乳類エンドセリン受容体遺伝子のコ
   ード領域に由来する核酸配列を有するｃＤＮＡクローン
   ； （ｂ）中程度の厳しい（ストリンジェット）条件下で（
   ａ）のクローンとハイブリダイズできて、かつ生物学的
   活性のあるエンドセリン受容体分子をコードしているＤ
   ＮＡ配列；及び （ｃ）（ａ）と（ｂ）で定義したＤＮＡ配列と遺伝的コ
   ードの結果として縮重していて、かつ生物学的活性のあ
   るエンドセリン受容体分子をコードしているＤＮＡ配列 からなる群から選択される、特許請求の範囲第１項記載
   のＤＮＡ配列。 ４。微生物もしくはウィルスのオペロン由来の誘導可能
   な制御要素を含む組み換え転写単位中で発現させること
   が可能な哺乳類エンドセリン受容体を実質的にコードし
   ている合成遺伝子からなる、特許請求の範囲第１項記載
   のＤＮＡ配列。 ５。エンドセリン受容体をコードする核酸配列と実質的
   に類似している特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列
   。 ６。哺乳類のエンドセリン受容体をコードする領域から
   実質的になるＤＮＡ配列からなる組換え発現ベクター。 ７。哺乳類のエンドセリン受容体をコードする領域から
   実質的になるＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクターを宿
   主細胞に挿入し、この細胞を発現を引き起こす条件下で
   培養することからなる哺乳類のエンドセリン受容体また
   はその類似体を生産する方法。 ８。組換え細胞培養により生産され、生物学的活性を有
   する哺乳類のエンドセリン受容体またはその類似体を含
   むタンパク質組成物。 ９。生物学的活性を有する哺乳類のエンドセリン受容体
   またはその類似体を含む、哺乳類のエンドセリンを検出
   するための薬剤。