JPH06172394A - 成長ホルモンレセプターの細胞質外ｃ−ドメイン蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 成長ホルモンレセプターの細胞質外Ｃ-ドメ
イン蛋白質(ｈＧＨＲ-ＣＤ)を提供する。また遺伝子組
換え技術を用いて上記ｈＧＨＲ-ＣＤを製造するための
手段として、ｈＧＨＲ-ＣＤをコードしているＤＮＡ断
片、該ＤＮＡ断片を組み込んだ改良ベクター、該ＤＮＡ
断片を組み込んだ組換え体バキュロウイルス、並びにｈ
ＧＨＲ-ＣＤをコードしているＤＮＡ断片を組み込んだ
発現プラスミッド、該発現プラスミッドで形質転換され
た大腸菌細胞を提供する。さらに、上記手段を用いるこ
とを特徴とする昆虫細胞発現系または大腸菌発現系によ
るｈＧＨＲ-ＣＤ製造方法を提供する。 【効果】 本発明の手段および方法によって得られるｈ
ＧＨＲ-ＣＤ蛋白質は、成長ホルモン機能の増強作用を
有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、成長ホルモンレセプタ
ーの細胞質外Ｃ-ドメイン蛋白質、詳しくは天然型の成
長ホルモンレセプターの細胞質外領域であるホルモン結
合領域のＮ末端側の大体半分を欠失せしめた残りのＣ末
端側のみからなる蛋白質(以下、ＧＨＲ-ＣＤと略記す
る)に関する。本発明のＧＨＲ-ＣＤは、成長ホルモン作
用の異常に伴う種々の疾患の治療薬または成長ホルモン
機能の増強剤として有用であり得る。また本発明は、遺
伝子組換え技術を用いて上記ＧＨＲ-ＣＤを製造するた
めの手段および方法に関する。

【従来技術と発明が解決する課題】

【０００２】成長ホルモンレセプター遺伝子の相補ＤＮ
ＡはＬeungらによりヒトおよびウサギに於いてクローニ
ングされ、そのホルモン結合領域である細胞質外領域
は、ヒト由来のものが動物細胞を用いて発現されている
[Nature,330 537-543(1987)]。さらに最近ではＦuhら
[J.Bio.Chem.,265,3111-3115(1991)]により大腸菌で、
さらに太田ら[Gene,106,159-164(1991)]により昆虫細胞
での発現がなされている。

【０００３】こうして製造された成長ホルモンレセプタ
ーのホルモン結合領域蛋白質は、臨床的に投与した場合
に生体内の成長ホルモンレセプターと拮抗することによ
って成長ホルモンの働きを阻害する可能性がある。従っ
て成長ホルモンのホルモン結合領域蛋白質は、巨人症や
末端肥大症など、なんらかの形で成長ホルモンの働きが
過剰なために起こる疾病の治療に役立つ可能性がある。
しかしながら、このホルモン結合領域蛋白質は成長ホル
モンレセプターの膜貫通領域および細胞質内領域を欠失
せしめたのみであるから、その残された蛋白質全体の形
は極めて天然に近い形を保持しているものと考えられ
る。従って、その機能も天然の成長ホルモンレセプター
の機能をそのまま反映したものに限定され、例えば生体
内の成長ホルモンレセプターとの拮抗と言ったものしか
期待しにくい。

【０００４】ところが近年、成長ホルモンレセプターの
立体構造やその生体内での機能がわかるにつれて、ホル
モン結合領域がさらにＮ-ドメインとＣ-ドメインの２つ
に分かれていること、また同レセプターが機能する際に
は少なくとも二量体の形で機能すること、その二量体の
形成にはＣ-ドメインが重要な働きをなしていることな
どがわかってきた[De Vosら,Science,255,306-312(199
2)；Fuhら,Science,256,1677-1680(1992)]。

【０００５】こうした知見は、この成長ホルモンレセプ
ターのホルモン結合領域をさらにエンジニアリングする
ことによって(例えばそのＣ-ドメインのみを取り出すこ
とによって)、これまでの全ホルモン結合領域では期待
し得なかった作用(例えばその臨床的な投与による成長
ホルモン機能もしくは成長ホルモンレセプター機能の増
強といった作用)をも取り出し得る可能性を示唆するも
のである。もしもこのような新規成長ホルモンレセプタ
ー誘導体に成長ホルモン機能の増強作用があれば、成長
ホルモン作用の異常による小人症の治療薬やさらには筋
肉増強剤などとして、これまで成長ホルモンの持ってい
た臨床作用を補い、さらにそれに置きかわりうる程の薬
効を期待できる可能性がある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、成長ホルモ
ンレセプターのホルモン結合領域である細胞質外領域を
コードする遺伝子からポリメラーゼチェインリアクショ
ン法（以下ＰＣＲ法と略す)によってそのＣ-ドメイン部
分のみを取り出した。

【０００７】続いてこれを発現するにあたり、一態様と
して、昆虫由来のウイルスであるバキュロウイルスをベ
クターとすることによって、昆虫由来の細胞を宿主とす
る発現系を利用した。その結果、目的の蛋白質が昆虫細
胞内に大量に蓄積し、それを細胞抽出液より抽出して製
造することに成功した。

【０００８】もう一つの態様として、上記Ｃ-ドメイン
遺伝子を大腸菌由来の発現プラスミッドに挿入した。こ
の態様では、マルトース結合蛋白質の下流に融合蛋白質
となって発現するように上記Ｃ-ドメイン遺伝子を挿入
した。この発現プラスミッドを大腸菌へ形質導入するこ
とにより、目的の蛋白質が融合蛋白質として宿主菌体内
に大量に蓄積した。さらにそれを菌体抽出液より抽出・
精製し、マルトース結合蛋白質から切り出すことによ
り、目的の蛋白質を得ることに成功した。これらにより
本発明が完成するに至った。

【０００９】

【発明の構成】本発明において、成長ホルモンレセプタ
ーという用語はヒトを含む天然のあらゆる哺乳動物起源
の成長ホルモンレセプターを意味すると共に、遺伝子操
作によって作られるそれら天然の成長ホルモンレセプタ
ーの変異体も含まれるものとする。

【００１０】成長ホルモンレセプターのホルモン結合領
域のアミノ酸配列はヒト[Leungら,Nature,330:537-543
(1987)]、ウサギ及びラット[Mathewsら,J.Biol.Chem.26
4:9905-9910(1989)]、マウス[Smithら,Mol.Endo.3:984-
990(1989)]などについて知られている。後述の実施例で
は、天然のヒト成長ホルモンレセプターのホルモン結合
領域のアミノ酸配列(配列番号１)をコードする合成ＤＮ
Ａを利用したが、天然の相補ＤＮＡなどもあり、必ずし
もこれに限定されるものではない。なお、配列番号１に
記載のアミノ酸配列をコードしている合成ＤＮＡはプラ
スミッドｐＢＳＲ８-３[太田ら,Gene,106,159-164(199
1)]に組み込まれており、ｐＢＳＲ８-３を保持する大腸
菌Ｋ１２株ＪＭ１０９／ｐＢＳＲ８-３は茨城県つくば
市東１−１−３の通産省工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている(受託日：平成４年１２月３日，受
託番号：微工研菌寄第１３３１７号)。

【００１１】成長ホルモンレセプターの細胞質外Ｃ-ド
メインとは、Ｄe Ｖosら[Science255,306-312(1992)]の
Ｘ線立体構造解析によって明確にされた２つのサブドメ
インのうちのＣ末端側をさすもので、具体的にヒト成長
ホルモンレセプターでは、Ｄe Ｖosらや上記Ｌeungらの
標示で、１２９番目バリンから２３８番目グルタミンに
至る部分を指すものである(配列番号１を参照のこと)。
また同様に、ウサギ成長ホルモンレセプターではホルモ
ン結合領域のＮ末端から数えて１２９番目バリンから２
３８番目プロリンに至る部分、ラット成長ホルモンレセ
プターでは１２９番目バリンから２３８番目スレオニン
に至る部分、マウス成長ホルモンレセプターでは１３７
番目バリンから２４６番目イソロイシンに至る部分が、
それぞれの細胞質外Ｃ-ドメインに相当する(それぞれ上
記文献を参照のこと)。

【００１２】ただし、このドメインがどこから始まりど
こで終了するかについてはかならずしも厳密でなく、そ
のＮ末端、Ｃ末端それぞれが数残基ずれたもの、あるい
は、数残基のアミノ酸が付加せられたものも含まれる。
つまりこれは、こうしたわずかな一次構造上の差異がド
メイン全体の立体構造に大きな影響を与えることはな
く、その機能は保たれると考えられるからである。実際
に、例えば後述の実施例に記載の方法で生産される２種
類のヒトＧＨＲ-ＣＤはそのＮ末端付近のアミノ酸配列
が若干異なっており、昆虫細胞で生産されるヒトＧＨＲ
-ＣＤではメチオニンに始まりそれが１３０番目のグル
タミンにつながり(配列番号２)、大腸菌で生産したヒト
ＧＨＲ-ＣＤではグリシン-セリンに始まりそれが１２９
番目のバリンにつながっている(配列番号５)。しかしな
がら、これら２種類のヒトＧＨＲ-ＣＤの機能に本質的
な相違は見いだせなかった。

【００１３】本発明の目的はＧＨＲ-ＣＤを得ることに
あり、この目的を達成する手段として、本発明は、同領
域をコードしているＤＮＡ断片を提供する。

【００１４】後述の実施例で詳述するように、ヒトＧＨ
Ｒ-ＣＤをコードするＤＮＡ断片は、上記ｐＢＳＲ８-３
からＰＣＲ法によって得ることができる。

【００１５】昆虫細胞宿主中でＧＨＲ-ＣＤをコードす
るＤＮＡ断片を発現させるためには、あらかじめ、この
ＤＮＡ断片を昆虫細胞の遺伝子発現系と連結しておく必
要がある。昆虫細胞の遺伝子発現系としては、昆虫を宿
主とするバキュロウイルスの一種である核多角体病ウイ
ルス(Ｎuclear Ｐolyhedrosis virus：ＮＰＶ)の発現系
が知られており、この発現系にはＡutographa Californ
ica ＮＰＶ(ＡｃＮＰＶ)とＢombyx mori ＮＰＶ(ＢｍＮ
ＰＶ)の２種類がある。宿主としては、ＡｃＮＰＶの場
合は夜盗蛾由来の細胞(Ｓpodoptera frugiperda：Ｓ.
ｆ.細胞)を、ＢｍＮＰＶの場合は蚕蛾由来の細胞(Ｂomb
yx mori Ｎ：ＢｍＮ細胞)を用いる。

【００１６】上記の両バキュロウイルスは共に多角体遺
伝子を含み、それは強い多角体プロモーターの支配下に
ある。従ってこれらのウイルスベクターを用いて発現さ
せる場合には、この多角体プロモーターの下流に所望の
遺伝子を挿入した組換え型バキュロウイルスを調製し、
これを宿主細胞に感染させた後、培養して目的とする蛋
白質を発現させる。

【００１７】この発現ウイルスベクターの調製に際して
は、このウイルスが約１３０キロ塩基対と大きいため、
目的とする遺伝子を直接挿入することができない。そこ
で、実際の手順としては、まず、遺伝子発現制御領域、
つまり多角体プロモーターを含む多角体遺伝子部分のみ
を切り出し、これを大腸菌を宿主とするベクター、例え
ばｐＵＣ８に挿入し、次いで目的とする遺伝子を多角体
プロモーターの下流へ挿入する。この場合に、そのまま
目的とする遺伝子を挿入すると、蛋白質への翻訳の開始
コドンであるＡＴＧをそのＮ末端に欠くことになるの
で、挿入に際してはＮ末端にＡＴＧを付加した形のもの
を用いる。このＡＴＧ付加は、先に述べたＰＣＲ法によ
る目的遺伝子の調製の際に容易に行なうことができる。
続いてこのベクターＤＮＡを野生型バキュロウイルスＤ
ＮＡと共に昆虫細胞に同時に移入して培養し、昆虫細胞
中で細胞内ＤＮＡ組換えを起こさせることによって組換
え型バキュロウイルスを得る。さらに、得られた組換え
型バキュロウイルスを幼虫に感染させ、幼虫より目的物
を抽出する方法もある。

【００１８】後述の実施例では、ＡｃＮＰＶベクター系
を用い、Ｓ.ｆ.細胞へ感染し、培養後、目的物を細胞よ
り抽出する方法について詳述する。さらに、後述の態様
ではＱ-セファロース、セファデックスＧ-７５による精
製で単一の目的物を得たが、本発明はこの方法に限定さ
れるものではない。

【００１９】要するに、本発明は、ＧＨＲ-ＣＤを発現
する手段として、ＧＨＲ-ＣＤをコードしているＤＮＡ
断片をバキュロウイルス由来の遺伝子制御系に組み込ん
だプラスミッド、および該ＤＮＡをやはりこの遺伝子制
御系のもとに組み込んである組換え型バキュロウイルス
ベクターを提供する。さらに本発明は、上記組換え型ウ
イルスベクターを昆虫細胞宿主と組み合わせて用いるこ
とを特徴とするＧＨＲ-ＣＤの製造方法、並びに該製造
方法によって得られるＧＨＲ-ＣＤを提供する。

【００２０】ＧＨＲ-ＣＤをコードする上記ＤＮＡ断片
を大腸菌宿主中で発現させるためには、あらかじめ、こ
のＤＮＡ断片を今度は大腸菌の遺伝子発現系と連結して
おく必要がある。大腸菌の発現系についてはすでに多く
の成書があり、あまり説明の必要はないので簡単に述べ
る。

【００２１】大腸菌の遺伝子発現系としては、それ自身
の菌体内で機能している遺伝子のプロモーター活性と翻
訳能を持つＤＮＡ断片由来のものが多い。このようなも
のとしては、トリプトファン遺伝子、ラクトース遺伝
子、アルカリ性ホスファターゼ遺伝子、さらには、トリ
プトファン遺伝子とラクトース遺伝子のハイブリッドで
あるｔａｃ遺伝子などがある(中原,松原(１９８６),日
本生化学会編,“遺伝子工学研究法II",1〜172,東京化学
同人)。通常は、これらのＤＮＡ断片を目的物をコード
する遺伝子の前に連結させることによって発現させる。
これ以外に用いられる方法としては、あらかじめ、よく
発現する蛋白質をコードする遺伝子の直後に、それと融
合する形で目的物が発現するように、目的物の遺伝子を
連結させておく方法がある。融合させる蛋白質として
は、β-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼやマルトー
ス結合蛋白質などがよく用いられる。これらの蛋白質
は、大腸菌の発現制御下では非常によく発現する。従っ
てこれに融合させた蛋白質もよい発現が得られることが
多い。融合蛋白質から目的とする蛋白質を切り出すため
には、目的物にメチオニンが含まれていない場合には臭
化シアン処理が行われ、またそれ以外の場合には、連結
部分に制限プロテアーゼファクターＸａの認識配列を入
れることによって制限プロテアーゼファクターＸａによ
る切り出しを可能にするなどの手法が用いられる。

【００２２】後述の実施例に、ヒトＧＨＲ-ＣＤをマル
トース結合蛋白質に融合させた形態での発現について詳
述する。この態様では、発現プロモーターとして、ＩＰ
ＴＧの添加によって誘導がかかるｔａｃプロモーターを
用いている。細胞に蓄積した融合蛋白質の抽出、Ｑ-セ
ファロース、ファクターＸａによる目的ペプチドの切り
出し、Ｑ-セファロース、バイオゲルＰ-６０からなる一
連の操作によって、目的とするペプチドを単一にまで精
製することができる。しかしながら本発明は、ここに述
べた方法に限定されるものではない。

【００２３】要するに、本発明は、ＧＨＲ-ＣＤを発現
する手段として、ＧＨＲ-ＣＤをコードするＤＮＡ断
片、該断片を組み込んだ大腸菌を宿主とする発現プラス
ミッド、および該発現プラスミッドによって形質転換さ
れた形質転換体を提供する。さらに本発明は、該形質転
換体を用いるＧＨＲ-ＣＤの製造方法、並びに該製造方
法によって得られるＧＨＲ-ＣＤを提供する。

【００２４】なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、
成書(Maniatisら(1982),Moleular Cloning：A Laborato
ry Manual,Cold Spring Harbor Laboratory)など最近の
多くの実験書に詳述されている。バキュロウイルスおよ
びその宿主を用いての実験に関しては、成書[Summersと
Smith(1987),A manual of methods for baculovirusvec
tors and insect cell culture procedures.,Texas Agr
icultural Experiment Station Bulletin No.1555,Texa
s A&M University]あるいは[前田(1989),実験医学,7巻,
146-151頁]にその手技について詳しい記述がなされてい
る。また蛋白質の精製などの基本的な方法も生化学実験
講座(日本生化学編,東京化学同人)などの多くの成書に
詳述されている。

【００２５】上述の方法により昆虫細胞または大腸菌を
宿主として組換え生産されたＧＨＲ-ＣＤの生理活性
は、いくつかの方法で測定することができるはずであ
る。

【００２６】成長ホルモンの活性測定法には、成長ホル
モンを注射などでマウスに直接投与し、その骨の長さを
測定する方法がある。骨は成長ホルモンに依存して成長
するので、骨の長さを測定すればよい。しかしながらこ
の方法はマウスを飼育しなければならないこと、骨の長
さを測定する操作が繁雑であることなどから、これをＧ
ＨＲ-ＣＤ活性の測定に適用していくことはけっして容
易ではない。もう一つの方法として、ＮＩＨ ３Ｔ３ ４
４２前脂肪細胞(preadipocyte)を脂肪細胞(adipocyte)
へ分化させる系がある。この分化は成長ホルモンを必要
とする(Morikawaら,Cell,29,783-789(1982))ことから、
これによって成長ホルモン活性を測定することができ
る。成長ホルモンに依存するこの分化は、前脂肪細胞上
の成長ホルモンレセプターを介して行われる。したがっ
てもしもＧＨＲ-ＣＤが成長ホルモンあるいはそのレセ
プターに対して何らかの作用を発揮するのであれば、Ｇ
ＨＲ-ＣＤの添加によるこの分化の系の作用への影響に
よってＧＨＲ-ＣＤの活性も測定することができるはず
である。

【００２７】前脂肪細胞から脂肪細胞へ分化する上記の
系に、ヒト成長ホルモンと共に本発明のＧＨＲ-ＣＤを
添加したところ、その分化の著しい促進が認められた。
成長ホルモンレセプターのホルモン結合領域、つまり全
細胞質外領域はホルモンに結合する。従って、この分化
の系へこれを添加した場合には、本来前脂肪細胞上のレ
セプターと結合するはずの成長ホルモンを奪ってしまう
ことになる。その結果、ヒト成長ホルモンによる分化の
作用の阻害が予想される。従って上記の測定において認
められた分化の促進効果は、成長ホルモンレセプターの
細胞質外Ｃ-ドメインのみを取り出すことによって初め
て得られた効果と考えられる。これは、本発明のＧＨＲ
-ＣＤが、生体や臨床においても成長ホルモン機能を増
強し、あるいはこれに置き換わりうる可能性を示すもの
である。

【００２８】

【発明の効果】以上述べたように、本発明は、昆虫細胞
または大腸菌を宿主とする遺伝子組換え法によってＧＨ
Ｒ-ＣＤを発現させ、該宿主からＧＨＲ-ＣＤを抽出・精
製する方法を確立したものである。また、こうして得た
ＧＨＲ-ＣＤは、これまでの成長ホルモンレセプターの
ホルモン結合領域に関して予想される効果とは反対に、
何らかの形で成長ホルモン機能の異常に起因する病気
(例えば小人症)の治療や成長ホルモンの機能増強などに
臨床的な効果を期待されるものであり、成長ホルモンの
医療および研究分野での用途を発展させるものと言え
る。

【００２９】

【実施例】以下実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説
明する。

【００３０】実施例１ ヒト成長ホルモンレセプターの
細胞質外Ｃ-ドメイン蛋白質をコードするＤＮＡ断片の
調製と転位ベクターｐＡｃＹＭ-Ｍｅｔ１３０Ｑ-２３８
Ｑの構築 公知のヒト成長ホルモンレセプターのアミノ酸配列(Leu
ngら,Nature,330 537-543(1987))を基に、その細胞質外
Ｃ-ドメインをコードするＤＮＡ断片を配列番号２に示
すように設計した。このＤＮＡ断片は、ヒトＧＨＲ-Ｃ
Ｄ(以下、ｈＧＨＲ-ＣＤと略す)部分の１３０番グルタ
ミンから２３８番グルタミンをコードするばかりでな
く、この部分のみがリボソーム上で翻訳されるようにそ
のＮ末端には開始コドンＡＴＧが付加されており、Ｃ末
端には終結コドン２個ＴＡＡＴＡＧが付加されている。
さらにこの断片を昆虫細胞発現用ベクターｐＡｃＹＭ１
(松浦ら,J.gen.Virol 68,1233-1250(1987))の制限酵素
部位ＢamＨＩに組み込むことができるように、開始コド
ンのＮ末端側および終結コドンのＣ末端側にそれぞれ制
限酵素ＢglIIの認識部位を付置してある。ＢamＨＩおよ
びＢglIIの制限酵素の切断によりそれぞれ露出するシン
グルストランドの塩基配列は同じＧＡＴＣである(つま
り対合塩基を形成する)ので、ＢglIIで切断すればその
ＤＮＡ断片をＢamＨＩ部位に挿入することは容易であ
る。

【００３１】該ＤＮＡ断片の実際の調製にはＰＣＲを使
った。具体的には、まず、アプライド・バイオシステム
社の３８０Ｂ型ＤＮＡ合成機を用いて、それぞれ配列番
号３及び配列番号４に記載の塩基配列を有するＮ-末端
プライマー１及びＣ-末端プライマー１を調製した。次
いで、２μM Ｎ-末端プライマー１、２μM Ｃ-末端プラ
イマー１、１ng ｐＢＳＲ８-３ ＤＮＡ、１０μl １０
×反応緩衝液、各０.２５mMのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＣＴＰ溶液、０.５μl Ｔaq ＤＮＡポリメラ
ーゼを加えて最終の量を１００μlとする。ここで１０
×反応緩衝液、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼは宝酒造のＧeneＡmpのキ
ットのものを使用した。この反応液をＤＮＡサーマルサ
イクラー(型式ＰＪ２０００,宝酒造)にセットし、９４
℃１分間熱処理、３７℃２分間アニーリング、７２℃３
分間反応のサイクルプログラムで２５回反応を繰り返す
ことにより目的のＤＮＡ断片を合成する。さらに、上記
ＰＣＲ反応液をフェノール処理することにより精製す
る。その精製ＤＮＡのうち約１μgを、０.１M食塩及び
１０mM塩化マグネシウムを含む５０mMトリス塩酸緩衝液
(ｐＨ７.５)５０μl及び制限酵素ＢglII(宝酒造)５単位
と共に３７℃で１時間インキュベートしてＤＮＡを消化
する。この消化液をフェノール処理及びエタノール沈殿
した後、１％アガロースゲルの電気泳動にかけ、約０.
３kbpのバンドを切り出し、スプレック-０１(宝酒造)に
入れ、−８０℃で１５分間凍結した後、３７℃で５分間
インキュベートして融解する。これを５０００回転で１
０分間遠心して、その濾液を回収する。フェノール処理
及びエタノール沈殿によって濾液から目的とするＤＮＡ
断片を取り出す。

【００３２】続いて転位ベクターであるｐＡｃＹＭ-Ｍ
ｅｔ１３０Ｑ-２３８Ｑプラスミッドの構築を行うため
に、ＡｃＮＰＶの多角体タンパク質をコードする部分を
含むｐＡｃＹＭ１(松浦ら,J.gen.Virol.(1987),68,1233
-1250；松浦氏(国立予防衛生研究所)から入手可能)の多
角体プロモーター下流に、上で調製したｈＧＨＲ-ＣＤ
をコードするＤＮＡ断片を挿入する(図１)。具体的に
は、４０μgのｐＡｃＹＭ１ ＤＮＡを、５０mM食塩及び
１０mM塩化マグネシウムを含む１０mMトリス塩酸緩衝液
(ｐＨ７.５)５０μlに溶解し、５単位のＢamＨＩで消化
する。これを１％アガロースゲル電気泳動にかけて、約
１０kbのバンドを切り出し、スプレック-０１(宝酒造)
に入れ、−８０℃で１５分間凍結した後、３７℃で５分
間インキュベートして融解する。これを５０００回転で
１０分間遠心して、その濾液を回収する。フェノール処
理及びエタノール沈殿により濾液から目的とするＤＮＡ
を抽出・精製した。これを１mM塩化マグネシウム及び
０.１mM塩化亜鉛を含む５０mMトリス塩酸緩衝液(ｐＨ
９.０)に溶解し、１３５単位のアルカリ性脱リン酸化酵
素(ウシ腸由来；宝酒造)を加えて、３７℃で３０分間、
続いて５０℃で５分間反応させることによりＢamＨＩ切
断部位に露出したリン酸残基を除いた後、フェノール処
理及びエタノール沈殿によって抽出・精製する。得られ
たＤＮＡ断片の２ngとｈＧＨＲ-ＣＤをコードする上記
ＤＮＡ断片２ngとを混合し、４μlのＴＥ緩衝液(１０mM
トリス塩酸、１mM ＥＤＴＡ)に溶解した。次いで、これ
を１６μlのＡ液及び４μlのＢ液(ＤＮＡライゲーショ
ンキット；宝酒造)と混合し、１６℃で３０分間反応さ
せた。これを１００μlの大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９コ
ンピテントセル(宝酒造より購入可能)と混合し、０℃で
３０分間、さらに４２℃で２分間インキュベートするこ
とでＪＭ１０９株へ移入することにより転位プラスミッ
ドｐＡｃＹＭ-Ｍｅｔ１３０Ｑ-２３８Ｑを作成した。こ
のプラスミッドでは、親プラスミッド由来のＢamＨＩ突
出末端と、挿入されるＤＮＡ断片のＢglII突出末端が対
合塩基対をつくるために、ＢamＨＩ部位とＢglII部位が
共に消失して存在しない。なお、この転位プラスミッド
を保持する大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９／ｐＡｃＹＭ Ｍ
ｅｔ１３０Ｑ-２３８Ｑは通産省工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託されている(受託日：平成４年１２月
３日，受託番号：微工研菌寄第１３３１９号)。

【００３３】実施例２ 組換えウイルスＡｃＭｅｔ１３
０Ｑ-２３８Ｑの作成 実施例１で得たプラスミッドｐＡｃＹＭ-Ｍｅｔ１３０
Ｑ-２３８Ｑ ＤＮＡより組換え型バキュロウイルスを作
成する。即ち、野生型ＡｃＮＰＶ ＤＮＡと共にこのプ
ラスミッドＤＮＡを塩化カルシウム-リン酸沈澱法で昆
虫細胞に移入し、さらにそれの細胞内における組換えに
よって、目的の組換え型バキュロウイルスを作成する。
その概略を図２に示す。

【００３４】具体的には、まず野生型バキュロウイルス
ＡｃＮＰＶのＤＮＡ１μg(ＡｃＮＰＶはＭ.D.Summers,
Department of Entomolgy, Texas Agricultural Experi
mentStation and Texas A&M Universoty College Stati
on, Taxas, 77843-2475より入手可能；そのＤＮＡの抽
出法は実験医学Vol7,No13,146-151,1989,前田による)と
ｐＡｃＹＭ-Ｍｅｔ１３０Ｑ-２３８Ｑ ＤＮＡ２５μg
(塩化セシウム密度勾配法で２回精製したものを用いる)
を塩化カルシウムを含むヘペス−リン酸緩衝液(ｐＨ７.
０５)中で沈澱させる。一方において昆虫細胞Ｓpodopte
ra frugiperda９(Americun Type Culture Collection,1
2301 Parklawn Drive,Rockvlle,MD20852・1776より入手
可能；以下Ｓ.ｆ.９と略す)の１０％牛胎児血清を含む
グレース培地(ギブコ社)で培養したもの(約１〜１.５×
１０⁶個／２ml)を３５mmの細胞培養用シャーレ(ファル
コン社３００１)に入れて１時間静置し、細胞を培養さ
せておく。ついで、この細胞上清を抜き取り、上記のＤ
ＮＡ沈澱物を滴下し、１時間静置する。さらに細胞上清
を抜き取り、新たに１０％牛胎児血清を含むグレース培
地を２ml加えて２６.５℃で４日間培養する。得られた
培養液には、野生型ＡｃＮＰＶに加えて目的とする組換
え型バキュロウイルスＡｃＭｅｔ１３０Ｑ-２３８Ｑが
含まれている。

【００３５】この培養液からＡｃＭｅｔ１３０Ｑ-２３
８Ｑを取り出すためにプラークアッセイを行う。まず、
前記と同様に生育させたＳ.ｆ.９細胞(１０⁶個／３５mm
シャーレ)の培地を抜き取り、約４倍から１万倍に希釈
した培養液０.１mlを加える。約１時間静置後、培養液
を抜き取り、１％アガロース溶液[３％アガロース(低融
点シープラークアガロース、エフ・エム・シー社)と１
０％牛胎児血清を含むグレース培地を１対２で混合し、
３７℃に保温したもの]を１ml重層する。アガロースの
固化後、１mlの１０％牛胎児血清を含むグレース培地を
さらに重層し、２６.５℃で４日間保温し、ウイルスプ
ラークを生じさせる。生じたプラークの中で、中心が透
明なものをピペットの先などでアガロースごと吸い上
げ、１mlの１０％牛胎児血清を含むグレース培地に懸濁
して単離する(野生型ウイルスはプラークの中心に白い
濁りがあり、組換え型は透明である)。透明なプラーク
が見い出しにくい時はプラークが判別しやすいように適
当な濃度に元の培養液を希釈しなおして、プラークアッ
セイをやりなおす。ひろい上げた透明プラークのプラー
ク懸濁液をそれぞれ１００倍から１０００倍程度に希釈
し、その０.２mlを上記と同様な方法でＳ.ｆ.９細胞に
重層することでプラーククアッセイを繰り返し、他の野
生型ウイルス等のプラークの混りのないものとする。こ
うして単離したものが組換え型バキュロウイルスＡｃＭ
ｅｔ１３０Ｑ-２３８Ｑである。

【００３６】実施例３ ＡｃＭｅｔ１３０Ｑ-２３８Ｑ
を用いた成長ホルモンレセプターの細胞質外Ｃ-ドメイ
ン蛋白質の発現 上記実施例２で得た組換え体ウイルスＡｃＭｅｔ１３０
Ｑ-２３８Ｑを１２５mlのスピナーフラスコ(コーニング
社)で培養している３×１０⁸個のＳ.ｆ.９細胞に接種し
て２６.５℃で数日間培養し、１mlあたり約１０⁸個のプ
ラーク形成能を含むウイルスストックを調製する。な
お、これ以降のスピナーフラスコでの培養には０.２５
％トリプトースリン酸ブロース(ディフコ)、０.１％プ
ルロニックＦ-６８(ギブコ)、１０％牛胎児血清を含む
ＩＰＬ-４１培地(ギブコ)を用いる。

【００３７】目的とするｈＧＨＲ-ＣＤを大量に得るた
めには、１リットルのスピナーフラスコ(和研薬)で培養
を行う。培養に際しては酸素を供給する(溶存酸素濃度
３ppm)。

【００３８】具体的には、３×１０⁹個のＳ.ｆ.９細胞
を培養し、それに約５×１０⁹個プラーク形成能のＡｃ
Ｍｅｔ１３０Ｑ-２３８Ｑウイルスを接種し、２６.５℃
で数日間培養した後、細胞を集める。ＳＤＳを含む１５
％のポリアクリルアミド電気泳動をクモシーブルーで染
色し、分子量が約１３キロダルトンの位置にバンドが存
在するかどうかによって、目的のｈＧＨＲ-ＣＤが生産
されたかどうかを判定する。

【００３９】実施例４ 成長ホルモンレセプターの細胞
質外Ｃ-ドメインの昆虫細胞からの精製 実施例３で培養した約８ｇのＡｃＭｅｔ１３０Ｑ-２３
８Ｑ感染細胞を、０.１M 食塩、１０mM ＥＧＴＡ、１０
mM ＥＤＴＡ、１０mM メルカプトエタノール、０.５mM
ＰＭＳＦ、２μg／ml アプロチニン、１μg／ml ペプス
タチンＡ、５μg／ml ロイペプチンを含む５０mlの１０
mM リン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.２)に懸濁し、０℃
で２５分間超音波破砕する(ソニファイアー,ブロンソ
ン)。破砕液を当量のＴＢＳ緩衝液(２５mM トリス塩酸
(ｐＨ８.２)、０.２M 食塩)で希釈した後、４０,０００
回転３０分間４℃の超遠心(４０Ｔｉ,ベックマン)で遠
心分離し、その上清を集める。上清を１０mM トリス塩
酸緩衝液に対して１晩透析した後、同緩衝液で平衡化し
たＱ-セファロース(２.５cm直径×１２cm,ファルマシ
ア)に添加し、０−０.４Mの食塩の濃度勾配(全体で５０
０ml；１０mM トリス塩酸(ｐＨ８.２)緩衝液を含む)で
溶出する。目的物のｈＧＨＲ-ＣＤであるかどうかは、
ＳＤＳを含む１５％のポリアクリルアミド電気泳動で約
１３キロダルトンの位置にバンドがあるかどうかで判定
する。この段階で目的物はほぼ単一である。目的とする
１３キロダルトンの蛋白質を、８０％の飽和度になるよ
うに硫酸アンモニウムを添加して沈澱させることにより
回収する。硫酸アンモニウム沈殿物を極小量のＴＢＳ緩
衝液に溶解し、セファデックスＧ-７５カラムに添加
し、ＴＢＳ緩衝液で展開して、完全に単一にまで精製す
る。

【００４０】展開物はＳＤＳを含む１５％のポリアクリ
ルアミド電気泳動で単一の約１３キロダルトンのバンド
を示した。この標品のＮ末端アミノ酸シークエンスはＭ
ｅｔ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ-Ａｓｐ-Ｐｒｏ-Ｐｒｏ-Ｉｌｅｕ-
Ａｌａを示し、これは設計通りに期待されるｈＧＨＲ-
ＣＤのＮ末端アミノ酸配列を示すものであった。これら
の結果は精製された蛋白質が目的とするｈＧＨＲ-ＣＤ
であることを示すものである。最終的に１リットルの培
養から単一に精製された標品が１６mg得られた。

【００４１】単一にまで精製したｈＧＨＲ-ＣＤの活性
測定を、Ｍorikawaらの方法(Cell,29,783-789(1982))に
若干の修正を加えて行なった。この方法は株化せられた
前脂肪細胞Ｐreadipose ３Ｔ３-Ｆ４４２Ａがヒト成長
ホルモンに依存して脂肪細胞Ａdiposeへ分化する性質に
基づいている。この場合、前脂肪細胞が脂肪細胞へ分化
するとグリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ(ＧＰＤ
Ｈ)が誘導されるので、ＧＰＤＨの量を測定すれば分化
の量を測定することができる。これは成長ホルモンの成
長ホルモンレセプターへの働きかけによって誘起される
と考えられている。ここではヒト成長ホルモン存在下で
の前脂肪細胞から脂肪細胞への分化に対して、精製した
ｈＧＨＲ-ＣＤがいかなる影響を与えるかを調べた。

【００４２】具体的には、３Ｔ３-Ｆ４４２Ａ細胞(Gree
nとKekinde, Cell,2,105-113(1976))を１０％の牛血清
を含むダルベッコ培地(以下ＤＭＥＭ培地と略す)で培養
して維持する。実験には、さらに１×１０⁴個のこの３
Ｔ３-Ｆ４４２Ａ細胞を直径３５mmのシャーレに植え、
３％のネコ血清と２％のウシ血清を含むＤＭＥＭ培養液
で４日間培養し、細胞がシャーレ面を大体を覆う位まで
成長させる。この段階で培養液を転換培地(１.５％ ネ
コ血清、１％ ウシ血清、５μg／ml ウシインシュリ
ン、５μg／ml ヒトトランスフェリン、２×１０^-9M ３
-ヨードチロシン、１０^-6M ビオチン、４０μM ２-メル
カプトエタノール、３０ng／ml マウスエピダーナルグ
ロースファクター、並びにｈＧＨおよび様々の濃度のｈ
ＧＨＲ-ＣＤを含むＤＭＥＭ培養液)に変えてさらに１０
日間培養する。この段階で細胞を１mMＥＤＴＡを含む２
５ｍＭトリス塩酸緩衝液(ｐＨ７.５)に集め、超音波で
細胞を破砕し、１０,０００回転で遠心して上清を集め
る。

【００４３】この上清中のＧＰＤＨ活性をＮＡＤＨの酸
化活性で測定する(ＷiseとＧreen,J.Biol.Chem.,254 27
3-275(1979))。具体的には、１００mMトリエチルアミン
塩酸緩衝液(ｐＨ７.５)、２.５mM ＥＤＴＡ、０.１２mM
ＮＡＤＨ、０.２mMデヒドロアセトンリン酸及び０.１m
Mメルカプトエタノールからなる溶液に１００μlになる
ように１〜１００μgの上清を加えて、２５℃で３４０n
mの吸収の変化を測定する。全細胞の蛋白質量はクマシ
ー−ブリリアントブルーＧ-２５０法(SeclmakとGrossbe
rg,Anal.Biochem.,79 544-552(1977))で測定できる。前
脂肪細胞Ｐreadipose ３Ｔ３-Ｆ４４２Ａから脂肪細胞
Ａdiposeへの分化の程度を、全細胞蛋白質量あたりのＧ
ＰＤＨ活性つまりＮＡＤＨの酸化量で表す。

【００４４】この測定によって、精製したｈＧＨＲ-Ｃ
Ｄの添加がヒト成長ホルモン存在下で前脂肪細胞の分化
を促進するという結果が得られた(図３)。これは、ｈＧ
ＨＲ-ＣＤがヒト成長ホルモンの存在下でその効果を増
強することを強く示唆するものである。

【００４５】実施例５ ヒト成長ホルモンレセプターの
細胞質外Ｃ-ドメイン蛋白質をコードするＤＮＡ断片の
調製と大腸菌発現ベクターｐＭＢＰ-ＧＳ１２９Ｖ-２３
８Ｑの構築 公知のヒト成長ホルモンレセプターのアミノ酸配列(Leu
ngら,Nature,330:537-543(1987))を基に、その細胞質外
Ｃ−ドメイン蛋白質をコードするＤＮＡ断片を配列番号
５に示すように設計した。このＤＮＡ断片はｈＧＨＲ-
ＣＤの１２９番バリンから２３８番グルタミンをコード
するばかりでなく、その部分を大腸菌マルトース結合蛋
白質(以下、ＭＢＰと略す)との融合型で発現させるベク
ター中に挿入することができるにように設計されてい
る。本態様では、ＭＢＰとｈＧＨＲ-ＣＤとの間にファ
クターＸａの認識部位であるＩｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-
Ａｒｇをコードする配列が挿入されている。したがって
この場合、ＭＢＰと融合した形で発現したｈＧＨＲ−Ｃ
Ｄは、制御プロテアーゼファクターＸａによる切断によ
ってＭＢＰから切り放される。本実施例ではファクター
Ｘａがより効率よく作用できるように１２９番バリンの
Ｎ末端側にグリシン-セリンをコードする配列であるＧ
ＧＴＴＣＴが付着している。またＣ末端には終結コドン
ＴＡＡが付着している。さらに、調製したＤＮＡ断片を
ｐＭＡＬ^TMＣのＨinｄIII部位に連結するべく、このＤ
ＮＡ断片のＣ末端側をさらに延長して、その延長部にＨ
inｄIII認識部位を形成させている。

【００４６】上記ＤＮＡ断片の実際の調製にはＰＣＲを
使った。具体的には、まず、それぞれ配列番号６及び配
列番号７に記載の塩基配列を有するＮ-末端プライマー
２及びＣ-末端プライマー２を実施例１と同様の方法で
調製する。次いで、２μM Ｎ-末端プライマー２(５末端
がリン酸化されているもの)、２μM Ｃ-末端プライマー
２、１ng ｐＢＳＲ８-３ ＤＮＡ、１０μl １０×反応
緩衝液、各０.２５mMのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ溶液、０.５μl Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼ
を加えて最終の量を１２０μlとする。以下は実施例１
と同様にＰＣＲを行ない、目的とするＤＮＡ断片を合成
する。合成されたＤＮＡ断片をフェノール処理及びエタ
ノール沈殿によって抽出・精製する。その精製ＤＮＡの
うちの約１μgを０.１M食塩及び１０mM塩化マグネシウ
ムを含む５０mMトリス塩酸緩衝液(ｐＨ７.５)５０μlに
溶解し、さらに制限酵素ＨindIII(宝酒造)５単位と共に
３７℃で１時間インキュベートしてＤＮＡを消化する。
この消化反応液をフェノール処理及びエタノール沈殿し
た後、１％アガロースゲルの電気泳動にかけ、約０.３k
bpのバンドを切り出し、スプレック-０１(宝酒造)に入
れ、−８０℃で１５分間凍結した後、３７℃で５分間イ
ンキュベートして融解する。これを５０００回転で１０
分間遠心してその濾液を回収する。フェノール処理及び
エタノール沈殿によって濾液から目的とするＤＮＡ断片
を取り出す。

【００４７】続いて、上記ＤＮＡ断片を、ｐＭＡＬ^TMＣ
(ニューイングランドバイオラボ社から購入可能)のＭＢ
Ｐの下流に連結された制限プロテアーゼファクターＸａ
の認識配列Ｉｌｅ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ末端に存在す
るＳtuＩ部位と、ＨinｄIII部位の間に挿入する(図４)。

【００４８】具体的には、約１μgのｐＭＡＬ^TMＣ ＤＮ
Ａを５０mM食塩及び１０mM塩化マグネシウムを含む１０
mMトリス塩酸緩衝液(ｐＨ７.５)５０μlに溶解し、さら
にそれぞれ５単位の制限酵素ＳtuＩとＨinｄIIIを加え
て、３７℃で１時間インキュベートすることにより、加
えたＤＮＡを消化する。次に、１％アガロースゲルの電
気泳動にかけて大きい方のＤＮＡ断片に相当するバンド
を切り出し、スプレック-０１(宝酒造)に入れ、−８０
℃で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュベー
トして融解する。これを５０００回転で１０分間遠心し
て、その濾液を回収する。フェノール処理及びエタノー
ル沈殿によって濾液から目的とするＤＮＡ断片を取り出
す。続いてこれを上で調製したＤＮＡ断片と混合し、１
mMのＥＤＴＡを含む１０mMトリス塩酸緩衝液(ｐＨ７.
４)を加えて４μlとする。これを１６μlのＡ液及び４
μlのＢ液(ＤＮＡライゲーションキット；宝酒造)と混
合し、１６℃で３０分間反応させた。これを１００μl
の大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９コンピテントセル(宝酒造
より購入可能)と混合し、０℃で３０分間、さらに４２
℃で２分間インキュベートすることでＪＭ１０９株へ移
入して発現プラスミッドｐＭＢＰ-ＧＳ１２９Ｖ-２３８
Ｑを構築した。このプラスミッドを導入した大腸菌Ｋ１
２株ＪＭ１０９／ｐＭＢＰ-ＧＳ１２９Ｖ-２３８Ｑは通
産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
(受託日：平成４年１２月３日，受託番号：微工研菌寄
第１３３１８号)。

【００４９】実施例６ ヒト成長ホルモンレセプターの
細胞質外Ｃ-ドメインの融合蛋白質としての発現と精製 発現プラスミッドｐＭＢＰ-ＧＳ１２９Ｖ-２３８Ｑを大
腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９へ形質導入し、その形質変換体
を作成する。

【００５０】ごく少量の消泡剤を添加した１リットルの
ＲＭＧ培地[１０g バクトトリプトン(ディフコ)、５g
イーストエキス(ディフコ)、８g 食塩、１００μg／ml
アンピシリン、０.２％ グルコースを含む培地]に上記
形質変換体を接種し、３７℃でミッドログフェーズ(ク
レット約１００位)まで増殖させる。それにＩＰＴＧ(シ
グマ社)を最終濃度が１mMになるように添加した。続い
て、３０℃で約５時間培養後、菌体を集め、破砕するま
では−７０℃に凍結して保存する。

【００５１】凍結した菌体を１００mlの溶解緩衝液(０.
１M 食塩、１０mM ＥＧＴＡ、１０mM ＥＤＴＡ、１０mM
メルカプトエタノール、０.５mM ＰＭＳＦ、２μg／ml
アプロチニン、１μg／ml ペプスタチンＡ、５μg／ml
ロイペプチンを含む１０mMナトリウムリン酸(ｐＨ７.
２)緩衝液)で溶かした後、０℃で２５分間、超音波で破
砕する(ソニファイアー,ブロンソン)。破砕液を当量の
ＴＢＳ緩衝液(トリス塩酸(ｐＨ８.２)、０.２M 食塩)で
希釈した後、４０,０００回転で３０分間超遠心し、そ
の上清を集める。これに４０％の飽和度になるように硫
酸アンモニウムを加え、生じた沈澱を１２,０００回転
の遠心によって除いた後、さらにその上清に８０％の飽
和度になるように硫酸アンモニウムを加え、生じた沈澱
をやはり１２,０００回転の遠心で集める。これを５０m
lのＴＢＳ緩衝液に懸濁した後、２リットルの１０mM ト
リス緩衝液(ｐＨ８.２)に対して一晩透析する。この透
析した液をＱ-セファロース(２.５cm直径×１０cm；フ
ァルマシア)に添加し、全体で５００mlのトリス塩酸(ｐ
Ｈ８.２)を含む緩衝液で０−０.４M 食塩の濃度勾配で
溶出する。ＭＢＰにｈＧＨＲ-ＣＤが融合した形態の目
的とする蛋白質は、２８０nmの吸光度で追跡すると０.
２M 食塩濃度付近にピークとして溶出され、ＳＤＳを含
む１５％のポリアクリルアミド電気泳動で約５４キロダ
ルトンの分子量を示すことで確認することができる。

【００５２】目的物の画分をセントリプレップ-３０(ア
ミコン)で約２０ml位にまで濃縮する。濃縮液に２mMに
なるように塩化カルシウムを添加する。これにさらに５
０μlのプロテアーゼファクターＸａ(ニューイングラン
ドバイオラボ社)を添加して１６℃で４８時間反応させ
る。これによりｈＧＨＲ-ＣＤがＭＢＰから切り放され
る。

【００５３】反応後、最終的に５mMになるようにＥＧＴ
Ａを、また１０mMになるようにマルトースを添加した
後、１０mMのマルトースを含む１０mMのトリス塩酸緩衝
液１リットルに対して１晩透析する。透析した溶液は再
度前記と同じ大きさのＱ-セファロースに添加し、今度
は前記の溶出緩衝液にさらに１０mM マルトースを添加
した上で、やはり０−０.４Ｍ食塩の濃度勾配で溶出す
る(図５)。２８０nmの吸光度で追跡すると、０.１５M
食塩濃度付近にＭＢＰから切り出された目的物のｈＧＨ
Ｒ-ＣＤが溶出される。ＳＤＳを含む１５％のポリアク
リルアミドゲル電気泳動で約１３キロダルトンのバンド
を検出することによって、これが目的物であることを確
認することができる。なおＭＢＰはｈＧＨＲ-ＣＤのピ
ークの後に溶出され、その分子量は約４２キロダルトン
である。

【００５４】硫酸アンモニウムを飽和濃度の８０％濃度
になるように加えることによって、１３キロダルトンの
画分を沈澱させ、濃縮する。濃縮液を少量のＴＢＳ緩衝
液に溶かした後、バイオゲルＰ-６０Ｍ(直径３.２cm×
８０cm；バイオ・ラッド社）に添加して０.２M 食塩を
含む２０mM ナトリウムリン酸緩衝液(ｐＨ７.２)で精製
する。

【００５５】このようにして、１リットルで培養した菌
体から約１０mgの単一に精製したｈＧＨＲ-ＣＤを得る
ことができる。このＮ末端のアミノ酸配列を調べたとこ
ろＧｌｙ-Ｓｅｒ-Ｖａｌ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ-Ａｓｐ-Ｐｒｏ
であり、これは予想されるＮ末端の配列と一致するもの
であった。以上の結果は精製されたものが目的とするｈ
ＧＨＲ-ＣＤであることを示すものである。

【００５６】大腸菌から単一にまで精製したｈＧＨＲ-
ＣＤの活性を、実施例４と同様に前脂肪細胞Ｐreadipos
e ３Ｔ３-Ｆ４４２Ａの脂肪細胞Ａdiposeへの分化に対
する影響に基づいて測定した。その結果として、昆虫細
胞から精製したｈＧＨＲ-ＣＤと同様に、ヒト成長ホル
モン存在下で分化を促進するという結果を得た(図６)。
この結果は、昆虫細胞を宿主とする系の場合と同様に、
大腸菌を宿主とする系で製造されたｈＧＨＲ-ＣＤがヒ
ト成長ホルモンの作用を増強することを示唆するもので
ある。

【００５７】

【配列表】

【００５８】配列番号：１ 配列の長さ：２４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Ser Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala Pro Trp 1 5 10 15 Ser Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser Lys Glu 20 25 30 Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe Ser Cys 35 40 45 His Trp Thr Asp Glu Val His His Glu Thr Lys Asn Leu Gly Pro Ile 50 55 60 Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln Glu Trp 65 70 75 80 Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe 85 90 95 Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys Leu Thr 100 105 110 Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp Glu Ile 115 120 125 Val Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu Asn Val 130 135 140 Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu Ala Pro 145 150 155 160 Arg Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr Glu Leu 165 170 175 Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp Pro Ile 180 185 190 Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys Glu Tyr 195 200 205 Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr Gly Glu 210 215 220 Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln Phe Thr 225 230 235 240 Cys Glu Glu Asp Phe Tyr 245

【００５９】配列番号：２ 配列の長さ：３４８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GATCT ATG CAA CCA GAC CCA CCA ATC GCT TTA AAC TGG ACT TTG TTG 47 Met Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu 1 5 10 AAC GTC TCT TTG ACT GGT ATT CAC GCT GAT ATC CAA GTT AGA TGG GAA 95 Asn Val Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu 15 20 25 30 GCT CCA AGA AAC GCC GAC ATT CAA AAA GGC TGG ATG GTT CTA GAA TAC 143 Ala Pro Arg Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr 35 40 45 GAA TTG CAA TAC AAG GAA GTC AAC GAA ACT AAA TGG AAG ATG ATG GAT 191 Glu Leu Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp 50 55 60 CCA ATC TTG ACC ACT TCT GTT CCA GTT TAC TCT CTT AAG GTT GAC AAG 239 Pro Ile Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys 65 70 75 GAA TAC GAA GTT AGA GTC AGA TCC AAG CAA AGA AAC TCT GGT AAC TAC 287 Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr 80 85 90 GGT GAA TTT TCC GAA GTA CTG TAC GTC ACC TTG CCA CAA ATG TCT CAA 335 Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln 95 100 105 110 TAATAGAGAG ATC 348

【００６０】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCAGATCTAT GCAACCAGAC CCACCAATCG 30

【００６１】配列番号：４ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴ ＡＴＴＡＴＴＧＡＧＡ ＣＡＴ
ＴＴＧＴＧＧ ２９

【００６２】配列番号：５ 配列の長さ：３４３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ＧＧＴ ＴＣＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＣＣＡ ＧＡＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＡＴＣ
ＧＣＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＣＴ ＴＴＧ ＴＴＧ ４８ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｉｌｅ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ １ ５
１０ １５ ＡＡＣ ＧＴＣ ＴＣＴ ＴＴＧ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＴＴ ＣＡＣ ＧＣＴ
ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＡ ＧＴＴ ＡＧＡ ＴＧＧ ＧＡＡ ９６ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｇｌｕ ２０ ２５
３０ ＧＣＴ ＣＣＡ ＡＧＡ ＡＡＣ ＧＣＣ ＧＡＣ ＡＴＴ ＣＡＡ ＡＡＡ
ＧＧＣ ＴＧＧ ＡＴＧ ＧＴＴ ＣＴＡ ＧＡＡ ＴＡＣ １４４ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ ３５ ４０
４５ ＧＡＡ ＴＴＧ ＣＡＡ ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＡ
ＡＣＴ ＡＡＡ ＴＧＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＡＴ １９２ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ａｓｐ ５０ ５５
６０ ＣＣＡ ＡＴＣ ＴＴＧ ＡＣＣ ＡＣＴ ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＣＡ ＧＴＴ
ＴＡＣ ＴＣＴ ＣＴＴ ＡＡＧ ＧＴＴ ＧＡＣ ＡＡＧ ２４０ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ ６５ ７０
７５ ８０ ＧＡＡ ＴＡＣ ＧＡＡ ＧＴＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＧＡ ＴＣＣ ＡＡＧ
ＣＡＡ ＡＧＡ ＡＡＣ ＴＣＴ ＧＧＴ ＡＡＣ ＴＡＣ ２８８ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｙｒ ８５
９０ ９５ ＧＧＴ ＧＡＡ ＴＴＴ ＴＣＣ ＧＡＡ ＧＴＡ ＣＴＧ ＴＡＣ ＧＴＣ
ＡＣＣ ＴＴＧ ＣＣＡ ＣＡＡ ＡＴＧ ＴＣＴ ＣＡＡ ３３６ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｎ １００ １０５
１１０ ＴＡＡＡＧＣＴ
３４３

【００６３】配列番号：６ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ＧＧＴＴＣＴＧＴＣＣ ＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣ ＡＣＣ
ＡＡＴＣＧＣ ２９

【００６４】配列番号：７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GGAAGCTTTA TTGAGACATT TGTGGCAAGG 30

【図面の簡単な説明】

【図１】 転位ベクターｐＡｃＹＭ-Ｍｅｔ１３０Ｑ-２
３８Ｑ構築の概略。

【図２】 組換え型バキュロウイルスＡｃＭｅｔ１３０
Ｑ-２３８Ｑの調製および単離方法の概略。

【図３】 昆虫細胞を宿主とする組換え発現系によって
製造されたｈＧＨＲ-ＣＤの、成長ホルモン存在下また
は非存在下における前脂肪細胞から脂肪細胞への分化に
対する効果を表すグラフ。

【図４】 大腸菌発現プラスミッドｐＭＢＰ-ＧＳ１２
９Ｖ-２３８Ｑ構築の概略。

【図５】 ＭＢＰ／ｈＧＨＲ-ＣＤ融合蛋白質のプロテ
アーゼファクターＸａ消化によって生成した切断産物Ｍ
ＢＰおよびｈＧＨＲ-ＣＤ蛋白質のＱ-セファロースカラ
ムによる分離を示すクロマトグラフ。

【図６】 大腸菌を宿主とする組換え発現系によって製
造されたｈＧＨＲ-ＣＤの、成長ホルモン存在下または
非存在下における前脂肪細胞から脂肪細胞への分化に対
する効果を表すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/12 15/62 15/70 15/83 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 成長ホルモンレセプターの細胞質外Ｃ-
   ドメイン蛋白質。
2. 【請求項２】 該成長ホルモンレセプターがヒト成長ホ
   ルモンレセプターである請求項１に記載の蛋白質。
3. 【請求項３】 配列番号２または配列番号５に記載のア
   ミノ酸配列を有する請求項２に記載の蛋白質。
4. 【請求項４】 請求項１に記載の蛋白質をコードしてい
   るＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】 配列番号２または配列番号５に記載のコ
   ード領域の塩基配列を有する請求項４に記載のＤＮＡ断
   片。
6. 【請求項６】 請求項４に記載のＤＮＡ断片をバキュロ
   ウイルス遺伝子発現系の制御下に含有している組換え型
   プラスミッド。
7. 【請求項７】 請求項４に記載のＤＮＡ断片をバキュロ
   ウイルス遺伝子発現系の制御下に含有している組換え型
   バキュロウイルス。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の組換え型バキュロウイ
   ルスを昆虫細胞に感染して培養することからなる請求項
   １に記載の蛋白質の製造方法。
9. 【請求項９】 培養後、細胞抽出液より請求項１に記載
   の蛋白質を回収することを特徴とする請求項８に記載の
   方法。
10. 【請求項１０】 請求項４に記載のＤＮＡ断片を大腸菌
    遺伝子発現系の制御下に含有している組換え体プラスミ
    ッド。
11. 【請求項１１】 大腸菌マルトース結合蛋白質に融合し
    た請求項１に記載の蛋白質をコードする請求項１０に記
    載の組換え体プラスミッド。
12. 【請求項１２】 請求項１０または請求項１１に記載の
    プラスミッドで形質転換した大腸菌。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の大腸菌を培養する
    ことによって該大腸菌内に第１項に記載の蛋白質を蓄積
    させ、該大腸菌より請求項１に記載の蛋白質を回収する
    ことからなる請求項１に記載の蛋白質の製造方法。