JPH0217156B2 - - Google Patents

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請求の範囲 １ ヒトエリスロポエチンのマチユア部分にあた
る下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含
むことを特徴とするDNA： 【表】 【表】 明細書 本発明は、天然ヒトエリスロポエチンをコード
するDNA（配列）及びそれから推定される該エリ
スロポエチンのアミノ酸配列を知見したことに基
づくものである。 本発明は上記知見に基づき、組換DNA技術を
利用した、ヒトエリスロポエチンの生産に関する
ものである。 血球増生、即ち赤血球の産生は、人間が生きて
いる限り、細胞破壊を補うために継続して行なわ
れる。血球増生は、循環を妨げる程多くはない充
分な数の赤血球を、適切な組織に酸素供給する血
液中で利用可能にさせる、非常に正確に制御され
た生物学的メカニズムである。赤血球の産生は骨
髄で行なわれ、ホルモン、即ちエリスロポエチン
で制御されている。 エリスロポエチンは分子量約34000ダルトンの
酸性糖蛋白質であつて、組織が実在数の赤血球か
ら充分な酸素供給を受けている健康状態に体があ
る場合、血漿中において極めて低濃度で存在して
いる。この正常な低濃度であつても、普通時間を
経るにつれて減少する赤血球の補充を促進するに
は充分である。 エリスロポエチンの循環量は、血球の循環によ
る酸素輸送量が減少する低酸素症状態下では増加
する。低酸素症は、出血による多量の血液の喪
失、放射線への過度露出による赤血球の破壊、高
所もしくは長期の意識喪失による酸素摂取量の減
少又は各種貧血によつて起こる可能性がある。組
織が低酸素ストレスを受けると、エリスロポエチ
ンは、骨髄中の原始前駆細胞が、前赤芽球（前赤
芽球はひき続いて成熟し、ヘモグロビンを合成
し、赤血球として循環系に放出される）に変換さ
れるのを促進することにより、赤血球の産生を増
大させる。循環系の赤血球数が正常組織での酸素
要求量よりも多い場合は、循環系エリスロポエチ
ンは減少する。 エリスロポエチンは赤血球形成過程で欠かせな
いものであるため、このホルモンは赤血球の産生
能が低く又は欠陥がある血液疾患の診断及び治療
に有効に適用することができる。 最近の研究により、各種の病態、疾患及び血液
異常状態において、エリスロポエチン治療の有効
性を予想する基礎が与えられた。 血漿又は尿から高収率でエリスロポエチンを得
ようとする以前の試みは不成功に終つた。複雑で
高度な実験技術が必要とされるが、一般には不純
で不安定な微量のエリスロポエチン含有抽出物を
集められるにしかすぎない。 米国特許第3033753号明細書には、ヒツジ血漿
からエリスロポエチンを部分的に精製するための
方法が記載されているが、低収率でエリスロポエ
チン含有粗製固体抽出物が得られただけである。 尿からエリスロポエチンを単離する初期の試み
では、不安定で生物学的に不活性なそのホルモン
調製物が得られた。米国特許第3865801号明細書
には、尿から回収されたエリスロポエチン含有粗
製物質の生物学的活性を安定化させる方法が開示
されている。得られるエリスロポエチン含有粗製
物は、称するところでは、90％のエリスロポエチ
ン活性を有しており、しかも安定である。 再生不良性貧血患者の尿からヒトエリスロポエ
チンを精製する別の方法が、ミヤケら、ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリイ、第
252巻、第15号、pp5558−5564（1977年８月10日）
［Miyake、et al.、J.Biol.Chem.、Vol252、No.
15、pp5558−5564］に記載されている。この７
工程の操作には、イオン交換クロマトグラフイ
ー、エタノール沈澱、ゲル過及び吸着クロマト
グラフイーが含まれ、21％の収率で、70400単
位／mgの比活性がある純粋なエリスロポエチン調
製物が得られている。 タケザワらの米国特許第4397840号明細書には、
弱塩基性イオン交換物にて健康なヒトの尿試料か
ら「エリスロポエチン生成物」を製造する方法が
記されており、エリスロポエチン阻害効果のない
低分子量生成物が得られたと述べている。 1982年５月６日に公開されたスギモトらによる
英国特許出願第2085887号明細書には、ハイブリ
ツドヒトリンパ芽球細胞の産生方法が述べてあ
り、哺乳類宿主増殖物が10⁷細胞／mlとなつた後、
培地に分配された細胞懸濁液１ml当り３〜420単
位のエリスロポエチン産生量があると報告されて
いる。達成されたとする最大の産生レベルでは、
エリスロポエチン産生速度は、イン・ビボ増殖系
から細胞が移し変えられたイン・ビトロ培地にお
いて、40〜4000単位／10⁶細胞／48時間と計算さ
れた（対応する米国特許第4377513号明細書も参
照）。多数の提案が新生物細胞をはじめとする組
織源からエリスロポエチンを単離するためになさ
れたが、収率は極めて低かつた。 精製エリスロポエチンの取得のために利用され
る他の単離技術としては、免疫学的操作がある。
エリスロポエチンに対する「モノクローナル」抗
体を得るために細胞融合とハイブリツド形成技術
を用い、更にヒトエリスロポエチンの単離と定量
化のためにこれらの抗体を用いる試みが行なわれ
た。 ポリクローナル及びモノクローナル抗体は、エ
リスロポエチンの定性及び定量のためのイムノア
ツセイに使用され、更にエリスロポエチンのアフ
イニテイー精製においても有用性を有する。しか
しながら、詳細な分析、臨床試験及び、例えば、
疾患組織がエリスロポエチン産生をになうことが
できない慢性腎疾患の治療のような、該物質の潜
在的に広範な治療用途にとつて充分なだけ多量の
エリスロポエチンを哺乳類源から単離する目的に
は、前記抗体を有効に活性することは難しいと考
えられている。したがつて、哺乳類エリスロポエ
チンを充分に特定化でき、しかも可能性のある診
断及び臨床的用途のためにそれを大量に供給する
為には、大規模な哺乳類エリスロポエチンの微生
物による大規模な合成をもたらす組換え操作の実
用化を成功させる必要があると、当業者間では考
えられている。 ヒト及び他の哺乳類のエリスロポエチンをコー
ドしているDNA配列を実験的に単離する実質的
な努力がこれまでなされてきたが、誰もまだ成功
していない。これは主に、エリスロポエチンをコ
ードするDNA配列を従来の技術により単離する
ことのできるcDNAライブラリーを構成し得る
mRNAに富む組織源、特にヒト組織源、の欠乏
に起因するものである。更に、エリスロポエチン
のアミノ酸残基連鎖についてはほとんど未知であ
るため、例えばcDNA特にゲノムDNAライブラ
リーのDNA／DNAハイブリダイゼーシヨンスク
リーニングにおいて安心して直ちに使用すること
ができる長鎖ポリヌクレオチドプローブを調製す
ることができないことによる。エリスロポエチン
のためのヒト遺伝子はヒトゲノム内で「単一の遺
伝子」として存在しているらしく、いかなる場合
も、ヒトエリスロポエチンをコードする遺伝子物
質はゲノムライブラリーに存在する総ヒトゲノム
DNAの0.00005％未満を構成するにしかすぎない
と推定される。 現在までのところ、単離可能量の哺乳類エリス
ロポエチンの微生物発現における使用に適した
DNA配列を与える組換え関連方法において、最
も成功した既知報告例でも、目標にはほど遠いも
のであつた。一例として、フアーバーら：「エク
スペリメンタル・ヘマトロジー」、第11巻、第14
増刊号、抄録101、1983年［Farber、et al.、
Exp.Hematol.、11、Supp.14、Abstract 101
（1983）］では、フエニルヒドラジン処理ヒヒの腎
臓組織からmRNAを抽出し、このmRNAをアフ
リカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞に
注入したが、それらの中に含まれるエリスロポエ
チンの生物学的性質を示す「翻訳生成物」の混合
体がイン・ビトロで産生するのはむしろ一時的な
結果であつたと報告している。更に最近におい
て、フアーバーら：「ブラツド」、第62巻、第５
号、第１増刊号、抄録392、第122a頁、1983年
［Farber、et al.、Blood、62、No.５、Supp.No.
１、Abstract392、at page122a（1983）］は、カ
エル卵母細胞によるヒト腎臓mRNAのイン・ビ
トロ翻訳について報告した。その得られた翻訳生
成混合体には、注入されたmRNA1μｇ当り、エ
リスロポエチン活性を有する翻訳生成物が220ｍ
Ｕ含有されていると推定された。エリスロポエチ
ンをコードしている外来性mRNAのこのような
イン・ビトロ翻訳量が（従来報告された、必要と
する生成物へのヒヒmRNA翻訳量と比べて）著
しく低いと認められたが、この結果は、ヒト腎臓
を、所望の遺伝子が単離され得る豊富なヒト腎
cDNAライブラリーの構成を可能にするエリスロ
ポエチン発現部位としてみなさせるものであると
考えられた［フアーバー：「クリニカル・リサー
チ」、第31巻、第４号、第769A頁、1983年
［Farber、Clin.Res.、31(4)、769A（1983）］も参
照］。 米国特許出願第561024号及び第582185号の出願
以後、大腸菌内で、ヒトエリスロポエチンcDNA
とみなされていた物質のクローニングと発現に関
する一つの報告がなされた。簡単に言えば、多数
のcDNAクローンが大腸菌プラスミドに挿入さ
れ、β−ラクタマーゼ融合生成物がヒトエリスロ
ポエチンの非特異的「エピトープ」に対するモノ
クローナル抗体と免疫応答性を有することに着目
されたのである。リー−フアン：「プロシーデイ
ングス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ」（米国）、第81巻、第2708−2712
頁、1984頁［Lee−Huang、Proc.Nat.Acad.Sci.
（U.S.A）、81、pp2780−2712（1984）］参照。 本発明は、その対立遺伝子変異体をも含む天然
エリスロポエチンの一次構造形状（即ち、アミノ
酸残基の連続配列）の一部もしくは全部、及び一
以上の生物学的性質（例えば、免疫学的性質並び
にイン・ビボ及びイン・ビトロでの生物学的活
性）を有する新規な精製単離されたポリペプチド
生成物をはじめて提供するものである。これらの
ポリペプチドは、ゲノムDNAもしくはcDNAの
クローニング又は遺伝子の合成によつて得られる
外来性DNA配列の原核もしくは真核宿主での発
現生成物（例えば、細菌、酵母、及び哺乳類の培
養細胞による）であるということによつても独特
に特徴づけられる。脊椎動物（例えば、哺乳類及
び鳥類）細胞における微小生物発現生成物は、自
然の哺乳類細胞環境又は血漿もしくは尿のような
細胞外液におけるエリスロポエチンと関連性があ
るであろうヒト蛋白質又は他の夾雑物とは全く関
係がないということによつて、更に特徴づけられ
るかもしれない。典型的な酵母［例えば、サツカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccaromyces
cerevisiae）］又は原核生物（例えば、大腸菌）
を宿主細胞とする生成物は、いかなる哺乳類の蛋
白質とも関連性を有していない。使用する宿主に
よつて、本発明のポリペプチドは哺乳類もしくは
他の真核生物の炭水化物によつてグリコシル化さ
れ、あるいはグリコシル化されないかもしれな
い。本発明のポリペプチドはまた、最初にメチオ
ニンアミノ酸残基（１番目の位置）を含んでいて
もよい。 本発明の新規な糖蛋白質生成物には、その一以
上の生物学的性質が得られるのに充分な天然（例
えばヒト）エリスロポエチンの複製である一次構
造形状を有し、天然（例えばヒト）エリスロポエ
チンのそれとは異なる平均的炭水化物組成を有す
るものが含まれる。 本発明により得られる脊椎動物（例えば、
COS−１及びCHO）細胞は、イン・ビトロで継
続した増殖が可能であつて、培地で増殖させた場
合、それらの培地中にて、ラジオイムノアツセイ
により48時間で10⁶個の細胞当り100単位以上（好
ましくは500単位以上、最も好ましくは1000〜
5000単位以上）のエリスロポエチンを産生するこ
とができる、常に入手し得る最初の細胞である。 更に、本発明によつて、初めて解明されたエリ
スロポエチンアミノ酸残基の連続配列の全体的も
しくは部分的複製である合成ポリペプチドが提供
される。これらの配列は、天然エリスロポエチン
の一次、二次又は三次構造形状特性を有している
ため、治療及び免疫過程でエリスロポエチンの生
物学的活性なもしくは免疫学的な代用物として用
いられるような、天然産物に共通した生物学的活
性及び（又は）免疫学的性質を有しているであろ
う。これに付随して、標準的手段によつて得ら
れ、このようなポリペプチドと免疫応答し、好ま
しくは天然エリスロポエチンとも免疫応答するモ
ノクローナル及びポリクローナル抗体が提供され
る。 本発明では、サル及びヒト種起源のクローン
DNA配列並びにそれから適切に誘導されたポリ
ペプチド配列についても解明しており、それらは
それぞれサル及びヒト種起源エリスロポエチンの
一次構造形状を表わしている。 更に本発明により、本発明のDNA配列を取り
込んだ新規な生物学的機能性のウイルス及び環状
プラスミドDNAのベクター、並びにそのような
ベクターにより安定にトランスフオーメーシヨン
又はトランスフエクシヨンがなされた微生物（例
えば、細菌、酵母及び哺乳類の細胞）宿主生物も
提供される。これに対応し、外来性ベクター担持
DNA配列の大規模な発現を促進する条件下にお
いて、このようなトランスフオーメーシヨン又は
トランスフエクシヨンされた微生物宿主を培養増
殖させ、増殖培地、細胞ライセート又は細胞膜画
分から所望のポリペプチドを単離することからな
る有用なポリペプチドの新規製造方法が、本発明
によつて提供される。 上記方法で得られる微生物発現ポリペプチドの
単離精製は、例えばプレパラテイブ・クロマトグ
ラフイー分離、並びにモノクローナル及び（又
は）ポリクローナル抗体調製物を用いる免疫学的
分離のような従来の手段によつて行なつてもよ
い。 エリスロポエチンのアミノ酸残基配列が解明さ
れたので、本発明により、エリスロポエチンをコ
ードするDNA配列の全体的及び（又は）部分的
製造がなされるが、そのDNA配列には、選ばれ
た非哺乳類宿主による発現に「好適な」コードン
の取り込み、制限エンドヌクレアーゼ酵素による
開裂部位の具備及び容易に発現するベクターの構
築を容易にする別の開始、終末又は中間DNA配
列の具備というような有利な特性が備えられてい
る。これに伴い、本発明は、一以上のアミノ配残
基の同一性又は位置に関して天然型とは異なる
が、天然型の一部もしくは全部の性質を有してい
るエリスロポエチンポリペプチド類似体もしくは
誘導体（即ち、エリスロポエチンの特定の残基を
全てではないが有する削除類似体、及び（又は）
一以上の特定の残基が他の残基と置換された置換
類似体、及び（又は）一以上のアミノ酸残基がポ
リペプチドの終末又は中間部位に付加された付加
類似体）の微生物発現をコードしているDNA配
列の製造法（並びにcDNA及びゲノムDNAの部
位特定突然変異誘発による生成法）を提供する。 本発明のDNAは、微生物宿主細胞における発
現によつて、天然エリスロポエチンの生物学的性
質を有するポリペプチド生成物を産生させること
のできる配列であつて、具体的には、表にヒト
EPOポリペプチドとして示したアミノ酸配列
（−27〜166又は１〜166）をコードする塩基配列
を含むDNA配列（縮重を含む）であり、例えば、
表に示したゲノムDNA配列及び表′、表
、表XIに示したイントロンを含まないDNA
配列を挙げることができる。 本発明には、エリスロポエチン治療、具体的に
は貧血症の状態及び最も具体的には慢性腎疾患を
伴うような貧血状態の治療に使用し得る、本発明
のポリペプチド生成物の治療上有効量と薬学上許
容される希釈剤、及びアジユバンド及び（又は）
担体とからなる医薬組成物も含まれる。 本発明のポリペプチド生成物は、固体組織及び
血液又は尿のような液体試料中のエリスロポエチ
ンの定性及び定量に有用な試薬とするために、検
出可能なマーカー物質と共有結合させて標準化し
てもよい（例えば ¹²⁵Iで放射線標識化する。）。
本発明のDNA生成物もまた、（放射線標識及びビ
オチンのような非同位元素標識のような）検出可
能なマーカーで標識化されていてもよく、ヒト、
サル及び他の哺乳類種の染色体地図におけるエリ
スロポエチン遺伝子座及び（又は）それに関連し
たすべての遺伝子群の座を決定するために、
DNAハイブリダイゼーシヨン過程で用いられて
もよい。それらはまた、DNAレベルにおけるエ
リスロポエチン遺伝子の欠陥を見出すために用い
ることができ、更には隣接する遺伝子及びそれら
の欠陥を見出すための遺伝子マーカーとして用い
ることもできる。 本明細書で詳細に記するように、本発明では更
に、マルチプル一本鎖ポリヌクレオチドを含む不
均一な細胞もしくはウイルス試料において、配列
未知の特定の一本鎖ポリヌクレオチドを検出する
ための重要な改良方法も提供するが、この方法は
下記のとおりである。 (a) 一様に変異した塩基鎖を有する標識化一本鎖
ポリヌクレオチドプローブの混合体が調製され
る。このプローブの各々は、被検ポリヌクレオ
チドに独特である、と推定される塩基配列に対
して潜在特異的に相補的である。 (b) 試料が固体基質に固定される。 (c) 前記基質が、該試料のポリヌクレオチドとの
ハイブリダイゼーシヨンによらないで、ポリヌ
クレオチドが更にそれと結合するのを抑制する
ように処理される。 (d) 処理済みの基質を、全体的に相補性のポリヌ
クレオチド間でのみハイブリツド形成し易い条
件下で、一時的に前記標識化プローブの混合体
と接触させる。次いで (e) 特定のポリヌクレオチドが、それと該標識化
プローブ混合物内の全体的に相補的なプローブ
とのハイブリツド形成反応の存在を確認するこ
とによつて検出される。これは標準化プローブ
の基質との非特異的結合に起因する標準化物質
の背景密度と比較して特定のポリヌクレオチド
位置における基質上の標準化物質の密度が高い
ということにより証明される。 この操作は、DNA／DNA、RNA／RNA又は
DNA／RNAハイブリツド形成において、17〜20
塩基を有する64、128、256、512、1024又はそれ
以上の混合ポリヌクレオチドプローブを使用する
ことが指示された状況下で特に有効である。 以下に記すように、上記改良方法により、サル
種起源のエリスロポエチンをコードし、貧血サル
腎細胞mRNAから誘導されたライブラリー内の
cDNAクローンを実際に同定することができた。
より具体的には、ヒトエリスロポエチンのフラク
シヨンを配列決定して導かれたアミノ酸配列情報
に基づく、128種類の一様に変異した20−merプ
ローブ混合体が、コロニーハイブリダイゼーシヨ
ン操作で用いられ、合計200000のコロニーの中か
ら７つの「＋（陽性）」エリスロポエチンcDNAク
ローンが同定された。更に特記すべきは、本発明
の改良方法を実施することにより、ヒトゲノムラ
イブラリーを構成する1500000のフアージプラー
クのスクリーニングの中から３つの陽性クローン
を迅速に単離することができたことである。これ
は、ヒトエリスロポエチンの別の連続配列のアミ
ノ酸分析による第二の128種類の17−merプロー
ブと一緒に上記した128種類の20−merプローブ
混合体を用いて実現されたものである。 上記で説明した操作は、哺乳類ゲノムクローン
を単離するためのDNA／DNAハイブリツド形成
過程において、多数の混合オリゴヌクレオチドプ
ローブを使用した最初の例であり、しかもcDNA
クローンの単離において32種類以上のオリゴヌク
レオチドプローブ混合体を使用した最初の例であ
る。 本発明によれば、ヒト及びサルの天然エリスロ
ポエチン（EPO）のポリペプチド配列の全部を
コードしているDNA配列が単離され、特定化さ
れた。 サル種起源のDNAは、化学的に誘導された貧
血状態を呈し、その血清が免疫学的測定によると
正常なサル血清と比べて高レベルのEPOを含有
するサルの腎組織から得られたmRNAにより構
成されたcDNAライブラリーから単離された。
EPOをコードするDNAを含む所望cDNAクロー
ンの単離は、128種類が混合され、放射線標識化
された20−merのオリゴヌクレオチドプローブの
プールを用いて、DNA／DNAクコロニーハイブ
リダイゼーシヨンにより実現されたが、200000コ
ロニーの迅速なスクリーニングが必要とされた。
オリゴヌクレオチドプローブの設計は、少量のヒ
トEPO試料の酵素的切断とアミノ酸配列決定に
より得られたアミノ酸配列情報に基づいた。 ヒト種起源のDNAはヒトゲノムDNAライブラ
リーから単離された。EPOをコードするDNAを
含むクローンの単離は、128種類が混合された20
−merのオリゴヌクレオチドプローブの上記プー
ルと、別の酵素によるヒトEPOフラグメントか
ら得られたアミノ酸配列情報に基づく128種類の
放射線標識化17−merプローブの第二のプールと
を用いて、DNA／DNAプラークハイブリダイゼ
ーシヨンにより行なわれた。 陽性のコロニー及びプラークは、20−merプロ
ーブのプール内の16塩基鎖サブセツトを用いたク
ローンDNAのジデオキシ配列法により確認され、
選択されたクローンは、それによりコードされる
EPOポリペプチドの一次構造形状を推定させる
ヌクレオチド配列分析に供された。推定されたポ
リペプチド配列は互いに、またヒトEPOフラグ
メントのアミノ酸分析により得られた部分配列に
対しても高度の相同性を示した。 選択された陽性のヒトゲノムクローンは、「シ
ヤトル」DNAベクターに挿入され、このベクタ
ーは大腸菌に導入されて、培養哺乳類細胞をトラ
ンスフエクシヨンするために増幅された。トラン
スフエクシヨンされた前記宿主細胞の培養増殖に
より、培養液１ml当り3000UのEPOを含有してい
ると推定される培地上澄標品が得られた。 以下の諸例は本発明の説明のために掲げられて
おり、特にEPOをコードするサルcDNAクロー
ン及びヒトゲノムクローンの同定に先立つて実施
される操作、この同定のための操作、並びに配列
決定、発現系の生成及びこの系におけるEPO発
現の免疫学的確認に関するものである。 更に具体的には、例１はヒトEPOフラグメン
トのアミノ酸配列及びこの配例に基づく放射線標
識化プローブ混合体の調製に関する。例２は一般
に、陽性サルcDNAクローンの同定に必要な操作
に関するものであり、このため動物の処置及び動
物血清の予備的ラジオイムノアツセイ（RIA）分
析に関する情報が得られる。例３は、cDNAライ
ブラリーの調製、陽性クローンのコロニーハイブ
リダイゼーシヨンスクリーニングおよび確認、陽
性cDNAクローンのDNA配列並びにサルEPOポ
リペプチド一次構造形状（アミノ酸配列）の情報
に関する。例４は陽性ヒトゲノムクローンの同定
に必要な操作に関するものであり、このためゲノ
ムライブラリー、プラークハイブリダイゼーシヨ
ン操作及び陽性クローンの確認に関する情報が得
られる。例５は、陽性ゲノムクローンのDNA配
列及びサルEPO鎖の情報との違いも含めた、ヒ
トEPOポリペプチドアミノ酸配列の情報に関す
る。例６は、陽性サルcDNAクローンから得られ
たEPOをコードするDNAを取り込んだベクター
の調製方法、COS−１細胞をトランスフエクシ
ヨンするためのベクターの使用法及びトランスフ
エクシヨンされた細胞の培養増殖法に関する。例
７は、陽性ヒトゲノムクローンから得られた
EPOをコードするDNAを取り込んだベクターの
調製方法、COS−１細胞をトランスフエクシヨ
ンするためのベクターの使用法及びトランスフエ
クシヨンされた細胞の培養増殖法に関する。例８
は、例６及び７におけるトランスフエクシヨンさ
れた細胞の培養増殖により得られた培地上澄で実
施されたイムノアツセイに関する。例９は、例６
及び７における真核生物細胞発現によるEPOの
イン・ビトロ及びイン・ビボ生物学的活性に関す
る。 例10は、チヤイニーズハムスター卵巣
（「CHO」）細胞によるサル種EPO−cDNA及びヒ
ト種ゲノムDNAについての哺乳類宿主発現系の
調製並びにこれらの発現系による生産物の免疫的
および生物学的活性、およびこれらの生産物の特
徴づけに関する。 例11は、ヒト種EPOをコードする合成遺伝子
（それらは大腸菌及び酵母での発現のための多数
の優先コドンを含むものである）の調製及びそれ
に基づく発現系に関する。 例12は、例11の系における発現生成物の免疫学
的及び生物学的活性面に関する。 例 １ Ａ ヒトEPOフラグメントのアミノ酸配列決定 ヒトEPOを尿から単離し、トリプシン切断
させて、約100〜150ピコモル量の17個に分断さ
れたフラグメントとし、単離した。 フラグメントに任意に数字を付し、気相配列
決定装置（アプライド・バイオシステムス）を
用いて微細配列順序分析によりアミノ酸配列を
分析し、以下の表に示した配列情報を得た。
表では、単一文字符号が用いられており、「Ｘ」
は明確に決定されなかつた残基を表わす。 【表】 【表】 Ｂ オリゴヌクレオチドプローブ混合体の設計と
調製 表に示したアミノ酸配列に関し、混合プロ
ーブ操作がcDNA及び（又は）ゲノムDNAラ
イブラリーでのDNA／DNAハイブリツド形成
操作に適用し得るかについて確認する目的で、
遺伝子暗号の縮重関係を精査した。この分析で
は、フラグメントNo.T35の中に７つのアミノ酸
残査（Val−Asn−Phe−Tyr−Ala−Trp−
Lys）が存在していたことが判明したが、この
鎖は20塩基対について可能な128種類のDNA鎖
のうちの一つによりコードされているというこ
とにより独特に特徴づけることができる。128
種類の20塩基鎖オリゴヌクレオチドの第一の組
は、したがつて下記表に示した配列に従い、
固体支持体上での標準ホスホアミデート法［例
えば、ビユーケージら；「テトラヘドロン・レ
ターズ」、第22巻、第1859−1862頁、1981年
（Beaucage、et al.、Tetrahedron Letters、
22、pp1859−1862（1981））参照］により合成
される。 【表】 更に分析すると、フラグメントNo.T38の中
に、６つのアミノ酸残基（Gln−Pro−Trp−
Glu−Pro−Leu）の存在が確認され、それに
基づけば、下記表に示したように128種類の
混合オリゴヌクレオチドの17−merプローブの
プールを調製することができる。 【表】 オリゴヌクレオチドプローブを、T₄ポリヌ
クレオチドキナーゼ（NEN）を用いて7500〜
8000Ci／ｍmol（ICN）のγ− ³²P−ATPによ
り5′末端で標識化した。 例 ２ Ａ サルの処理操作 メスのカニクイザル（Cynomolgus
monkey）マカカ・フアシキユラリアス
（Macaca fascicularias）（2.5〜３Kg、1.5〜２
年齢）に１、３及び５日目；12.5mg／Kgの用量
でPH7.0の塩酸フエニルヒドラジン溶液を皮下
注射して処理した。ヘマトクリツト値をそれぞ
れ注射する前に測定した。７日目に、あるいは
ヘマトクリツト値が初期値の25％低下した際、
塩酸ケタミン25mg／Kgを投与して、血清及び腎
臓を採取した。採取物を直ちに液体窒素で凍結
し、−70℃で保存した。 Ｂ EPOのRIA 試料中のEPO定量のためのラジオイムノア
ツセイ操作を以下の操作に従い実施した。 エリスロポエチンの標準（この標準は、
CAT−１と呼ばれる人尿由来のエリスロポエ
チンで、そのエリスロポエチン活性はエリスロ
ポエチンの国際的標準であるWHO IRP＃１に
対し検定されているものである。なお、この標
準はシカゴ大学のゴールドワツサー（Dr.E.
Goldwasser）より入手した。）又は未知試料を
37℃で２時間抗血清と一緒にインキユベートし
た後、試験管を氷冷し、 ¹²⁵I−標識化エリス
ロポエチンを加え、管を15時間以上０℃でイン
キユベートした。各試験管には、希釈免疫血清
50μ、 ¹²⁵I−エリスロポエチン10000cpm.ト
ラシロール5μ及びEPO標準もしくは未知試
料０〜250μからなり、残部が0.1％BSA含有
PBSであるインキユベート混合物500μが入
つていた。使用した抗血清は、ヒト尿エリスロ
ポエチンの純粋な１％標品で免疫されたウサギ
の第２回目採血液であつた。試験のための最終
的抗血清希釈液は、抗体−結合 ¹²⁵I−EPOが
入力総カウント数の10〜20％を超えないように
調整された。一般に、これは１：50000〜１：
100000の最終的抗血清希釈液に相当した。 抗体−結合 ¹²⁵I−エリスロポエチンは、ス
タフＡ（staph Ａ）150μの添加により沈澱し
た。40分間インキユベートした後、試料を遠心
分離し、ペレツトを0.15M NaCl、２ｍＭ
EDTA及び0.05％トリトンＸ−100含有10ｍＭ
トリス−HCl0.75ml（PH8.2）で二回洗浄した。
洗浄したペレツトをガンマーカウンターで計測
し、 ¹²⁵I−エリスロポエチン結合体の％を求
めた。免疫前の血清のカウント数を、非特異的
沈澱について補正するため、全ての最終値から
差し引いた。未知試料のエリスロポエチン含量
を標準曲線と比較して求めた。 上記操作を、未処理サル血清のみならず、前
記Ａ部で得られたサル血清にも適用した。正常
血清値を分析すると含有量は約36ｍＵ／mlであ
つたが、処理サル血清では含有量は1000〜1700
ｍＵ／mlであつた。 例 ３ Ａ サルcDNAライブラリーの構築 メツセンジヤーRNAを、チヤーグウイン
ら：「バイオケミストリー」、第18巻、第5294
頁、1979年［Chirgwin、et al.、Biochemistry
18、p5294（1979）］のチオシアン酸グアニジウ
ム法によつて正常と貧血サル腎臓から単離し、
ポリ(A)⁺mRNAを、マニアテイスら：「モレキ
ユラー・クローニング、ア．ラボラトリー・マ
ニユアル」（1982年、ニユーヨーク州、ハーバ
ー、コールドスプリングス所在、コールドスプ
リングスハーバーラボラトリー）［Maniatis、
et al.、“Molecular Cloning、Ａ
Laboratory Manual”（Cold Springs Harbor
Laboratory、Cold Springs Harbor、N.Y.、
1982）］第197−198頁に記載されているように、
オリゴ（dT）−セルロースカラムクロマトグラ
フイーで二回精製した。cDNAライブラリー
を、オカヤマら：「モレキユラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー」、第２巻、第161−170
頁、1982年［Okayama、et al.、Mol.and
Cell.Biol.、２、pp161−170（1982）］の一般的
方法の修正法により調整した。本発明での好ま
しい操作のキーポイントは以下のとおりであつ
た：(1)pUC8を唯一のベクターとして使用し、
Pstで切断し、次いで60〜80塩基鎖のオリゴ
dTの尾部をつけた。(2)Hinc切断によりベク
ターの一端からオリゴdT尾部を取り除いた、
(3)第一の鎖の合成とオリゴdGの尾部づけを公
表された方法により実施した、(4)BamH切
断によりベクターの一端からオリゴdG尾部を
取り除いた、及び(5)DNAによるRNA鎖の置換
には、オリゴdG尾部つきベクターよりも３倍
モル過剰の２つのリンカー
（GATCTAAAGACCGTCCCCCCCCCおよび
ACGGTCTTTA）を用いた。 Ｂ サルcDNAライブラリーをスクリーニングす
るためのコロニーハイブリダイゼーシヨン トランスフオーメーシヨンを受けた大腸菌
を、50μｇ／mlのアンピシリン含有栄養平板上
に、10×10cmプレート当り9000コロニーの密度
で分散させた。ジーン・スクリーン・フイルタ
ー（Gene Screen filter）（ニユーイングラン
ド・ヌクレア・カタログNo.NEF−972）をBHI
−CAMプレート（バクト（Baoto）脳心臓浸
出液37ｇ／、カザミノ酸２ｇ／及び寒天15
ｇ／、クロラムフエニコール500μｇ／ml含
有）にて予め湿潤させ、プレートからコロニー
を採取するのに用いた。コロニーを同一の培地
で12時間以上増殖させて、プラスミド複製数を
増やした。増殖したコロニー（コロニ・サイ
ド・アツプ）を、以下の溶液でそれぞれ飽和さ
れた２枚のワツトマン3MM紙上にフイルター
を連続的におくことにより処理した： (1) ５分間は50ｍＭグルコース−25ｍＭトリス
HCl（PH8.0）−10ｍＭ EDTA（PH8.0）、 (2) 10分間は0.5M NaOH、及び (3) ３分間は1.0MトリスHCl（PH7.5） フイルターを次いで、80℃にて２時間減圧乾
燥させた。 フイルターを次に、プロテイナーゼＫで消化
に付し、緩衝液Ｋ［0.1MトリスHCl（PH8.0）−
0.15M CaCl−10ｍＭ EDTA（PH8.2）−0.2％
SDS］中に該プロテアーゼ酵素50μｇ／mlを含
む溶液で処理した。具体的には、この溶液５ml
を各フイルターに加え、55℃で30分間消化処理
し、しかる後溶液を除去した。 フイルターを次いで、プレハイブリダイゼー
シヨン緩衝液（５×SSPE−0.5％SDS−100μ
ｇ／mlSS大腸菌DNA−５×BFP）４mlで処理
した。プレハイブリダイゼーシヨン処理を55℃
で、おおむね４時間以上行ない、その後、プレ
ハイブリダイゼーシヨン緩衝液を除去した。 ハイブリツド形成操作を以下の方法で行なつ
た。各フイルターに、表の128種類のプロー
ブ配列（EPV混合体とされる全ての混合体）
をそれぞれ0.025ピコモル含有するハイブリダ
イゼーシヨン緩衝液（５×SSPE−0.5％SDS−
酵母菌tRNA100μｇ／ml）３mlを加え、フイル
ターを48℃で20時間保持した。この温度は、全
てのプローブについて決定された計算解離温度
（Td）の最低のものより２℃低かつた。 ハイブリツド形成後、フイルターを振盪器に
て10分間、室温で６×SSC−0.1％SDSにより
３回洗浄し、ハイブリツド形成温度（48℃）に
て２〜３回６×SSC−１％SDSで洗浄した。 フイルターのオートラジオグラフイーによ
り、スクリーニングされた200000コロニーの中
から７つの陽性クローンが見出された。 推定されるサルcDNAクローンの一つ（クロ
ーン＃83）の最初の配列分析が、ウオレスら：
「ジーン」、第16巻、第21−26頁、1981年
［Wallace、et al.、Gene、16、pp21−26
（1981）］の方法を修正して確認のために行われ
た。即ち、サルcDNAクローン＃83からのプラ
スミドDNAをEcoRで切断して直鎖状とな
し、沸騰水浴上で加熱して変性させた。ヌクレ
オチド配列をサンガーら：「P.N.A.S.」（米
国）、第74巻、第5463−5467頁、1977年
［Sanger、et al.、P.N.A.S.（U.S.A）、74、
pp5463−5467（1977）］のジデオキシ法で調べ
た。16の配列からなるEPVプローブ混合体の
一部を塩基配列決定のプライマーとして用い
た。 Ｃ サルEPO cDNA配列 クローン＃83のヌクレオチド配列分析をメツ
シング：「メソツド・イン・エンザイモロジ
ー」、第101巻、第20−78頁、1983年
［Messing、Methods in Enzymology、101、
pp20−78（1983）］の方法に従つて行なつた。
表に示したのは、クローン＃83における約
1600塩基対のEcoR／Hindクローン化フラ
グメントの予備的な制限酵素地図分析結果であ
る。制限エンドヌクレアーゼ酵素認識部位のお
およその位置は、該フラグメントの5′末端の
EcoR部位に対する3′側の塩基数によつて表
わされる。ヌクレオチドの配列決定は、重複す
るフラグメントを重ね合せるように、個々の制
限フラグメントをつなげることにより行なわれ
た。例えば、C113の制限フラグメント（111の
Sau3A／324のSma）におけるヌクレオチド
分析で得られる配列情報とC73のフラグメント
（424のAlu／203のBstE）の逆方向配列決
定により得られる配列情報との重複である。 表 制限酵素認識部位 おおよその位置（ｓ） EcoR 1 Sau3A 111 Sma 180 BstE 203 Sma 324 Kpn 371 Rsa 372 Alu 424 Pst 426 Alu 430 Hpa 466 AluI 546 Pst 601 Pvu 604 Alu 605 Alu 782 Alu 788 Rsa 792 Pst 807 Alu 841 Alu 927 Nco 946 Sau3A 1014 Alu 1072 Alu 1115 Alu 1223 Pst 1301 Rsa 1343 Alu 1384 Hind 1449 Alu 1450 Hind 1585 約1342塩基対（EcoR部位の3′側のSau3A
部位からHind部位までの範囲内で）の配列
を決め、全ての解読可能な構造を分析して、表
に示したDNA及びアミノ酸鎖の情報を解明
することができた。表中、成熟EPOのアミノ
末端と推定される最初のアミノ酸残基（ヒユー
イツク・エムら：「ジヤーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー」、第256巻、第7990−
7997頁、1981年［Hewick、M.、et al.、J.
Biol.Chem.、256、7990−7997（1981）］の操作
によりアミノ酸分析が気相配列決定装置［アプ
ライド・バイオシステム社（Appllied
Biosystems、Inc）］によつて行なわれた成熟
ヒトエリスロポエチンの最初の20個のアミノ末
端残基配列分析と対比させて確認されるよう
な）は、数値の＋１で示されている。成熟蛋白
質アミノ酸鎖において一番目の残基である最初
のアミノ末端アラニン残基の「上流」に位置し
ていてメチオニンを特定化するATGコドン
（−27で示される）の存在は、成熟EPOが循環
系に入る前に切除される27のアミノ酸「リーダ
ー」領域を含む前駆体型として、EPOが細胞
質中でまず発現される可能性のあることを示し
ている。ポリペプチド中の潜在的グリコシル化
部位は＊で示されている。翻訳領域の分子量は
21117ダルトンであり、成熟サルEPOを構成す
るポリペプチドの165残基の分子量は18236ダル
トンであつた。 【表】 【表】 表のポリペプチド鎖は、例えばホツプら：
「P.N.A.S.」（米国）、第78巻、第3824−3828
頁、1981年［Hopp、et al.、P.N.A.S.（U.S.
A.）、78、pp3824−3828（1981）］、カイトら：
「ジヤーナル・オブ・モノキユラー・バイオロ
ジー」、第157巻、第105−132頁、1982年
［Kyte、et al.、J.Mol.Biol.、157、pp105−
132（1982）］及び（又は）チユーら：「バイオケ
ミストリー」、第13巻、第222−245、1974年
［Chou、et al.、Biochem、13、pp222−245
（1974）］及び「アドバンシズ・イン・エンザイ
モロジー」、第47巻、第45−47頁、1978年
［Advances in Eyzymology、47、pp45−47
（1978）］の方法により、高度に親水性の領域及
び（又は）潜在的に高度な免疫原性領域を示す
二次構造特性の存在に関する分析に容易に付さ
れるであろう。ホツプらの方法によるコンピユ
ーター補助分析は、カリフオルニア州、パロア
ルト、ユニバーシテイアベニユ124のインテリ
ジエネテイツクス社から入手可能なPEPレフ
アレンスのセクシヨン６、７に示すプログラム
により実施可能である。 例 ４ Ａ ヒトゲノムライブラリー ローンら：「セル」、第15巻、第1157−1174
頁、1978年［Lawn、et al、Cell］の方法によ
り調製されたCh4Aフアージ担持ヒト胎児肝ゲ
ノムライブラリーを得、プラークハイブリダイ
ゼーシヨン分析で使用するために保存した。 Ｂ ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングす
るためのプラークハイブリダイゼーシヨン操作 フアージ粒子を溶解し、DNAを、ジーンス
クリーン・プラス・フイルタ（ニユーイングラ
ンド・ヌクレア・カタログNo.NEF−972）及び
NZYAMプレート・（１リツトルにつき、
NaCl5ｇ、MgCl₂−6H₂O2ｇ、NZ−アミン
A10ｇ、酵母エキス５ｇ、カザミノ酸２ｇ、マ
ルトース２ｇ、及び寒天15ｇ）を使用すること
を除いては、ウー：「メソツズ・イン・エンザ
イモロジー」、第68巻、第389−395頁、1979年
［Woo、Methods In Enzymology、68、pp389
−395（1979）］の方法により、フイルター（フ
イルター当り50000プラーク）に固定した。 風乾したフイルターを80℃で１時間焼付し、
次いで例３のＢに記したように、プロテイナー
ゼＫで消化した。プレハイブリダイゼーシヨン
を55℃で４時間以上1M NaCl−１％SDS緩衝
液で行ない、しかる後緩衝液を除去した。ハイ
ブリツド形成及びハイブリツド後洗浄を例３の
Ｂに記したように行なつた。EPVで示される
128種類の20−merプローブ混合体及びEPQ混
合体で示される表の128種類の17−merプロ
ーブ混合体を用いた。ハイブリツド形成は、
EPVプローブ混合体を用い、48℃で行なわれ
た。EPQプローブ混合体ハイブリツド形成は
46℃、即ち混合体中の最低の計算Td値より４
℃低い温度、で行なわれた。再ハイブリツド形
成のためのハイブリツド形成プローブの除去
を、１×SSC−0.1％SDSと一緒に２分間煮沸
することにより行なつた。フイルターのオート
ラジオグラフイーにより、調べられた1500000
のフアージプラーク中３つの陽性クローン（い
ずれのプローブ混合体とも反応する）が見出さ
れた。EPOをコードしているような陽性クロ
ーンの確認が、DNAシークエンシングと、例
３のサルcDNAとのヘテロ二重鎖形成の電子顕
微鏡写真による視覚化とによつてなされた。こ
の操作によつても、ゲノムDNA鎖における多
数のイントロンの存在が実証された。 例 ５ （λhE1で示される）陽性クローンの一つのヌ
クレオチド配列分析（前記サンガーらのジデオキ
シ法）を行なつたが、これまでに得られた結果は
表に示されている。 表中、最初のDNA配列は、ヒトEPO遺伝子
の翻訳部分の直前の非翻訳配列と思われる最前の
620塩基を示す。より具体的には、その配列は、
リーダー配列（「前配列」）における最初の４つの
アミノ酸（−27〜−24）をコードする翻訳DNA
領域（この領域は、後述する表に示されるヒト
EPOゲノムDNAとサルEPOcDNAがコードする
アミノ酸配列の間の相同性等に基づいて決定され
た。）まで続く5′末端遺伝子からなつているよう
である。リーダーの始まりをコードする遺伝子の
前に位置する鎖中の４つの塩基対はまだ明確には
確認されなかつたため、「Ｘ」で表わされている。
次いで、約639塩基対（そのうち439塩基対が配列
決定されたが、残りの200塩基対は「I.S.」で表
わされている）からなるイントロンに続いてお
り、翻訳されるポリペプチドの残基−23として示
されたグルタミン酸コドンの直前に位置してい
る。その直後に続くエキソン鎖は、（成熟ヒト
EPOのアミノ酸鎖残基＋１として示される）ア
ラニン残基から、＋26のスレオニンを特定化する
コードンまでのアミノ酸残基をコードしているこ
とが判明し、しかる後具体的に示した256塩基か
らなる第二のイントロンに続いている。このイン
トロンの後、27〜55のアミノ酸残基のエキソン配
列が続き、その後612塩基対からなる第三のイン
トロンが始まる。次のエキソンはヒトEPOの56
〜115の残基をコードしており、次いで特定化さ
れた134塩基からなる第四のイントロンが始まる。
第四のイントロンに続くのは、第116〜166の残基
をコードするエキソンと「停止」コードン
（TGA）である。最後に、表では、ヒトEPO
遺伝子の非翻訳3′領域と思われる568塩基対鎖を
明らかにしているが、「Ｘ」で示される２つの塩
基対はまだ明確には配列決定されなかつた。 表はこのように、166個の特定のアミノ酸残
基の成熟ヒトEPO（推定分子量＝18399）の一次
構造形状（アミノ酸配列）を確認するのに役立
つ。同表中で同時に示されているのが、ヒト遺伝
子オペロンのプロモーター／オペレーター機能に
とつて重要な5′−3′DNA鎖とともに、27残基の
リーダー配列をコードするDNA配列である。成
熟ヒトEPOポリペプチドの潜在的グリコシル化
部位は、表中に＊で示されている。表の特定の
アミノ酸配列がヒトエリスロポエチンの自然発生
的対立遺伝型のそれを構成している可能性がある
ことに注意すべきである。この立場に関する支持
が、残基126において表に示したセリンと対立す
るメチオニンを有する多くのエリスロポエチン分
子の発見に至つた、尿中にヒトエリスロポエチン
の単離物を配列決定するという長年の努力の結果
の末に見出された。 以下の表はヒトおよびサルのEPOにおける
ポリペプチド配列の相同性の程度を示している。
表中の上部の連続列において、一文字の符号は残
基−27で始まるヒトEPOについて推定翻訳され
たポリペプチド配列を示すために用いられてお
り、下部の連続列は指定の残基−27で始まるサル
EPOについて推定されたポリペプチド配列を示
している。＊は、配列相同性を強調するために用
いられている。推定されたヒトおよびサルEPO
配列は、ヒトにおける部位116に「付加的」リジ
ン(K)残基を示していることに注目すべきである。
表と相互に参照することにより、この残基が丁
度ゲノム配列において推定されるmRNAのスプ
ライス部位であることが明らかとなる。ヒトポリ
ペプチド配列におけるリジン残基の存在は、下記
例７でヒトゲノムDNAによりトランスフオーメ
ーシヨンされたCOS−１細胞から単離された
mRNAより得られるヒトcDNA鎖クローンを配
列決定することによつても更に確認された。尚、
リーダー領域を含む前駆体型のヒトEPOをコー
ドするイントロンを含まない本発明のDNA配列
を表及び表に基づいて作成し、これをまとめ
て表′に示す。 【表】 【表】 【表】 ^{＊＊＊ ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
＊＊ ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
＊ ＊＊＊}
サル AISLPDAASAAPLRTITADTFCKLFRVYSNFLRGKLKL
YTGEACRRGDR

【表】 例 ６ 例３の操作で得たサルcDNAによりコードされ
るEPOポリペプチド物質を単離可能な量で微生
物合成するために最初の試みとして選択された発
現系は、哺乳類宿主細胞のうちの一種（即ち、
COS−１細胞、A.T.C.C.No.CRL−1650）であつ
た。その細胞は、大腸菌宿主（pBR322由来
DNAの存在下にて）および哺乳類宿主（SV40ウ
イルス由来DNAの存在下にて）内で自律的に複
製することが可能な「シヤトル」ベクターにより
トランスフエクシヨンされた。 更に具体的には、発現ベクターは以下の操作に
より調製された。例３のプラスミドクローン＃83
を大腸菌で増殖させ、約1.4kbのサルEPOをコー
ドするDNAをEcoRおよびHind切断により
単離した。分別して単離されたのは、約4.0kbの
pBR322由来Hind／Saフラグメントであつ
た。約30bpのEcoR／Sal「リンカー」フラ
グメントがM13mp 10RF DNA（ＰアンドＬラボ
ラトリーズ）から得られた。このリンカーは
EcoR付着端を含んでおり、順にSst、Sma
、BamHおよびXba認識部位さらにはSal
付着端が続いている。上記３つのフラグメント
は約5.4kbの中間プラスミド（「pERS」）の形成
のために連結されたが、このプラスミドにおい
て、EPO DNAは有効な制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位の「バンク」近傍の一端に位置してい
た。pERSを次いでHindおよびSalで消化す
ると、EPO DNAおよびEcoRからSal
（M13mp 10）までのリンカーが得られた。1.4kb
のフラグメントを約4.0kbのpBR322のBamH
／Salおよび約30bpの他のM13mp10.Hind
／BamH RFフラグメントリンカーと結合
させた。M13リンカーフラグメントは、Hind
付着端、それに続くPst、Sal、Xbaに認識
部位およびBamH付着端という特徴を有して
いた。結合生成物は、再び、制限部位バンクを
EPO DNAの近傍両端に有する有用な中間プラ
スミド（「pBR−EPO」）であつた。 COS−１細胞におけるEPO DNA発現のため
に選択されたベクター（「pDSVL1」）は大腸菌に
て選別および自律的に複製させられるよう予め調
製された。これらの特徴は、pBR322ヌクレオチ
ド2448〜4362の領域に存在する複製起点とアンピ
シリン耐性遺伝子DNA鎖により付与される。こ
の配列は、ベクターに取込まれる前に、ヌクレオ
チド2448に直接隣接するようにHind認識部位
を付与するリンカーを付加することにより構造的
に変換された。選択されたベクターの他の有用な
特性としては、COS−１細胞において自律的に
複製しうる能力と哺乳動物細胞中で機能するウイ
ルス性プロモーター配列の存在であつた。これら
の特徴は、SV40ゲノムにおけるヌクレオチド数
5171〜270の343bp配列に存在する複製DNA配列
の起点および「後期遺伝子」ウイルス性プロモー
ターDNA配列により示される。市販のリンカー
［コラボレーテイブ・リサーチ（Collaborative
Research）］を用いて唯一の制限部位（BamH
）ベクターにつけ、ウイルス性プロモーター配
列に直接接合させた。更にベクターには、「後期
遺伝子」ウイルスmRNAポリアデニル化信号
（通常、転写ターミネターと称される）を有する
238塩基対配列（SV40のヌクレオチド数2533〜
2770に由来する）が取込まれていた。このフラグ
メントは、ベクターにおいて、「後期遺伝子」ウ
イルス性プロモーターから唯一のBamH部位
までに対応し、適切に配向していた。更に、ベク
ターには、ウイルス性プロモーターとターミネー
ターとの間の配列において、唯一のBamH部
位に挿入された遺伝子の潜在的転写に関与しない
部位に別の哺乳類遺伝子が存在していた［哺乳類
遺伝子は、ガツサーら：「P.N.A.S.」（米国）、第
79巻、第6522−6526頁、1982年（Gasser、et
al.、P.N.A.S.（U.S.A）、79、pp6522−6526
（1982））のように、プラスミドpMG−１から単
離された2500bpのマウスジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ（DHFR）小遺伝子からなつていた］。 pDSVL1の構築について以下に補足説明を加え
る。 このプラスミドベクターは5049bpから成り、
４種のDNAフラグメントから合成により得られ
るものである。これら４種のDNAフラグメント
及び合成リンカーはいずれも容易に入手可能なも
のであり、その塩基配列もすでに決定されてい
る。 各DNAフラグメントは夫々次のように調製す
ることができる。 (1) ヌクレオチド１−2520： この2520bpのEcoR−Pstフラグメント
はpMG1から得られ、マウスジヒドロ酸レダク
ターゼ小遺伝子をコードするものである。
pMG1はスタンフオード大学のDr.R.Schimke
から入手したもので、このプラスミドは一般に
入手可能なものである（前掲ガツサーら参照）。 (2) ヌクレオチド2521−2783： この263bpから成るPst−BamHフラグ
メントは、SV40ゲノムのヌクレオチド数2533
−2770由来のBamH−Bclフラグメント
（238bp）のBcl部位に合成リンカーを付加し
てPst部位に変換することにより調製したも
のである。尚、SV40及びここで用いた合成リ
ンカーは市販されているものである。 (3) ヌクレオチド2784−3129： この346bpから成るBamH−Hindフラ
グメントは、SV40ゲノムのヌクレオチド数
5171−270由来のPvu−Hindフラグメント
（343bp）のPvu部位（ヌクレオチド数270）
に、市販の合成リンカーを接合させてBamH
部位に変換することにより調製したものであ
る。 (4) ヌクレオチド3130−5049： この1920bpから成るHind−EcoRフラグ
メントは、pBR322のヌクレオチド数2448−
4362領域のヌクレオチド数2448にHind認識
部位を付与する合成リンカーを直接付加するこ
とによつて調製したものである。 例えば、上記マニアテイスらの方法により、
EPOをコードするDNAをBamHフラグメント
としてプラスミドpBR−EPOから単離し、
BamHで切断されたプラスミドpDSVL1に結
合させた。制限酵素分析を行ない、２つの得られ
たクローンベクター（複製ベクターＨおよぴＬ）
が正確に配向してEPO遺伝子が挿入されたこと
を確認した。プラスミドpDSVL−MkEを示した
第２図参照。誤つて配向したEPO遺伝子を有す
るベクター（ベクターＦ、ＸおよびＧ）は、正確
に配向したEPO DNAを有するベクターでトラ
ンスフオーメーシヨンされた宿主のEPO発現量
を測定するためのトランスフエクシヨン実験にお
いて、ネガテイブコントロールとして使用するた
めに保存した。 キヤリアDNA（マウス肝および脾DNA）と結
合したベクターＨ、Ｌ、Ｆ、ＸおよびＧを用い、
リン酸カルシウム微細沈澱法により、二重60mmプ
レートをトランスフエクシヨンした。二重60mmプ
レートはまた、「にせ」のトランスフオーメーシ
ヨンのネガテイブコントロールであるキヤリア
DNAによつてもトランスフエクシヨンされた。
５日後、全ての培地について、天然EPOの免疫
学的性質を有するポリペプチドの有無に関し試験
した。 例 ７ Ａ COS−１細胞を含む第一EPO発現系 ヒトゲノムのDNA EPOクローンによりコ
ードされたヒトEPOポリペプチド物質を単離
可能な量で微生物合成する最初の試みのために
選択された系には、哺乳類宿主細胞（即ち、
COS−１細胞、A.T.C.C.No.CRL−1650）での
発現が包含される。ヒトEPO遺伝子を、まず、
大腸菌宿主（pBR322由来DNAの存在下にて）
および哺乳類細胞系COS−１（SV40由来DNA
の存在下にて）内で自律的に複製することが可
能な「シヤトル」ベクターにてまずサブクロー
ン化した。EPO遺伝子含有シヤトルベクター
を次いでCOS−１にトランスフエクシヨンし
た。EPOポリペプチド物質がトランスフエク
シヨンされた細胞から産生され、細胞培地に分
泌された。 更に具体的には、発現ベクターは以下の操作
により調製された。ラムダクローンλhE1から
単離され、ヒトゲノムEPO遺伝子を含むDNA
をBamHおよびHind制限エンドヌクレア
ーゼで消化して、全EPO遺伝子を含む5.6kb
DNAフラグメントを単離した。このフラグメ
ントを、同様に消化された細菌プラスミドpU
C8［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社
（Bethesda Research Laboratories、Inc.）］
と混合し、結合させて、この制限フラグメント
の簡便な供給源となる中間プラスミド「pUC8
−HuE」を得た。 COS−１細胞におけるEPO DNA発現のた
めに選択される3338bpから成るベクター
（pSV4SEt）を予め調製した。プラスミド
pSV4SEtは３種のDNAフラグメントから合成
されており、各フラグメントは市販のDNAに
入手容易な合成リンカーを付加して修飾したも
のである。このプラスミドは、大腸菌における
選択および自律的な複製をなすDNA配列を含
んでいた。これらの特徴は、細菌プラスミド
pBR322のヌクレオチド数2448〜4362領域に存
在している複製起点およびアンピシリン耐性遺
伝子DNA配列により付与される。この領域を、
ヌクレオチド数2448にHind認識部位を付与
するリンカーを付加することにより構造的に変
換し、pSV4SEtのヌクレオチド数1422−3338
（Hind−EcoR）領域とした。このHind
−EcoR領域は、カリフオルニア大学のテイ
ジヤン（R.Tjian）より分与を受けたプラスミ
ドpSV08（メイヤーら：「セル」、第25巻、第373
−384頁、1981年［Myers、R.M.、et al.、
Cell、25、pp373−384（1981）］）をHindおよ
びEcoRで消化することにより得た。得られ
たHindリンカー部分を含む該断片概略を以
下に示す。 【表】 尚、該Hind−EcoR断片は、以下に述べ
るような方法によつても、調製することができ
る。まず、pBR322よりSfaN−Bgl断片
（約914bp）を単離する。次に、pBR322よりア
ンピシリン耐性遺伝子領域にかかる部分を含む
Bal−Hind断片（約908bp）を単離する。
最後に、以下に示す配列［pBR322のヌクレオ
チド数2448から2567（SfaN部位）の配列に、
更にHind部位を2448側に付加した配列］を
有する129bpのDNA断片を合成する。 これら３つのDNA断片を連結して得られた
プラスミドを、HindおよびEcoRで消化す
ることにより、唯一の大断片として該Hind
−EcoR断片が得られる。 【表】 プラスミドpSV4SEtは、COS−１細胞にお
いても自律的に複製することができた。この特
徴は、SV40のウイルス複製起点を含む343bp
のHind−Pvuフラグメント（ヌクレオチ
ド数5171〜270）にあつた。このフラグメント
を、EcoR認識部位をヌクレオチド数270に接
合させるリンカー、およびSal認識部位をヌ
クレオチド数5171に接合させるリンカーを付加
することにより変換し、pSV4SEtのヌクレオ
チド数１−353（EcoR−Sal）領域とした。
SV40由来の1063bpのHind−Bclフラグメ
ント（ヌクレオチド1708〜2770）を、Sal認
識部位をヌクレオチド2770に接合させるリンカ
ーを付加することにより変換し、pSV4SEtの
ヌクレオチド数354−1421（Sal−Hind）領
域とした。このフラグメント中には、唯一の
BamH認識配列も含まれていた。即ち、以
上の３種のDNAフラグメントから成るプラス
ミドpSV4SEtは、ヒトEPO遺伝子が挿入され
るBamHおよびHind認識部位、大腸菌内
で複製および選択される配列、並びにCOS−
１細胞内で複製される配列を含んでいた。 EPO遺伝子をpSV4SEtに挿入するため、プ
ラスミドpUC8−HuEをBamHおよびHind
制限エンド・ヌクレアーゼで消化し、EPO
をコードする5.6kbのDNA遺伝子を単離した。
pSV4SEtもBamHおよびHindで切断し、
2513bpの大フラグメントを単離した（全ての
必要な機能を保有している）。これらのフラグ
メントを混合連結して、最終的ベクター
「pSVgHu EPO」を得た（第３図参照）。この
ベクターを大腸菌（HB101株）中で増殖させ、
ベクターDNAを単離した。制限酵素分析を行
ない、EPO遺伝子の挿入を確認した。 プラスミドpSVgHuEPO DNAを用いCOS
−１細胞においてヒトEPOポリペプチド物質
を発現させた。更に具体的には、
pSVgHuEPO DNAをキヤリアDNAととも
に、COS−１細胞の三重60mmプレートにトラ
ンスフエクシヨンした。コントロールとして、
キヤリアDNAのみをCOS−１細胞にトランス
フエクシヨンした。細胞培養培地を５日後およ
び７日後に採取し、天然ヒトEPOの免疫学的
性質を有するポリペプチドの有無について試験
した。 Ｂ COS−１細胞を含む第二EPO発現系 更に別の系が、COS−１細胞（A.T.C.C.No.
CRL−1650）において、ヒトゲノムDNA
EPOクローンによりコードされたヒトEPOポ
リペプチド物質の改良生産法を得るために設計
された。 直前のシステムにおいて、EPOが、5.6kbの
BamHからHindまでの制限フラグメント
中に存在するそれ自身のプロモーターを用い
て、COS−１細胞にて発現された。下記調製
例では、EPO遺伝子を、SV40後期プロモータ
ーにより発現しうるように変換させる。 更に具体的には、クローン化された5.6Kbの
BamHからHindまでのゲノムヒトEPO制
限フラグメントを以下の操作により変換した。
前記プラスミドpUC8−HuEをBamHおよび
BstE制限エンドヌクレアーゼで切断した。
BstEは、ペプチド前駆体をコードする開始
ATGから5′方向に44塩基対であり、Hind制
限部位から3′方向に約680塩基対である部位に
おいて、5.6kb EPO遺伝子を切断する。約
4900塩基対のフラグメントを単離した。Sal
およびBstE付着端並びに内在BamH認識
部位を有する合成リンカー DNAフラグメント：
5′TCGACTGGATCCTAG3′ 3′GACCTAGGATCCAGTG5′ を合成し、精製した。２つのフラグメントを
SalおよびBamHで切断されたプラスミド
pBR322と混合し、連結させて、中間プラスミ
ドpBRgHEを得た。ゲノムヒトEPO遺伝子は、
アミノ末端をコードする領域に近接した
BamH部位から3′方向に53塩基対である部位
に一つのATGを含む完全な構造の遺伝子を保
有する4900塩基対のBamH切断フラグメン
トとして、それらから単離することができる。 このフラグメントを単離し、BamHフラ
グメントとして、BamH切断発現ベクター
プラスミドpDSVL1に挿入した。得られるプラ
スミド、即ち第４図に示すpDSVL−gHiEPO
を用い、例６及び7Aに示したように、COS−
１細胞からEPOポリペプチド物質を発現させ
た。 例 ８ 例６における６つのトランスフエクシヨンされ
たCOS−１の増殖後の培地を、例２のＢに示し
た操作に従い、ラジオイムノアツセイによつて分
析した。各試料を250、125、50および25μ量で
分析した。不正確なEPO遺伝子配向を有するベ
クターでトランスフエクシヨンされたにせの細胞
増殖物の上澄は、明らかにEPO免疫応答性に関
し陰性であつた。正確な配列のEPO DNAを有
するベクター（ＨおよびＬ）でトランスフエクシ
ヨンされたCOS−１細胞の増殖物から得た２つ
の上澄のそれぞれの試料に関し、抗体に対する
¹²⁵I−EPO結合阻害率は72〜88％の範囲であり、
全ての値が標準曲線の上位に位置していた。培地
上澄の正確なEPO濃度は、このため、信頼すべ
き程度までには調べることができなかつた。しか
しながら、最大量（250μ）の計算値から控え
めに推定すると、300ｍＵ／mlであつた。 例６の代表的培養液、並びに例7Aで得た５日
目および７日目の培養液を、組換えサルおよびヒ
トEPO物質および天然ヒトEPO標準と比較する
ために、RIAで試験し、結果を第１図のグラフで
示した。即ち、結果は予期されたように、組換え
サルEPOは抗ヒトEPO抗体と著しく競合したが、
試験条件下では完全には結合を阻害できないこと
を示した。組換えヒトEPOに関する最大の％阻
害率はしかしながら、ヒトEPO標準の値と極め
て近似していた。用量応答曲線が平行関係である
ことは、一般に免疫学的な配列（エピトープ）の
同一性を示唆している。サルEPO培養液の先の
評価をそれよりも高い希釈レベルで再度実施する
と、2.91〜3.12U／mlの範囲であつた。調べられ
たヒトEPO生産量は、５日間増殖試料が392ｍ
Ｕ／mlで、７日間増殖試料が567ｍＵ／mlであつ
た。例7Bの発現系におけるEPO測定値は同レベ
ルかそれ以上であつた。 例 ９ 例６および７で得られた培養液を、ゴールドワ
ツサーら：「エンドクリノロジー」、第97巻、第２
号、第315−323頁、1975年［Goldwasser、et
al.、Endocrinology、97、２、pp315−323
（1975）］の方法によるEPO活性イン・ビトロ分
析に供した。被検培養液のサルEPO測定値は3.2
〜4.3U／mlの範囲であつた。ヒトEPO培養液も
このイン・ビトロ分析では活性を示し、この活性
は抗EPO抗体で中和することができた。例６の
組換えサルEPO培養液も、コーツら：「ネーチヤ
ー」、第191巻、第1065−1067頁、1961年
［Cotes、et al.、Nature、191、pp1065−1067
（1961）］およびハモンドら：「アナルス・オブ・
ニユーヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス」、
第149巻、第516−527頁、1968年［Hammond、
et al.、Ann、N.Y.Acad.Sci.、149、pp.516−527
（1968）］の一般的方法によるイン・ビボ生物学的
活性分析に供したところ、活性値は0.94〜
1.24U／mlであつた。 例 10 前述の諸例において、組換えサルまたはヒト
EPO物質を、COS−１細胞をトランスフエクシ
ヨンするのに用いたベクターからつくつた。こら
れのベクターは、細胞内におけるSV40のＴ抗原
とベクター上のSV40の複製起点との存在によつ
て、COS−１細胞内で複製する。これらのベク
ターはCOS−１細胞内で有効量のEPOを産生す
るが、その発現はベクターが最終的に減少してい
くため、まさしく一時的である（７〜14日）。更
にまた、少量のCOS−１のみが該ベクターでト
ランスフエクシヨンされた。本例では、チヤイニ
ーズハムスターの卵巣（CHO）DHFR^-細胞およ
び選別可能なマーカーDHFRを用いた発現系を
述べている［関連する発現系の議論については、
いずれも米国特許第4399216号並びに1984年８月
29日に公開された欧州特許出願第117058号、第
117059号および第117060号参照］。 ウルラウブら：「プロシーデイングス・オブ・
ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ」
（米国）、第77巻、第4461頁、1980年［Urlaub、
et al.、Proc.Nat.Acad.Sci.（U.S.A.）Vol.77、
4461（1980）］に示されたCHO DHFR^-細胞
（DuX−Bll）CHO K1細胞は、構造遺伝子の突
然変異によつてジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素
（DHFR）を欠如しており、このため培地中にグ
リシン、ヒポキサンチンおよびチミジンの存在を
要求する。プラスミドpDSVL−MKE（例６）ま
たはプラスミドpDSVL−gHuEPO（例7B）を、
60mm培養プレート中のヒポキサンチン、チミジン
およびグリシン含有培地で増殖するCHO
DHFR^-細胞内に、キヤリアDNAと一緒にトラ
ンスフエクシヨンした。プラスミド
pSVgHuEPO（例7A）を、細菌プラスミドベクタ
ーpBR322でクローン化されたマウスジヒドロ葉
酸レダクターゼ遺伝子含有プラスミドpMG2と混
合した。 pMG2は、Gasser C.S.et al、Proc.Natl.
Acad.Sci.、USA、79、p6522−6526（1982）にそ
の調製方法が記載されているpMg2と同一のプラ
スミドである。本プラスミドは、前述の文献の著
者の１人であるDr.Schimke R.D.より、分与を受
けた。本願出願時点で、Dr.Schimkeは、希望者
と対し本プラスミドを分譲している。従つて、本
プラスミドの入手については、Dr.Schimkeから
分譲を受ける事により可能である。また、以下に
述べるように当該文献に従い、調製することもで
きる。 pMg2は、マウス染色体dhfr遺伝子の5′上流領
域の後に、マウスdhfr遺伝子cDNAを接続し、更
にcDNAの3′非翻訳領域中に、マウス染色体dhfr
遺伝子3′下流領域を挿入した約4.3Kbのいわゆる
「dhfr mini遺伝子」を含むプラスミドである。
まず、マウス染色体dhfr遺伝子の5′上流〜エクソ
ン、までの領域を持つプラスミドpDR34
（Crouse G.F.et al、J.Biol.Chem.257、p7887−
7897（1982））より、1.0KbのEcoR−Taq断
片（5′上流領域とエクソンの一部を含む）を単
離した。また、マウスdhfr遺伝子cDNAを含むプ
ラスミドpDHFRll（Chang A.C.Y.et al、Nature
275、p617−624（1978））より、0.19KbのTaq
断片及び1.3KbのTaq−Pst断片（両断片は、
cDNA中における連続した断片である。）を単離
した。1.0KbのEcoR−Taq断片のTaq部
位は、エクソン中に単一に存在する認識部位で
あり、cDNA中の最初のTaq部位に相当する。 これらの３つの断片は、EcoR−Taq断片
（1.0Kb）、Taq断片（0.19Kb）、Taq−Pst
断片（1.3Kb）の順に正しく並ぶよう連結し、
Taq断片が正方向に入つている方のEcoR−
Pst断片（2.49Kb）をpBR322のEcoR−Pst
断片（大きい方）に挿入し、pMg1を得た。 次に、マウス染色体dhfr遺伝子の最終エクソン
と2.7Kbの3′下流領域を持つプラスミド
pDHFRg1（Nunberg J.H.et al、Cell、19、p355
−364（1980））より、1.8KbのBgl断片（マウス
染色体dhfr遺伝子3′下流領域）を単離した。この
Bgl断片（1.8kb）を、pMg1の２番目のBgl
部位に挿入し、pMg2を得た。 プラスミド混合体およびキヤリアDNAをCHO
DHFR^-細胞にトランスフエクシヨンした（一つ
のプラスミドを獲得した細胞は一般に第二のプラ
スミドをも獲得する）。３日後、細胞を、ヒポキ
サンチンおよびチミジン欠如培地の数個の100mm
培養プレートに、トリプシン処理して分散させ
た。DHFR遺伝子で安定的にトランスフオーメ
ーシヨンされその結果EPO遺伝子によつてもト
ランスフオーメーシヨンされたそれらの細胞のみ
がこの培地で生存する。７〜21日後、生存する細
胞のコロニーが明確になつた。これらのトランス
フオーマントコロニーは、トリプシン処理で分散
された後、ヒポキサンチンおよびチミジン欠如培
地中で継続して増殖することができ、新種の細胞
株（例えば、CHO pDSVL−MkEPO、CHO
pSVgHuEPO及びCHO−pDSVL−gHuEPO）が
得られた。 上記細胞株の培養液を、組換えサルまたはヒト
EPOの有無についてRIAで分析した。 CHO pDSVL−MkEPO株培地は、プラスミド
pDSVL−MkEPOでトランスフエクシヨンされ
たCOS−１細胞から得たEPOと同様の免疫学的
性質を有するEPOを含有していた。代表的な65
時間培養液は0.60U／mlのサルEPOを含有してい
た。 CHO pSVgHuEPOおよびCHO pDSVL−
gHuEPOの培養液は、プラスミドpSVgHuEPO
またはpDSVL−gHuEPOでトランスフエクシヨ
ンされたCOS−１細胞から得たものと同様の免
疫学的性質を有する組換えヒトEPOを含有して
いた。RIAにより測定すると、代表的なCHO
pSVgHuEPOの３日間培養液は2.99U／mlのヒト
EPOを含有し、CHO pDSVL−gHuEPOの5.5日
間試料は18.2U／mlのヒトEPOを有していた。 前記細胞株から得られるEPO量は、遺伝子を
増幅させて産生能の高い新規細胞株をつくること
によつて増加させることができる。DHFR遺伝
子によりコードされた産物たるジヒドロ葉酸レダ
クターゼ酵素（DHFR）は、薬物メソトレキセ
ート（MTX）で阻害することができる。更に具
体的には、ヒポキサンチンおよびチミジン欠如培
地で増殖した細胞は、MTXにより阻害されまた
は殺される。適切な条件下（例えば最低のMTX
濃度）では、MTXに耐性でかつMTX存在下で
も増殖可能な細胞を得ることができる。これらの
細胞は、DHFR遺伝子数が増加し、その結果
DHFR酵素量が増加することにより、MTX耐性
であることが判明する。残存した細胞を次いで、
徐々に濃度を高めてMTXで処理してもよく、こ
れにより更に多量のDHFR遺伝子を含む細胞株
が得られる。DHFR遺伝子と一緒に発現ベクタ
ー上に乗せられ、またはDHFR遺伝子とともに
トランスフオーメーシヨンされた「パツセンジヤ
ー遺伝子」（例えばEPO）は、それらの遺伝子コ
ピー数の増加がしばしば見出されている。 この増幅系の実施例として、細胞株CHO
pDSVL−MkEPOを徐々に増加させたMTX濃度
（0nM、30nM及び100nM）に供した。各増加段
階から得た代表的な65時間培地試料をRIA分析す
ると、それぞれ0.60、2.45及び6.10U／ml含有し
ていた。 細胞株CHO pDSVL−gHuEPOを、30nM、
50nM、100nM、200nM、1μM及び5μMにMTX
濃度を増加させて試験に供した。100nM MTX
段階から得た代表的な３日間培地試料は、RIAで
調べると、3089±129U／mlのヒトEPOを含有し
ていた。100nMおよび1μM MTX段階から得た
代表的な48時間培地試料は、RIAで調べると（３
回分析の平均）、それぞれ466および1352U／mlの
ヒトEPOを含有していた。これらの操作では、
１×10⁶個の細胞を60mm培養皿中の培地５mlに接
種した。24時間後、培地を除去し、無血清培地
（0.1ｍＭの非必須アミノ酸およびＬ−グルタミン
が添加された高グルコースDMEM）５mlで置き
換えた。EPOを無血清培地で48時間蓄積させた。
培地をRIA分析用に集め、細胞をトリプシン処理
し、計数した。100nMおよび1μM MTXで増殖
した細胞に関する467U／mlおよび1352U／mlの
平均RIA値から、それぞれ実際の収量2335U／プ
レートおよび6750U／プレートが求められた。一
プレート当りの平均細胞数はそれぞれ1.94×10⁶
および3.12×10⁶であつた。これらの培養条件下
での有効産生速度は、したがつて、1264および
2167U／10⁶細胞／48時間であつた。 直上に記載した培養細胞は、遺伝的に不均一な
群である。標準的スクリーニング操作が、最大産
生能を有するおおむね均一なクローンを単離する
ために用いられている。米国食品薬局（U.S.
Food and Drug Administration）、薬局および
生物学センター（Center for Drugs and
Biologics）、生物学研究調査庁（Office of
Biologics Research Review）、1984年６月１
日、「生物の産生に用いられる株化細胞の特徴に
おいて考慮すべき点（Points to Consider in
the Characteriation of Cell Lines Used to
Produce Biologics）］のセクシヨンＡ、パート
２参照。 前記EPO産生CHO細胞系の生産性は、適切な
細胞培養技術により改善することができる。哺乳
類培養細胞の増殖には、成長培地に血清の存在を
要する。血清を含有しない培地でCHO細胞から
エリスロポエチンを産生する方法は、培地からの
エリスロポエチンの精製を著しく容易化するもの
である。下記方法によれば、産生に充分な多量の
無血清培地において、経済的にエリスロポエチン
を産生させることができる。 標準的細胞培養条件下で増殖させたCHO
pDSVLgHuEPO細胞株を用い、スピナー細胞培
養フラスコに接種する。この細胞を、５％胎児牛
血清、Ｌ−グルタミン、ペニシリンおよびストレ
プトマイシンが添加された高グルコースDMEM
およびHam′sF12の50−50混合物、0.05ｍＭ非必
須アミノ酸並びに適当な濃度のメソトレキセート
からなる培地が入つたスピナー細胞培養フラスコ
内で、懸濁液細胞系として増殖させる。懸濁細胞
培養では、EPO産生CHO細胞を容易に多量に増
殖させることができる。懸濁液中で増殖した
CHO細胞を用い、培地200mlが入つた850cm²のロ
ーラー瓶に1.5×10⁷個の生育細胞の初期接種密度
で、ローラー瓶に接種する。細胞を３日間にわた
り、付着細胞系として一面に拡がるまで増殖させ
る。この増殖相に使用される培地は、懸濁増殖に
用いられたものと同様である。３日の増殖期間の
最後に、血清含有培地を除去し、100mlの無血清
培地、即ち0.05ｍＭ非必須アミノ酸およびＬ−グ
ルタミンが添加されたた高グルコースDMEMお
よびHam′sF12の50−50混合物で置き換える。ロ
ーラー瓶をローラー瓶インキユベーターに１〜３
時間戻し、培地を再び除去し、新しい無血清培地
100mlで置き換える。無血清培地を１〜３時間イ
ンキユベートすると、汚染血清蛋白質濃度が減少
する。ローラー瓶を７日間インキユベーターに戻
し、その間にエリスロポエチンが無血清培地中で
蓄積する。７日間の産生期の最後に、培養済み培
地を除去し、第二の産生サイクルのために新しい
無血清培地で置き換える。この産生系の実施例で
は、代表的な７日間無血清培地試料は、RIAによ
ると、3892±409U／mlのヒトエリスロポエチン
を含有していた。0.9〜1.8×10⁵細胞／cm²の推定細
胞密度に基づけば、各850cm²のローラー瓶は0.75
〜1.5×10⁸個の細胞を含有しており、したがつて
７日間の100mlの培養についてのEPO産生速度は
750〜1470U／10⁶細胞／48時間であつた。 10nM MTXで処理された細胞株CHO pDSVL
−MkEPOの培養液をRIAイン・ビトロおよびイ
ン・ビボEPO活性分析に供した。培養済み培地
試料は、RIAで測定すると41.2±1.4U／ml、イ
ン・ビトロ生物学的活性分析で測定すると41.2±
0.064U／mlおよびイン・ビボ生物学的活性分析
で測定すると42.5±5U／ml、のMkEPOを含有し
ていた。ポリペプチド生成物のアミノ酸の配列を
調べるとEPO生成物の存在が示されており、基
本的な種では推定アミノ末端アラニンに隣接する
「リーダー」配列の３残基分を有していた。これ
は、CHO細胞内でのポリペプチドの膜処理が不
正確であることの結果なのか、あるいはヒト
EPOと比較したサルEPOアミノ末端構造の違い
を反映しているのかはまだわかつていない。 細胞株CHO pDSVL−gHuEPOの培養液を３
つの分析に供した。5.5日目の試料は、培地中に
組換えヒトEPOを、RIA分析で18.2U／ml、イ
ン・ビトロ分析で15.8±4.6U／mlおよびイン・ビ
ボ分析で16.8±3.0U／ml含有していた。 徐々に100nMのMTXまで増加させて得た
CHO pDSVL−gHuEPO細胞の培養液を３つの
分析に供した。３日間の試料は、組換えヒト
EPOをRIAで3089±129U／ml、イン・ビトロ分
析で2589±71.5U／mlおよびイン・ビボ分析で
240±160U／ml含有していた。この生成物のアミ
ノ酸配列は表に示したアミノ末端と一致してい
る。 10nMのMTX中、プラスミドpDSVL−MkEで
トランスフエクシヨンされたCHO細胞培養済み
培地をプールし、数日間にわたりMTXを透析除
去すると、221±5.1U／ml（EPO−CCM）の
EPO活性がある培地が得られた。正常BALB／
ｃマウスのヘマトクリツト値に及ぼすEPO−
CCMのイン・ビボ効果を、調べるため、以下の
実験を行なつた。トランスフエクシヨンしてない
CHO細胞の細胞培養済み培地（CCM）および
EPO−CCMをPBSで調製した。CCMをコントロ
ール群（マウス３匹）に用い、２つの用量の
EPO−CCM（４単位（Ｕ））の注射および44単位
（Ｕ）の注射）を実験群（１群２匹）に用いた。
５週間の間、７匹のマウスを週３回腹腔内注射し
た。８回目の注射後における、コントロール群の
平均ヘマトクリツト値は50.4％、4U群は55.1％、
および44U群は67.9％であつた。 哺乳類細胞の発現生成物は、エタノール勾配を
かけ、好ましくはPH７でHPLC（C₄）に付すこと
により、培地から実質的に精製された形で容易に
単離回収することができる。 予備実験を行ない、CHO細胞におけるヒト
EPO遺伝子発現調整培地から得られる組換え糖
蛋白質生成物を、ウエスタン・ブロツト分析およ
びSDS−PAGEによつてヒト尿EPO単離物と比
較して、その特徴を調べた。組換えCHO生成物
および尿抽出生成物を（両者から炭水化物を全て
除去するため）エンドグリコシダーゼＦ酵素
（EC3.2.1）処理して比較した結果、本質的に同一
の分子量を有する実質的均一な生成物を得た。 例 11 本例は、表に示したヒト種EPO配列をコー
ドし、大腸菌および酵母菌［サツカロマイセス・
セレビシエ（S.cerevisiae）］細胞での発現にお
けるそれぞれの「優先」コドンを取込んでいる２
つの構造遺伝子ヌクレオチド塩基集合体の全体的
製造に関する。簡単に言うと、用いられたプロト
コールは、アルトンらの開示（1983年11月24日に
WO83／04053として公開）に掲載されているも
のとほぼ同じであつた。遺伝子はまず成分オリゴ
ヌクレオチドを組み立ててマルチプル・ジユープ
レツクスとし、これを次いで３つの別個のセクシ
ヨンに組み立てるように設計した。これらのセク
シヨンは、容易に増幅するように設計してあり、
増幅系から除いてから順番に、あるいは多数フラ
グメントの結合により、適切な発現ベクターに構
築された。 下記表〜は、いかなるリーダーまたはプ
レ配列も欠如しているが、−１位に第一にメチオ
ニン塩基を有するヒトEPO翻訳生成物をコード
する合成遺伝子の設計と組立体を示している。更
に遺伝子は実質的部分に大腸菌の優先コドンを取
込んでおり、このためその構築は「ECEPO」遺
伝子と呼ばれる。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 更に具体的には、表は、ヒト種ポリペプチド
のアミノ末端残基をコードするセクシヨン１の
ECEPOの遺伝子を得るために用いられるオリゴ
ヌクレオチドを示している。オリゴヌクレオチド
は二重鎖（１と２、３と４等）として組立てら
れ、二重鎖は次いで結合され、表のような
ECEPOセクシヨン１が得られた。組立てられた
セクシヨンは末端EcoR及びBamH付着端を
それぞれ含み、EcoR付着端の「下流」には
Xba製限酵素認識部位が存在し、BamH付
着端の「上流」にはKpn認識部位が存在してい
ることに注目されたい。セクシヨン１は、このセ
クシヨンの配列の確認のために用いられるM13フ
アージベクターを用いて、容易に増幅させること
ができた。いくつかの困難な点が、大腸菌由来
RF DNAからXba／Kpnフラグメントとし
てセクシヨンを単離する上で現われたが、それは
おそらく宿主内でKpn認識部位塩基がメチル化
されるためであろう。一本鎖フアージDNAがし
たがつて単離され、プライマー・エクステンシヨ
ン法によりイン・ビトロで二重鎖型とされ、しか
る後所望の二重鎖フラグメントが容易に単離され
た。 ECEPO遺伝子セクシヨン２および３（表XIおよ
び）を、表およびXIIのオリゴヌクレオチド
からそれぞれ同様の方法で調製した。各セクシヨ
ンは配列の確認に用いられるM13ベクターで増幅
され、フアージDNAから単離された。表XIから
明らかなように、ECEPOセクシヨン２はEcoR
およびBamH付着端から構成さており、Kpn
／Bglフラグメントとして単離することがで
きた。同様に、ECEPOセクシヨン３をBamH
およびSal付着端から調製し、Bgl／Salフ
ラグメントとしてフアージRF DNAから単離す
ることができた。このように調製された３つのセ
クシヨンは、大腸菌翻訳開始のアミノ末端メチオ
ニンコドン（ATG）を含み、完全ヒトEPOポリ
ペプチドをコードするDNA連鎖（表）とし
て容易に組立てすることができる。開始ATGの
「上流」には、大腸菌の高度な発現OMP−ｆ遺伝
子におけるリボソーム結合部位配列を実質的に複
製する一連の塩基対が存在していることにも注目
されたい。 適切な発現ベクターを用いてECEPOを運搬す
ることができる。特定のベクターとして、チヤー
ルズ・エフ・モーリス（Charles F.Morris）に
より1984年８月６日に出願され、同時に係属中の
米国特許出願第636727号（公開された欧州特許出
願No.136490）に記載された、プラスミド
pCFM414（A.T.C.C.40076）の誘導体である「温
度感受性」プラスミドpCFM536をECEPO遺伝子
発現用に選択した。より具体的にはpCRM536を
XbaおよびHindで消化し、大フラグメント
を単離して、ECEPO遺伝子と２つの部分で結合
させるのに用いた。セクシヨン１（Xba／Kpn
）、２（Kpn／Bgl）および３（Bgl／Sal
）をM13内で正確な順序で予め組立てておき、
EPO遺伝子をそれから一本のXba／Hindフ
ラグメントとして単離した。このフラグメント
は、M13mp9フアージ由来のSalからHindま
での部位のポリリンカーの部分を有していた。得
られた発現プラスミドp536による発現の制御は
ラムダP_Lプロモーターによりなされたが、この
プロモーター自体、C〓₈₅₇リプレツサー遺伝子
（例えば、大腸菌株K₁₂ΔH_trpから得られる）の支
配下にある。 酵母菌の優先コードンを取込んだ合成遺伝子
（「SCEPO」）の構造は、以下の表〜XIに示
したとおりである。ECEPO遺伝子の場合と同様
に、完全な構築には３組のオリゴヌクレオチド
（表、および）形成が含まれており、
これを二重鎖に形成し、各セクシヨン（表、
および）に組立てた。合成は、SCEPO
およびECEPOの構造においていくらか適合性の
ある（sub−optimal）コードン（即ち、各遺伝
子におけるセクシヨン２のオリゴヌクレオチド１
〜６と同様に、各遺伝子のセクシヨン１のオリゴ
ヌクレオチド７〜12が一致する）を用いることに
より、部分的に容易化されたことに注目された
い。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 組立てられたSCEPOセクシヨンがM13にて配
列決定され、セクシヨン１、２および３はHind
／Kpn、Kpn／BglおよびBgl／Sal
フラグメントしてフアージから単離可能であつ
た。 SCEPO遺伝子生成物にとり現在好ましい発現
系は、グランド・エー・ビツターにより1983年４
月22日に出願され、同時に欧州特許願第0123294
号として1984年10月31日に公開された、係属中の
米国特許出願第487753号明細書に記載されている
ようなサツカロマイセス・セレビシエのα−因子
分泌に基づく分泌系である。簡単に言えば、この
系は、酵母α−因子遺伝子生成物のリーダー配列
をコードするDNAが、発現すべき外来性遺伝子
の暗号領域の5′側に直接位置している構造からな
る。その結果、翻訳された遺伝子生成物は、余剰
生成物の分泌時に、内在酵母酵素によつて「切離
される」リーダーまたはシグナル配列を含んでい
る。この構築ではα−因子翻訳開始（ATG）コ
ードンを利用しているため、SCEPO遺伝子の−
１位にそのようなコードンを付与する必要がなか
つた。表XIから明らかになるであろうように、
アラニン（＋１）暗号配列は、α−因子プロモー
ターに続くα−因子リーダーの最初の80残基の
DNAを含むプラスミドに直接挿入されるリンカ
ー配列の後にきている。SCEPO遺伝子発現のた
めの特定の好ましい構築においては、前記
SCEPOセクシヨンフラグメントおよびプラスミ
ドpαC3のHind／Sal消化による大フラグメ
ントからなる４部分の結合が行なわれる。得られ
るプラスミドpαC3／SCEPOから、α−因子プロ
モーター、リーダー配列およびSCEPO遺伝子を
BamH消化により単離し、BamH消化プラ
スミドpYEと連結させて、発現プラスミド
pYE／SCEPOを形成した。 例 12 本例は、例11の発現系における、合成ECEPO
およびSCEPO遺伝子の組換え生成物の発現に関
する。 大腸菌宿主細胞に用いられる発現系において、
例11のプラスミドp536を、C〓₈₅₇遺伝子を有する
適切なプラスミドpMW1で予めトランスフオー
メーシヨンされたAM7大腸菌細胞に移入させた。
LBブロス（アンピシリン50μｇ／mlおよびカナマ
イシン5μｇ／ml、好ましくは10ｍＭ MgSO₄も
添加）中の培養細胞を28℃に維持し、O.D.600＝
0.1となるまで培養細胞が増殖してから、培養温
度を42℃に上げてEPO発現を誘導した。約400.D.
まで増殖した細胞は、約５mg／OD.リツトルの
EPO生成物（ゲルで評価）を産生した。 細胞を採取し、分離し、フレンチプレス
（10000psi）で破壊し、リゾチームおよびNP−40
界面活性剤で処理した。24000xg遠心分離で得た
ペレツトを塩酸グアニジンで溶解し、C₄（バイタ
ツク、Vydac）リバース・フエース（Reverse
Phase）HPLC（エタノール０〜80％、50ｍ
MNH₄Ac、PH4.5）により一工程で更に精製し
た。分離した蛋白質は95％以上純粋な生成物であ
り、得られた生成物は、約３：１の量比で、二つ
の異なるアミノ末端Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｒ……およびＰ
−Ｐ−Ｒ……を有していた。hEPOおよび
［desAla¹］hEPO生成物についての後者の観察
は、宿主細胞におけるアミノ末端「プロセツシン
グ」が、末端メチオニンおよびある場合には開始
アラニンを除去するように作用することを示して
いる。単離物のラジオイムノアツセイ活性は
150000〜160000U／mgであり、イン・ビトロ分析
活性では30000〜62000U／mgであり、更にイン・
ビボ分析活性では約120〜720U／mgであつた（参
考のために、各分析におけるヒト尿単離物標準は
70000U／mgである）。イン・ビボ分析における組
換え生成物の用量応答曲線は、ヒト尿EPO標準
のものとは著しく異なつていた。 サツカロマイセス・セレビシエ宿主細胞に用い
られる発現系において、プラスミドpYE／
SCEPOを二つの異なる株、即ち、YSDP4（遺伝
子型α pep4−３ trp1）およびRK81（遺伝子
型αα pep4−3trp1）に移入させた。トランスフ
オーメーシヨンされたYSDP4宿主を、カザミノ
酸が0.5％添加されたPH6.5のSD培地［ニユーヨー
ク州、コールドスプリングハーバー所在、コール
ドスプリングハーバーラボラトリー、「酵母遺伝
学の方法（Methods in Yeast Genetics）、第62
頁、1983年］で30℃にて増殖させた。細胞が
36O.D.まで増殖したときに採取した培地は、
EPO生成物を約244U／ml（RIAで97μｇ／OD.リ
ツトル）含有していた。6.5O.D.または60.O.D.ま
で増殖した形質転換RK81細胞は、約80〜90U／
mlのEPO濃度（RIAで34μｇ／OD・リツトル）
の培地を与えた。予備分析では、発現系により得
られる生成物は極めて不均一であつたが、それは
おそらく発現される蛋白質のグリコシル化が様々
であり、関連する炭水化物の中でマンノース含量
が比較的高かつたためであろう。 HB101大腸菌細胞に含まれるプラスミドPαC₃
およびpYEを、1984年９月27日に米国特許庁施
行規則に従い、それぞれ受託番号A.T.C.C.No.
39881およびA.T.C.C.No.39882として、メリーラ
ンド州、ロツクビル、パークローン・ドライブ
12301のアメリカン・タイプ、カルチヤー・コレ
クシヨン（American Type Culture
Collection）に寄託した（ブタペスト条約に基く
寄託）。AM7細胞中のプラスミドpCFM526、
JM103細胞中のpCFM536およびJM103細胞の
pMW1を同様に、それぞれA.T.C.C.No.39932、No.
39934およびNo.39933として、1984年11月21日に寄
託した（ブタペスト条約に基く寄託）。サツカロ
マイセス・セレビシエ株YSPD4およびRK81をそ
れぞれA.T.C.C.No.20734およびNo.20733として
1984年11月21日に寄託した（ブタペスト条約に基
く寄託）。 前述のように、本発明の組換え体由来生成物
は、天然源からのEPO単離物のイン・ビトロ生
物学的活性を様々な程度で保有しており、したが
つて赤血球形成細胞の増殖に用いられる培地にお
いて、EPO単離物に対する代替物としての利用
性を有するものと考えられる。同様に、本発明の
ポリペプチド生成物が天然EPO単離物のイン・
ビボ活性を有する範囲内において、それらはヒト
をはじめとする哺乳類におけるエリスロポエチン
治療処置に用いるのに極めて好適であり、イン・
ビボでのEPOに起因する効果、例えば、網状赤
血球応答の刺激、鉄動態効果の促進（例えばプラ
ズマ鉄回転効果および骨髄通過時間効果）、赤血
球質量変化、ヘモグロビン合成促進および例10に
示した哺乳動物におけるヘマトクリツト値の増加
などのあらゆる効果を促進させる。本発明の生成
物で治療可能なヒトの分類の中には、一般に輸血
を要する患者、外傷者などの外科患者、透析患者
などの腎疾患患者並びに血友病、鎌型赤血球病及
び生理学的貧血などのような各種血液組成に影響
を及ぼす疾患の患者が含まれる。EPO治療の採
用による輸血治療の必要性の最小化は感染物質に
よる感染の抑制につながると期待される。本発明
の生成物は、組換え法により生産されたものであ
るため、発熱物質、天然阻害物質等が混入してお
らず、このため天然由来生成物と比べ、高い総合
的な治療効果を発揮すると予想される。本発明の
生成物によるエリスロポエチン治療は、低酸素環
境条件下にある個体において酸素供給能を高め、
更には可能性として有益な心臓脈管系効果をもた
らすと期待される。 本発明のポリペプチド生成物を投与するための
好ましい方法は、非経口投与（例えば、静注、筋
注、皮下注または腹腔内注）であり、投与される
組成物には、治療有効量の生成物が、許容される
希釈剤、担体および／またはアジユバンドととも
に通常含有されている。有効量は治療条件によつ
て実質上変動すると思われるが、治療量は実際に
は活性物質の7U〜7000U／Kg体重の範囲内であ
ると予想される。ヒト血清アルブミンのような標
準的希釈剤が本発明の医薬組成物用として考えら
れ、生理的食塩水のような標準的担体が同様に考
えられる。 本発明の組成物に使用するのに好適なアジユバ
ント物質には、テストステロン、前駆細胞周激
剤、インシユリン様成長因子、プロスタグランジ
ン類、セロトニン、サイクリツクAMP、プロラ
クチンおよびトリヨードチロニンのように赤血球
生成刺激効果に関して独立に注目される化合物、
並びにメテノレン、スタノゾロールおよびナンド
ロロンのように、再生不良性貧血の治療に一般に
用いられる薬物が含まれる。 更にアジユバンドとして考えられるものには、
アドレナリン作動性物質、甲状線ホルモン、男性
ホルモンおよびBPAのように、エリスロポエチ
ンまたはアシアロ−EPOの効果を高めること、
あるいは補強すること、が報告された物質並びに
「肝造血因子」と目される化合物類、「エリスロト
ロピン類」（Erythrotropins）および「エリスロ
ジエニン類」（erythrogenins）が挙げられる。 本発明ポリペプチドの診断的用途も同様に広範
であり、RIAおよびELSA等の各種イムノアツセ
イ技術、並びに各種のイン・ビトロおよびイン・
ビボ活性分析において標識および末標識型での使
用が挙げられる。 本発明の他の面によれば、ここに記載された、
ヒトおよびサルEPOポリペプチドをコードする
クローンDNA配列は、天然生成物の単離物につ
いての数10年間にわたる分析にもかかわらず今ま
で利用できなかつた哺乳類エリスロポエチンアミ
ノ酸配列に関し、それらが与える情報において極
めて価値が高い。このDNA配列はまた、各種組
換え技術によつて大量のエリスロポエチンを微生
物合成するのに役立つ生成物としても極めて価値
がある。即ち、本明細書で示したDNA配列は、
新規でかつ有用なウイルス性および環状プラスミ
ドDNAベクター、新規でかつ有用なトランスフ
オーメーシヨンおよびトランスフエクシヨンされ
た原核ならびに真核宿主細胞（培地で増殖される
細菌、酵母細胞および哺乳類細胞が含まれる）お
よびEPO、並びにEPO生成物の発現が可能な微
生物宿主細胞の新規でかつ有用な培養増殖方法を
得る上で有益である。本発明のDNA配列は、こ
こに具体的に説明したヒトおよびサル種以外の哺
乳動物種におけるEPOおよび関連蛋白質をコー
ドするcDNAおよびゲノムDNA配列を単離する
上で、標識化プローブとして使用するのに極めて
適した物質でもある。本発明のDNA配列が、各
種の別の蛋白質合成方法において（例えば昆虫の
細胞）、あるいはヒトおよび他の哺乳動物の遺伝
子治療において使用される範囲は計算できない。
本発明のDNA配列は、エリスロポエチンおよび
エリスロポエチン生成物を大量に産生する真核
「宿主」として機能する遺伝子変異哺乳動物種を
得る上で有用であると予想される。一般的には、
パーミターら：「サイエンス」、第222巻、第4625
号、第809−814頁、1983年［Palmiter、et al.、
Science、222（4625）、809−814（1983）］参照。 この観点からすれば、したがつて、特定の実施
例の開示は本発明の範囲を制限するものでないこ
とは明白であり、多数の改変および変更が当業者
において考えられる。一例として、実施例で得ら
れるDNA配列はcDNAおよびゲノムDNA配列を
含み、それは本発明がDNA配列の製造に必要な
アミノ酸配列情報を提供するためのものだからで
あるが、本発明にはEPOアミノ酸配列の情報に
基づいて調製されるような合成DNA配列も含ま
れる。 同様の意味で、前記諸例は、細菌性プラスミド
およびウイルス性ゲノム起源のハイブリツドベク
ターに挿入されたDNAの哺乳動物細胞発現に関
し、EPO生成物を微生物発現させる発明を説明
するものであるが、広範な発現系が本発明の概念
の中に含まれる。特に、培養された各種細菌、酵
母菌及び哺乳動物細胞に適用される均一源からの
ベクターを含む発現系、及びベクターを含まない
発現系（例えば、リン酸カルシウムでトランスフ
エクシヨンされた細胞）が含まれる。 本発明のハイブリツド形成改良方法は、実際に
は上記DNA／DNAスクリーニングに用いられた
が、これはRNA／RNAおよびRNA／DNAスク
リーニングにて同様に適用可能である。ここに説
明したような混合プローブ技術は、一般に、より
迅速にかつ信頼をもつてポリヌクレオチドを単離
できるハイブリツド形成過程において多くの改良
点を有している。これらの多数の個々の操作上の
改良点としては、改良されたコロニー移転および
保存方法、および同様のフイルターで再プローブ
化でき、フイルターの繰返し使用が可能で、新規
なプロテアーゼ処理の適用を可能にするジーンス
クリーン（Gene Screen）およびジーンスクリー
ン・プラス（Gene Screen Plus）のようなナイ
ロン基質フイルターの使用［例えば、タウブら：
「アナリテイカル・バイオケミスリー」、第126巻、
第222−230頁、1982年［Taub、et al.、Anal.
Biochem.、126、pp222−230（1982）］と比較され
たい］、多数の混合プローブ（例えば、32種類を
超える数）のそれぞれの極めて低い濃度（0.025
ピコモルのオーダー）での使用、および、用いら
れる全ての混合プローブの中の最低の計算解離温
度に非常に近い厳格なる温度下での（即ち、それ
より４℃以内、好ましくは２℃以内での）ハイブ
リダイゼーシヨンおよびポストハイブリダイゼー
シヨン工程の実施、が挙げられる。これらの改良
点を組合わせると、それらの実施によるものとは
予想できない程の結果が得られる。このことは、
比較的低めの充分量なるメツセンジヤーRNA種
に、cDNAスクリーンを用いると好結果が得られ
たと今までに報告されたプローブ数の４倍量を含
む混合プローブ操作を、1500000のフアージプラ
ークのゲノムライブラリースクリーニングにおい
て唯一の遺伝子配列を単離するのに適用して成功
した、という事実により詳細に説明される。この
偉業は、アンダーソンらの、「混合プローブスク
リーニング法は相当するRNAの遺伝子が利用で
きない限り、哺乳類蛋白質遺伝子を単離するのは
実際上不可能である」との論評の公開と実質上同
時に行なわれたものである。 （アンダーソンら：「P.N.A.S.」、米国、第80
巻第6838−3842頁、1983年）。