ES2913530T3 - Métodos para tratar trastornos oftálmicos - Google Patents

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Abstract

Un antagonista de VEGF para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno oftálmico, donde el paciente tiene: (a) un único alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, y donde el trastorno oftálmico es degeneración macular senil (DMS); o (b) dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, y donde el trastorno oftálmico es degeneración macular senil (DMS) o edema macular diabético (EMD).

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para tratar trastornos oftálmicos
Campo técnico
La divulgación se refiere a métodos predictivos, terapias personalizadas, kits, formas transmisibles de información y métodos para tratar pacientes que padecen un trastorno oftálmico.
Antecedentes de la invención
La retinopatía diabética (RD) es una complicación microvascular de la diabetes con una compleja patogénesis multifactorial. Una creciente evidencia sugiere una participación significativa de factores genéticos en la susceptibilidad a RD independiente del control glucémico y de la duración de la diabetes. El factor genético más caracterizado que se asocia con el riesgo de RD es el polimorfismo funcional en el gen de la eritropoyetina (EPO) (rs1617640). Este polimorfismo se ubica en la región promotora de EPO y el alelo T estuvo asociado de manera significativa con RD proliferativa (RDP) en tres cohortes europeo-americanas. Los ensayos del promotor de la luciferasa mostraron que el alelo T es responsable de una mejora en un factor de 25 de la expresión del indicador en comparación con el alelo G. Además, la concentración de EPO en el cuerpo vítreo humano fue 7,5 veces más alta en sujetos normales con un genotipo homocigoto TT que en aquellos con un genotipo GG.
EPO es un potente factor angiogénico observado en el ojo diabético de seres humanos y ratones. La concentración de ARNm de EPO aumenta en el modelo en ratones de neovascularización retiniana inducida por la isquemia y esta neovascularización se suprime mediante la inhibición de EPO. Se detectó una fuerte inmunorreactividad del receptor de EPO en los tejidos neovasculares de ojos con RDP. Hermann M..M. et al. (2014) divulgan (véase todo el documento) polimorfismos de rs4576072 y rs6828477 en el gen de VEGFR2 que se asocian con mejores tasas de respuesta al tratamiento con ranibizumab (una terapia anti-VEGF) en degeneración macular senil que es un trastorno oftálmico/retiniano.
Compendio breve de la invención
En un aspecto, la descripción presenta un método para tratar selectivamente a un paciente que padece un trastorno oftálmico, que incluye la administración selectiva de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de VEGF al paciente basándose en que el paciente tiene uno o más marcadores de respuesta oftálmicos seleccionados del grupo que incluye: un único alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, un único alelo que tiene una guanina en el locus rs2010963, y dos alelos que tienen una guanina en el locus rs2010963.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar selectivamente a un paciente que padece un trastorno oftálmico, que incluye administrar selectivamente una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de EPO o la combinación de un antagonista de VEGF y un antagonista de EPO al paciente basándose en que el paciente tiene al menos un alelo que tiene una timina en el locus rs1617640 (por ejemplo, dos alelos que tienen una timina en el locus rs1617640).
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar selectivamente a un paciente que padece un trastorno oftálmico con un antagonista de VEGF, que incluye:
a) seleccionar el paciente para el tratamiento con el antagonista de VEGF basándose en que el paciente tiene uno o más marcadores de respuesta oftálmicos seleccionados del grupo que incluye: un único alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, un único alelo que tiene una guanina en el locus rs2010963, y dos alelos que tienen una guanina en el locus rs2010963; y
b) posteriormente, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista de VEGF al paciente. En otro aspecto más, la descripción presenta un método para tratar selectivamente a un paciente que padece un trastorno oftálmico con un antagonista de EPO hola combinación de un antagonista de VEGF y un antagonista de EPO, que incluye:
a) seleccionar el paciente para el tratamiento con el antagonista de VEGF y EPO basándose en que el paciente tiene al menos un alelo (por ejemplo, dos alelos) que tienen una timina en el locus rs1617640; y
b) posteriormente, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista de VEGF y/o el antagonista de EPO al paciente.
En un aspecto adicional, la descripción presenta un método para tratar selectivamente a un paciente que padece un trastorno oftálmico con un antagonista de VEGF, que incluye:
a) someter a ensayo una muestra biológica del paciente para detectar uno o más marcadores de respuesta oftálmicos seleccionados del grupo que incluye: un único alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, un único alelo que tiene una guanina en el locus rs2010963, y dos alelos que tienen una guanina en el locus rs2010963; y
b) posteriormente, administrar selectivamente al paciente el antagonista de VEGF.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar selectivamente a un paciente que padece un trastorno oftálmico con un antagonista de EPO hola combinación de un antagonista de VEGF y un antagonista de EPO, que incluye: a) someter a ensayo una muestra biológica del paciente para detectar al menos un alelo (por ejemplo, dos alelos) que tiene una timina en el locus rs1617640; y
b) posteriormente, administrar selectivamente al paciente el antagonista de VEGF y/o antagonista de EPO.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar selectivamente a un paciente que padece un trastorno oftálmico con un antagonista de VEGF, que incluye:
a) someter a ensayo una muestra biológica del paciente para detectar uno o más marcadores de respuesta oftálmicos seleccionados del grupo que incluye: un único alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, un único alelo que tiene una guanina en el locus rs2010963, y dos alelos que tienen una guanina en el locus rs2010963;
b) posteriormente, seleccionar el paciente para el tratamiento con el antagonista de VEGF basándose en que la muestra biológica del paciente tiene uno o más marcadores de respuesta oftálmicos seleccionados del grupo que incluye: un único alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, un único alelo que tiene una guanina en el locus rs2010963, y dos alelos que tienen una guanina en el locus rs2010963; y
c) posteriormente, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista de VEGF.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar selectivamente a un paciente que padece un trastorno oftálmico con un antagonista de EPO hola combinación de un antagonista de VEGF y un antagonista de EPO:
a) someter a ensayo una muestra biológica del paciente para detectar al menos un alelo (por ejemplo, dos alelos) que tiene una timina en el locus rs161764;
b) posteriormente, seleccionar el paciente para el tratamiento con la combinación de un antagonista de VEGF y un antagonista de EPO basándose en que la muestra biológica del paciente tiene al menos un alelo que tiene una timina en el locus rs161764; y
c) posteriormente, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista de VEGF y/o el antagonista de EPO. En otro aspecto, la descripción presenta un antagonista de VEGF para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno oftálmico, caracterizado por que se va a administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista de VEGF al paciente basándose en que el paciente tiene uno o más marcadores de respuesta oftálmicos seleccionados del grupo que incluye: un único alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, un único alelo que tiene una guanina en el locus rs2010963, y dos alelos que tienen una guanina en el locus rs2010963.
En un aspecto relacionado, la descripción presenta un antagonista de EPO para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno oftálmico, caracterizado por que se va a administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista de EPO al paciente basándose en que el paciente tiene al menos un alelo (por ejemplo, dos alelos) que tiene una timina en el locus rs1617640.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para predecir la probabilidad de que un paciente que padece un trastorno oftálmico responda al tratamiento con un antagonista de VEGF, que incluye someter a ensayo una muestra biológica del paciente para detectar la presencia o ausencia de uno o más marcadores de respuesta oftálmico seleccionados del grupo que incluye: un único alelo que tiene nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, un único alelo que tiene una guanina en el locus rs2010963 y dos alelos que tienen una guanina en el locus rs2010963.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para predecir la probabilidad de que un paciente que padece un trastorno oftálmico responda al tratamiento con una combinación de un antagonista de EPO o la combinación de un antagonista de VEGF y un antagonista de EPO, que incluye someter a ensayo una muestra biológica del paciente para detectar la presencia o ausencia de al menos un alelo (por ejemplo, dos alelos) que tiene una timina en el locus rs1617640. En otro aspecto más, la descripción presenta un método para producir una forma de información transmisible para predecir la sensibilidad de un paciente que padece un trastorno oftálmico al tratamiento con un antagonista de VEGF, que incluye determinar una mayor probabilidad de que el paciente responda al tratamiento con el antagonista de VEGF basándose en la presencia de uno o más marcadores de respuesta oftálmicos seleccionados del grupo que incluye: un único alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, un único alelo que tiene una guanina en el locus rs2010963, y dos alelos que tienen una guanina en el locus rs2010963 y registrar el resultado del paso de determinación en un medio tangible o intangible para su uso en la transmisión.
En otro aspecto más, la descripción presenta un método para producir una forma de información transmisible para predecir la sensibilidad de un paciente que padece un trastorno oftálmico al tratamiento con un antagonista de e Po o la combinación de un antagonista de VEGF y un antagonista de EPO, que incluye determinar una mayor probabilidad de que el paciente responda al tratamiento con un antagonista de EPO o la combinación de un antagonista de VEGF y un antagonista de EPO basándose en la presencia de al menos un alelo (por ejemplo, dos alelos) que tiene una timina en el locus rs1617640 y registrar el resultado del paso de determinación en un medio tangible o intangible para su uso en la transmisión.
En otra realización más, la descripción presenta un método para determinar la sensibilidad de un individuo con un trastorno retiniano al tratamiento con un antagonista de VEGF, incluyendo el método:
(i) aislar una muestra de un individuo que padece un trastorno retiniano;
(ii) realizar un ensayo que detecta la presencia de uno o más marcadores de respuesta oftálmicos seleccionados entre un único alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, un único alelo que tiene una guanina en el locus rs2010963, y dos alelos que tienen una guanina en el locus rs2010963;
(iii) señalar al individuo como alguien que responde al antagonista de VEGF si uno o más de los marcadores de respuesta oftálmicos están presentes en la muestra.
Asimismo, la descripción presenta un método para determinar la sensibilidad de un individuo con un trastorno retiniano al tratamiento con un antagonista de EPO, incluyendo el método:
(i) aislar una muestra de un individuo que padece un trastorno retiniano;
(ii) realizar un ensayo que detecta la presencia de al menos un alelo que tiene una timina en el locus rs1617640;
(iii) señalar al individuo como alguien que responde al antagonista de EPO si los marcadores de respuesta oftálmicos están presentes en la muestra.
Además, ciertos aspectos de la invención presentan un método para determinar si un sujeto con un trastorno retiniano debería ser tratado con un antagonista de VEGF, incluyendo el método:
(i) aislar una muestra del sujeto;
(ii) realizar un ensayo que detecta la presencia de al menos un alelo que tiene una timina en el locus rs1617640;
(iii) determinar que el sujeto se debe tratar con un antagonista de VEGF.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para determinar si un sujeto con un trastorno retiniano debería ser tratado con un antagonista de VEGF, incluyendo el método:
(i) aislar una muestra del sujeto;
(ii) realizar un ensayo que detecta la presencia de uno o más marcadores de respuesta oftálmicos seleccionados entre un único alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, un único alelo que tiene una guanina en el locus rs2010963, y dos alelos que tienen una guanina en el locus rs2010963;
(iii) determinar que el sujeto se debe tratar con un antagonista de VEGF.
Asimismo, se divulga pero no es parte de la invención un kit para predecir la respuesta a un antagonista de VEGF, incluyendo el kits los reactivos necesarios para detectar la presencia de uno o más marcadores de respuesta oftálmico seleccionados entre un único alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, un único alelo que tiene una guanina en el locus rs2010963, y dos alelos que tienen una guanina en el locus rs2010963.
Finalmente, se divulga, pero no es parte de la invención, un kit para predecir la respuesta a un antagonista de VEGF, incluyendo el kit los reactivos necesarios para detectar la presencia de al menos un alelo (por ejemplo, dos alelos) que tiene una timina en el locus rs1617640.
Los métodos anteriores pueden incluir además, opcionalmente, el paso de obtener la muestra biológica del paciente, donde el paso de obtención se realiza antes del paso de detección.
Cualquiera de los pasos de ensayo anteriores puede incluir preferentemente someter a ensayo la muestra biológica para detectar una secuencia genómica que incluye el locus rs161764 y/o el locus rs2010963. Tal ensayo puede ser, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ensayos de tipo TaqMan, secuenciación directa, hibridación dinámica específica de alelos, micromatrices de SNP con alta densidad de oligonucleótidos, ensayos de polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés), ensayos de extensión del cebador, ensayos de la oligonucleótido-ligasa, análisis de polimorfismos de la conformación de cadenas sencillas, electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE, por sus siglas en inglés), cromatografía de líquidos de alta resolución desnaturalizante, análisis de fusión de alta resolución, ensayos con proteínas que se unen a ADN con emparejamientos erróneos, SNPLex®, electroforesis capilar, transferencia de Southern, citometría de flujo, HPLC y espectrometría de masas. Las muestras biológicas pueden incluir, por ejemplo, líquido sinovial, sangre, suero, heces, plasma, orina, lágrimas, saliva, líquido cefalorraquídeo, una muestra de leucocitos y una muestra de tejido.
En cualquiera de los métodos anteriores el trastorno oftálmico es degeneración macular (por ejemplo, degeneración macular senil), edema macular diabético o retinopatía diabética. Asimismo, en cualquiera de los métodos anteriores, el antagonista de VEGF es una molécula que se une a VEGF o una molécula que se une al receptor de VEGF (por ejemplo, VEGFA). Las moléculas que se unen a VEGF (por ejemplo, VEGFA) pueden ser, por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGFA o porción que se une al antígeno o derivado de este (por ejemplo, bevacizumab o ranibizumab, un anticuerpo o porción que se une al antígeno o derivado de este seleccionado del grupo que incluye: NVS4, NVS80, NVS81, NVS82, NVS83, Nv S84 y NVS85 como se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. 20120014958 o el anticuerpo para VEGFA o porción que se une al antígeno o derivado de este descrito en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. 20140186350.
Además, el antagonista anti-EPO de los métodos anteriores puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o porción de unión al antígeno o derivado de este, por ejemplo, un anticuerpo o porción que se une al antígeno o derivado de este que tiene las secuencias CDR de Fab NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4 (incluidos anticuerpos o derivados de estos que incluyen los Fab NVS1-4) como se divulgan en la
Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2014/0199306.
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
Descripción breve de los dibujos
La Fig. 1 es un gráfico que muestra el efecto del genotipo de EPO en la respuesta de MAVC en pacientes con EMD tratados con Lucentis®.
La Fig. 2 es un gráfico que muestra el efecto del genotipo de EPO en la respuesta de MAVC en pacientes con EMD tratados con Lucentis® y láser.
La Fig. 3 es un gráfico que muestra el efecto del genotipo de EPO en la respuesta de MAVC en pacientes con EMD tratados con láser.
La Fig. 4 es un gráfico que muestra el efecto del genotipo de EPO en la respuesta de MAVC en pacientes con DMS tratados con Lucentis®.
La Fig. 5 es un gráfico que muestra el efecto del genotipo de EPO en la respuesta de MAVC en pacientes con DMS tratados con Lucentis® y láser.
La Fig. 6 es un gráfico que muestra el efecto del genotipo de VEGF en la respuesta de MAVC en pacientes con EMD tratados con Lucentis®.
La Fig. 7 es un gráfico que muestra el efecto del genotipo de VEGF en la respuesta de MAVC en pacientes con EMD tratados con Lucentis® y láser.
La Fig. 8 es un gráfico que muestra el efecto del genotipo de VEGF en la respuesta de MAVC en pacientes con EMD tratados con láser.
La Fig. 9 es un gráfico que muestra el efecto del genotipo de VEGF en la respuesta de MAVC en pacientes con DMS tratados con Lucentis®.
La Fig. 10 es un gráfico que muestra el efecto del genotipo de VEGF en la respuesta de MAVC en pacientes con DMS tratados con Lucentis® y láser.
La Fig. 11 es un gráfico que muestra el efecto aditivo de los genotipos de EPO y VEGF en la respuesta de MAVC en pacientes con DMS tratados con Lucentis®.
La Fig. 12 es un gráfico que muestra el efecto aditivo de los genotipos de EPO y VEGF en la respuesta de MAVC en pacientes con DMS tratados con Lucentis y láser.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa, parte, en el descubrimiento de que ciertos marcadores genómicos (denominados en la presente «marcadores de respuesta oftálmicos») son predictivos respecto al resultado de la terapia anti-VEGF en el tratamiento de trastornos oftálmico (por ejemplo, Lucentis®). En particular, los presentes inventores han descubierto que un polimorfismo en el promotor de la eritropoyetina humana es predictivo respecto a la eficacia de la terapia anti-VEGF. Además, los inventores han descubierto que la presencia de un polimorfismo particular en la UTR 5' de VEGF solo, o combinado con el polimorfismo de EPO, proporciona información adicional en relación a la respuesta predictiva respecto a la terapia anti-VEGF. Por lo tanto, la invención presenta métodos para identificar pacientes que es probable que respondan a la terapia anti-VEGF. Además, para los pacientes identificados por no incluir uno o más de los marcadores de respuesta oftálmicos anteriores, la invención presenta un tratamiento con un antagonista de EPO (por ejemplo, sólo o combinado con un antagonista de VEGF).
Específicamente, la invención se basa en parte en la observación de que el tratamiento (por ejemplo, en un sujeto con degeneración macular senil) con un antagonista de VEGF es más eficaz en pacientes que tienen al menos un alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640. Además, el tratamiento con un antagonista de VEGF en tales pacientes es aún más eficaz cuando el paciente tiene dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640. La invención también se basa en parte en la observación de que un polimorfismo en VEGF [UTR 5'] es un factor predictivo adicional de la eficacia de la monoterapia anti-VEGF. En tales casos, la presencia de un único alelo que tenga una guanina en el locus rs2010963 sugiere una mayor eficacia del tratamiento con monoterapia para VEGF mientras que el hecho de que dos alelos tengan esta guanina sugiere una eficacia aún mayor. Finalmente, la invención se basa en la observación de que, colectivamente, la presencia de los polimorfismos anteriores en los locus rs1617640 y rs2010963 (por ejemplo, en 2, 3 o los 4 alelos) representa una probabilidad mayor de eficacia de la monoterapia anti-VEGF en comparación con individuos sin una combinación de ambos polimorfismos.
Adicionalmente, la invención presenta la predicción de que la presencia de una timina en uno o más alelos en el locus rs1617640 sugiere eficacia del tratamiento con un antagonista de EPO. Aquí, la invención presenta el tratamiento de tales pacientes (por ejemplo, aquellos con degeneración macular senil) con un antagonista de EPO solo o con un antagonista de EPO combinado con un antagonista de VEGF.
El término «aproximadamente» en relación con un valor numérico x significa /-10 % a menos que el contexto dicte lo contrario.
Tal como se utiliza en la presente, los términos «sujeto» y «paciente» incluyen cualquier ser humano.
La expresión «someter a ensayo» se utiliza para hacer referencia al acto de identificar, cribar, explorar con una sonda, medir o determinar, acto que se puede llevar a cabo por cualquier medio convencional. Por ejemplo, una muestra se puede someter a ensayo para detectar la presencia de un marcador genético particular utilizando un ensayo ELISA, una transferencia de Northern, obtención de imágenes, secuenciación génica, fenotipado, haplotipado, espectrometría de masas, etc. El término «detectar» (y similares) se refiere al acto de extraer información particular de una fuente determinada, que puede ser directa o indirecta. En algunas realizaciones de los métodos predictivos divulgados en la presente, la presencia de una cosa concreta (por ejemplo, alelo, etc.) se detecta en una muestra biológica indirectamente, por ejemplo, haciendo búsquedas en una base de datos. Los términos «someter a ensayo» y «determinar» contemplan una transformación de materia, por ejemplo, una transformación de una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de sangre u otra muestra de tejido, de un estado a otro sometiendo esa muestra a evaluación física.
El término «obtener» se refiere a procurar, por ejemplo, adquirir la posesión por cualquier medio, por ejemplo, por intervención física (por ejemplo, biopsia, extracción de sangre) o intervención no física (por ejemplo, transmisión de información mediante un servidor), etc.
La frase «someter a ensayo una muestra biológica...», y similares, se utiliza para dar a entender que una muestra se puede evaluar (directa o indirectamente) para determinar la presencia o ausencia de un marcador de respuesta oftálmico concreto. Se entenderá que, en una situación en la que la presencia de una sustancia denota una probabilidad y la ausencia de una sustancia denota una probabilidad diferente, entonces se puede utilizar la presencia o la ausencia de tal sustancia para guiar una decisión terapéutica. Por ejemplo, se puede determinar si un paciente tiene un marcador de respuesta oftálmico determinando la existencia real del alelo de respuesta particular en el paciente o determinando la ausencia del alelo de respuesta particular en el paciente. En los dos casos, se ha determinado si el paciente tiene la presencia del marcador de respuesta oftálmico.
El término «VEGF» se refiere a VEGF-A, e incluye variantes polimórficas de VEGF-A, y equivalentes funcionales de VEGF-A. Los equivalentes funcionales de VEGF-A de acuerdo con la presente divulgación tienen preferentemente al menos aproximadamente un 85 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o incluso un 99 % de identidad secuencial global con un VEGFA natural.
«Antagonista de VEGF», tal como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula capaz de ejercer un efecto antagonista (por ejemplo, reducir, inhibir, disminuir, retrasar) en la función, expresión y/o señalización de VEGF (por ejemplo, bloqueando la unión de VEGF al receptor de VEGF). Los ejemplos no limitantes de antagonistas de VEGF incluyen moléculas que se unen a VEGF y moléculas que se unen al receptor de VEGF. En algunas realizaciones de los métodos, pautas, kits, procesos, usos y composiciones divulgados, se emplea un antagonista de VEGF.
Por «molécula que se une a VEGF» se entiende cualquier molécula capaz de unirse al antígeno VEGF humano ya sea solo o asociado con otras moléculas. La reacción de unión se puede mostrar mediante métodos estándar (ensayos cualitativos) que incluyen, por ejemplo, un ensayo de unión, ensayo de competición o un bioensayo para determinar la inhibición de la unión de VEGF a su receptor o cualquier tipo de ensayos de unión, con referencia a una prueba de control negativo en la que hay un anticuerpo con una especificidad no relacionada pero idealmente del mismo isotipo. Los ejemplos no limitantes de moléculas que se unen a VEGF incluyen moléculas de bajo peso molecular, señuelos del receptor de VEGF, y anticuerpos como se unen a VEGF como los producidos por linfocitos B o hibridomas y anticuerpos quiméricos, con injertos de CDR o humanos, o cualquier fragmento de estos, por ejemplo, fragmentos F(ab')2 y Fab, así como anticuerpos monocatenarios o de monodominio. Preferentemente, la molécula que se une a VEGF ejerce un efecto antagonista (por ejemplo, reduce, inhibe, disminuye, retrasa) la función, expresión y/o señalización de VEGf . En algunas realizaciones de los métodos, pautas, kits, procesos, usos y composiciones divulgados, se emplea una molécula que se une a VEGF.
Por «molécula que se une al receptor de VEGF» se entiende cualquier molécula capaz de unirse al receptor de VEGF humano ya sea solo o asociado con otras moléculas. La reacción de unión se puede mostrar mediante métodos estándar (ensayos cualitativos) que incluyen, por ejemplo, un ensayo de unión, ensayo de competición o un bioensayo para determinar la inhibición de la unión del receptor de VEGF a VEGF o cualquier tipo de ensayos de unión, con referencia a una prueba de control negativo en la que se utilizan un anticuerpo con una especificidad no relacionada pero idealmente del mismo isotipo. Los ejemplos no limitantes de moléculas que se unen al receptor de VEGF incluyen moléculas de bajo peso molecular, señuelos de VEGF, y anticuerpos contra el receptor de VEGF como los producidos por linfocitos B o hibridomas y anticuerpos quiméricos, con injertos de CDR o humanos, o cualquier fragmento de estos, por ejemplo, fragmentos F(ab')2 y Fab, así como anticuerpos monocatenarios o de monodominio. Preferentemente, la molécula que se une al receptor de VEGF ejerce un efecto antagonista (por ejemplo, reduce, inhibe, disminuye, retrasa) la función, expresión y/o señalización de VEGF. En algunas realizaciones de los métodos, pautas, kits, procesos, usos y composiciones divulgados, se emplea una molécula que se une al receptor de VEGF.
Las expresiones «proteína Epo» o «antígeno Epo» o «EPO» o «Epo» se utilizan indistintamente y se refieren a la proteína eritropoyetina en diferentes especies. Las secuencias proteicas de Epo humana, de cinomolgo, de ratón, de rata y de conejo son de acceso público. La EPO humana también puede estar hiperglucosilada.
Las expresiones «receptor de EPO» o «EPOR» se utilizan indistintamente y se refieren a la proteína receptora de eritropoyetina y se refieren a la proteína receptora de eritropoyetina en diferentes especies. Se ha descrito EPOR en Winkelmann J. C., Penny L. A., Deaven L. L., Forget B. G., Jenkins R. B. Blood 76:24-30 (1990).
«Antagonista de EPO», tal como se utiliza la presente, se refiere a una molécula capaz de ejercer un efecto antagonista (por ejemplo, reducir, inhibir, disminuir, rechazar) la función, expresión y/o señalización de EPO (por ejemplo, bloqueando la unión de EPO al receptor de EPO). Los ejemplos no limitantes de antagonistas de EPO incluyen moléculas que se unen a EPO y moléculas que se unen al receptor de EPO. En algunas realizaciones de los métodos, pautas, kits, procesos, usos y composiciones divulgados, se emplea un antagonista de EPO.
Por «molécula que se une a EPO» se entiende cualquier molécula capaz de unirse al antígeno EPO humano ya sea solo o asociado con otras moléculas. La reacción de unión se puede mostrar mediante métodos estándar (ensayos cualitativos) que incluyen, por ejemplo, un ensayo de unión, ensayo de competición o un bioensayo para determinar la inhibición de la unión de EPO a su receptor o cualquier tipo de ensayos de unión, con referencia a una prueba de control negativo en la que hay un anticuerpo con una especificidad no relacionada pero idealmente del mismo isotipo. Los ejemplos no limitantes de moléculas que se unen a v Eg F incluyen moléculas de bajo peso molecular, señuelos del receptor de VEGF, y anticuerpos como se unen a VEGF como los producidos por linfocitos B o hibridomas y anticuerpos quiméricos, con injertos de CDR o humanos, o cualquier fragmento de estos, por ejemplo, fragmentos F(ab')2 y Fab, así como anticuerpos monocatenarios o de monodominio. Preferentemente, la molécula que se une a VEGF ejerce un efecto antagonista (por ejemplo, reduce, inhibe, disminuye, retrasa) la función, expresión y/o señalización de VEGf . En algunas realizaciones de los métodos, pautas, kits, procesos, usos y composiciones divulgados, se emplea una molécula que se une a VEGF.
El término «anticuerpo» tal como se hace referencia a él en la presente incluye anticuerpos enteros y cualquier porción que se une al antígeno o cadenas sencillas de este. Un «anticuerpo» que se produce de forma natural es una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente como Vh) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio: CL. Las regiones Vh y Vl se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones hipervariables o regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de armazón (FR, por sus siglas en inglés). Cada Vh y Vl está compuesta de tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, incluidas diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico. En algunas realizaciones de los métodos, pautas, kits, procesos, usos y composiciones divulgados, se emplea un anticuerpo contra VEGF, EPO, receptor de VEGF o receptor de EPO, preferentemente un anticuerpo contra VEGF o EPO.
La expresión «porción que se une al antígeno» de un anticuerpo, tal como se utiliza en la presente, se refiere a fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, VEGF o EPO). Se ha mostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro de la expresión «porción que se une al antígeno» de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, CL y CH1; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un único brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), que econsiste en un dominio Vh; y una región CDR aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, estén codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, a través de un conector sintético que les permite convertirse en una única cadena proteica en la que las regiones Vl y Vh se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véanse, por ejemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; y Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Se pretende que el término «anticuerpo» también abarque los anticuerpos monocatenarios de este tipo. Los anticuerpos monocatenarios o porciones que se unen al antígeno se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones de los métodos, pautas, kits, procesos, usos y composiciones divulgados, se emplea un anticuerpo monocatenario o una porción que se une al antígeno de un anticuerpo contra VEGF o EPO.
Un «anticuerpo aislado», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente exento de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas. Las expresiones «anticuerpo monoclonal» o «composición de anticuerpo monoclonal» tal como se utilizan en la presente se refieren a un preparado de moléculas de anticuerpo de una sola composición molecular. La expresión "anticuerpo humano", tal como se utiliza en la presente, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las cuales tanto la región de armazón como las regiones CDR proceden de secuencias de origen humano. Un «anticuerpo humano» no necesita ser producido por un ser humano, tejido humano o célula humana. Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden incluir residuos aminoacídicos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro, o por adición de nucleótidos N a las uniones in vivo durante la recombinación de genes de anticuerpos o por mutación somática in vivo).
Se pretende que el término «Kd» haga referencia a la velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Se pretende que el término «Kd», tal como se utiliza en la presente, se refiera a la constante de disociación, que se obtiene de la relación de Kd respecto a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de Kd para anticuerpos se pueden determinar utilizando métodos muy consolidados en la técnica. Un método para determinar la Kd de un anticuerpo es utilizando resonancia de plasmones superficiales o utilizando un sistema de biosensor tal como un sistema Biacore®.
El término «afinidad» se refiere a la fuerza de interacción entre el anticuerpo y el antígeno en sitios antigénicos individuales. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del «brazo» de anticuerpo interactúa a través de fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numerosos sitios; cuantas más interacciones, más fuerte será la afinidad. En la técnica se conocen ensayos estándar para evaluar la afinidad de unión de los anticuerpos por VEGF o EPO de varias especies, que incluyen, por ejemplo, ensayos ELISA, inmunoelectrotransferencia y RIA. La cinética de la unión (por ejemplo, afinidad de unión) de los anticuerpos también se puede evaluar mediante ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como el análisis con Biacore.
Se entenderá que un anticuerpo que «inhibe» una o más de las propiedades funcionales de estos VEGF o EPO (por ejemplo, actividades bioquímicas, inmunoquímicas, celulares, fisiológicas o de otro tipo, o similares) según se determinan de acuerdo con metodologías conocidas en la técnica y descritas en la presente, se refiere a una disminución significativa desde un punto de vista estadístico en la actividad particular en relación con la observada en ausencia del anticuerpo (o cuando está presente un anticuerpo de control de especificidad irrelevante). Un anticuerpo que inhibe la actividad de VEGF o EPO ejerce una disminución significativa desde un punto de vista estadístico, por ejemplo, de al menos un 10 % del parámetro medido, de al menos un 50 %, 80 % o 90 %, y en ciertas realizaciones de los métodos, usos, procesos, kits y composiciones divulgados, el anticuerpo contra VEGF o EPO utilizado puede inhibir más de un 95 %, 98 % o 99 % de la actividad funcional de VEGF o EPO.
El término «derivado», a menos que se indique otra cosa, se utiliza para definir variantes de secuencias de aminoácidos y modificaciones covalentes (por ejemplo, PEGilación, desamidación, hidroxilación, fosforilación, metilación, etc.) de un antagonista de VEGF o EPO. Un «derivado funcional» incluye una molécula que comparte una actividad biológica cualitativa con los antagonistas de VEGF o EPO divulgados. Un derivado funcional incluye fragmentos y análogos peptídicos de un antagonista VEGF o EPO como los divulgados en la presente. Los fragmentos comprenden regiones dentro de la secuencia de un polipéptido de acuerdo con la presente divulgación, por ejemplo, de una secuencia especificada. Los derivados funcionales de los antagonistas de VEGF y EPO divulgados en la presente comprenden preferentemente dominios Vh y/o Vl que tienen al menos un 65 %, 75 %, 85 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o incluso un 99 % de identidad secuencial global con las secuencias de Vh y/o Vl de las moléculas que se unen a VEGF y EPO divulgadas en la presente, y conservan sustancialmente la capacidad de unirse a VEGF o EPO humana.
La frase «sustancialmente idéntica» significa que la secuencia de aminoácidos o nucleótidos relevante (por ejemplo, dominio Vh o Vl) será idéntica o tendrá diferencias insustanciales (por ejemplo, por sustituciones de aminoácidos conservadoras) en comparación con una secuencia de referencia particular. Las diferencias insustanciales incluyen cambios poco importantes de aminoácidos, tales como 1 o 2 sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras, tales como cambiar una serina por una treonina, o sustituciones en posiciones que no participan en la actividad, integridad estructural, fijación del complemento, etc., del anticuerpo) en una secuencia de 5 aminoácidos de una región especificada (por ejemplo, dominio Vh o Vl). En el caso de anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene al menos un 50 % de la afinidad de este. Las secuencias sustancialmente idénticas (por ejemplo, al menos aproximadamente un 85 % de identidad secuencial) a las secuencias divulgadas en la presente también forman parte de esta divulgación. En algunas realizaciones, la identidad secuencial de un anticuerpo de VEGF o EPO derivado puede ser de aproximadamente un 90 % o superior, por ejemplo, un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o superior respecto a las secuencias divulgadas.
«Identidad» con respecto a un polipéptido nativo y su derivado funcional se define en la presente como el porcentaje de residuos aminoacídicos en la secuencia de interés que son idénticos a los residuos de un polipéptido nativo correspondiente, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el porcentaje de identidad máximo, y sin tener en cuenta ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad secuencial. No se considerará que reducen la identidad ni las extensiones ni las inserciones N- o C-terminales. Los métodos y programas informáticos para la alineación de secuencias son muy conocidos. El porcentaje de identidad se puede determinar mediante algoritmos de alineación estándar, por ejemplo, la herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST, por sus siglas en inglés) descrita por Altshul et al. ((1990) J. Mol. Biol., 215: 403410); el algoritmo de Needleman et al. ((1970) J. Mol. Biol., 48: 444453); o el algoritmo de Meyers et al. ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11 17). Un conjunto de parámetros puede ser la matriz de puntuación Blosum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización por extensión de hueco de 4 y una penalización por hueco de desplazamiento del marco de 5. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.
«Aminoácido(s)» se refiere a todos los L-a-aminoácidos naturales, por ejemplo, e incluye D-aminoácidos. La frase «variante de secuencia de aminoácidos» se refiere a moléculas con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos en comparación con las secuencias de acuerdo con la presente divulgación. Las variantes de secuencias de aminoácidos incluyen variantes por sustitución (aquellas en las que se elimina al menos un residuo aminoacídicos y se inserta en su lugar un aminoácido diferente en la misma posición en un polipéptido de acuerdo con la presente divulgación), variantes por inserción (aquellas en las que se insertan uno o más aminoácidos de manera inmediatamente adyacente a un aminoácido en una posición particular en un polipéptido de acuerdo con la presente divulgación) y variantes por deleción (aquellas en las que se eliminan uno o más aminoácidos en un polipéptido de acuerdo con la presente divulgación).
La expresión «farmacéuticamente aceptable» se refiere a un material atóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del principio o los principios activos.
El término «administrar» en relación con un compuesto, por ejemplo, una molécula que se une a VEGF o EPO u otro agente, se utiliza para hacer referencia al suministro de ese compuesto a un paciente por cualquier vía.
Tal como se utiliza en la presente, una «cantidad terapéuticamente eficaz» se refiere a una cantidad de un antagonista de VEGF o EPO que es eficaz, al administrar una dosis o múltiples dosis a un paciente (tal como un ser humano) para tratar, prevenir, prevenir la aparición de, curar, retrasar, reducir la gravedad de, mejorar al menos un síntoma de un trastorno o trastorno recurrente, o prolongar la supervivencia del paciente superando la esperada en ausencia de tal tratamiento. Cuando se aplica a un principio activo individual administrado solo, la expresión se refiere a ese principio solo. Cuando se aplica a una combinación, la expresión se refiere a cantidades combinadas de los principios activos que provocan el efecto terapéutico, ya sean administrados en combinación, en serie o simultáneamente.
Tal como se utiliza en la presente, el término "tratar" o "tratamiento" de cualesquiera afecciones o trastornos asociados con una vasculopatía retiniana, afecciones o trastornos asociados con la retinopatía diabética y/o afecciones o trastornos asociados con el edema macular se refiere en un aspecto a mejorar la enfermedad o trastorno (es decir, ralentizar o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o al menos uno de los síntomas clínicos de esta). En otro aspecto "tratar" o "tratamiento" se refiere a aliviar o mejorar al menos un parámetro físico incluidos aquellos que pueden no ser perceptibles por el paciente. En otro aspecto más, «tratar» o «tratamiento» se refiere a modular la enfermedad o el trastorno, ya sea físicamente (por ejemplo, la estabilización de un síntoma perceptible), fisiológicamente (por ejemplo, la estabilización de un parámetro físico) o ambos. En otro aspecto más, "tratar" o "tratamiento" se refiere a prevenir o retrasar el inicio o desarrollo o evolución de la enfermedad o trastorno. "Prevención", referida a indicaciones descritas en la presente, incluidas afecciones o trastornos asociados con una vasculopatía retiniana, afecciones o trastornos asociados con la retinopatía diabética y/o afecciones o trastornos asociados con el edema macular, se refiere a cualquier acción que evite o ralentice un empeoramiento en la función visual, la anatomía de la retina, parámetro de la vasculopatía retiniana, parámetro de la retinopatía diabética y/o parámetro del edema macular, como se describe a continuación, en un paciente en riesgo de dicho empeoramiento. Más específicamente, el "tratamiento" de afecciones o trastornos asociados con la vasculopatía retiniana, afecciones o trastornos asociados con la retinopatía diabética y/o afecciones o trastornos asociados con el edema macular se refiere a cualquier acción que provoque, o esté contemplado que provoque, la mejora o conservación de la función visual y/o anatomía de la retina. Los métodos para evaluar el tratamiento y/o prevención de enfermedades son conocidos en la técnica y se describen en este documento más adelante.
La frase «responde al tratamiento» se utiliza para dar a entender que un paciente que ha recibido un tratamiento particular muestra un beneficio clínico significativo debido a dicho tratamiento. Se pretende que la frase «responde al tratamiento» se interprete comparativamente en lugar de como una respuesta absoluta. Por ejemplo, se predice que un paciente oftálmico que tiene un marcador de respuesta oftálmico obtendrá más beneficio del tratamiento con un antagonista de VEGF que un paciente oftálmico que no tenga el marcador de respuesta oftálmico. Estos portadores de los marcadores de respuesta oftálmicos responden de manera más favorable al tratamiento con el antagonista de VEGF y se puede decir simplemente que «responden al tratamiento» con un antagonista de VEGF.
La frase «recibir datos» se utiliza para referirse a obtener información por cualquier medio disponible, por ejemplo, por medio oral, electrónico (por ejemplo, por correo electrónico, codificado en un disquete u otro medio), escrito, etc.
Tal como se utiliza en la presente, «seleccionar» y «seleccionado», en referencia a un paciente, se utiliza para indicar que un paciente particular se elige específicamente de un grupo más grande de pacientes paciente basándose en que (debido a que) el paciente particular tiene un criterio predeterminado, por ejemplo, el paciente tiene un marcador de respuesta oftálmico. De manera similar, «tratar selectivamente» se refiere a proporciona tratamiento a un paciente que padece una enfermedad particular, donde el paciente se elige específicamente de un grupo más grande de pacientes basándose en que el paciente particular tiene un criterio predeterminado. De manera similar, «administrar selectivamente» se refiere a administrar un fármaco a un paciente que se elige específicamente de un grupo más grande de pacientes paciente basándose en que (debido a que) el paciente particular tiene un criterio predeterminado, por ejemplo, un marcador genético o biológico de otro tipo particular. Con seleccionar, tratar de manera selectiva y administrar de manera selectiva, se da a entender que se suministra a un paciente una terapia personalizada basándose en la biología particular del paciente en lugar de suministrar una pauta de tratamiento estándar basada únicamente en que el paciente padece una enfermedad particular. Seleccionar, en referencia a un método de tratamiento utilizado en la presente, no se refiere al tratamiento fortuito de un paciente que tiene, por ejemplo, un marcador de respuesta oftálmico, sino que se refiere a la elección deliberada de administrar un antagonista de VEGF a un paciente basándose en que el paciente tiene un marcador de respuesta oftálmico. Por lo tanto, el tratamiento selectivo se diferencia del tratamiento estándar, que suministra un fármaco particular a todos los pacientes, independientemente de su estado alélico.
Tal como se utiliza en la presente, «predecir» indica que los métodos descritos en la presente proporcionan información que permite que el personal sanitario determine la probabilidad de que un individuo padezca una enfermedad oftálmica seleccionada entre vasculopatía retiniana, edema macular, retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía diabética proliferativa y trastornos mediados por VEGF que responderán o responderán más favorablemente al tratamiento con una molécula que se une a VEGF y/o EPO. No se refiere a la capacidad de predecir la respuesta con un 100 % de exactitud. En su lugar, el experto entenderá que se refiere a una mayor probabilidad.
Tal como se utilizan en la presente, «probabilidad» y «probable» son una medida de cuán probable es que se produzca un evento. Se puede utilizar indistintamente con «posibilidad». La probabilidad se refiere a una posibilidad que es más que una especulación pero menos que una certeza. Por lo tanto, un evento es probable si una persona razonable que utiliza el sentido común, formación o experiencia concluye que dadas las circunstancias, un evento es factible. En algunas realizaciones, una vez que se ha determinado la probabilidad, el paciente se puede tratar (o continuar el tratamiento o seguir el tratamiento con un aumento de la dosis) con moléculas que se unen a VEGF y/o EPO o el paciente puede que no se trate (o suspender el tratamiento o continuar el tratamiento con una dosis menor) con las moléculas que se unen a VEGF y/o EPO.
La frase «mayor probabilidad» se refiere a un aumento en la probabilidad de que se produzca un evento. Por ejemplo, algunos métodos de la presente permiten predecir si un paciente presentará una mayor probabilidad a responder a un tratamiento con una molécula que se une a VEGF y/o EPO o una mayor probabilidad de responder mejor al tratamiento con una molécula que se une a VEGF y/o EPO en comparación con un paciente que padece una enfermedad oftálmica seleccionada entre vasculopatía retiniana, edema macular, retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía diabética proliferativa y trastornos mediados por VEGF que no tiene un genotipo particular (por ejemplo, un marcador de respuesta oftálmico).
Tal como se utiliza en la presente «SNP» se refiere a «polimorfismo mononucleotídico». Un polimorfismo mononucleotídico es una variación de la secuencia de ADN que se produce cuando un único nucleótido en el genoma (u otra secuencia compartida) difiere entre miembros de una especie biológica o cromosomas emparejados en un individuo. La mayoría de los SNP sólo tienen dos alelos y uno es normalmente más habitual en la población. Un SNP puede estar presente en un exón o un intrón de un gen, una región no traducida en 5' o 3' de un gen o en una publicación puramente genómica (es decir, no transcrita). Cuando se produce un SNP en la región codificante de un gen, el SNP puede no originar cambios (es decir, un polimorfismo sinónimo) debido a la redundancia del código genético o el SNP puede dar como resultado un cambio en la secuencia del polipéptido codificado (es decir, un polimorfismo no sinónimo). En la presente divulgación, se identifican los SNP por su numero rs de la base de datos de polimorfismos mononucleotídicos (dbSNP), por ejemplo, «rs1617640» o «rs2010963». El dbSNP es un archivo público de acceso libre de la variación genética dentro y a través de diferentes especies desarrollado y organizado por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, por sus siglas en inglés) en colaboración con el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano (NHGRI, por sus siglas en inglés).
Un sitio polimórfico, tal como un SNP, está normalmente precedido y seguido de secuencias conservadas en el genoma de la población de interés y, por lo tanto, se puede hacer referencia a menudo a la ubicación de un sitio polimórfico respecto a una secuencia de ácido nucleico consenso (por ejemplo, de treinta a sesenta nucleótidos) que rodea al sitio polimórfico, lo que en el caso de un SNP se denomina habitualmente como la «secuencia contexto del SNP». Las secuencias contexto para los SNP divulgados en la presente se pueden consultar en la base de datos SNP de NCBI que se puede consultar en: www.ncbi.nlm.nih.gov/snp. Como alternativa, se puede identificar la ubicación del sitio polimórfico por su ubicación en una secuencia de referencia (por ejemplo, depósito GeneBank) respecto al comienzo del gen, transcrito de ARNm, clon BAC o o incluso respecto al codón de inicio (ATG) para la traducción de la proteína. El experto entiende que la ubicación de un sitio polimórfico particular puede no ocurrir precisamente en la misma posición en una secuencia de referencia o contexto en cada individuo en una población de interés debido a presencia de una o más inserciones o deleciones en el genoma del individuo en comparación con la secuencia consenso o de referencia. Es algo habitual para el experto diseñar ensayos robustos, específicos y exactos para detectar los alelos alternativos en un sitio polimórfico en cualquier individuo dado, cuando se proporciona al experto la identidad de los alelos alternativos en el sitio polimórfico que se va a detectar en la secuencia de referencia o en la secuencia contexto o en ambas en las que se produce el sitio polimórfico. Por lo tanto, el experto entenderá que especificar la ubicación de cualquier sitio polimórfico descrito en la presente por referencia a una posición particular en una secuencia de referencia o contexto (o con respecto a un codón de inicio en una secuencia de este tipo) es meramente por comodidad y que cualquier posición nucleotídica enumerada específicamente incluye literalmente cualquier posición nucleotídica en la que está ubicado realmente el mismo sitio polimórfico en el mismo locus en cualquier individuo en el que se está estudiando la presencia del marcador genético de la invención utilizando cualquiera de los métodos de genotipado descritos en la presente u otros métodos de genotipado conocidos en la técnica.
Además de SNP, los polimorfismos genéticos incluyen traslocaciones, inserciones, sustituciones, deleciones, etc., que se producen en potenciadores, exones, intrones, promotores, UTR de 5', UTR de 3', etc., de los genes.
Tal como se utiliza en la presente, «rs1617640» se refiere a un SNP ubicado dentro del promotor del gen de EPO humano. El sitio polimórfico rs1617640 está ubicado en la posición cromosómica [chr7:100719675] (construcción [107]; ensamblaje [GRCh38.p2]), que es la posición [38212896] de Cóntigo NT_007933.16].
Tal como se utiliza en la presente, «rs2010963» se refiere a un SNP ubicado dentro de la [UTR 5'] del gen de VEGFA humano. El sitio polimórfico rs2010963 está ubicado en la posición cromosómica [chr6:43770613] (construcción [107]; ensamblaje [GRCh38.p2]), que es la posición [43710613] de Cóntigo [NT_007592.16].
Como reconoce un experto, las muestras de ácido nucleico que contienen un SNP particular pueden ser moléculas bicatenarias complementarias y, por lo tanto, una referencia a un sitio particular en la cadena sentido se refiere también al sitio correspondiente en la cadena antisentido complementaria. De manera similar, la referencia a un genotipo particular obtenido para un SNP en ambas copias de una cadena de un cromosoma es equivalente al genotipo complementario obtenido para el mismo SNP en ambas copias de la otra cadena.
Tal como se utiliza la presente, «secuencia genómica» se refiere a una secuencia de ADN presente en un genoma e incluye una región dentro de un alelo, el propio alelo, o una secuencia de ADN más grande de un cromosoma que contiene un alelo de interés.
El término «sonda» se refiere a cualquier composición de materia que es útil para detectar específicamente otra sustancia. Una sonda puede ser un oligonucleótido (incluido un oligonucleótido conjugado) que se hibrida específicamente con una secuencia genómica de un marcador de respuesta oftálmico, o un producto de tipo ácido nucleico de un marcador de respuesta oftálmico. Un oligonucleótido conjugado se refiere a un oligonucleótido unido covalentemente a un cromosoma o moléculas que contiene un ligando (por ejemplo, un antígeno), que es sumamente específico para una molécula receptora (por ejemplo, un anticuerpo específico para el antígeno). La sonda también puede ser un cebador de PCR, por ejemplo, junto con otro cebador, para amplificar una región particular dentro de un marcador de respuesta oftálmico. Además, la sonda puede ser un anticuerpo que se une específicamente a productos polipeptídicos de esos alelos. En realizaciones preferidas, la sonda se hibrida específicamente a una secuencia de ácido nucleico (preferentemente ADN genómico) oh se une específicamente a una secuencia polipeptídica de un alelo de interés.
La frase «se hibrida específicamente» se utiliza para referirse a la hibridación en condiciones de hibridación rigurosas. Los expertos en la técnica conocen las condiciones rigurosas y estas se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Se describen métodos acuosos y no acuosos en esa referencia y se puede utilizar cualquiera de ellos. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45 °C, seguida de al menos un lavado en SSC 0,2X, 0,1 % de SDS a 50 °C. Un segundo ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en SSC 6X a aproximadamente 45 °C, seguida de al menos un lavado en SSC 0,2X, 0,1 % de SDS a 55 °C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en SSC 6X a aproximadamente 45 °C, seguida de al menos un lavado en SSC 0,2X, 0,1 % de SDS a 60 °C. Un ejemplo adicional de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en SSC 6X a aproximadamente 45 °C, seguida de al menos un lavado en SSC 0,2X, 0,1 % de SDS a 65 °C. Las condiciones de hibridación muy rigurosas incluyen la hibridación en fosfato de sodio 0,5 M, 7 % de SDS a 65 °C, seguida de al menos un lavado en SSC 0,2X, 1 % de SDS a 65 °C.
La frase «una región de un ácido nucleico» se utiliza para señalar una secuencia más pequeña dentro de una secuencia mayor de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un gen es una región de un cromosoma, un exón es una región de un gen, etc.
La expresión «se une específicamente» en el contexto de los polipéptidos utiliza para indicar que un compuesto se une a una diana polipeptídica dada (por ejemplo, VEGF o EPO) en lugar de unirse aleatoriamente a polipéptidos no deseados. Sin embargo, «se une específicamente» no excluye una cierta reactividad cruzada con polipéptidos no deseados, siempre que la reactividad cruzada no interfiera con la capacidad de la sonda para proporcionar una medida útil de la presencia de una diana polipeptídica dada.
El término «capaz» se utiliza para referirse a la capacidad de conseguir un resultado dado, por ejemplo, una sonda que es capaz de detectar la presencia de una sustancia particular significa que se puede utilizar la sonda para detectar la sustancia particular.
Un «oligonucleótido» se refiere a una secuencia corta de nucleótidos, por ejemplo, 2-100 bases.
La expresión «muestra biológica», tal como se utiliza en la presente, se refiere a una muestra de un paciente, que se puede utilizar a efectos de identificación, diagnóstico, predicción o monitorización. Las muestras preferidas incluyen muestras de líquido sinovial, sangre, un producto procedente de la sangre (tal como la capa leucoplaquetaria, suero y plasma), linfa, orina, lágrimas, saliva, folículos del cabello, líquido cefalorraquídeo, exudados yugales, heces, líquido sinovial, células sinoviales, esputo o tejido (por ejemplo, muestras de cartílago). Además, un experto se dará cuenta de que algunas muestras se podrán analizar más fácilmente después de un procedimiento de fraccionamiento o purificación, por ejemplo, aislamiento de ADN a partir de la sangre intacta.
Antagonistas de VEGF
Las diferentes composiciones farmacéuticas, pautas, procesos, usos, métodos y kits divulgados utilizan un antagonista de VEGF, por ejemplo, una molécula que se une a VEGF (por ejemplo, un anticuerpo contra VEGF o porción que se une al antígeno de este, por ejemplo, ranibizumab (Lucentis®)) o una molécula que se une al receptor de VEGF (por ejemplo, anticuerpo contra el receptor VEGF o porción que se une al antígeno de este).
Los antagonistas de VEGF incluyen ranibizumab (Ferrara N et al., Retina. octubre de 2006; 26(8):859-70), bevacizumab (Ferrara N et al., Nat Rev Drug Discov. mayo de 2004; 3(5):391-400.), aflibercept (Stewart M W et al., Nat Rev Drug Discov.
30 de marzo de 2012; 11(4):269-70.), KH902 (Zhang M et al., Mol. Vis. 10 de enero de 2008; 14:37-49.), MP0112 (Campochiaro P A et al., Am J. Ophthalmol. abril de 2013; 155(4):697-704), pegaptanib (Gragoudas E S et al., N Engl J. Med. 30 de diciembre de 2004; 351(27):2805-16.), CT-322 (Dineen S P et al., BMC Cancer. 27 de nov. de 2008; 8:352. doi: 10.1186/1471-2407-8-352.), los anticuerpos y fragmentos anti-VEGF descritos en la Publicación de la Solicitud de Patente de EE. UU. 20140186350, incluidos NVS4, NVS80, NVS81, NVS82, NVS83, NVS84 y NVS85, y anticuerpos y fragmentos anti-VEGF como los descritos en US20120014958.
Los derivados de cualquiera de las moléculas anteriores también se incluyen en la expresión antagonistas de VEGF.
Antagonistas de EPO
Las diferentes composiciones farmacéuticas, pautas, procesos, usos, métodos y kits divulgados utilizan un antagonista de EPO, por ejemplo, una molécula que se une de EPO (por ejemplo, un anticuerpo contra EPO o porción que se une al antígeno de este, o una molécula que se une al receptor de EPO (por ejemplo, anticuerpo contra el receptor EPO o porción que se une al antígeno de este). Los ejemplos de antagonistas de EPO incluyen anticuerpos o derivados de estos que tienen las secuencias CDR, cadenas ligeras, pesadas o una combinación de cadenas pesadas y ligeras de Fab NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4 (incluidos anticuerpos o derivados de estos que comprenden los Fabs NVS1-4) según se divulgan en la siguiente tabla y en la Publicación de la Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2014/0199306.
Tabla de secuencias de antagonistas de EPO
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Enfermedades oftálmicas
Los métodos divulgados son útiles para el diagnóstico, tratamiento, prevención y/o mejora de enfermedades oftálmicas, incluidas afecciones o trastornos asociados con la vasculopatía retiniana, es decir, afecciones, trastornos o enfermedades en las que la retina se degenera o se vuelve disfuncional. Esto incluye afecciones o trastornos asociados con la retinopatía diabética (RD), edema macular diabético (EMD), retinopatía diabética proliferativa (RDP), retinopatía diabética no proliferativa (Rd NP), degeneración macular senil (DMS), oclusión de la vena retiniana (OVR), coroiditis multifocal, neovascularización coroidea miope o retinopatía del prematuro. Las características anatómicas de la vasculopatía retiniana que se pueden tratar mediante la inhibición de Epo y/o VEGF incluyen edema macular, dilatación venosa, tortuosidad de los vasos, filtración vascular medida por angiografía con fluoresceína, hemorragia retiniana y anomalías microvasculares (por ejemplo, microaneurisma, exudados algodonosos, AMIR), prolapso de los capilares, adhesión leucocitaria, isquemia retiniana, neovascularización de la papila óptica, neovascularización del polo posterior, neovascularización del iris, hemorragia intrarretiniana, hemorragia vítrea, cicatriz macular, fibrosis subretiniana y fibrosis retiniana.
La expresión "afección o trastorno asociado con la retinopatía diabética" se refiere a afecciones en que la retina se degenera o se vuelve disfuncional, como consecuencia de efectos de la diabetes mellitus (de tipo 1 o tipo 2) sobre la vasculatura retiniana, el metabolismo retiniano, el epitelio pigmentario retiniano, la barrera hematorretiniana o los niveles oculares de productos finales de la glucación avanzada (a Ge , por sus siglas en inglés), actividad de la aldosa-reductasa, hemoglobina glucosilada y proteína cinasa C. La pérdida visual en pacientes con retinopatía diabética puede ser un resultado de la isquemia retiniana, edema macular, filtración vascular, hemorragia vítrea o efectos directos de niveles elevados de glucosa en las neuronas retinianas. Las características anatómicas de la retinopatía diabética que se pueden tratar mediante inhibición de Epo incluyen microaneurisma, exudados algodonosos, dilatación venosa, edema macular, anomalías microvasculares intrarretinianas (AMIR), hemorragia intrarretiniana, proliferación vascular, neovascularización de la papila, rubeosis e isquemia retiniana. El "edema macular diabético" se produce en un sujeto con retinopatía diabética y puede producirse en cualquier etapa de la enfermedad.
La expresión "afección o trastorno asociado con el edema macular" se refiere a afecciones o trastornos en los que se produce hinchamiento o engrosamiento de la mácula como resultado de la filtración de líquidos desde los vasos sanguíneos de la retina, "edema macular". El edema macular se produce en, y a menudo es una complicación de, la vasculopatía retiniana. Las afecciones o trastornos específicos asociados con el edema macular incluyen la retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía diabética proliferativa, retinopatía diabética no proliferativa, degeneración macular senil, oclusión de la vena retiniana, coroiditis multifocal, neovascularización coroidea miope o retinopatía del prematuro. El tratamiento del edema macular mediante la inhibición de Epo se puede determinar mediante examen oftalmoscópico, tomografía de coherencia óptica y agudeza visual mejorada.
Técnicas para someter a ensayo, métodos de diagnóstico y métodos para producir una forma transm isible de información
Los métodos divulgados son útiles para el tratamiento, prevención o mejora de enfermedades oftálmicas, así como también para prevenir la probabilidad de que un paciente con una enfermedad oftálmica responda a un tratamiento con un antagonista de VEGF y/o EPO. Estos métodos emplean, entre otros, determinar si el paciente tiene un marcador de respuesta oftálmico en una muestra del paciente.
Se puede someter a ensayo una muestra biológica del paciente para detectar la presencia de un marcador de respuesta oftálmico mediante cualquier medio convencional aplicable. Se puede utilizar numerosas muestras biológicas para identificar la presencia de alelos o proteínas, el nivel de expresión de genes o proteínas y la actividad una proteína, por ejemplo, sangre, líquido sinovial, capa leucoplaquetaria, suero, plasma, linfa, heces, orina, lágrimas, saliva, líquido cefalorraquídeo, exudados yugales, esputo o tejido. En los métodos divulgados se pueden utilizar diversas fuentes dentro de una muestra biológica, por ejemplo, se puede someter a ensayo ADN genómico obtenido de una muestra biológica para detectar un marcador de respuesta oftálmico o se pueden someter a ensayo productos de un marcador de respuesta oftálmico, por ejemplo, productos de tipo ácido nucleico (por ejemplo, ADN, pre-ARNm, ARNm, microARN, etc.) y productos polipéptidos (por ejemplo, proteínas expresadas) obtenidos de una muestra biológica.
Como se describen los ejemplos, los autores han descubierto que la presencia de una timina en el locus rs1617640 (por ejemplo, una timina en ambos alelos en el locus rs1617640) da como resultado una menor sensibilidad a ranibizumab en comparación con otros alelos. Basándose en parte en este descubrimiento, la invención presenta el tratamiento selectivo de sujetos que no tienen (una o más) timinas en el locus rs1617640.
También, como se describen los ejemplos, los autores han descubierto que la presencia de una citosina en el locus rs2010963 (por ejemplo, una citosina en ambos alelos en el locus rs2010963) da como resultado una menor sensibilidad a ranibizumab en comparación con otros alelos. Basándose en parte en este descubrimiento, la invención presenta el tratamiento selectivo de sujetos que no tienen (una o más) citosinas en el locus rs2010963.
Se puede preparar ADN (genómico y ADNc) para la detección de SNP a partir de una muestra biológica mediante métodos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, extracción con fenol/cloroformo, sistema de purificación PUREGENE DNA® de GentAS Systems (Qiagen, CA). La detección de una secuencia de ADN puede incluir examinar el nucleótido o los nucleótidos ubicados en la cadena sentido o antisentido dentro de esa región. Se puede detectar la presencia de polimorfismos en un paciente a partir del ADN (genómico o ADNc) obtenido a partir de PCR utilizando sondas específicas de la secuencia, por ejemplo, sondas de hidrólisis de Taqman, Beacons, Scorpions; o sondas de hibridación que detectan el marcador o polimorfismo. Para la detección del polimorfismo, se pueden diseñar sondas específicas de la secuencia de modo que se hibriden específicamente con el ADN genómico para los alelos de interés o, en algunos casos, un ARN de interés. Los celadores y sondas para sitios polimórficos (por ejemplo, SNP) se pueden diseñar basándose en secuencias contexto encontradas en la base de datos de SNP de NCBI que se puede consultar en: www.ncbi.nlm.nih.gov/snp. Estas sondas se pueden marcar para la detección directa o poner en contacto con una segunda molécula detectable que se une específicamente a la sonda. Los productos de PCR también se pueden detectar mediante agentes que se unen al ADN. Dichos productos de PCR se pueden secuenciar posteriormente mediante cualquier método de secuenciación del ADN disponible en la técnica. Como alternativa, se puede detectar la presencia de un alelo mediante secuenciación utilizando cualesquiera métodos de secuenciación tales como, entre otros, secuenciación de Sanger, pirosecuenciación o secuenciación de nueva generación (Shendure J. y Ji, H., Nature Biotechnology (1998), Vol. 26, N.° 10, páginas 1135-1145). Se pueden adquirir ensayos de discriminación alélica optimizados para SNP de Applied Biosystems (Foster City, California, EE. UU.).
Se pueden aplicar diversas técnicas para estudiar un polimorfismo particular (por ejemplo, SNP), incluidos, por ejemplo, métodos que utilizan la hibridación, tales como genotipado por hibridación específica de alelos dinámica (DASH, por sus siglas en inglés), detección del sitio polimórfico (por ejemplo, SNP) mediante balizas moleculares (Abravaya K., et al. (2003) Clin Chem Lab Med. 41:468-474), tecnología Luminex xMAP®, tecnología Illumina Golden Gate® y micromatrices de SNP con alta densidad de oligonucleótidos (por ejemplo, Affymetrix Human SNP 5.0 GeneChip® realiza un ensayo hologenómico que puede genotipar más de 500000 SNP humanos), los kits BeadChip® de Illumina, por ejemplo, Human660W-Quad y Human 1.2M-Duo); métodos con enzimas, tales como el polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP), métodos que utilizan PCR (por ejemplo, ARMS-PCR con tetracebador), ensayos Invader (Olivier M. (2005) Mutat Res. 573(1-2):103-10), diversos ensayos por extensión del cebador (incorporados en formatos de detección, por ejemplo, espectrometría de masas MALDl-TOF, electroforesis, transferencia y métodos de tipo ELISA), ensayos TaqMan® y ensayos con oligonucleótido-ligasa; y otros métodos después de la amplificación, por ejemplo, análisis del polimorfismo de la conformación de cadenas sencillas (Costabile et al. (2006) Hum. Mutat. 27(12):1163-73), electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE), cromatografía de líquidos de alta resolución desnaturalizante, análisis de fusión de alta resolución, ensayos con proteínas que se unen a ADN con emparejamientos erróneos (por ejemplo, la proteína MutS de Thermus aquaticus se une a diferentes emparejamientos de nucleótidos únicos con diferentes afinidades y se puede utilizar en la electroforesis capilar para diferenciar los seis conjuntos de emparejamientos erróneos), SNPLex® (sistema de detección de SNP patentado que se puede adquirir de Applied Biosystems), electroforesis capilar, espectrometría de masas y diversos métodos de secuenciación, por ejemplo, pirosecuenciación y secuenciación de nueva generación, etc. Los kits comerciales para el genotipado de SNP incluyen, por ejemplo, IFC Fluidigm Dynamic Array® (Fluidigm), ensayo de genotipado de SNP TaqMan® (Applied Biosystems), MassARRAY® iPLEX Gold (Sequenom), kit para PCR con sonda para SNP Type-it Fast® (Quiagen), etc.
En algunas realizaciones, se detecta la presencia de un sitio polimórfico (por ejemplo, SNP) en un paciente utilizando un ensayo de hibridación. En un ensayo de hibridación, se determina la presencia del marcador genético en función de la capacidad del ácido nucleico de la muestra para hibridarse con una molécula de ácido nucleico complementaria, por ejemplo, una sonda oligonucleotídica. Se dispone de diversos ensayos de hibridación. En algunos, se detecta la hibridación de una sonda a la secuencia de interés directamente visualizando una sonda unida, por ejemplo, un ensayo de Northern o Southern. En estos ensayos, se aísla ADN (Southern) o ARN (Northern). A continuación, se escinde el a Dn o ARN con una serie de enzimas de restricción que escinden en frecuentemente el genoma y lejos de cualquiera de los marcadores que se están sometiendo a ensayo. A continuación, se separa el ADN o ARN, por ejemplo, en un gel de agarosa, y se transfiere a una membrana. Se permite que una sonda o sondas marcadas, por ejemplo, por incorporación de un radionucleótido o agente de unión (por ejemplo, verde SYBR®), entre en contacto con la membrana en condiciones de rigurosidad baja, media o alta. Se elimina la sonda que no se ha unido y se detecta la presencia de la unión visualizando la sonda marcada. En algunas realizaciones, se pueden utilizar micromatrices, por ejemplo, el sistema MassARRAY® (Sequenom, San Diego, California, EE. UU.) para genotipar a un sujeto.
También se pueden utilizar métodos de genotipado tradicionales para su uso en el genotipado. Tales métodos tradicionales incluyen, por ejemplo, técnicas de amplificación de ADN tales como PCR y variantes de esta, secuenciación directa, hibridación con SSO acoplada con la tecnología Luminex xMAP®, caracterización con SSP y SBT.
La caracterización con oligonucleótidos específicos de la secuencia (SSO, por sus siglas en inglés) utiliza amplificación de la diana por PCR, hibridación de los productos de la PCR con un panel de oligonucleótidos específicos de la secuencia inmovilizados sobre las perlas, detección del producto amplificado unido a la sonda mediante la formación de color y después análisis de los datos. Los expertos en la técnica entenderán que la hibridación con oligonucleótidos específicos de la secuencia (SSO) se puede realizar utilizando diversos kits comercializados, tales como los que proporcionan One Lambda, Inc. (Canoga Park, CA) o kits de caracterización de HLA Lifecodes (Tepnel Life Sciences Corp.) acoplados con tecnología Luminex® (Luminex, Corporation, TX). SSO LABType® es una solución de caracterización de ADN con SSO inversos (rSSO) que utiliza sondas oligonucleotídicas específicas de la secuencia (SSO) y microesferas codificadas con colores para identificar los alelos de HLA. El ADN diana se amplifica con reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) y después se hibrida con la micromatriz de sondas en perlas. El ensayo tiene lugar en un único pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos; por lo tanto, se pueden procesar 96 muestras a la vez.
La caracterización con cebadores específicos de la secuencia (SSP, por sus siglas en inglés) es una técnica con PCR que utiliza cebadores específicos de la secuencia para la caracterización con ADN. El método de SSP se basa en el principio de que sólo los cebadores con secuencias completamente emparejadas con las secuencias diana darán como resultado frutos amplificados en condiciones de PCR controladas. Los pares de cebadores específicos de la secuencia de los alelos se diseñan para amplificar selectivamente secuencias diana que son específicas de un único alelo o grupo de alelos. Los productos de la PCR se pueden visualizar en un gel de agarosa. Los pares de cebadores de control que se emparejan con secuencias no alélicas presentes en todas las muestras actúan como un control de la PCR interno para verificar la eficacia de la amplificación por PCR. Los expertos en la técnica entenderán que el genotipado de resolución baja, media y alta con la caracterización con cebadores específicos de la secuencia descritos se puede realizar utilizando diversos kits comercializados, tales como los kits Olerup SSP™ (Olerup, PA) o (Invitrogen) o Allset y ™Gold DQA1 con SSP de baja resolución (Invitrogen).
La caracterización basada en la secuencia (SBT, por sus siglas en inglés) se basa en la amplificación de la diana por PCR, seguida de secuenciación de los productos de la PCR y análisis de los datos.
En algunos casos, también se puede utilizar ARN, por ejemplo, ARNm maduro, pre-ARNm, para determinar la presencia de polimorfismos particulares. Por ejemplo, se puede utilizar la cantidad de ARNm de EPO como un sustituto de la actividad del promotor de EPO. El análisis de la secuencia de ARNm transcrito a partir de un gen dado se puede realizar utilizando cualquier método conocido en la técnica incluidos, entre otros, análisis por transferencia de Northern, ensayos de protección frente a nucleasas (NPA, por sus siglas en inglés), hibridación in situ, retrotranscripción seguida de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), RT-PCR ELISA, RT-PCR cuantitativa con TaqMan (RT-PCR cuantitativa con sonda) y RT-PCR cuantitativa con verde SYBR.
En algunos casos, se puede determinar la presencia de un polimorfismo en un paciente analizando productos polipeptídicos de los marcadores respuesta oftálmicos como sustitutos de la actividad del promotor de EPO. La detección de los productos polipéptido y con se puede realizar utilizando cualquier método conocido en la técnica incluidos, entre otros, tinción y inmunocitoquímica, ELISA, citometría de flujo, inmunoelectrotransferencia, espectrofotometría, HPLC y espectrometría de masas.
Un método para detectar productos polipeptídicos en una muestra es mediante una sonda que sea una proteína de unión capaz de interaccionar específicamente con una proteína marcadora (por ejemplo, un anticuerpo capaz de unirse a la proteína EPO). Preferentemente, se puede utilizar anticuerpos marcados, porciones de unión de estos, u otros compañeros de unión. Los anticuerpos pueden ser de origen monoclonal o policlonal, o pueden producirse biosintéticamente. Los compañeros de unión también pueden ser moléculas de origen natural o producirse sintéticamente. La cantidad de proteínas en complejo se determina usando metodologías estándar de detección de proteínas descritas en la técnica. Se puede consultar una revisión detallada del diseño, teoría y protocolos de ensayos inmunológicos en numerosos textos de la técnica, incluido Practical Immunology, Butt, W. R., ed., Marcel Dekker, Nueva York, 1984. Se puede disponer de diversos ensayos para detectar proteínas con anticuerpos marcados. Las marcas directas e incluyen etiquetas fluorescentes o luminiscentes, metales, tintes, radionúclidos y similares unidos al anticuerpo. Las marcas indirectas incluyen diversas enzimas muy conocidas en la técnica, tales como fosfatasa alcalina, hidrógeno-peroxidasa y similares. En un ensayo de un paso, los productos polipeptídicos, si están presente, se inmovilizan incuban con un anticuerpo marcado. El anticuerpo marcado se une a la molécula diana inmovilizada. Después del lavado para eliminar las moléculas no unidas, la muestra se somete a ensayo para detectar la marca.
La presente divulgación también contempla el uso de anticuerpos inmovilizados específicos para las proteínas o polipéptidos. Los anticuerpos se pueden inmovilizar en diversos soportes sólidos, tales como partículas de matriz magnética o cromatográfica, la superficie de una placa de ensayo (tal como pocillos de microvaloración), trozos de un material de sustrato sólido (tal como plástico, nailon, papel) y similares. Se puede preparar una tira de ensayo recubriendo con el anticuerpo o con una pluralidad de anticuerpos una matriz en un soporte sólido. A continuación, esta tira se puede sumergir en la muestra de prueba y después procesarla rápidamente través de lavados y paso dos de detección para generar una señal medible, tal como una mancha coloreada.
En un ensayo de dos pasos, se pueden incubar EPO inmovilizada con un anticuerpo no marcado. El complejo de anticuerpo no marcado, si está presente, se une a continuación a un segundo anticuerpo marcado que es específico para el anticuerpo no marcado. La muestra se lava y se somete a ensayo para detectar la presencia del marcador. La elección de marcador utilizado para marcar los anticuerpos variará dependiendo de la aplicación. Sin embargo, la elección del marcador la puede determinar fácilmente un experto en la materia. Los anticuerpos se pueden marcar con un átomo radiactivo, una enzima, un resto cromóforo o fluorescente o una etiqueta colorimétrica. La elección de la marca para etiquetar también dependerá de las limitaciones de la detección deseadas. Los ensayos enzimáticos (ELISA) normalmente permitirán la detección de un producto coloreado formado por la interacción del complejo de la enzima etiquetada con un sustrato de la enzima. Algunos ejemplos de átomos radiactivos incluyen 32P, 125I, 3H y 14P. Algunos ejemplos de enzimas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa y glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa. Algunos enzimas de restos cromóforos incluyen fluoresceína y rodamina. Los anticuerpos se pueden conjugar estas marcas mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las enzimas y moléculas cromóforas se pueden conjugar con los anticuerpos mediante agentes de acoplamiento, tales como dialdehídos, carbodiimidas, dimaleimidas y similares. Como alternativa, se puede producir la conjugación a través de un par ligando-receptor. Algunos pares adecuados de ligando-receptor incluyen, por ejemplo, biotina-avidina o -estreptavidina, y anticuerpo-antígeno.
En un aspecto, la presente divulgación contempla el uso de una técnica de tipo sandwich para detectar productos polipeptídicos en muestras biológicas. La técnica necesitados anticuerpos capaces de unirse a la proteína de interés: por ejemplo, uno inmovilizado en un soporte sólido y uno libre en solución, pero marcado con algún compuesto químico que se detecte con facilidad. Los ejemplos de marcas químicas que se puede utilizar para el segundo anticuerpo incluyen, entre otros, radioisótopos, compuestos fluorescentes y enzimas u otras moléculas que generan productos coloreados o con actividad electroquímica cuando se exponen a un reactivo o sustrato enzimático. Cuando se colocan en este sistema muestras que contienen productos polipeptídicos, los productos polipeptídicos se unen tanto al anticuerpo inmovilizado como al anticuerpo marcado. Esto da como resultado un complejo inmunitario de tipo «sandwich» sobre la superficie del soporte. La proteína en forma de complejo se detecta eliminando con lavados los componentes de la muestra no unidos y el anticuerpo marcado en exceso y midiendo la cantidad de anticuerpo marcado que forma un complejo con la proteína en la superficie del sustrato. El inmunoensayo sandwich es sumamente específico y muy sensible, siempre que se utilicen marcas con buenos límites de detección.
Preferentemente, se detecta la presencia de productos polipeptídicos en una muestra mediante radioinmunoensayos o inmunoensayos enzimáticos, inmunoensayos enzimáticos de unión competitiva, inmunotransferencia por puntos, inmunoelectrotransferencia, cromatografía, preferentemente cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) u otros ensayos conocidos en la técnica. La unión inmunológica específica del anticuerpo a la proteína o polipéptido se puede detectar directa o indirectamente.
Al llevar a cabo cualquiera de los métodos descritos en la presente que requieren determinar la presencia de un marcador de respuesta oftálmico, tal determinación se puede llevar a cabo consultando un almacén de datos que contiene suficiente información sobre la composición genética del paciente para determinar si el paciente tiene el marcador de interés.
Preferentemente, el almacén de datos enumera el genotipo presente (o ausente) en el individuo. El almacén de datos podría incluir la historia clínica del paciente, una tarjeta de datos médicos, un archivo (por ejemplo, archivo ASCII sin formato) informático u otro medio electrónico o no electrónico en el cual se pueden almacenar los datos genéticos o información apropiados. Tal como se utiliza la presente, una tarjeta de datos médicos es un dispositivo de almacenamiento portátil tal como una tarjeta de datos magnética, una tarjeta inteligente, que tiene una unidad de procesamiento incorporada y que está comercializada por proveedores tales como Siemens de Múnich, Alemania, o una tarjeta de memoria flash. Si el almacén de datos es un archivo informático; tales archivos pueden estar ubicados en diversos medios que incluyen: un servidor, un cliente, un disco duro, un CD, un DVD, un asistente digital personal tal como un teléfono inteligente, una grabadora, un disco zip, la memoria ROM interna del ordenador (memoria de solo lectura) o internet o la red. Para el experto serán obvios otros medios para el almacenamiento de archivos informáticos.
Normalmente, una vez que se determina la presencia de un marcador de respuesta oftálmico, se puede notificar el resultado a los médicos o asesores especializados en genética o pacientes u otros investigadores. Específicamente el resultado se puede plasmar en una forma transmisible de información que se pueda comunicar o transmitir a otros investigadores o médicos o asesores especializados en genética o pacientes. Una forma de este tipo puede variar y puede ser tangible o intangible. El resultado en el individuo estudiado se puede plasmar en comunicados descriptivos, diagramas, fotografías, gráficos, imágenes o cualquier otra forma visual. Por ejemplo, se pueden utilizar imágenes de electroforesis en gel de productos de la PCR en la explicación de los resultados. También son útiles diagramas que muestran donde está presente una variante al indicar los resultados de la prueba. Los comunicados respecto a los niveles de expresión de EPO, niveles de proteína/actividad de EPO o la presencia de un marcador de respuesta oftálmico también son útiles al indicar los resultados de la prueba. Estos comunicados y formas visuales se pueden registrar en un medio tangible tal como artículos, medios informáticos tales como disquetes, discos compactos, etc., o en un medio intangible, por ejemplo, un medio electrónico en forma de correo electrónico o página web en internet o intranet. Además, el resultado también se puede registrar en una forma auditiva y transmitir a través de cualquier medio adecuado, por ejemplo, líneas de cable analógicas o digitales, cables de fibra óptica, etc., mediante teléfono, facsímil, teléfono móvil inalámbrico, llamada telefónica por internet y similares. Todas estas formas (tangibles e intangibles) constituirían una "forma transmisible de información". Por tanto, la información y los datos sobre un resultado de una prueba se pueden producir en cualquier parte del mundo y transmitir a un lugar diferente. Por ejemplo, cuando se lleva a cabo un análisis de genotipado transnacional, se pueden generar y emitir la información y los datos sobre un resultado de una prueba en una forma transmisible como las que se han descrito anteriormente. El resultado de la prueba en una forma transmisible, por tanto, se puede importar a los Estados Unidos. Por consiguiente, la presente divulgación también abarca un método para producir una forma transmisible de información que contiene niveles de expresión de EPO, niveles de proteínas/actividad de EPO o la presencia de un marcador de respuesta oftálmico o en un individuo. Esta forma de información es útil para predecir la sensibilidad de un paciente que padece un trastorno oftálmico al tratamiento con un antagonista de VEGF y/o EPO, para seleccionar un ciclo de tratamiento basándose en esa información, y para tratar selectivamente a un paciente basándose en esa información.
En la presente se divulgan métodos para predecir la probabilidad de que un paciente que padece una enfermedad oftálmica responda al tratamiento con un antagonista de VEGF y/o EPO, que comprende detectar la presencia o ausencia de al menos un marcador de respuesta oftálmico en una muestra biológica del paciente. Como se ha señalado anteriormente, la presencia de uno o más alelos que contienen un marcador de respuesta oftálmico se asocia con una mayor probabilidad de que una monoterapia anti-VEGF sea eficaz. Como se ha señalado anteriormente, un sujeto puede tener tan solo cero y hasta cuatro alelos que contengan un marcador de respuesta oftálmico (dos para la presencia de un ácido nucleico que no tiene timina en el locus rs1617640 y dos para la presencia de una guanina en el locus rs2010963). En consecuencia, cuanto mayor sea el número de marcadores de respuesta oftálmicos, mayor será la probabilidad de eficacia de la monoterapia anti-VEGF. Por el contrario, cuantos menos marcadores respuesta oftálmicos estén presentes en un sujeto, mayor será la probabilidad de sugerir tratamiento con un antagonista de EPO. En particular, la presencia de una o más timinas en el locus rs1617640 sugerirá la terapia con antagonistas de EPO.
En algunas realizaciones, el método comprende además el paso de obtener una muestra biológica del paciente, donde el paso de obtención se realiza antes del paso de ensayo.
En algunas realizaciones, el al menos un marcador de respuesta oftálmico se detecta sometiendo a ensayo la muestra biológica para detectar un producto de tipo ácido nucleico del al menos un marcador de respuesta oftálmico, un producto polipeptídico del al menos un marcador de respuesta oftálmico o un marcador genético equivalente del al menos un marcador de respuesta oftálmico. En algunas realizaciones, el marcador de respuesta oftálmico se detecta sometiendo a ensayo la muestra biológica para detectar una secuencia genómica del al menos un marcador de respuesta oftálmico. En algunas realizaciones, la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en líquido sinovial, sangre, suero, heces, plasma, orina, lágrimas, saliva, líquido cefalorraquídeo, una muestra de leucocitos y una muestra de tejido.
En la presente también se divulgan varios métodos para predecir la probabilidad de que un paciente que tiene una enfermedad oftálmica seleccionada entre vasculopatía retiniana, edema macular, retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía diabética proliferativa y trastornos mediados por VEGF responda al tratamiento con un antagonista de VEGF y/o antagonista de EPO, que comprende detectar el nivel de expresión de EPO (por ejemplo, ARNm, ADNc, etc.), el nivel de la proteína EPO y/o el nivel de la actividad de EPO en una muestra biológica del paciente respecto a un control; donde una reducción del nivel de la expresión de EPO, reducción del nivel de la proteína EPO y/o una reducción del nivel de la actividad de EPO respecto al control es indicativo de una mayor probabilidad de que el paciente responda al tratamiento con el antagonista de VEGF (por ejemplo, monoterapia con el antagonista de VEGF). En una realización de este tipo, el control es un nivel de referencia de la expresión de EPO, nivel de la proteína EPO o nivel de la actividad de EPO procedente de un sujeto que se sabe que responde mal al tratamiento con un antagonista de VEGF.
En la presente también se divulgan varios métodos para predecir la probabilidad de que un paciente que tiene una enfermedad oftálmica seleccionada entre vasculopatía retiniana, edema macular, retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía diabética proliferativa y trastornos mediados por VEGF responda al tratamiento con un antagonista de VEGF y/o EPO, que comprende detectar un marcador de respuesta oftálmico, el nivel de expresión de EPO (por ejemplo, ARNm, ADNc, etc.), el nivel de la proteína EPO y/o el nivel de la actividad de EPO en una muestra biológica del paciente respecto a un control; donde un nivel similar de la expresión de EPO, nivel similar de la proteína EPO o un nivel similar de la actividad de EPO respecto al control es indicativo de una mayor probabilidad de que el paciente responde al tratamiento con el antagonista de VEGF y/o EPO. En una realización de este tipo, el control es un nivel de referencia de la expresión de EPO, nivel de la proteína EPO o nivel de la actividad de EPO procedente de un sujeto que se sabe que responde bien al tratamiento con un antagonista de VEGF y/o EPO.
En algunas realizaciones, la presencia del al menos un marcador de respuesta oftálmico, el nivel de la expresión de EPO o el nivel de la proteína/actividad de EPO se detecta mediante una técnica seleccionada del grupo que consiste en análisis por transferencia de Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción seguida de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), ensayos TaqMan, secuenciación directa, hibridación específica de alelos dinámica, micromatrices de SNP con alta densidad de oligonucleótidos, ensayos de polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP), ensayos de extensión del cebador, ensayos con oligonucleótido-ligasa, análisis de polimorfismos de la conformación de cadenas sencillas, electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE), cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante, análisis de fusión de alta resolución, ensayos con proteínas que se unen a ADN con emparejamientos erróneos, SNPLex®, electroforesis capilar, transferencia de Southern, inmunoensayos, inmunohistoquímica, ELISA, citometría de flujo, inmunoelectrotransferencia, HPLC y espectrometría de masas.
En algunas realizaciones, la enfermedad oftálmica es vasculopatía retiniana. En algunas realizaciones, la enfermedad oftálmica es edema macular. En algunas realizaciones, la enfermedad oftálmica es retinopatía diabética. En algunas realizaciones, la enfermedad oftálmica es edema macular diabético. En algunas realizaciones, la enfermedad oftálmica es retinopatía diabética proliferativa.
Métodos de tratamiento y usos de antagonistas de VEGF y EPO
Los métodos divulgados permiten a los facultativos proporcionar terapia personalizada a pacientes que padecen una enfermedad oftálmica (por ejemplo, vasculopatía retiniana, edema macular, retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía diabética proliferativa y trastornos mediados por VEGF), es decir, permiten determinar si tratar selectivamente al paciente con un antagonista de VEGF, antagonista de EPO o combinación de un antagonista tanto de VEGF como de EPO. De este modo, un facultativo puede maximizar los beneficios y minimizar los riesgos del antagonismo de VEGF y/o EPO en toda la población de pacientes aquejados de una enfermedad oftálmica (por ejemplo, vasculopatía retiniana, edema macular, retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía diabética proliferativa y trastornos mediados por VEGF). Se entenderá que los antagonistas de VEGF y EPO son útiles para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad oftálmica (por ejemplo, vasculopatía retiniana, edema macular, retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía diabética proliferativa y trastornos mediados por VEGF) como se divulga en la presente.
Los antagonistas de VEGF y/o EPO se pueden utilizar como una composición farmacéutica cuando se combinan con un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición de este tipo puede contener, además de un antagonista de VEGF y/o EPO, portadores, varios diluyentes, rellenos, sales, tampones, estabilizantes, solubilizantes y otros materiales muy conocidos en la técnica. Las características del portador dependerán de la vía de administración. Las composiciones farmacéuticas para su uso en los métodos divulgados también pueden contener agentes terapéuticos adicionales para el tratamiento del trastorno deseado particular. Por ejemplo, una composición farmacéutica también puede incluir agentes antiinflamatorios. Tales factores y/o agentes adicionales se pueden incluir en la composición farmacéutica para producir un efecto sinérgico con los antagonistas de VEGF y/o EPO o para minimizar efectos secundarios provocados por los antagonistas de VEGF y/o EPO.
Al llevar a la práctica alguno de los métodos de tratamiento o usos de la presente divulgación, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de VEGF y/o EPO al paciente (por ejemplo, un ser humano). Aunque se entiende que los métodos divulgados permiten el tratamiento selectivo de pacientes dependiendo de la presencia de un marcador de respuesta oftálmico, esto no excluye que, si el paciente se trata en última instancia con un antagonista de VEGF y/o EPO, tal terapia con un antagonista de VEGF y/o EPO sea necesariamente la única terapia. Ciertamente, si el paciente se selecciona para el tratamiento con un antagonista de VEGF y/o EPO, entonces el antagonista de VEGF y/o EPO se puede administrar de acuerdo con el método de la divulgación ya sea solo o combinado con otros agentes terapéuticos para tratar una enfermedad oftálmica en los pacientes. Cuando se coadministra con uno o más agentes terapéuticos adicionales, un antagonista de VEGF y/o EPO se puede administrar de forma simultánea con el otro agente terapéutico o de forma secuencial. Si se administra de forma secuencial, el facultativo a cargo el tratamiento decidirá la secuencia de administración apropiada del antagonista de VEGF y/o EPO en combinación con otros agentes terapéuticos, así como or las dosificaciones apropiadas para el cosuministro.
Se prefiere que la administración sea intravítrea. Otros métodos de administración incluyen intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, o la administración de forma próxima al sitio de la diana. El portador farmacéuticamente aceptable debe ser adecuado para la administración intravítrea, intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, medular o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, molécula biespecífica y multiespecífica, puede estar recubierto por un material para proteger el compuesto frente a la acción de ácidos y otras condiciones naturales que podrían desactivar el compuesto.
Kits
La invención también engloba kits para detectar un marcador de respuesta oftálmico en un paciente. Tales kits se pueden utilizar para predecir si es probable que un paciente que padece una enfermedad oftálmica seleccionada entre vasculopatía retiniana, edema macular, retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía diabética proliferativa y trastornos mediados por VEGF responda (o tenga una respuesta mayor) al tratamiento con un antagonista de VEGF y/o EPO. Por ejemplo, el kit puede comprender una sonda (por ejemplo, un oligonucleótido, anticuerpo, compuesto marcado u otro agente) capaz de detectar un marcador de respuesta oftálmico en una muestra biológica. El kit también puede comprender instrucciones para obtener la predicción sobre la probabilidad de que el paciente responda al tratamiento con el antagonista de VEGF y/o EPO.
Las sondas se pueden hibridar específicamente a secuencias genómicas, productos de tipo ácido nucleico o productos polipeptídicos. Son sondas ilustrativas los oligonucleótidos u oligoucleótidos conjugados que se hibridan específicamente a los alelos de respuesta de, por ejemplo, rs1617640 (por ejemplo, de ADN, ADNc, ARNm, etc.); oligonucleótidos de extensión del cebador, cebadores específicos de los alelos, una combinación de cebadores específicos de los alelos, sondas específicas de los alelos y cebadores de extensión de cebadores, etc. Opcionalmente, el kit puede contener una sonda cuya diana es un alelo de control interno, que puede ser cualquier alelo que presente la población general. Se diseña la detección de un alelo de control interno para garantizar el rendimiento del kit. Los kits divulgados también pueden comprender, por ejemplo, un agente tamponante, un conservante o un agente que estabiliza proteínas. El kit también puede comprender componentes necesarios para detectar el agente detectable (por ejemplo, una enzima o sustrato). El kit también puede contener una muestra de control o una serie de muestras de control que se pueden someter a ensayo y comparar con la muestra de prueba contenida. Cada componente del kit normalmente se encuentra dentro de un recipiente individual y todos los diferentes recipientes están dentro de un único envase junto con las instrucciones de uso.
Tales kits también pueden comprender un antagonista de VEGF y/o EPO o una composición farmacéutica que comprende el antagonista de VEGF y/o EPO. De este modo, tales kits son útiles en el tratamiento selectivo de pacientes que padecen un trastorno oftálmico utilizando un agonista de VEGF y/o EPO. Además, tales kits pueden comprender medios para administrar el antagonista de (por ejemplo, una jeringuilla y, un vial, una jeringuilla precargada, una pluma precargada) e instrucciones de uso. Estos kits pueden contener agentes terapéuticos adicionales (descritos anteriormente) para tratar una enfermedad oftálmica, por ejemplo, para su suministro en combinación con los antagonistas de VEGF y/o EPO adjuntos.
La frase «medio para administrar» se utiliza para indicar cualquier utensilio disponible para administrar por vía sistémica un fármaco a un paciente, que incluye, entre otros, una jeringuilla precargada, un vial y jeringuilla, una pluma de inyección, un autoinyector, etc. Con aparatos de este tipo, un paciente se puede autoadministrar el fármaco (es decir, administrarse el fármaco a sí mismo) o un médico puede administrar el fármaco.
General
Los detalles de una o más realizaciones de la divulgación se exponen en la descripción anterior adjunta. Aunque se pueden utilizar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o estudió de la presente divulgación, se describen ahora los métodos y materiales preferidos. Otras características, objetos y ventajas de la divulgación serán evidentes a partir de la descripción y a partir de las reivindicaciones. En la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular incluyen las referencias al plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado con el que los entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación.
Los siguientes Ejemplos se presentan con el fin de ilustrar más detalladamente las realizaciones preferidas de la divulgación. Estos ejemplos no se deben de interpretar de ningún modo como limitantes del alcance del tema sobre pacientes divulgado, según se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLO
El objetivo de los siguientes ejemplos fue:
Examinar el efecto del polimorfismo del promotor de EPO (rs1617640) en la respuesta a Lucentis en pacientes con DMS y EMD.
Examinar el efecto del polimorfismo de VEGF (rs2010963) en la respuesta a Lucentis en pacientes con DMS y EMD. Examinar el efecto aditivo de los dos polimorfismos en la respuesta a Lucentis en pacientes con DMS y EMD.
Descripción del método
Muestras y extracción de ADN
Se incluyeron dos estudios clínicos de EMD (CRFB002D2301 y CRFB002D2303) y tres de DMS (CRFB002A2302, CBPD952A2309 y CBPD952A2308) en esta evaluación farmacogenética. Se recogió una muestra de sangre de 10 mL en un tubo que contenía ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para la extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN). Después de extraer la sangre, la muestra se invirtió de 8 a 10 veces para evitar la coagulación. Se extrajo ADN genómico de la sangre intacta utilizando el kit de aislamiento de ADN PUREg En E™ (D-50K) (Gentra, Minneapolis, MN).
Genotipado
Se genotiparon un total de 316 pacientes con EMD y 458 con DMS húmeda para detectar el polimorfismo del promotor de EPO (rs1617640) y el polimorfismo de VEGF (rs2010963), respectivamente. Se utilizaron ensayos Assays-by-Design y Assays-on-Demand TaqMan en un secuenciador ABI 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA). El genotipado utilizó 5 ng de ADN genómico de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). La determinación del genotipo (genotyping cali) para cada ensayo fue >95 %.
Variables clínicas
Valor medio de la mejor agudeza visual corregida (MAVC) en el estado inicial para el ojo de estudio.
Cambio medio en MVAC desde el estado inicial hasta 12 meses para el ojo de estudio.
Número de inyección Lucentis®.
Análisis de los datos
Se utilizó la población de análisis por intención de tratar (IDT) con la última observación disponible (UOD) en el análisis. En el análisis se incluyeron todos los pacientes con datos del genotipo evaluables. En el análisis se combinaron los dos ensayos clínicos de d Ms , CRFB002D2301 y CRFB002D2303, para aumentar el tamaño de la muestra. De manera similar, en el análisis también se combinaron los tres estudios clínicos de DMS, CRFB002A2302, CBPD952A2309 y CBPD952A2308.
Se utilizó un modelo de regresión lineal para estudiar la presencia de una asociación entre factores genéticos y variables clínicas. En el modelo se incluyeron la edad, género, raza, centros de estudio y valor inicial como covariables. Se evaluó el modelo genético aditivo. Todas las pruebas estadísticas fueron bilaterales. No se ajustaron los valores de p para las pruebas múltiples. Se utilizó SAS 9.2.
Resultados
Características demográficas y MAVC inicial por genotipo de EPO
Un total de 301 pacientes con EMD y 453 con DMS húmeda tuvieron datos genotípicos evaluables para el polimorfismo el promotor de EPO (rs1617640), respectivamente. Los datos genotípicos no se desviaron del equilibrio de Hardy-Weinberg con p < 0,05 en una prueba de x2, de modo que no se observó evidencia del fallo del genotipado o mezcla de la población. En el análisis se incluyeron todos los pacientes con datos del genotipo evaluables. Las características demográficas se resumen en la Tabla 1 y Tabla 2. No hubo una diferencia significativa de las características demográficas entre los fenotipos de EPO excepto la raza en los pacientes con EMD. Aproximadamente un 91 % de los pacientes con EMD con TT fueron caucásicos mientras que sólo un 39 % de los pacientes con EMD con GG fueron caucásicos.
Tabla 1
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Tabla 2
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Hubo un gran porcentaje de asiáticos en uno de los estudios de EMD (Tabla 3). El resultado puede sugerir que la frecuencia del genotipo de EPO es significativamente diferente entre los caucásicos y los asiáticos. Como se muestra en la Tabla 3, la frecuencia de TT es significativamente más alta en los asiáticos que en los caucásicos (69,42 % frente a 34,12 %). Además, la frecuencia del genotipo de EPO de los caucásicos es muy similar entre EMD y DMS. Sin embargo, se sigue desconociendo si la frecuencia del genotipo observada sugiere una asociación con las humedades debido a la ausencia de controles emparejados en el presente estudio.
Tabla 3
Frecuencia del genotipo de EPO por raza y enfermedad
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Además, se estudió el efecto del genotipo de EPO en la agudeza visual inicial. Como se muestra en la Tabla 1 y Tabla 2, no hubo una diferencia significativa en la MAVC inicial entre los genotipos de EPO.
Efecto del polimorfismo del promotor de EPO en respuesta a Lucentis® en pacientes con EMD
Se combinaron dos ensayos clínicos de EMD, CRFB002D2301 y CRFB002D2303, en el estudio de la presencia de una asociación entre el polimorfismo del promotor de EPO y la respuesta a Lucentis®. Hubo un gran porcentaje de asiáticos en el estudio CRFB002D2303. Pero no hubo una diferencia significativa de la respuesta a Lucentis® entre caucásicos y asiáticos en los dos estudios combinados. Se realizó un modelo ANCOVA para evaluar el efecto del genotipo de EPO en el criterio principal de valoración clínico MAVC. Los tres grupos de tratamiento se analizaron por separado. Los resultados se presentan en la Tabla 4, Figura 1, Figura 2 y Figura 3. Las diferencias de la respuesta a Lucentis® no fueron significativas entre los grupos de genotipo, excepto en la monoterapia con Lucentis® en el mes 3 y 5 (p<0,05). Los pacientes con EMD con el alelo de riesgo (T) tendieron a tener una mejora de MAVC menor que aquellos sin el alelo de riesgo.
Como se muestra en la Figura 1, Figura 2 y Figura 3, hubo una gran variabilidad de respuesta a Lucentis durante los 12 meses de tratamiento en el estudio clínico global. Por lo tanto, se implementó un análisis de una mejora promedio de MAVC durante 12 meses para determinar la eficacia global de Lucentis en pacientes con EMD. Se observó una tendencia interesante de asociación entre el genotipo de EPO y la mejora promedio de MAVC en pacientes tratados sólo con Lucentis (p<0,1). Esto respalda las observaciones en el mes 3 y 5.
Tabla 4
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Efecto del polimorfismo del promotor de EPO en respuesta a Lucentis en pacientes con DMS
Los autores expandieron el estudio del polimorfismo del promotor de EPO a pacientes con DMS para comparar el efecto genético en la respuesta a Lucentis® entre las dos diferentes enfermedades. Inicialmente, se espero que el análisis árabe los pacientes con DMS tuviera un resultado negativo ya que no hay evidencia de asociación entre el polimorfismo del promotor de EPO y DMS hasta la fecha.
Se combinaron dos ensayos clínicos de DMS, CRFB002A2302, CBPD952A2309 y CBPD952A2308, en el estudio de la presencia de una asociación entre el polimorfismo del promotor de EPO y la respuesta a Lucentis®. Se realizó un modelo ANCOVA para evaluar el efecto del genotipo de EPO en el criterio principal de valoración clínico MAVC. Los resultados se presentan en la Tabla 5, Figura 4, Figura 5 y Figura 6.
Sorprendentemente, el efecto del genotipo de EPO en la mejora de MAVC resultó más obvio en pacientes con DMS que en pacientes con EMD. Las diferencias de la respuesta a la monoterapia con Lucentis® fueron significativas entre los grupos de genotipo, en el mes 7, 8, 9, 11 y 12 (p<0,05) (Tabla 5). También se observó una tendencia de asociación en el mes 5, 6 y 10 (p<0,1) (Tabla 5).
Como se muestra en la Figura 4, los pacientes con genotipo GG (n=44) comenzaron a presentar un rendimiento mejor en MAVC que los pacientes con genotipos GT o TT en respuesta a la monoterapia con Lucentis® del mes 2. Los pacientes con genotipo GT(n=117) comenzaron a presentar un rendimiento mejor que los pacientes con genotipo TT (n=91) a partir del mes 6. La diferencia de la mejora de MAVC entre los genotipos de EPO también fue mucho mayor en pacientes con DMS que la diferencia observada en pacientes con EMD.
Tabla 5
Efecto del genotipo de EPO en la respuesta de MAVC a Lucentis en pacientes con DMS
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Características demográficas y MAVC inicial por genotipo de VEGF
Los autores expandieron aún más este análisis farmacogenético al polimorfismo de VEGF (rs2010963) debido a que VEGF es la diana de Lucentis® y rs2010963 se asoció con RD y DMS (Errera et al. (2007) Diabetes Care. 30(2):275-9; Janik-Papis K et al. (2009) Exp Mol Pathol. 87(3):234-8). Interesantemente, un estudio reciente demostró que el alelo C de rs2010963 se asocia con una expresión del gen de VEGF más elevada en la retina humana.
Un total de 306 pacientes con EMD y 456 con DMS húmeda tuvieron datos genotípicos evaluables para el polimorfismo de VEGF, respectivamente. Los datos genotípicos no se desviaron del equilibrio de Hardy-Weinberg con p < 0,05 en una prueba de x2, de modo que no se observó evidencia del fallo del genotipado o mezcla de la población. En el análisis se incluyeron todos los pacientes con datos del genotipo evaluables.
Las características demográficas se resumen en la Tabla 6 y Tabla 7. De manera similar a los datos genotípicos de EPO, no hubo una diferencia significativa de las características demográficas entre los fenotipos de VEGF excepto la raza en los pacientes con EMD. Aproximadamente un 65 % de los pacientes con EMD con GG fueron caucásicos mientras que un 38 % de los pacientes con EMD con CC fueron caucásicos. Como se ha mencionado anteriormente, el resultado puede sugerir que la frecuencia del genotipo de VEGF es diferente entre los caucásicos y los asiáticos. Además, no hubo una diferencia significativa de MAVC inicial entre los genotipos de VEGF (Tabla 6 y Tabla 7).
Tabla 6
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Tabla 7
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Como se muestra en la Tabla 8, la frecuencia de genotipo GG es significativamente más alta en los asiáticos que en los caucásicos (41,14 % frente a 28,10 %). Además, se observó una frecuencia similar del genotipo de VEGF entre EMD y DMS en los caucásicos.
Tabla 8
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Efecto del polimorfismo de VEGF en la respuesta a Lucentis® en pacientes con EMD
Se combinaron los dos ensayos clínicos de EMD y se realizó un modelo ANCOVA para evaluar el efecto del polimorfismo de VEGF en el criterio principal de valoración clínico MAVC. Los resultados se presentan en la Tabla 9, Figura 6, Figura 7 y Figura 8. En ningún momento se observaron diferencias significativas de la respuesta a Lucentis® entre los grupos de genotipo. Hubo una tendencia de asociación entre el genotipo de VEGF y mejora de MAVC en el mes 10 y 11 para los pacientes que recibieron monoterapia de Lucentis® (p<0,1) (Tabla 9). Los pacientes con EMD y genotipo CC tendieron a tener una mejora de MAVC menor que aquellos con fenotipos CG o GG.
Tabla 9
Efecto del genotipo de VEGF en la respuesta de MAVC a Lucentis® en pacientes con EMD
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Efecto del polimorfismo de VEGF en la respuesta a Lucentis® en pacientes con DMS
Se combinaron los tres ensayos clínicos de DMS y se estudió el efecto del polimorfismo de VEGF en el criterio principal de valoración clínico MAVC mediante un modelo ANCOVA. Los resultados se presentan en la Tabla 10, Figura 9 y Figura 10. Las diferencias de la respuesta a la monoterapia con Lucentis® fueron significativas entre los grupos de genotipo en el mes 3, 5, 8, 9, 10 y 11 (p<0,05). También se observó una tendencia en el mes 6 (p<0,1) (Tabla 10).
Como se muestra en la Figura 9, los pacientes con el genotipo CC (n=27) solo mejoraron 1,48 letras cuando se trataron con Lucentis solo durante 12 meses. Por el contrario, los pacientes con los genotipos CG (n=103) y GG (n=123) mejoraron 6,25 y 6,77 letras, respectivamente.
Tabla 10 Efecto del genotipo de VEGF en la respuesta de MAVC a Lucentis en pacientes con DMS
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Efecto aditivo del polimorfismo de EPO y VEGF en la respuesta a Lucentis® en pacientes con DMS
La respuesta al tratamiento es compleja y está influenciada por múltiples factores. Para estudiar la posibilidad de un efecto genético aditivo en la respuesta a Lucentis®, se estratificaron los datos genotípicos de acuerdo con el número de alelos de riesgo en los genes de EPO y VEGF. El efecto adictivo en los alelos de riesgo en el criterio principal de valoración clínico MACV se estudió mediante un modelo ANCOVA. El análisis solo se realizó para los pacientes con DMS pero no para los pacientes con EMD debido al número extremadamente pequeño de pacientes en el grupo con 4 alelos de riesgo. Los resultados se presentan en la Tabla 11, Figura 11 y Figura 12.
Las diferencias de la respuesta a la monoterapia con Lucentis® fueron significativas entre los grupos de riesgo en el mes 8, 9 y 11 (p<0,05). También se observó una tendencia en el mes 5, 6 y 10 (p<0,1) (Tabla 11). No hubo una diferencia significativa de la respuesta a la monoterapia con Lucentis entre los portadores de 0 (n=18), 1 (n=84) y 2 (n=92) alelos de riesgo (Figura 11). Los pacientes mejoraron aproximadamente 7,5 letras durante 12 meses. Por el contrario, los portadores de 3 vale los de riesgo (n=45) mostraron una mejora moderada (3,29 letras) mientras que los portadores de 4 alelos de riesgo (n=12) demostraron un deterioro significativo en MAVC (-4,75 letras) durante 12 meses. Los resultados globales sugieren un efecto genético aditivo significativo de los dos genes en la respuesta a Lucentis®.
Tabla 11 Efecto aditivo de EPO y VEGF en la respuesta de MAVC a Lucentis en pacientes con DMS
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un antagonista de VEGF para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno oftálmico, donde el paciente tiene:
(a) un único alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, y donde el trastorno oftálmico es degeneración macular senil (DMS); o
(b) dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, y donde el trastorno oftálmico es degeneración macular senil (DMS) o edema macular diabético (EMD).
2. El antagonista de VEGF para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 combinado con un antagonista de EPO.
3. Un método para predecir la probabilidad de que un paciente que padece degeneración macular senil (DMS) o edema macular diabético (EMD) responda a un tratamiento con un antagonista de VEGF, que comprende someter a ensayo una muestra biológica de un paciente para detectar la presencia o ausencia de un único alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, donde el paciente padece DMS, o dos alelos que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, donde el paciente padece d Ms o EMD.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3 para predecir la probabilidad de que un paciente que padece degeneración macular senil (DMS) o edema macular diabético (EMD) responda al tratamiento con una combinación de un antagonista de VEGF y antagonista de EPO.
5. El método de la reivindicación 3 o 4, que comprende someter a ensayo una muestra biológica del paciente para detectar la presencia o ausencia de dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, donde el paciente padece DMS o EMD.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 5, donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en líquido sinovial, sangre, suero, heces, plasma, orina, lágrimas, saliva, líquido cefalorraquídeo, una muestra de leucocitos y una muestra de tejido.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 6, donde el paso de ensayo comprende una técnica seleccionada del grupo que consiste en reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ensayos TaqMan, secuenciación directa, hibridación específica de alelos dinámica, micromatrices de SNP con alta densidad de oligonucleótidos, ensayos de polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP), ensayos de extensión del cebador, ensayos con oligonucleótido-ligasa, análisis de polimorfismos de la conformación de cadenas sencillas, electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE), cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante, análisis de fusión de alta resolución, ensayos con proteínas que se unen a ADN con emparejamientos erróneos, electroforesis capilar, transferencia de Southern, citometría de flujo, HPLC y espectrometría de masas.
8. Un método para producir una forma transmisible de información para predecir la sensibilidad de un paciente que padece degeneración macular senil (DMS) o edema macular diabético (EMD) al tratamiento con un antagonista de Ve Gf , que comprende determinar un aumento de la probabilidad de que el paciente responda al tratamiento con un antagonista de VEGF basándose en la presencia de un único alelo que tiene un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, donde el paciente padece DMS, o dos alelos que tienen un nucleótido que no es timina en el locus rs1617640, donde el paciente padece DMS o EMD, y registrar el resultado del paso de determinación en un medio tangible o intangible para su uso en la transmisión.
9. El método para producir una forma transmisible de información de acuerdo con la reivindicación 8 para predecir la sensibilidad de un paciente que padece degeneración macular senil (DMS) o edema macular diabético (EMD) al tratamiento con una combinación de un antagonista de VEGF y antagonista de EPO.
10. El antagonista de VEGF para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 2 o el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 9, donde el antagonista de VEGF es una molécula que se une a VEGF o molécula que se une al receptor de VEGF.
11. El antagonista de VEGF para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, o el método de acuerdo con la reivindicación 10, donde la molécula que se une a VEGF es un anticuerpo anti-VEGFA o porción que se une al antígeno o derivado de este.
12. El antagonista de VEGF para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 2 y de 10 a 11, o el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 11, donde el antagonista de VEGF se selecciona del grupo que consiste en: bevacizumab, ranibizumab y aflibercept.
13. El antagonista de VEGF para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, o el método de acuerdo con la reivindicación 12, donde el antagonista de VEGF es ranibizumab.
14. El antagonista de VEGF para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2, de 10 a 13, o el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 4 a 7 o de 8 a 13, donde dicho antagonista de EPO es un anticuerpo o porción que se une al antígeno o derivado de este.
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