JP2001512745A - インスリンｃ−ペプチドの組換え発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、インスリンＣ−ペプチドを製造する方法において、インスリンＣ−ペプチドの多重コピーからなるマルチマーポリペプチドを宿主細胞中で発現させ、上記発現ポリペプチドを切断してインスリンＣ−ペプチドの単一コピーを放出させることからなる方法を提供する。また、このような方法に使用するための核酸分子、発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにこのような方法で発現されたおよび切断されたマルチマーインスリンＣ−ペプチドが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

本発明はインスリンＣ−ペプチドをコードする遺伝子配列のマルチマーコピー
よりなる組換えＤＮＡ分子からのインスリンＣ−ペプチドの製造に関する。

【０００２】

【背景技術】

インスリンは血糖レベルの調節に関与するタンパク質ホルモンである。インス
リンは肝臓においてインスリンのＢおよびＡ鎖が連結Ｃ−ペプチドを介して互い
に連結して構成されるその前駆物質プロインスリンとして産生される（以下プロ
インスリン分子に由来するこのＣ−ペプチドは、「インスリンＣ−ペプチド」と
呼ぶ）。インスリン自体はＢ鎖およびＡ鎖のみからなる。いくつかの最近の研究
はＣ−ペプチドに臨床的関連があることを示している（Johanssonら, Diabetolo
gia35: 121-128, 1992 および J.Clin.Endocrinol.Metab. 77, 976-981, 1993）
。内因性Ｃ−ペプチドを欠く１型糖尿病の患者では、このペプチドの投与が腎機
能を改善し、筋肉およびグルコース利用を刺激し、血液−網膜関門の機能を改善
する（Johanssonら, 1992 および 1993, 前出）。

【０００３】 まだ広く確認されているわけではないが、医療分野におけるインスリンＣ−ペ
プチドの治療的有用性は次第に知られるようになっている。したがって、インス
リンＣ−ペプチドの経済的かつ効率的な容易な合成方法の必要性がある。ペプチ
ドの化学的合成方法、たとえば固体支持体上におけるアミノ酸の段階的な付加に
よる方法は、現在では十分に開発され自動化されてはいるが、依然として時間が
かかり、特に重要な点は実施に経費がかかり、また、経済的で合成可能な信頼で
きる最大のペプチドの長さという点においては制限される。別法として組換えＤ
ＮＡの発現によるペプチドの産生方法が開発されているが、これらにもたとえば
収率の点などで欠点がないわけではない。

【０００４】 インスリンＣ−ペプチドの現在の製造スキームは、インスリンとＣ−ペプチド
の前駆体分子、プロインスリンの、通常はトリプシンおよびカルボキシペプチダ
ーゼＢによるプロセッシングに基づくものである（Nilssonら, J.Biotechnol. 4
8:241-250, 1996；Jonassonら, Eur.J.Biochem. 236: 656-661, 1996）。プロイ
ンスリンは大腸菌内で高レベルに発現可能な融合タンパク質として製造され、こ
の融合タンパク質は融合パートナーがプロインスリンのインスリンとＣ−ペプチ
ドへのプロセッシングによって同時に切断できる方法によって操作されている。
プロインスリンは、ＩgＧ（免疫グロブリン）に結合するスタフィロコッカスの プロテインＡに由来する合成の親和性融合タグ、ＺＺとの融合タンパク質として
製造される（Nilssonら, Prot.Eng, 1: 107-113, 1987）。この融合タグは、そ のタンパク分解に対する安定性、そのＩgＧ−結合能力、その高い発現レベルお よび溶解性によって選択された。選択された製造戦略は、封入体の可溶化および
続いて再生ののちに、ＺＺ親和性タグの切断および除去のための付加的な単位操
作を行わないで、効率的な精製に親和性タグの使用を可能にした。タグは、プロ
インスリンのインスリンおよびＣ−ペプチドへのトリプシン／カルボキシペプチ
ダーゼＢ消化により同時に切断されることが証明された。しかしながら、大きな
融合タンパク質の発現による小さなペプチドの産生は、最終生成物が発現遺伝子
産物の小部分を構成するにすぎないので、一般的に収率はかなり低い。

【０００５】 Ｓhen は Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 81: 4627-4631, 1984 に、プロインスリ ンポリペプチドドメインの多重縦列連結コピーからなる融合または非融合遺伝子
産物の発現によるヒトプロインスリンの製造方法を記載している。この遺伝子産
物はシアノーゲンブロミド処理によって単一のプロインスリン単位に切断するこ
とができる。ヒトインスリンはプロインスリン単位のトリプシン／カルボキシペ
プチダーゼによる切断で調製できると提案されている。しかしながら、インスリ
ンＣ−ペプチドの収率の改良の問題は処理されていない。

【０００６】 したがって、非融合生成物としてのインスリンＣ−ペプチドの収率を改良する
組換え発現方法の必要性が残されている。本発明はこの必要性を課題とする。

【０００７】 本発明は、ペプチドの組換え発現の現存する方法の改良を探求し、本質的には
単一遺伝子産物として、標的ペプチド（インスリンＣ−ペプチド）の多重コピー
をもつマルチマー（すなわちマルチマーポリペプチド）を発現させ、ついでこの
ようなマルチマー遺伝子産物（すなわちマルチマーポリペプチド）を切断し標的
ペプチドを個々のモノマー単位として放出させることにより標的ペプチド（この
場合インスリンＣ−ペプチド）の発現量を増加させるとの考え方に基づいている
。

【０００８】

【発明の開示】

したがって一態様において、本発明は、インスリンＣ−ペプチドの製造方法に
おいて、上記インスリンＣ−ペプチドの多重コピーからなるマルチマーポリペプ
チドを宿主細胞内において発現させ、上述の発現したポリペプチドを切断して、
インスリンＣ−ペプチドの単一コピーを放出させる（すなわち、マルチマーから
インスリンＣ−ペプチドモノマーを放出させる）ことからなる方法を提供する。

【０００９】 マルチマーポリペプチド（遺伝子産物）はインスリンＣ−ペプチドをコードす
るヌクレオチド配列の多重コピーからなる遺伝子構築体（換言すれば核酸分子）
によりコードされる。多重コピーもしくはリピートは、構築体中において、それ
らが単一のマルチマー遺伝子産物（すなわち、マルチマーポリペプチド）と一緒
に転写および翻訳されるように連結される。すなわち、たとえば構築体中で読み
取り枠がマッチするように多重ヌクレオチド配列が連結される「読み取りフォー
マット」に連結される。本質的には遺伝子構築体（核酸分子）はインスリンＣ−
ペプチドをコードするヌクレオチド配列のコンカテマーから構成されるのが有利
である。好ましくは遺伝子構築体はコードされたヌクレオチド配列の縦列コピー
から構成される。したがって、このような遺伝子構築体が調製され、ついで標準
方法によって宿主細胞中に導入され、発現される。発現した遺伝子産物（ポリペ
プチド）は、ついで回収され、切断されて、インスリンＣ−ペプチドモノマーを
放出する。

【００１０】 したがって、本発明のさらに他の態様においては、インスリンＣ−ペプチドを
コードするヌクレオチド配列の多重コピーからなる核酸分子を含有する宿主細胞
を上記核酸分子のマルチマーポリペプチドが発現する条件下に培養し、ついで、
上記発現ポリペプチドを切断して上記インスリンＣ−ペプチドの単一コピーを放
出させることからなるインスリンＣ−ペプチドの製造方法を提供する。

【００１１】 本明細書で用いられる「多重」または「マルチマー」なる語は、インスリンＣ
−ペプチドまたはそれをコードするヌクレオチド配列の２またはそれ以上、好ま
しくは２〜５０、２〜３０または２〜２０、さらに好ましくは２〜１５または２
〜１０のコピーを意味する。更なる例示的範囲には３〜２０、３〜１５または３
〜１０も包含される。

【００１２】 構築体は３またはそれ以上のコピーたとえば３〜７または５〜７のインスリン
Ｃ−ペプチドをコードするヌクレオチド配列のコピーからなるのが便利である。
７またはそれ以上の範囲たとえば７〜３０、７〜２０または７〜１５も有用であ
る。

【００１３】 本明細書において使用される「インスリンＣ−ペプチド」なる語は、ネイティ
ブなまたは合成のペプチドを包含するすべての型のインスリンＣ−ペプチドを包
含する。このようなインスリンＣ−ペプチドは、ヒトペプチドであってもまた他
の種および属の動物好ましくは哺乳動物からのペプチドであってもよい。すなわ
ちネイティブなインスリンＣ−ペプチドの変異体および修飾体も、それらがイン
スリンＣ−ペプチドの活性を維持する限り包含される。インスリンＣ−ペプチド
は、それらのネイティブな型、すなわち天然に他の種において見られるもしくは
幾何的変異等により異なる対立遺伝子変異体として、あるいは、それらのアミノ
酸のたとえば先端切除（たとえば、Ｎ−もしくはＣ−末端または両者から）また
は他のアミノ酸の欠失、付加もしくは置換により異なるそれらの機能的に均等な
変異体または誘導体として発現されてもよい。タンパク質またはペプチドの配列
の修飾は、それらの有用な活性を維持して、当該分野において標準であり文献に
広く記載されている方法、たとえば核酸等のランダムまたは部位特異的突然変異
誘発、切断およびライゲションーを用いて達成されることが周知である。すなわ
ち、ネイティブなインスリンＣ−ペプチド配列の機能性に均等な変異体または誘
導体は当該分野で周知の技術により容易に製造が容易であり、機能性、たとえば
ネイティブなインスリンＣ−ペプチドの生物活性を有するペプチド配列が包含さ
れる。すなわち、このような活性の語では、たとえばインスリンＣ−ペプチドは
、Ｃ−ペプチドについて報告されている治療活性たとえば糖尿病の処置または糖
尿病合併症たとえば糖尿病神経症、腎症および網膜症の処置または予防の各種治
療活性の基底にあるＮa⁺Ｋ⁺ＡＴＰase刺激活性を有することが知られている。ネ
イティブなもしくは合成のインスリンＣ−ペプチド配列のフラグメントもまた、
それらが由来し、したがって同様に包含されるペプチドの所望の機能的活性を有
する。特に Wahrenらにより WO 98／13384 に記載されたインスリンＣ−ペプチ ドフラグメントを挙げることができる。このようなインスリンＣ−ペプチドのす
べての類縁体、変異体、誘導体またはフラグメントは、特に本発明の範囲内に包
含され、「インスリンＣ−ペプチド」の語のもとに包括される。

【００１４】 ネイティブなヒトインスリンＣ−ペプチドを使用するのが便利で、このペプチ
ドは図２Ｃに示す（配列番号：１）。

【００１５】 本発明の方法のさらに好ましい実施態様においては、遺伝子構築体はさらに、
たとえば、遺伝子発現の生成物のプロセッシング時に用いられるマトリックスに
結合できる融合パートナー（融合タグ）をコードする配列からなる。

【００１６】 「融合パートナー」なる語は、その性質が発現した融合生成物の更なるプロセ
ッシングに使用することができるインスリンＣ−ペプチドと連続して翻訳される
任意のタンパク質もしくはペプチド分子またはその誘導体もしくはフラグメント
を意味する。

【００１７】 融合パートナーとマトリックスの間の相互作用は、親和性、キレートペプチド
、疎水性もしくは電荷相互作用または当該分野で周知の任意の他の機構に基づく
ものである。融合パートナーは親和性結合パートナーまたはリガンドのペアの一
方、たとえばタンパク質、ポリペプチド、またはリガンドに選択的もしくは特異
的に結合もしくは反応できるペプチド配列であるのが便利である。適当な融合パ
ートナーにはたとえば、ストレプトコッカスのプロテインＧおよびスタフィロコ
ッカスのプロテインＡならびにそれらの誘導体、β−ガラクトシダーゼ、グルタ
チオン-Ｓ-トランスフェラーゼおよびアビジンまたはストレプトアビジン、また
は免疫グロブリンＧ、基質類縁体または抗体およびビオチンのそれぞれと強力な
親和性を有する上述の任意のタンパク質のフラグメントまたは誘導体が包含され
る。このような相互作用は融合タンパク質生成物を複雑な混合物から精製するた
めに使用することができる。プロテインＡのＺＺフラグメント（Nilssonら, 前 出参照）は使用できるタンパク質フラグメントの一例である。ヒスチジンペプチ
ドはそれらが金属イオン、たとえばＺn²⁺，Ｃu²⁺またはＮi²⁺に結合し、溶出は ｐＨを下げるか、またはＥＤＴＡによって実施できるので、融合パートナーとし
て使用することができる（Ljungquistら, Eur.J.Biochem. 186: 563-569, 1989 ）。特に好ましいポリペプチド融合パートナーは、ストレプトコッカスのプロテ
インＧ（ＳpＧ）に由来する２５kＤaの血清アルブミン結合領域（ＢＢ）である か（Nygrenら, J.Mol.Recogn. 1: 69-74, 1988）または他のＳpＧ−誘導アルブ ミン結合タグ（Stahl & Nygren, Path.Bio. 45: 66-76, 1997）である。Obergら
は、所望の生成物のＢＢとの融合タンパク質としての発現のための遺伝子フラグ
メントの挿入に適した発現ベクター，ｐＴrp ＢＢ（配列番号：１４）について を報告している（Proceedings of the 6th European Congress on Biotechnolog
y 179-182,1994）。これらの融合パートナーは、アルブミンに対して強力な親和
性を有し、したがって発現した融合タンパク質の精製は、たとえばアルブミンを
充填したカラムを用いるリガンド親和性クロマトグラフィーに基づいて実施でき
る。アルブミンは固体支持体上に固定化することが好ましい。

【００１８】 切断工程、すなわちマルチマーポリペプチド、すなわち発現した遺伝子産物、
および存在すれば所望により融合パートナーからのモノマーインスリンＣ−ぺプ
チドの切断を達成するには、任意の簡便な方法を使用することができる。これは
酵素を用いて行うのが便利である。好ましくは、遺伝子発現の最初の生成物すな
わち融合パートナーおよびインスリンＣ−ぺプチドの多重コピー（モノマー）か
らなるマルチマーポリペプチドまたは融合生成物もしくは融合タンパク質を単一
プロセス工程で１種または２種以上のタンパク分解酵素により切断し、インスリ
ンＣ−ぺプチドの非融合単一コピーが生成される。トリプシンおよびカルボキシ
ペプチダーゼＢ（たとえばウシ、ブタまたは他のソースから）の併用処理は所望
の切断生成物を得るのに特に好ましい方法である。トリプシンはタンパク質を各
アルギニン残基のＣ末端で切断し、カルボキシペプチダーゼＢはトリプシン消化
後に各ペプチド上に存在するＣ末端アルギニンを除去する。タンパク分解切断を
達成するための条件は当該分野で周知であり、他の適当なタンパク分解酵素には
、たとえばスブチリシン（その突然変異体を含む）、エンテロキナーゼ、第Xa因
子、トロンビン、ＩgＡプロテアーゼ、プロテアーゼ３Ｃ、およびインテインが 包含される。たとえば、発現遺伝子産物のタンパク分解酵素（たとえば、トリプ
シンおよびカルボキシペプチダーゼＢ）との６０分間のインキュベーションは、
発現タンパク質の完全なプロセッシングに十分である。融合もしくはマルチマー
タンパク質が慣用の SDS−PAGE によって検出されないような融合タンパク質の 適当なプロセッシングには５分間のインキュベーション時間が十分である。別法
として遺伝子発現の最初の生成物を化学試薬たとえばＣＮＢr、ヒドロキシルア ミンまたはギ酸によって切断することができる。

【００１９】 用いられるインスリンＣ−ぺプチドおよび核酸分子（遺伝子構築体）の正確な
性質に応じて、たとえばタンパク分解のための切断部位は、天然に存在するか、
またはそれらは既知の技術たとえば部位特異的突然変異誘発、適当な切断部位を
コードするヌクレオチド配列のライゲーション等を用いる遺伝子構築体の適当な
操作によって導入することができる。

【００２０】 マルチマー発現ポリペプチドはリンカー領域、すなわち切断部位を導入または
提供するリンカー残基またはペプチドを含むのが便利である。切断部位はタンパ
ク分解酵素によって認識され切断される切断可能なモチーフからなるのが有利で
ある。リンカー領域は、マルチマー構築体中の各「モノマー」ペプチド間に、お
よび／または融合パートナーが存在すればそれとモノマーペプチドの間にも任意
に導入できる。各モノマーペプチドはリンカー領域と縦列にアレンジされるのが
有利である。マルチマー中のインスリンＣ−ぺプチドモノマーは、リンカー領域
残基を含まないインスリンＣ−ぺプチドの切断および放出が保証されるように、
適当なリンカー配列と隣接するのが有利である。リンカー領域が１〜１５たとえ
ば１〜１２または１〜１０アミノ酸残基からなるが、長さは重要ではなく便宜上
または好みにより選択される。１〜８たとえば１、５および７のリンカー領域ガ
便利である。各構築体内の個々のリンカー領域は同じでも異なってもよいが、一
般的にそれらは同一であるのが便利である。すなわち、たとえばトリプシンおよ
びカルボキシペプチダーゼＢの組合わせによる切断には、アルギニン残基で始ま
るかまたは終わるリンカーが提供される。

【００２１】 別のリンカーは、もっぱらまたは長い配列の一部としてアミノ酸リジンからな
り、またトリプシン／カルボキシペプチダーゼＢの組合わせにより切断される。

【００２２】 インスリンＣ−ぺプチドモノマーの間に包含されるためには、このようなリン
カーは、付加的なアミノ酸をもたないインスリンＣ−ぺプチドモノマーの放出が
保証されるように、切断部位たとえばＮおよびＣ末端の両者のアルギニン残基で
開始または終結するのが有利である。融合パートナーの間および／またはインス
リンＣ−ぺプチドマルチマーの末端に包含されるためには、単一の切断部位（た
とえばＡrg）がリンカーの適当な末端（または正確なリンカー配列および用いら
れる切断酵素に応じて相当する適当な切断部位）に存在することができる。

【００２３】 代表的なリンカー領域の例には、Ｃ−ぺプチドモノマーの間に包含されるため
には−ＲＴＡＳＱＡＲ−（配列番号：２）、融合パートナーとＣ−ぺプチドマル
チマーの間に包含されるためには−ＡＳＱＡＲ−（配列番号：３）およびマルチ
マーの末端では−ＲＴＡＳＱＡＶＤ−（配列番号：４）が包含される。

【００２４】 上述のように、リンカー配列の導入には、当該分野でよく知られた標準方法を
使用することができる。

【００２５】 本発明のさらに他の態様は、インスリンＣ−ぺプチドをコードするヌクレオチ
ド配列の多重コピーからなる核酸分子であり、上記核酸分子は切断されて上記イ
ンスリンＣ−ぺプチドの単一コピーを産生できるマルチマーポリペプチドをコー
ドする。

【００２６】 別の見方をすれば、本発明のこの態様は、インスリンＣ−ぺプチドをコードす
るヌクレオチド配列のコンカテマーからなる核酸分子を提供するものとみなすこ
ともできる。

【００２７】 以上（以下）に掲げた本発明の様々な態様は、マルチマーポリペプチド（遺伝
子産物）は、インスリンＡおよびインスリンＢペプチドの両者は包含しないか、
または核酸分子はインスリンＡおよびインスリンＢペプチドの両者はコードしな
い実施態様を包含する。さらに詳しくはマルチマーポリペプチド中のまたは核酸
分子によってコードされたインスリンＣ−ペプチドのコピー数が２であるこのよ
うな実施態様においては、マルチマーポリペプチドはインスリンＡおよびインス
リンＢペプチドの両者は包含しないか、または核酸分子はインスリンＡおよびイ
ンスリンＢペプチドの両者をコードしない。

【００２８】 特に好ましい本発明の実施態様においては核酸分子は、さらにコードされたマ
ルチマーポリペプチドの更なるプロセッシングを助ける融合パートナーをコード
するヌクレオチド配列、たとえば発現タンパク質生成物の精製に有用なヌクレオ
チドからなる。融合パートナーをコードする遺伝子はインスリンＣ−ペプチドの
多重コピーとともに翻訳されて初期の単一融合ペプチドを形成するように正しい
位置および方向にある。適当な融合タンパク質については上に述べた。

【００２９】 核酸分子はまた、上述のように切断部位からなるリンカー領域をコードする１
または２以上のヌクレオチド配列からなるのが有利である。

【００３０】 したがって、本発明の核酸分子の例としては、式（Ｉ） Ｈ₂Ｎ−Ａ−(Ｃ−Ｘ)n−ＣＯＯＨ （Ｉ） 〔式中、ＣはインスリンＣ−ペプチドであり、Ａは結合、または基Ｆ（Ｆは融合
パートナーである）もしくは基−(Ｆ−Ｘ)であり、Ｘは少なくとも１個の切断部
位からなるリンカー領域であり、各Ｘは同種または異種であり、ｎは２〜５０の
整数である〕のポリペプチドをコードする核酸分子を挙げることができる。

【００３１】 本発明のこの態様には、式（Ｉ）が、ｎ＝２の場合に上記ポリペプチド（Ｉ）
はインスリンＡおよびＢ鎖からは構成されないという条件を含む実施態様を包含
する。

【００３２】 インスリンＣ−ペプチド（基Ｃ）、融合パートナー（基Ｆ）、およびリンカー
領域（基Ｘ）は上に定義した通りでよい。同様に、ｎは「多重」および「マルチ
マー」なる語に関連して上に定義した通りである。

【００３３】 本発明の方法に有用な核酸分子または遺伝子構築体は好ましくは、宿主細胞に
おいて発現を制御する適当な調節配列を含有する。このような調節もしくは発現
制御配列には、コード配列に読み取り枠がマッチして連結した、たとえば、転写
（たとえば、プロモーター−オペレーター領域、リボソーム結合部位、終結停止
配列、エンハンサーエレメント等）および翻訳（たとえば、開始および停止コド
ン）制御エレメントを包含する。

【００３４】 原核および真核細胞を含め任意の適当な宿主細胞を使用することが可能で、た
とえば細菌、酵母、昆虫（たとえば、バキュロウイルスに基づく）または哺乳類
発現システムのような選択された発現システムに応じて選択することができる。
当該分野においては、きわめて多数の様々な発現システムが知られていて、文献
に広範に記載されている。たとえば大腸菌は、調節配列が、たとえば大腸菌ｔｒ
ｐプロモーターからなるペプチド産生のための宿主細胞として使用できる。他の
適当な宿主には、大腸菌以外のグラム陰性菌、グラム陽性菌、酵母、昆虫、植物
または動物細胞、たとえば遺伝子操作された細胞系が包含される。

【００３５】 上述の核酸分子からなる発現ベクターはさらに、本発明の態様を構成する。

【００３６】 本発明の方法により発現を達成するためには、任意の便利なベクターを使用す
ることが可能で、きわめて多くのベクターが当該分野において周知であり、文献
に記載されている。すなわち、適当なベクターには、プラスミド、コスミド、ま
たはウイルスベースのベクターが包含される。発現のために宿主細胞に導入され
たこれらのベクターはしかしながら、好ましくはプラスミド、ファージまたはウ
イルスベクターである。ベクターは、本発明の核酸分子と読み取り枠がマッチし
て連結した適当な制御配列を包含する。他の遺伝子エレメントたとえばレプリコ
ン、またはベクターの宿主細胞への移送を補助もしくは促進する配列、たとえば
宿主中でのベクターの維持を補助する安定化機能、クローニング部位、制限エン
ドヌクレアーゼ切断部位またはマーカーコード配列は、当該分野で周知の技術に
より包含させることができる。ベクターは、宿主細胞中に別個の実体として残さ
れていてもよく、また、プラスミド挿入ベクターもしくは他の挿入ベクターの場
合は、宿主細胞の染色体に挿入されていてもよい。宿主染色体へのランダムな非
特異的インテグレーションも可能であるが特異的な均一なインテグレーションが
好ましい。このための技術は当該分野で周知である（たとえば Pozziら, J.Res.
Microbiol. 143: 449-457, 1992 および Gene 169: 85-90, 1996 参照）。プラ スミド挿入ベクターは宿主細胞の染色体のＤＮＡのセグメントからなるのでイン
テグレーションは「均一」である。

【００３７】 遺伝子構築体の発現に適当な代表的プラスミドの例、または本発明による核酸
分子には、ｐＴrpＢＢ（Obergら, 前出）またはその誘導体が包含される。また このようなプラスミドは、所望により、融合パートナーをコードする配列を除去
するように修飾することができる。Ｔrp−プロモーターまたは類似体を導入する
任意の高コピー数ベクターが使用できる。

【００３８】 発現のため原核または真核細胞にこのようなベクターを導入するには、当該分
野では様々な技術が周知であり、たとえば細菌トランスフォーメーション法、ト
ランスフェクション、エレクトロポレーションが使用できる。トランスフォーム
またはトランスフェクトされた真核または原核宿主細胞すなわち本発明に従い上
述のように核酸分子を含有する宿主細胞は本発明の更なる態様を形成する。

【００３９】 実施例にさらに詳細に記載するように、本発明の核酸分子を繋留した発現ベク
ター、特にプラスミドはそれらの宿主内において遺伝的に安定な利点を有し、高
細胞密度に増殖させた培養液から調製したプラスミドには、制限マッピングによ
り評価して、遺伝的な不安定性は検出されなかった。

【００４０】 本発明のさらに他の態様は、インスリンＣ−ペプチドの多重コピーからなるマ
ルチマーポリペプチドをコードし、発現したマルチマーポリペプチドはついで切
断してインスリンＣ−ペプチドの単一コピーを生成できる核酸分子の製造方法に
おいて、マッチした読み取り枠で連結したインスリンＣ−ペプチドをコードする
ヌクレオチド配列の多重コピーからなる核酸分子を発生させることからなる方法
を提供する。

【００４１】 本発明の方法に使用できる遺伝子もしくは遺伝子フラグメントのマルチマーコ
ピーを発生させるためには、当該分野で多くの方法が知られている。たとえば合
成ＤＮＡフラグメントは、設計された単一鎖非パリンドローム突出端を用いて頭
尾重合させることができる。重合したＤＮＡフラグメントはついで、酵素的制限
から生じたマッチする突出部に直接ライゲートさせることができる（Ljungquist
ら, Eur.J.Biochem. 186: 563-569, 1989）。遺伝子フラグメントのマルチマー 化を達成するための他の方法は、クラスII Ｓ制限酵素たとえばＢspＭＩ（Stahl
ら, Gene 89: 87-193, 1990）またはＢsmＩ（Haydn & Mandecki DNA 7: 571-577
, 1988）の使用に基づくものである。別の戦略では、遺伝子構築体の重合および
、更なるサブクローニングを可能にする制限部位を含有するアダプター分子のラ
イゲーションを包含する（Aslundら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84: 1399-1403,
1987 および Irvingら, Technological Advances in Vaccine Development. A.
R. LissInc., New York, 97-105, 1988）。ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ
）の使用を含むマルチマー遺伝子フラグメントの発生に適した遺伝子の新たな合
成方法も知られている（Majumder, Gene 110: 89-94, 1992 および Nguyenら, Advances in Biomagnetic Separation, Eaton Publishing Co., Natick, 73-78
, 1994）。

【００４２】 本発明の方法の好ましい実施態様においては、精製された遺伝子フラグメント
（すなわち、インスリンＣ−ペプチドをコードするヌクレオチド配列）は設計さ
れた非パリンドローム突出部により頭尾様式での重合（マルチマー化）が可能で
あり、ついで、制限酵素好ましくはＳfiＩによって消化されたプラスミドにライ
ゲートされる。

【００４３】 特に好ましい実施態様においては、インスリンＣ−ペプチドをコードするヌク
レオチド配列（たとえば遺伝子フラグメント）からなるプラスミドは、上記配列
または遺伝子フラグメントを切り出すように消化され、配列または遺伝子フラグ
メントのマルチマー化ののち、それらは消化されたプラスミド中に戻しライゲー
トされる。トランスフォーマントは、インスリンＣ−ペプチドの１または２以上
のコピーをコードするセグメントを増幅するＰＣＲスクリーニング法（Stahlら,
Biotechniques 14: 424-434, 1993）を用いてスクリーニングするのが有利であ る。ＰＣＲ増幅フラグメントは、アガロースゲル電気泳動によって比較できる。
さらに好ましい実施態様においては、コンカタマライズしたインスリンＣ−ペプ
チドの所望数、たとえば３または７をコードする遺伝子フラグメントを単離し、
インスリンＣ−ペプチドをコードするフラグメントを切り出すために用いたのと
同じ制限酵素を使用して消化した別のプラスミドにライゲートする。最も好まし
くは、宿主細胞のトランスフォーメーションに使用したこの後者のプラスミドは
付加的に適当なプロモーターおよびインスリンＣ−ペプチドの適当な融合パート
ナーをコードする配列からなる。

【００４４】 本発明のさらに他の態様は、上述の方法の産物、すなわちインスリンＣ−ペプ
チドマルチマーおよび上記マルチマーから切断によって放出される個々のＣ−ペ
プチドを包含する。

【００４５】 特に本発明のこの態様は、切断されてインスリンＣ−ペプチドの単一コピーを
放出できる上記インスリンＣ−ペプチドの多重コピーからなるマルチマーポリペ
プチドを提供する。このマルチマーポリペプチドは付加的に、融合パートナーお
よび／または上記各Ｃ−ペプチドモノマーに隣接する切断部位からなるリンカー
領域から任意に構成されてもよい。

【００４６】 また、切断されてインスリンＣ−ペプチドの単一コピーを放出できる上記イン
スリンＣ−ペプチドの多重コピーからなるマルチマーポリペプチドを製造する方
法において、上記マルチマーポリペプチドをコードする核酸分子を含有する宿主
細胞を上記マルチマーポリペプチドが発現される条件下に培養し、発現したマル
チマーポリペプチドを回収することからなる方法が提供される。 宿主細胞は当該分野でよく知られた技術、たとえばバッチまたは連続的培養フ
ォーマットを用いて培養される。

【００４７】 マルチマー遺伝子産物またはポリペプチドは、当該分野で周知の標準技術、た
とえば標準細胞溶解およびタンパク質精製技術を用いて宿主細胞培養液から回収
される。上述のように、融合パートナーはマルチマーポリペプチド中に包含され
、精製は融合パートナーの親和性結合に基づいて容易に達成される。

【００４８】 ネイティブにおよび組換えにより発現されたいずれのポリペプチドを細胞また
は細胞培養メジウムから単離する様々な方法が当該分野において周知であり、こ
れらのいずれを用いてもよい。細胞内タンパク質／ポリペプチドを放出させるた
めの細胞溶解は、当該分野において周知の多くの方法および文献に記載された方
法のいずれかにより実施され、必要に応じて、さらに精製工程がバッチまたは連
続培養法のいずれが使用されたかに依存して、この場合も当該分野で周知の技術
に基づいて実施できる。

【００４９】 細胞の溶解およびポリペプチドの回収のための熱処理方法は、本発明のインス
リンＣ−ペプチドのマルチマーポリペプチドの場合、たとえば WO 90／00200 に
記載の方法およびその修飾法において特に有効であることがわかっている。この
ような方法は、宿主細胞含有培養メジウムをたとえば５０〜１００℃にある時間
、一般に１時間を越えずに加熱し、発現したポリペプチドをメジウム中に有利に
は実質的に純粋な型で放出させることを包含する。これは、発現したポリペプチ
ドの選択的な放出から生じるものと考えられる。特に、このような方法は驚くべ
きことに熱処理に安定な可溶性ポリペプチド産物の場合によく働くことが観察さ
れ、組換えまたはそうでない場合に関係ない（したがって、この方法は一般的適
用性に優れている）が、特に本発明のインスリンＣ−ペプチドマルチマーポリペ
プチドの場合、驚くべきことに高い純度の産物が高収率に得られる。すなわち、
たとえばこのような熱処理は、８０〜１００℃、たとえば８５〜９９℃または９
０〜９５℃に ５〜２０分たとえば８〜１０分加熱することによって行われ、つ いでたとえば０〜４℃または氷上で冷却する。

【００５０】 マルチマーポリペプチドの回収後、個々のインスリンＣ−ペプチドのモノマー
を放出させるためにそれを切断する。したがって、本発明のさらに他の態様は、
インスリンＣ−ペプチドを製造する方法において、上に定義したマルチマーポリ
ペプチドを切断し、上記インスリンＣ−ペプチドの単一コピーを放出させること
からなる方法を提供する。

【００５１】 上に述べたマルチマーポリペプチドの切断後に、個々のＣ−ペプチドモノマー
を生成させるためにこれらをさらに、精製の標準方法、たとえば限外ろ過、サイ
ズ排除クロマトグラフィー、澄明化、逆相クロマトグラフィー等を用いて均一に
（たとえば SDS−PAGE によって証明されるように）精製する。

【００５２】 本発明のさらに他の態様は、上述の方法で切断されたペプチド生成物の治療に
おける使用である。切断されたインスリンＣ−ペプチドは１型糖尿病および／ま
たは糖尿病合併症の処置に使用することができる。したがって、上述のいずれか
の方法で製造されたインスリンＣ−ペプチドの投与からなる１型糖尿病および／
または糖尿病合併症の処置方法も本発明の範囲に包含される。

【００５３】

【実施例】

次に非限定的実施例および添付の図面を参照しながら、本発明をさらに詳細に
説明する。

【００５４】 実施例１ ＤＮＡ構築体の調製 ４種の合成オリゴヌクレオチド Jope 10（5′−CGGCCTCCCA GGCCCGCGAA GCTGA
GGACC TGCAAGTTGG TCAGGTTGAA CTGGGCGGTG GCCCGGGTGC AGGＣ−3′)（配列番号 ：６），Jope 11（5′-TCTTTGCAGC CGCTGGCTTT AGAAGGTTCT CTTCAGCGTA CGGCCTC
CCA GGCCGTCGAC TAACTGCA−3′)（配列番号：７），Jope 12（3′−CATGGCCGGA
GGGTCCGGGC GCTTCGACTC CTGGACGTTC AACCAGTCCA ACTTGACCCG CCACCGGG−5′)(配
列番号：８）および Jope 13（3′−CCCACGTCCG AGAAACGTCG GCGACCGAAA TCTTCC
AAGA GAAGTCGCAT GCCGGAGGGT CCGGCAGCTG ATTG−5'）（配列番号：９）をリン酸
化し、７０℃で１０分間インキュベートし、ついで室温に冷却してペア毎に（Jo
pe 10 : Jope 12 およびJope 11 : Jope 13）アニーリングさせた。創成された ２つのリンカーを混合し、ＫpnＩ−ＰstＩ消化プラスミドｐＵＣ18にライゲート
し（Yanish-Perronら, Gene33: 103-106, 1985)（図１）、ライゲーション混合 物を dcm−大腸菌株ＧＭ31にトランスフォームした（Marinus, Mol.Gen.Menet.
127: 47-55, 1973）。挿入されたインスリンＣ−ペプチドをコードする遺伝子フ
ラグメント中に正しいヌクレオチド配列を有するトランスフォーマント（ｐＵＣ
−Ｃ1）をＰＣＲベースの固相ＤＮＡ配列決定法を使用して同定した（Hultmanら
, Nucl.Acids Res. 17: 4937-4946, 1989）。ｐＵＣ−Ｃ1 からプラスミドＤＮ Ａを調製し、ＳfiＩで制限したのち、切り出したインスリンＣ−ペプチド−コー
ド遺伝子フラグメントおよびベクター部分の両者を Mermaid−キット（ガラス−
ミルク）（BIO 101 Inc., CA, USA）または GeneClean-キット（BIO 101 Inc.,
CA, USA）をそれぞれ用いて精製した。

【００５５】 精製されたインスリンＣ−ペプチド遺伝子フラグメントを設計した非パリンド
ローム突出部により頭尾様式で重合させ、ついで精製したＳfiＩ−消化プラスミ
ドに戻しライゲートした。大腸菌ＲＲＩΔＭ15 細胞（Ruther, Nucl.Acids Res.
10: 5765-5772, 1982）をライゲーション混合物でトランスフォームし、得られ たトランスフォーマントをＰＣＲ−スクリーニング法を用いてスクリーニングし
た（Stahlら, 1993, 前出）。略述すれば、単一のコロニーを、５０μlのＰＣＲ
反応混合物［20mM TAPS，20℃においてpH 9.3，２mM MgCl₂，50mM KCl，0.1％ T
ween-20，0.2mM dNTP，６ピコモルの各プライマー（RIT27：5′−GCTTCCGGCTCGT
ATGTGTG−3′, 配列番号：10）およびRIT28：5′−AAAGGGGGATGTGCTGCAAG GCG−
3′，配列番号：11）および1.0単位のTaqポリメラーゼ］を含有するＰＣＲ試験 管に取った。２種のＰＣＲプライマーＲＩＴ27 とＲＩＴ 28 は、インスリンＣ −ペプチドフラグメントの挿入点に隣接してｐＵＣ18 にアニーリング部位を有 する。クローンからの様々な数の挿入されたオリゴヌクレオチドを有するＰＣＲ
増幅フラグメントをアガロースゲル電気泳動によりｐＵＣ18を対照に比較すると
、１〜７の挿入体をもつトランスフォーマントを同定することができた。したが
って、得られたプラスミドはｐＵＣ−Ｃ1、ｐＵＣ−Ｃ2 等と命名された。

【００５６】 プラスミドを調製し、所望の数の挿入体を含む遺伝子フラグメントをＫpnＩ−
ＰstＩ消化によって切り出した。それぞれ１、３または７個のコンカタマライズ
されたインスリンＣ−ペプチドをコードする遺伝子フラグメントを単離し、同様
に消化したｐＴrpＢＢ−Ｔ1Ｔ2 にライゲートし、得られたプラスミドをそれぞ れｐＴrpＢＢ−Ｃ1，ｐＴrpＢＢ−Ｃ3 およびｐＴrpＢＢ−Ｃ7 と命名した。プ ラスミドｐＴrpＢＢ−Ｔ1Ｔ2 はプラスミドｐＫＫ223−3（Pharmacia Biotech,
Uppsala, Sweden）から誘導される転写ターミネーター配列の挿入によって、プ ラスミドｐＴrpＢＢ（oebergら, Proc. 6th Eur. Congress Biotechnol; Elsevi
er Science B.V. 179-182, 1994）から構築された。転写ターミネーター配列は 標準ＰＣＲ増幅プロトコール（Hultmanら, 1989, 前出）ならびにオリゴヌクレ オチド HEAN−19, 5′−CCCCCTGCAGCTCGAGCGCCTTTA ACCTGTTTTGGCGGATG−3′(配
列番号：１２）、およびHEAN−20, 5′-CCCCAAGCTTAGAGTTTGTAG AAACGＣ−3′（
配列番号：１３）を使用して、ｐＫＫ223−3 から得られた。

【００５７】 ＰＣＲによって導入された制限部位をＰstＩおよびＨind III で消化し、つい
で予め同一の酵素によって消化したｐＴrpＢＢに挿入した。得られた発現ベクタ
ーｐＴrpＢＢＴ1Ｔ2 はｔｒｐオペロン誘導リーダー配列（８アミノ酸）からな る親和性ハンドルおよびストレプトコッカスのプロテインＧに由来する血清アル
ブミン結合領域ＢＢ（25kＤa）（Nygrenら, 1988, 前出）をコードする。転写は
大腸菌 trp プロモーターの制御下にある。さらに、プラスミドはカナマイシン 抵抗性の遺伝子を有する。

【００５８】 実施例２ タンパク質の発現および精製 ｐＴrpＢＢ−Ｃ3 およびｐＴrpＢＢ−Ｃ7 を繋留し、したがって、融合タンパ
ク質ＢＢ−Ｃ3 およびＢＢ−Ｃ7 をそれぞれコードする大腸菌細胞を、酵母エキ
ス（Difco)（５g／L）およびカナマイシン一硫酸塩（50mg／L）を補充したトリ プシン大豆ブロス（Difco, USA)（30ｇ／L）１０mlを含有する振盪フラスコ中、
３７℃で一夜増殖させた。一夜培養液を１０倍の１００mlに同じ種類のメジウム
を有するバッフル装置付き振盪フラスコに希釈し、３７℃で増殖させた。遺伝子
発現を、中対数期（Ａ_600nm＝１）にβ−インドールアクリル酸２５ｇ／mlを加 え誘導した。細胞を２.0時間誘導後約６０００ｇで１０分間遠心分離して収穫し
た。細胞をついでＴＳＴ（50mM Tris-HCl pH 8.0, 200mMのNaCl, 0.05％ Tween
20, １mMのEDTA）中培養容量の１／20 に再懸濁し、超音波処理して溶解し、約4
0,000ｇで遠心分離した。超音波処理のサンプルは振盪フラスコ培養液を遠心分 離で沈降させ、ついで細胞を３０mlの冷ＴＳＴ緩衝液に再懸濁して調製した。サ
ンプルは、Sonics & Materials Inc.（Danbury, Connecticut, USA）Vibra Cell
（500Ｗ）上１３mmの標準ホーンチップ、７０％義務サイクル（20kHz）および出
力制御セット６.５で実施した２分間のパルス超音波処理の間氷上に保存した。 可溶性細胞質タンパク質を含む上清をろ過し（0.45μm)、ＴＳＴで１００mlに希
釈した。可溶性融合タンパク質は、Stahlら, J.Immunol.Meth. 124: 43-52, 198
9 の記載のようにしてヒト−血清−アルブミン(HSA)−Sepharose上親和性クロマ
トグラフィーによって単離した（Nygrenら, 1988, 前出)。溶出した分画は、２ ８０nmにおける吸収の測定によってタンパク質含量についてモニターし、関連分
画を凍結乾燥した。

【００５９】 図３は、HSA-Sepharose 上単一工程で精製後、親和性精製したＢＢ−Ｃ3 およ
びＢＢ−Ｃ7 をそれぞれ示す。両融合タンパク質について完全長生成物が優先し
、それらもそれらの分子量：それぞれ３９.１および５４.２kＤaに従い移動した
。振盪フラスコ培養での発現レベルは、２つの融合タンパク質についてほぼ同一
であり、ＢＢ−Ｃ3 について１３０mg／L、ＢＢ−Ｃ7 について１２０mg／Lであ
った。

【００６０】 実施例３ 融合タンパク質のタンパク分解消化 塩基性アミノ酸残基のＣ−末端を切断するトリプシンは、融合タンパク質の切
断にずっと以前から使用されている。期待された低い特異性にもかかわらず、ト
リプシンは、融合タンパク質の特異的切断に有用であり、フォールディングされ
たタンパク質ドメイン内に、塩基性残基は切断されないまま残ることが示された
（Wangら, J.Biol.Chem. 264: 21116-21121, 1989）。トリプシンはさらに安価 で容易に利用できるという利点がある。ここでは本発明者らは、ネイティブな、
ヒトインスリンＣ−ペプチドを得るため、それぞれＢＢ−Ｃ3 およびＢＢ−Ｃ7
のプロセッシングにカルボキシペプチダーゼＢと組合わせたトリプシンを使用し
た。すなわちトリプシンは融合タンパク質を各アルギニン残基のＣ−末端で切断
し、カルボキシペプチダーゼＢは、トリプシン消化後に各インスリンＣ−ペプチ
ドモノマー上に存在するＣ−末端アルギニンを除去する。

【００６１】 プロセッシングの効率を分析するためには、２つの融合タンパク質、ＢＢ−Ｃ
3およびＢＢ−Ｃ7 を様々な時間、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ とインキュベートし、SDS／PAGE分析に付した。両融合タンパク質とも速やかに 処理され、５分間のプロセッシング後に融合タンパク質は SDS／PAGE分析では可
視化できないことが見いだされた（図４ＡおよびＢ）。

【００６２】 さらに、融合タンパク質、ＢＢ−Ｃ3 およびＢＢ−Ｃ7 それぞれの切断後のイ
ンスリンＣ−ペプチドモノマーの相対収率の比較を実施した。等モル量のＢＢ−
Ｃ3 およびＢＢ−Ｃ7 それぞれをトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで
処理したのちの切断混合物を逆相ＨＰＬＣ（250mm, Kromasil Ｃ8 カラム，4.6
mm内径，粒子サイズ７μm，Hewlett Packard 1090）で分析した。溶出は０.１％
トリフルオロ酢酸含有１０〜４０％アセトニトリル勾配を用いて、３０分間４０
℃で実施した。図５から明らかなように、ＢＢ−Ｃ3 融合タンパク質の切断に比
べてＢＢ−Ｃ7 融合タンパク質の切断によって、インスリンＣ−ペプチド生成物
（溶出時間約25.4分）と他の切断生成物（ＢＢ融合パートナー起源）の間に有意
に高い比が得られた。インスリンＣ−ペプチドピーク面積の積分（Ｃ7：Ｃ3）で
は理論値２.３３に近いピーク面積比２.４３が得られた。

【００６３】 これは融合タンパク質が完全にプロセッシングされた場合について何ら情報を
提供しない。トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ処理が何時完結に到達
したかを検討するためには、融合タンパク質、ＢＢ−Ｃ7 を様々な時間酵素的プ
ロセッシングに付した。凍結乾燥したＢＢ−Ｃ7 融合タンパク質を、０.１％（ 容量％）Ｔween 20含有１００mＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７.５に、タンパク質濃 度１mg／mlに溶解し、トリプシン（T-2395, Sigma, St.Louis, Mo, USA）および
カルボキシペプチダーゼＢ（Boehringer Mannheim）をそれぞれ、トリプシン／ 融合タンパク質比１／5000（質量比）とカルボキシペプチダーゼＢ／融合タンパ
ク質比１／2000（質量比）で加えた。１５、３０、６０および１２０分後に、サ
ンプルを切断混合物から採取し、ＨＡcを加えてｐＨを３に低下させて消化を停 止させた。切断生成物を安定化するためにアセトニトリルを２０％（容量％）加
えた。

【００６４】 切断材料をサイズ排除クロマトグラフィー［ＳＭＡＲＴ（登録商標）システム
上 Superdex Peptide カラム、Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden］によって
分析し、クロマトグラムのオーバーレイプロット作成することにより（図６）、
インキュベーション時間を増加させてもさらにインスリンＣ−ペプチドが得られ
なかったことから、ＢＢ−Ｃ7 はこれらの条件下に６０分後に完全にプロセッシ
ングされたと結論することができた。これらの結果はまた、インスリンＣ−ペプ
チドのマルチマー型からなる融合タンパク質から定量的収率でインスリンＣ−ペ
プチドを得ることが可能なことを指示している。

【００６５】 実施例４ 得られたインスリンＣ−ペプチドの特性：逆相クロマトグラフィー（
ＲＰＣ）および質量スペクトル 得られたペプチドが実際にネイティブなヒトインスリンＣ−ペプチドに相当す
るかを確認するため、２つの異なる分析を実施した。第一に、ＢＢ−Ｃ7 のプロ
セッシングにより得られたＲＰＣ−精製インスリンＣ−ペプチドのインスリンＣ
−ペプチド標準との比較のために逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）分析を使用
した。上記標準は Eli Lilly（CA, USA）から入手したＣ−ペプチドおよび市販 品を入手できるインスリンＣ−ペプチドのフラグメント 3-33（Sigma, USA）で ある。インスリンＣ−ペプチドプレパレーションは Sephasil Ｃ8 ５μm ＳＣ２
.１／１０カラム上ＳＭＡＲＴ（登録商標，Pharmacia Biotech, Uppsala, Swede
n）システムを用いてＲＰＣにより分析した。溶出は０.１％（容量％）トリフル
オロ酢酸を含有する２６〜３６％アセトニトリル勾配を用いて、２０分間２５℃
で実施した。流速は１００μl／分とし、吸収は２１４nmで測定した。３つのす べてのプレパレーションは同じ保持時間および不純物の同じ低レベルを示し、同
一に近かった（図７）。第二に、ＢＢ−Ｃ7 から得られたインスリンＣ−ペプチ
ドを質量スペクトルの測定に付した（表１）。タンパク質の質量の測定には、エ
レクトロスプレー装置を付したJEOL SX102 質量分析計（JEOL, Japan）を用いて
実施した。質量における良好な一致（表１）は、比較ＲＰＣ分析におけるインス
リンＣ−ペプチド標準との観察された類似性とともにネイティブなヒトインスリ
ンＣ−ペプチドが得られたことを示唆するものである。

【００６６】

【表１】 表 １ インスリンＣ−ペプチドの分子量（Ｄa） 計 算 値 3020.3 実 験 値 3019.7±1.8

【００６７】 実施例５ 得られたインスリンＣ−ペプチドモノマーの特性：ラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ） 融合タンパク質ＢＢ-Ｃ7 の切断によって得られたインスリンＣ−ペプチドモ ノマーを、たとえば血中および尿中のヒトインスリンＣ−ペプチドレベルのモニ
ター用に開発された市販品のラジオイムノアッセイ（Euro-Diagnostica, Malmo,
Sweden;cat. no. MD 315）を用いて分析した。比較のため、予め生物学的に活 性であることが証明された（Johanssonら, Diabetologia 35: 1151-1158, 1992 ）インスリンＣ−ペプチドプレパレーション（Eli-Lilly Co, Indianapolis, In
d. USA）も分析した。分析用サンプルは、秤量し、０.０５Ｍリン酸−Ｎa塩緩衝
液ｐＨ７.４、５％ヒトアルブミン血清（ＨＳＡ）および０.０２％チメロサール
中、最終濃度それぞれ３.３１および３.３０ナノモル／リットルに希釈して２種
類のＣ−ペプチドのプレパレーションを調製した。略述すれば、アッセイは、標
準曲線の構築後、アッセイサンプル中に、ウサギ抗−ヒトＣ−ペプチド抗血清、 ¹²⁵ Ｉ−ヒトインスリンＣ−ペプチドトレーサー、ヤギ抗−ウサギＩｇ抗血清− ＰＥＧ試薬、ヒトインスリンＣ−ペプチド標準、およびインスリンＣ−ペプチド
を定量するための対照サンプルを包含する。２つのサンプルの分析の結果を以下
の表２にまとめる。結果は、２つのプレパレーションは、ＲＩＡアッセイにより
等しく認識され定量された。

【００６８】

【表２】

【００６９】 実施例６ 融合タンパク質ＢＢ−Ｃ1、ＢＢ−Ｃ3 およびＢＢ−Ｃ7 の発現、精 製およびタンパク分解消化 本実施例は、実施例２および３に示した実験のＢＢ−Ｃ1 融合タンパク質に関
してさらに比較的結果を提供する。

【００７０】 プラスミドｐＴrpＢＢ−Ｃ1、ｐＴrpＢＢ−Ｃ3 またはｐＴrpＢＢ−Ｃ7 をそ れぞれ繋留する大腸菌細胞（実施例１参照）を増殖させ、融合タンパク質を実施
例２に記載のようにして発現させ、収穫し、精製し、分析した。

【００７１】 ｐＴrpＢＢ−Ｃ1、ｐＴrpＢＢ−Ｃ3 またはｐＴrpＢＢ−Ｃ7 のいずれかでト ランスフォームした大腸菌細胞の分析はコードされた融合タンパク質ＢＢ−Ｃ1 、ＢＢ−Ｃ3 およびＢＢ−Ｃ7 が細胞内に可溶性遺伝子産物として蓄積すること
を示した（データは示していない）。細胞の破壊後、生成した融合タンパク質は
ＨＳＡ-親和性クロマトグラフィーにより効率的に精製された。図９はＨＳＡ−S
epharose上での一工程精製後の親和性精製されたＢＢ−Ｃ1、ＢＢ−Ｃ3 および ＢＢ−Ｃ7 融合タンパク質をそれぞれ示す。３種の融合タンパク質について完全
長の生成物が優先していて、それらはまた、それらの分子量；３１.５、３９.１
および５４.２kＤaに応じてそれぞれ移動した。振盪フラスコ培養の発現レベル は３種の異なる融合タンパク質について、４０〜６０mg／Lの範囲で再現性があ り、類似していた。

【００７２】 ３種類の親和性精製融合タンパク質のプロセッシングの効率を分析するため、
ＢＢ−Ｃ1、ＢＢ−Ｃ3 およびＢＢ−Ｃ7 を、トリプシンおよびカルボキシペプ チダーゼＢと様々な時間インキュベートし、SDS−PAGE分析に付した。３種の融 合タンパク質は迅速にプロセッシングされ、処理５分後には、残った完全長融合
タンパク質はSDS−PAGEでは検出されなかった（データは示していない）。

【００７３】 タンパク分解プロセッシングの効率を実施例３に記載のようにさらに分析し、
ＢＢ−Ｃ7 は６０分後には完全に切断されることを見いだした。

【００７４】 ＢＢ−Ｃ1、ＢＢ−Ｃ3 およびＢＢ−Ｃ7 融合タンパク質それぞれの切断後の Ｃ−ペプチドモノマーの相対的収率をさらに適切に比較するために、逆相ＨＰＬ
Ｃ分析を実施した（実施例３に記載のように）。ほぼ等モル量のＢＢ−Ｃ1、Ｂ Ｂ−Ｃ3およびＢＢ−Ｃ7 それぞれを１２０分間トリプシン＋カルボキシペプチ ダーゼＢで処理した切断混合物を分析した（Ａ_220nmをモニター）。結果（図１ ０）はＣ−ペプチド生成物とＢＢ−Ｃ7 およびＢＢ−Ｃ3 融合タンパク質の他の
切断生成物の間に、ＢＢ−Ｃ1 融合タンパク質の切断に比べて有意に高い比が証
明された。３種のクロマトグラムに可視化されたトリプシン消化ＢＢ−タグ由来
の等しいピーク高によって証明されるように、各融合タンパク質のほぼ等モル量
をＲＰＣカラム上に負荷した（図１０）。Ｃ−ペプチドピーク面積の積分（ＢＢ
−Ｃ1、ＢＢ−Ｃ3 およびＢＢ−Ｃ7 それぞれにつき、９４０、２３２４および ５６４７の吸収単位×ｓ×10^-3）はＣ3：Ｃ1 について２.５およびＣ7：Ｃ1 に ついて６.０の比を生じ、これは理論値のそれぞれ３および７に近似していた。

【００７５】 結果はさらに、モノマー融合タンパク質（Ｃ1）に比較してインスリンＣ−ペ プチドマルチマー（Ｃ3, Ｃ7）からのＣ−ペプチドモノマーの改良された収率を
示す。

【００７６】 実施例７ ＢＢ−Ｃ7 融合タンパク質をコードするプラスミドｐＴrpＢＢ−Ｃ7
の遺伝子安定性の検討 本実施例はＢＢ−Ｃ7 融合タンパク質をコードするプラスミドｐＴrpＢＢ−Ｃ
7 の遺伝子安定性を評価する方法を記載する。プラスミドｐＴrpＢＢ−Ｃ7 を繋
留する大腸菌細胞を様々な時間増殖させ、培養０、７、２７および３１時間後に
、サンプルを採取した。３１時間はＢＢ−Ｃ7 の大規模発酵製造における培養時
間に類似する。プラスミドを標準プロトコール（Sambrookら, A Laboratory Man
ual,Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）に従 いサンプルから回収した。Ｃ7 コンカタマーをコードするフラグメントを切り出
すために、プラスミドをＫpnＩ−ＰstＩ制限に付した（図１参照）。大腸菌細胞
の初期のトランスフォーメーションに使用された最初のｐＴrpＢＢ−Ｃ7 プラス
ミドが対照として包含され、したがってＫpnＩ−ＰstＩ制限に付された。図１１
から明らかなように、すべてのサンプルからの制限フラグメントは、同じサイズ
を有し、プラスミドｐＴrpＢＢ−Ｃ7 は延長期間の培養時、遺伝子として安定で
あることが確証される。

【００７７】 実施例８ ＢＢ−Ｃ7 の培養メジウム中への選択的放出のための熱処理 本実施例はＢＢ−Ｃ7 融合タンパク質を熱処理により培養メジウム中に放出で
きる方法、およびそれによりＢＢ−Ｃ7 の更なる精製のための出発原料の純度を
有意に改良する方法を記載する。バックグランド：大腸菌の細胞内に産生された
組換えタンパク質を放出させるため最も広く用いられている方法（遠心分離、適
当な緩衝液中への細胞ペレットの再懸濁、および高圧ホモジネーションによる細
胞破壊の単位操作を含む）に比較して、熱処理法による遺伝子産物の放出は多く
の利点を有する。 (ｉ)熱処理を含む製造スキームは澄明化工程が一つ少なくてすむ、(ii)遺伝子
産物の安定性は宿主細胞のプロテアーゼの熱変性により増大する、(iii）遺伝子
産物の重要な初期の精製は他の大腸菌タンパク質の沈殿によって得られる、およ
び(iv)核酸の放出は細胞の総分解に比較して低下する。 この方法は、高発現レベルで同じく可溶性であり、タンパク質の放出に要求さ
れる熱処理に安定な、他の細胞内発現組換えタンパク質の放出にも適している。

【００７８】 ＢＢ−Ｃ7 をコードするプラスミドｐＴrpＢＢ−Ｃ7 を繋留する大腸菌細胞を
実施例２に記載のように培養した。細胞の破壊のために記載の超音波処理方法（
実施例２）の別法として、熱処理工程はＢＢ−Ｃ7 の培養メジウム中への選択的
かつ効率的な放出に利用することができる。培養液は深部培養の終わりに沸騰水
の水浴中に８〜１０分間置いた。この時点ののち培養液は約９０℃の温度に到達
した。ついで、振盪フラスコを氷上に置いた。図１２（レーン３）から明らかな
ように、この温度でＢＢ−Ｃ7 融合タンパク質は、宿主のタンパク質の実質的な
量が放出されることなく、培養メジウム中に放出される。宿主のタンパク質は、
この処理によって大部分が完全に変性されるものと考えられる。これに反して、
細胞を破壊するための超音波処理（図１２，レーン２）および他の機械的方法は
すべての宿主タンパク質ならびに核酸を放出させ、ＢＢ−Ｃ7 の更なる精製のた
めにきわめて不均一な出発原料を生じる。正常時には培養大腸菌によってはきわ
めてわずかなタンパク質しか分泌されない（図１２，レーン１）。ＢＢ−Ｃ7 は
熱処理に対して安定で、実施例１〜３に記載のように、Ｃ−ぺプチドモノマーの
放出のためにさらに精製およびプロセッシングできることが見いだされた。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｃ−ペプチドコード遺伝子フラグメントのマルチマー化を含めて本発明の遺伝
子構築体の製造を示す模式的説明である。

【図２】 ２つの遺伝子産物、ＢＢ−Ｃ３（Ａ）およびＢＢ−Ｃ７（Ｂ）と、単一文字記
号で指示されたＣ−ペプチドに隣接するリンカー領域の模式的説明であり、アル
ギニン残基（ボールド体）は各Ｃ−ペプチドに隣接する。そして（Ｃ）は単一文
字記号でのＣ−ペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。

【図３】 HSA−Sepharose 上親和性精製後の２つの融合タンパク質、ＢＢ−Ｃ3（レーン
１）、およびＢＢ−Ｃ7（レーン２）それぞれの、還元条件下におけるＳＤＳ-Ｐ
ＡＧＥ（10〜15％）ゲルの写真である。分子量それぞれ９４、６７、４３、３０
、２０および１４kＤaのマーカータンパク質はレーンＭに示す。

【図４】 (Ａ)は、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢと様々な時間インキュベ
ートしたのち、ＢＢ-Ｃ3 の還元条件下における SDS−PAGE（10〜15％）ゲルの 写真である。レーン１は非消化融合タンパク質、レーン２はトリプシンおよびカ
ルボキシペプチダーゼＢで５分間プロセッシングしたのちのタンパク質消化物で
ある。レーンＭは分子量それぞれ９４、６７、４３、３０、２０および１４kＤa
のマーカータンパク質を示す。(Ｂ)は、融合生成物ＢＢ−Ｃ7 がここで調べられ るほかは(Ａ)の場合と同じである。

【図５】 それぞれ、等モル量のＢＢ−Ｃ7（上部）ならびにＢＢ−Ｃ3（中央部）からの
トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ切断混合物の逆相クロマトグラフィ
ー（ＲＰＣ）分析を示す。Sigma からのインスリンＣ−ペプチド（下部）は対照
として分析した。

【図６】 様々な時間トリプシン（質量比 5000：１）およびカルボキシペプチダーゼＢ （質量比 2000：１）でプロセッシングしたＢＢ-Ｃ7 融合生成物のサイズ排除ク
ロマトグラム（Superdex Peptide, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）のオ
ーバーレイプロットを示す。

【図７】 Eli Lilly によって提供された（Ｂ）または Sigma から購入した（Ｃ）イン スリンＣ−ペプチド標準との比較によるプロセッシングされたＢＢ−Ｃ7（Ａ） に由来するインスリンＣ−ペプチドの逆相クロマトグラフィー分析を示す。

【図８】 融合パートナーＢＢおよびインスリンＣ−ペプチドの７個のコピーからなるペ
プチド生成物の単一文字記号でのアミノ酸配列（配列番号：５）を例示する。

【図９】 合成された融合タンパク質、ＢＢ−Ｃ1（レーン１）、ＢＢ−Ｃ3（レーン２）
およびＢＢ−Ｃ7（レーン３）の HSA−Sepharose 上での親和性精製後の、ＳＤ Ｓ−１０〜１５％ＰＡＧＥによる分析を示す。分子量はkＤaで指示する。

【図１０】 それぞれ等モル量のＢＢ−Ｃ1、ＢＢ−Ｃ3 ならびにＢＢ−Ｃ7 からのトリプ シン＋カルボキシペプチダーゼＢ切断混合物のＲＰＣ分析を示す。市販のＣ−ペ
プチド標準（Sigma）を対照として包含した（最下部参照）。

【図１１】 ０時間（レーン１）、７時間（レーン２）、27時間（レーン３）、または 31 時間（レーン４）増幅させた大腸菌培養液からのｐＴrpＢＢ−Ｃ7 プラスミドプ
レパレーションのＫpnＩ−ＰstＩ制限のアガロースゲル（１％）電気泳動分析を
示す。レーン５は大腸菌細胞の最初のトランスフォーメーションに使用した元の
ｐＴrpＢＢ−Ｃ7 プラスミドのＫpnＩ−ＰstＩ制限であり、レーン６は 31 時間
培養後の非切断ｐＴrpＢＢ−Ｃ7 を示す。マーカー（Ｍ）レーンはＰstＩ−制限
λファージＤＮＡを含有する。矢印はＣ7 フラグメントの位置を指示する。

【図１２】 ＢＢ−Ｃ7 培養からのサンプルのＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析（還元条件下）を示す 。レーン１：非処置培養液からの２μlメジウム；レーン２：0.5μlの超音波処 理培養液；レーン３：培養液の熱処理後のメジウム０.５μl。矢印はＢＢ−Ｃ7
融合タンパク質の位置を指示する。レーンＭは分子量９４、６７、４３、３０、
２０および１４kＤaのマーカータンパク質を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月４日（２０００．２．４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 マティーアス・ユーレン スウェーデン国エス−100 44 ストック ホルム．デパートメント・オブ・バイオケ ミストリ．ロイアル・インスティチュー ト・オブ・テクノロジー (72)発明者 ペル−オーケ・ニュグレン スウェーデン国エス−100 44 ストック ホルム．デパートメント・オブ・バイオケ ミストリ．ロイアル・インスティチュー ト・オブ・テクノロジー (72)発明者 ペル・ユーナソン スウェーデン国エス−100 44 ストック ホルム．デパートメント・オブ・バイオケ ミストリ．ロイアル・インスティチュー ト・オブ・テクノロジー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA02 CA01 DA06 EA04 FA03 FA07 FA13 GA11 GA19 HA01 4B065 AA26X AB01 BA02 BD01 BD15 BD16 CA24 CA44 4H045 AA10 AA20 BA41 DA37 EA27 FA70 FA74 GA01 GA15 GA25

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インスリンＣ−ペプチドの多重コピーからなるマルチマーポ
   リペプチドを宿主細胞内で発現させ、発現したポリペプチドを切断してインスリ
   ンＣ−ペプチドの単一コピーを放出することからなるインスリンＣ−ペプチドの
   製造方法。
2. 【請求項２】 核酸分子が、インスリンＣ−ペプチドの単一コピーを産生で
   きる切断可能なマルチマーポリペプチドをコードする、インスリンＣ−ペプチド
   をコードするヌクレオチド配列の多重コピーからなる核酸分子。
3. 【請求項３】 発現したマルチマーポリペプチドはついで切断されてインス
   リンＣ−ペプチドの単一コピーを産生できるインスリンＣ−ペプチドの多重コピ
   ーからなるマルチマーポリペプチドをコードする核酸分子の製造方法において、
   読み取り枠がマッチして連結するインスリンＣ−ペプチドをコードするヌクレオ
   チド配列の多重コピーからなる核酸分子を発生させることからなる方法。
4. 【請求項４】 インスリンＣ−ペプチドの単一コピーを放出するように切断
   することができるインスリンＣ−ペプチドの多重コピーからなるマルチマーポリ
   ペプチド。
5. 【請求項５】 インスリンＣ−ペプチドの単一コピーを放出するように切断
   することができるインスリンＣ−ペプチドの多重コピーからなるマルチマーポリ
   ペプチドを製造する方法において、上記マルチマーポリペプチドをコードする核
   酸分子を含有する宿主細胞を、上記マルチマーポリペプチドが発現するような条
   件下に培養し、発現したマルチマーポリペプチドを回収することからなる方法。
6. 【請求項６】 請求項４に記載のマルチマーポリペプチドを切断することか
   らなるインスリンＣ−ペプチドの製造方法。
7. 【請求項７】 上記インスリンＣ−ペプチドまたはインスリンＣ−ペプチド
   をコードするヌクレオチド配列の多重コピーが縦列にアレンジされている請求項
   １〜６のいずれか１項に記載の方法、核酸分子またはマルチマーポリペプチド。
8. 【請求項８】 上記マルチマーポリペプチドは上記インスリンＣ−ペプチド
   の２〜３０コピーからなる請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法、核酸分子
   またはマルチマーポリペプチド。
9. 【請求項９】 上記マルチマーポリペプチドは上記インスリンＣ−ペプチド
   の３〜７コピーからなる請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法、核酸分子ま
   たはマルチマーポリペプチド。
10. 【請求項１０】 上記マルチマーポリペプチドは、さらに融合パートナーか
    らなる請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法、核酸分子またはマルチマーポ
    リペプチド。
11. 【請求項１１】 上記融合パートナーは親和性結合パートナーまたはリガン
    ドのペアの一つである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法、核酸分子ま
    たはマルチマーポリペプチド。
12. 【請求項１２】 上記融合パートナーはストレプトコッカスのプロテインＧ
    由来の２５kＤa血清アルブミン結合領域（ＢＢ）である請求項１〜１１のいずれ
    か１項に記載の方法、核酸分子またはマルチマーポリペプチド。
13. 【請求項１３】 上記マルチマーポリペプチド中のインスリンＣ−ペプチド
    モノマーは切断部位からなるリンカー領域に隣接する請求項１〜１２のいずれか
    １項に記載の方法、核酸分子またはマルチマーポリペプチド。
14. 【請求項１４】 上記切断部位はタンパク分解酵素によって切断可能である
    請求項１３に記載の方法、核酸分子またはマルチマーポリペプチド。
15. 【請求項１５】 上記切断部位はトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼ
    Ｂによって切断可能なアルギニン残基からなる請求項１３に記載の方法、核酸分
    子またはマルチマーポリペプチド。
16. 【請求項１６】 上記核酸分子はさらに１個または２個以上の調節または発
    現制御配列からなる請求項１〜３および７〜１４のいずれか１項に記載の方法ま
    たは核酸分子。
17. 【請求項１７】 請求項２および７〜１６のいずれか１項に記載された核酸
    分子からなる発現ベクター。
18. 【請求項１８】 プラスミドである請求項１７に記載の発現ベクター。
19. 【請求項１９】 プラスミドｐＴrpＢＢ（配列番号：１４）またはその誘導
    体に基づく請求項１８に記載の発現ベクター。
20. 【請求項２０】 請求項２および７〜１６のいずれか１項に記載された核酸
    分子を含有する宿主細胞。
21. 【請求項２１】 請求項１または６に記載の方法によって産生されたインス
    リンＣ−ペプチド。