SK1532000A3 - METHOD OF PRODUCING AN INSULIN C-PEPTIDE, A NUCLEIC ACIDì (54) MOLECULE, MULTIMERIC POLYPEPTIDE, EXPRESSION VECTOR, PROCESS - Google Patents

Description

Spôsob prípravy inzulínového C-peptidu, molekula nukleovej kyseliny, multimérny polypeptid, expresný vektor, spôsoby ich prípravy a hostiteľská bunka

Oblasť techniky

Súčasný vynález sa týka prípravy inzulínového C-peptidu z rekombinantných molekúl DNA, ktoré zahŕňajú multimérne kópie sekvencie génu kódujúceho uvedený inzulínový C-peptid.

Doterajší stav techniky

Inzulín je proteínový hormón, ktorý hrá úlohu v regulácii hladiny krvného cukru. Inzulín sa tvorí v pečeni ako prekurzor proinzulín pozostávajúci z reťazcov B a A inzulínu, ktoré sú spojené spojovacím C-peptidom (ďalej sa tento C-peptid odvodený z molekuly proinzulínu označuje ako „inzulínový C-peptid“). Samotný inzulín pozostáva iba z reťazca B a A. Niektoré najnovšie štúdie ukazujú, že Cpeptid má klinický význam (Johansson a spol., Diabetológia (1992) 35, 121 až 128 a J. Clin. Endocrinol. Metab. (1993) 77, 976 až 981). U pacientov s cukrovkou prvého typu, ktorí nemajú endogénny C-peptid, podávanie peptidu zlepšuje funkciu obličiek, stimuluje používanie svalov a glukózy a zlepšuje funkciu bariéry medzi krvou a sietnicou (Johansson a spol., 1992 a 1993, pozri vyššie).

Hoci sa to ešte neuznáva všeobecne, lekári si stále viac uvedomujú terapeutické využívanie inzulínového C-peptidu. Preto je potrebný spôsob na rýchlu syntézu inzulínových C-peptidov, ktorý by bol hospodárny aj efektívny. Hoci spôsoby chemickej syntézy peptidov, napríklad postupným pridávaním aminokyselín na tuhý podklad, sú už dostatočne prepracované, zostávajú pracné aj napriek automatizácii, avšak, čo je dôležitejšie, sú nákladné a môžu byť limitujúce aj čo sa týka maximálnej dĺžky peptidu, ktorá sa dá hospodárne a spoľahlivo syntetizovať. Ako alternatívne spôsoby sa vyvinuli spôsoby prípravy peptidov expresiou rekombinantnej DNA, hoci ani tieto spôsoby nie sú bez nevýhod, napríklad čo sa týka výťažnosti.

-2Súčasné schémy prípravy inzulínového C-peptidu sa zakladajú na spracovaní proinzulínu, prekurzorovej molekuly inzulínu a C-peptidu, za normálnych podmienok s použitím trypsínu a karboxypeptidázy B (Nilsson a spol. (1996), J. Biotechnol. 48, 241 až 250); Jonasson a spol. (1996), Eur. J. Biochem. 236, 656 až 661). Proinzulín sa pripravil ako fúzovaný proteín, ktorý bol schopný expresie s vysokými hladinami v E. coli, a fúzovaný proteín sa skonštruoval tak, aby sa mohol odštiepiť spolu so spracovaním proinzulínu na inzulín a C-peptid. Proinzulín sa pripravil ako fúzovaný proteín obsahujúci ZZ, syntetickú afinitnú značku fúzie odvodenú zo stafylokokového proteínu A, ktorý viaže IgG (imunoglobulín) (Nilsson a spol. (1987) Prot. Eng. 1, 107 až 113). Táto značka fúzie sa vybrala pre jej stabilitu voči proteolýze, jej schopnosť viazať IgG, vysokú hladinu expresie a solubilizačné vlastnosti. Zvolená produkčná stratégia po rozpustení inklúznych teliesok a následnej renaturácii umožnila použiť afinitnú značku na čistenie, a to bez zahrnutia ďalších postupov na štiepenie a odstránenie afinitnej značky ZZ. Dokázalo sa, že táto značka sa odštepuje simultánne s natrávením proinzulínu trypsínom/karboxypeptidázou B za vzniku inzulínu a C-peptidu. Avšak príprava malých peptidov pomocou expresie veľkých fúzovaných proteínov dáva všeobecne skôr malú výťažnosť, pretože výsledný produkt je iba malou časťou exprimovaného génového produktu.

V Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81, 4627 až 4631, 1984, Shen opísal spôsob prípravy ľudského proinzulínu expresiou fúzovaného alebo nefúzovaného génového produktu zahŕňajúceho viacnásobné kópie proinzulínovej polypeptidovej domény pospájané v tandeme za sebou. Tento génový produkt možno naštiepiť na jednotlivé proinzulínové jednotky pomocou brómkyánu. Bolo navrhnuté, aby sa ľudský inzulín dal pripravovať štiepením proinzulinových jednotiek pomocou trypsínu/karboxypeptidázy. Problém zvyšovania výťažnosti inzulínového C-peptidu to však nerieši.

Stále je preto potrebné vyvinúť spôsob rekombinantnej expresie, ktorý by zvýšil výťažnosť inzulínového C-peptidu ako nefúzovaného produktu. Súčasný vynález túto potrebu rieši.

-3Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je spôsob rekombinantnej expresie peptidov a v podstate sa zakladá na koncepcii zvyšovania množstva exprimovaného cieľového peptidu (v tomto prípade inzulínového C-peptidu) expresiou multiméru ako produktu jediného génu (t. j. multimérneho polypeptidu) s viacnásobnými kópiami cieľového peptidu (inzulínového C-peptidu), a potom štiepením takého multimérneho génového produktu (t. j. multimérneho polypeptidu) za uvoľnenia cieľového peptidu ako jednotlivých monomérnych jednotiek.

V jednom uskutočnení súčasný vynález poskytuje spôsob prípravy inzulínového C-peptidu, ktorý zahŕňa expresiu multimérneho polypeptidu v hostiteľskej bunke, ktorá zahŕňa viacnásobné kópie uvedeného inzulínového Cpeptidu a štiepenie uvedeného exprimovaného polypeptidu za uvoľnenia monomérov inzulínového C-peptidu z monomérov.

Multimérny polypeptid (génový produkt) je kódovaný genetickým konštruktom (inými slovami, molekulou nukleovej kyseliny), ktorý zahŕňa viacnásobné kópie nukleotidovej sekvencie kódujúcej inzulínový C-peptid. Viacnásobné kópie, alebo opakovania, sú v konštrukte pospájané tak, že sú transkribované a translatované spolu do jediného multimérneho génového produktu (t. j. do multimérneho polypeptidu), t. j. sú v priebežnom čítacom formáte, napríklad viacnásobné nukleotidové sekvencie sú v konštrukte pospájané v zodpovedajúcom čítacom rámci. V podstate genetický konštrukt (molekula nukleovej kyseliny) výhodne zahŕňa konkatemér nukleotidovej sekvencie kódujúcej inzulínový C-peptid. Genetický konštrukt vhodne zahŕňa tandemové kópie kódujúcej nukleotidovej sekvencie. Pripraví sa preto takýto genetický konštrukt, potom sa štandardným spôsobom zavedie do hostiteľskej bunky a exprimuje sa. Možno potom získať a štiepiť exprimovaný génový produkt (polypeptid) s cieľom uvoľniť monoméry inzulínového C-peptidu.

V inom uskutočnení vynález poskytuje spôsob prípravy inzulínového Cpeptidu, ktorý zahŕňa kultiváciu hostiteľskej bunky, ktorá obsahuje molekulu nukleovej kyseliny zahŕňajúcu viacnásobné kópie nukleotidovej sekvencie kódujúcej uvedený inzulínový C-peptid za takých podmienok, že multimérny polypeptid

-4uvedenej molekuly nukleovej kyseliny sa exprimuje a naštiepi sa uvedený exprimovaný polypeptid s cieľom uvoľniť jednotlivé kópie uvedeného inzulínového C-peptidu.

Tak ako sa používa v tomto vynáleze, výraz „viacnásobný alebo „multimérny“ sa týka dvoch alebo viacerých kópií inzulínového C-peptidu alebo nukleotidovej sekvencie, ktorá ho kóduje, výhodne 2 až 50, 2 až 30 alebo 2 až 20, výhodnejšie 2 až 15 alebo 2 až 10. Iné rozpätia v príkladoch môžu zahŕňať aj 3 až 20, 3 až 15 alebo 3 až 10.

Konštrukt výhodne zahŕňa 3 alebo viacero kópií, napríklad 3 až 7 alebo 5 až 7 kópií nukleotidovej sekvencie kódujúcej inzulínový C-peptid. Môžu byť užitočné aj rozpätia od 7 alebo viac, napríklad 7 až 30, 7 až 20 alebo 7 až 15.

Výraz „inzulínový C-peptid“ používaný v tomto vynáleze zahŕňa všetky formy inzulínového C-peptidu včítane natívnych alebo syntetických peptidov. Takéto inzulínové C-peptidy môžu byť ľudské peptidy, alebo môžu pochádzať z iných živočíšnych druhov a rodov, výhodne cicavcov. Zahrnuté sú aj varianty a modifikácie natívneho inzulínového C-peptidu, pokiaľ si zachovávajú aktivitu inzulínového C-peptidu. Inzulínové C-peptidy možno exprimovať v ich natívnej forme, čiže ako rôzne alelické varianty tak, ako sa vyskytujú v prírode u rôznych druhov, alebo v dôsledku geografických variácií atď., alebo ako funkčne ekvivalentné varianty alebo ich odvodeniny, ktoré sa môžu odlišovať sekvenciou aminokyselín, napríklad skracovaním (napríklad z N- alebo C-terminálneho konca alebo z oboch koncov), alebo v dôsledku iných aminokyselinových delécií, adícií alebo substitúcií. V problematike sú známe spôsoby na modifikovanie sekvencii proteinov alebo peptidov, avšak pri zachovaní svojej plnej aktivity, a toto sa môže dosiahnuť spôsobmi, ktoré sú v problematike štandardne používané a sú v literatúre podrobne opísané, ako je napríklad náhodná alebo cielená mutagenéza, štiepenie a spájanie nukleových kyselín, atď. Takto možno ľahko pripraviť funkčne ekvivalentné varianty alebo deriváty sekvencii natívneho inzulínového C-peptidu s použitím spôsobov, ktoré sú v problematike dobre známe, a zahŕňajú sekvencie peptidov s funkčnou, napríklad biologickou aktivitou natívneho inzulínového Cpeptidu. V súvislosti s takýmito aktivitami je napríklad známe, že inzulínový C-peptid

-5má aktivitu pri stimulácii Na⁺K⁺ATPázy, ktorá môže byť základom pre rôzne terapeutické aktivity známe u C-peptidu, napríklad v liečbe cukrovky alebo v liečbe alebo prevencii komplikácií cukrovky, ako je napríklad diabetická neuropatia, nefropatia a retinopatia. Fragmenty natívnych alebo syntetických sekvencií inzulínového C-peptidu môžu mať aj výhodné funkčné vlastnosti peptidu, z ktorého sú odvodené, a sú preto tiež zahrnuté. Možno osobitne spomenúť fragmenty inzulínového C-peptidu, ktoré opísali Wahren a spol. v WO98/13384. Všetky takéto analógy, varianty, deriváty alebo fragmenty inzulínového C-peptidu sú špeciálne začlenené do rozsahu tohto vynálezu, a sú zhrnuté pod výrazom „inzulínový Cpeptid.

Výhodne možno použiť natívny ľudský inzulínový C-peptid a je uvedený na obrázku 2C (SEQ ID No. 1).

V ďalšom výhodnom uskutočnení spôsobu podľa tohto vynálezu bude génový konštrukt okrem toho zahŕňať sekvenciu, ktorá kóduje partnera fúzie (značku fúzie), napríklad tie, ktoré sa dokážu naviazať na matrice použité počas spracovania produktu génovej expresie.

Výraz „partner fúzie“ sa týka akejkoľvek molekuly proteínu alebo peptidu alebo jej derivátu alebo fragmentu, ktorý je translatovaný spolu s inzulínovým Cpeptidom, ktorého vlastnosti možno využiť v ďalšom spracovaní exprimovaného produktu fúzie.

Interakcia medzi partnerom fúzie a matricou sa môže zakladať na afinite, chelatujúcich peptidoch, hydrofóbnych alebo elektricky nabitých interakciách alebo na akomkoľvek inom mechanizme známom v problematike. Výhodne, partner fúzie je jedným z dvojice afinitných väzobných partnerov alebo ligandov, napríklad proteín, polypeptid alebo sekvencia peptidu schopná selektívne alebo špecificky sa viazať na ligand alebo reagovať s ním. Vhodní partneri fúzie zahŕňajú napríklad proteín G zo streptokokov a proteín A zo stafýlokokov a ich deriváty, βgalaktozidázu, glutatión-S-transferázu a avidín alebo streptavidín, alebo fragment alebo derivát ktoréhokoľvek z uvedených proteínov, ktoré majú silnú afinitu k imunoglobulínu G, analógom substrátu alebo protilátkam, prípadne k biotínu. Takéto interakcie možno použiť na čistenie produktu fúzovaného proteínu

-6z komplexnej zmesi. Fragment ZZ proteínu A (pozri vyššie, Nilsson a spol.) je príkladom použiteľného proteínového fragmentu. Ako partnerov fúzie možno použiť histidínové peptidy, pretože sa viažu na ióny kovov, napríklad Zn²⁺, Cu^z+ alebo Ni²⁺, a elúcia sa môže uskutočniť znížením pH alebo s pomocou EDTA (Ljungquist a spol. (1989) J. Biochem. 186, 563 až 569). Osobitne výhodným polypeptidovým partnerom fúzie je 25 kDa sérová albumínová väzbová oblasť (BB) odvodená zo streptokokového proteínu G (SpG) (Nygren a spol. (1988) J. Mol. Recogn. 1, 69 až 74) alebo iné albumínové väzbové značky odvodené z SpG (Stahl a Nygren (1997) Path. Bio. 45, 66 až 76). Ôberg a spol. opisujú expresný vektor pTrp BB (SEQ ID No. 14) vhodný na včlenenie génových fragmentov na expresiu požadovaného produktu ako fúzovaného proteínu s BB (Proceedings of the 6th European Congress on Biotechnology, 1994, 179 až 182). Títo partneri fúzie majú silnú afinitu k albumínu a preto čistenie exprimovaného fúzovaného proteínu sa môže uskutočniť na základe ligandovej afinitnej chromatografie napríklad s použitím kolóny naplnenej albumínom. Albumín sa výhodne imobilizuje na tuhom podklade.

Na dosiahnutie štiepenia možno použiť akýkoľvek vhodný spôsob, t. j. na vyštiepenie monomérnych inzulínových C-peptidov z multimérneho polypeptidu, t. j. z exprimovaného génového produktu, a voliteľne z partnera fúzie, ak je prítomný. Toto sa dá vhodne dosiahnuť pomocou enzýmov. Výhodne, počiatočný produkt génovej expresie, t. j. multimérny polypeptid alebo produkt fúzie alebo fúzovaný proteín, ktorý zahŕňa partnera fúzie a viacnásobné kópie (monoméry) inzulínového C-peptidu, sa štiepi jedným alebo viacerými proteolytickými enzýmami v jedinom kroku, čím vznikajú nefúzované jednotlivé kópie inzulínového C-peptidu. Kombinované spracovávanie trypsínom a karboxypeptidázou B (napríklad z hovädzieho, prasačieho alebo iného zdroja) je osobitne výhodným spôsobom na získavanie požadovaných štiepnych produktov. Trypsín štiepi proteíny na Cterminálnom konci oboch arginínových zvyškov a karboxypeptidáza B odstraňuje Cterminálny arginín prítomný na každom z peptidov po natrávení trypsínom. Podmienky pre dosiahnutie proteolytického štiepenia sú v problematike známe, a známe sú aj iné vhodné proteolytické enzýmy, ako je napríklad subtilizín (včítane jeho mutantov), enterokináza, faktor Xa, trombín, proteáza IgA, proteáza 3C a

-7inteíny. Zistilo sa napríklad, že inkubácia exprimovaného génového produktu s proteolytickými enzýmami (napríklad s t ry ps inom a karboxypeptidázou B) počas 60 minút je dostatočne dlhá doba na spracovanie exprimovaného proteínu. Výhodne, 5-minútový inkubačný čas môže stačiť na primerané spracovanie fúzovaného proteínu tak, aby sa konvenčnou SDS PAGE elektroforézou nedala dokázať prítomnosť fúzovaného alebo multimérneho proteínu. Podobne, počiatočný produkt génovej expresie možno štiepiť chemickými reagenciami ako je napríklad CNBr, hydroxyl-amín alebo kyselina mravčia.

V závislosti od presnej povahy inzulínového C-peptidu a použitej molekuly nukleovej kyseliny (genetický konštrukt) štiepne miesta napríklad pre proteolýzu môžu byť prítomné prirodzene, alebo ich možno zaviesť vhodnou manipuláciou genetického konštruktu s použitím známych spôsobov, ako je napríklad cielená mutagenéza, spájanie vhodných nukleotidových sekvencii kódujúcich štiepne miesto, atď.

Výhodne, multimérny exprimovaný polypeptid môže zahŕňať oblasť linkera, t.j. linkerový zvyšok alebo peptid začleňujúci alebo poskytujúci štiepne miesto. Výhodne, štiepne miesto zahŕňa štiepateľný motív rozpoznávaný a štiepený proteolytickým enzýmom. Linkerové oblasti možno začleniť medzi každý „monomérny“ peptid v multimérnom konštrukte, a/alebo voliteľne aj medzi partnera fúzie, ak je prítomný, a monomérny peptid. Výhodne, každý monomérny peptid možno tandemovo usporiadať s linkerovou oblasťou. Výhodne, v susedstve monomérov inzulínového C-peptidu v multiméri sa nachádzajú vhodné linker sekvencie, aby sa zabezpečilo štiepenie a uvoľnenie inzulínového C-peptidu zbavených akýchkoľvek zvyškov linkerovej oblasti. Linkerová oblasť môže zahŕňať 1 až 15, napríklad 1 až 12 alebo 1 až 10 aminozvyškov, hoci dĺžka nie je rozhodujúca a môže sa zvoliť to, čo je výhodnejšie, alebo podľa voľby. Vhodné môžu byť linkerové oblasti s veľkosťou 1 až 8, napríklad 1, 5 a 7. Jednotlivé linkerové oblasti v rámci každého konštruktu môžu byť rovnaké alebo odlišné, hoci pre pohodlnosť sú všeobecne rovnaké. Takže napríklad na štiepenie kombináciou trypsínu a karboxypeptidázy B možno poskytnúť linkery začínajúce alebo končiace arginínovým zvyškom.

-8Alternatívny linker môže zahŕňať aminokyselinu lyzín, buď samostatne alebo ako súčasť dlhšej sekvencie, a možno ho tiež štiepiť kombináciou trypsínu a karboxypeptidázy B.

Na začlenenie medzi monoméry inzulínového C-peptidu môžu takéto linkery výhodne začínať a končiť v takom štiepnom mieste, napríklad v arginínovom zvyšku na oboch, C- aj N-koncoch, aby sa zabezpečilo uvoľňovanie monoméru inzulínového C-peptidu bez ďalších aminokyselín. Na začlenenie medzi partnera fúzie a/alebo na koniec multiméru inzulínového C-peptidu, na vhodnom konci linkera môže byť prítomné jediné štiepne miesto (napríklad Arg).

Napríklad reprezentatívne linkerové oblasti zahŕňajú -RTASQAR- (SEQ ID No. 2) na začlenenie medzi monoméry C-peptidu, -ASQAR- (SEQ ID No. 3) medzi partnera fúzie a multimér C-peptidu, a -RTASQAVD- (SEQ ID No. 4) na koniec multiméru.

Na zavedenie linkerových sekvencii možno použiť štandardné spôsoby dobre známe v problematike.

Ďalej súčasný vynález poskytuje molekulu nukleovej kyseliny obsahujúcej viacnásobné kópie nukleotidovej sekvencie kódujúcej inzulínový C-peptid, kde uvedená molekula nukleovej kyseliny kóduje multimérny polypeptid schopný štiepenia tak, aby sa získali jednotlivé kópie uvedeného inzulínového C-peptidu.

V podobnom uskutočnení vynález poskytuje molekulu nukleovej kyseliny zahŕňajúcu konkatemér nukleotidovej sekvencie kódujúcej inzulínový C-peptid.

Rôzne aspekty vynálezu uvedené vyššie (a nižšie) zahŕňajú uskutočnenia, kde multimérny polypeptid (génový produkt) nezahŕňa peptid inzulínu A a peptid inzulínu B, alebo kde molekula nukleovej kyseliny nekóduje peptid inzulínu A a peptid inzulínu B. Osobitnejšie, v takých uskutočneniach, kde počet kópií inzulínového C-peptidu v multimérnom polypeptide, alebo kódovaný molekulou nukleovej kyseliny je dva, multimérny polypeptid nezahŕňa, alebo molekula nukleovej kyseliny nekóduje peptidy inzulínu A a inzulínu B.

V osobitne výhodnom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny dodatočne obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje partnera fúzie, ktorý je prítomný pri ďalšom spracovaní kódovaného multimérneho polypeptidu, napríklad

-9ktorý je užitočný na čistenie exprimovaného proteínového produktu. Gén kódujúci partnera fúzie bude v správnej polohe a orientácii, aby sa translatoval spolu s viacnásobnými kópiami inzulínového C-peptidu, čím vznikne spočiatku jediný fúzovaný peptid. Proteíny vhodné na fúziu sú uvedené vyššie.

Výhodne, molekula nukleovej kyseliny bude obsahovať jednu alebo viaceré nukleotidové sekvencie kódujúce linkerové oblasti zahŕňajúce štiepne miesta, ako sa uvádza vyššie.

Ako príklad molekuly nukleovej kyseliny podľa súčasného vynálezu možno uviesť molekuly kódujúce polypeptid vzorca (I)

H₂N - A - (C-X)_n - COOH (I) kde

C je inzulínový C-peptid;

A je väzba, alebo skupina F, kde F je partner fúzie, alebo skupina - (F-X) -;

X je linkerová oblasť obsahujúca aspoň jedno štiepne miesto, pričom každé X je rovnaké alebo odlišné; a n je celé číslo od 2 do 50.

V tomto uskutočnení polypeptid vzorca vzorec (I) zahŕňa podmienku, že ak n = 2, uvedený polypeptid (I) neobsahuje A a B reťazec inzulínu.

Inzulínové C-peptidy (skupina C), partneri fúzie (skupina F) a linkerové oblasti (skupina X) môžu byť ako boli definované vyššie. Podobne, n môže byť vo vzťahu k výrazom „viacnásobný“ a „multimérny podľa uvedenej definície.

Molekula nukleovej kyseliny alebo genetický konštrukt užitočný v spôsoboch vynálezu výhodne obsahuje vhodnú regulačnú sekvenciu, ktorá bude kontrolovať expresiu v hostiteľskej bunke. Takéto regulačné alebo expresné kontrolné sekvencie zahŕňajú napríklad transkripčné (napríklad promótorové operátorové oblasti, ribozómové väzbové miesta, terminačné stop sekvencie, podporné elementy, atď.) a translačné (napríklad štartovacie a stop kodóny) kontrolné elementy pospájané vo vhodnom čítacom rámci do kódujúcich sekvencii.

-10Použif možno akékoľvek vhodné hostiteľské bunky zahŕňajúce prokaryotické a eukaryotické bunky a možno ich vybrať podľa zvoleného expresného systému, ktorým môžu byť bakteriálne, kvasinkové, hmyzie (napríklad na základe bakulovírusu) alebo cicavčie expresné systémy. V tejto oblasti je známe veľké množstvo expresných systémov a sú v literatúre podrobne opísané. Napríklad E. coli možno použiť ako hostiteľské bunky na produkciu peptidov, a v tomto prípade regulujúca sekvencia môže zahŕňať napríklad promótor trp z E. coli. Iné vhodné hostiteľské systémy zahŕňajú gram-negatívne baktérie iné ako je E. coli, grampozitívne baktérie, bunky kvasiniek, hmyzu, rastlín alebo živočíchov, napríklad geneticky modifikované bunkové línie.

Expresné vektory, ktoré zahŕňajú vyššie opísané molekuly nukleových kyselín, sú ďalšou súčasťou súčasného vynálezu.

Na dosiahnutie expresie možno podľa spôsobov vynálezu použiť akýkoľvek výhodný vektor a v tejto problematike je ich známych a v literatúre opísaných veľmi veľa. Vhodné vektory zahŕňajú plazmidy, kozmidy alebo vektory na základe vírusov. Tieto vektory, ktoré sa zavádzajú do hostiteľských buniek na expresiu, sú však výhodne plazmidy, fágy alebo vírusové vektory. Vektory môžu zahŕňať zodpovedajúce kontrolné sekvencie zoradené do vhodného čítacieho rámca s molekulami nukleovej kyseliny podľa vynálezu. Možno zahrnúť aj iné genetické elementy, napríklad replikóny, alebo sekvencie napomáhajúce alebo uľahčujúce prenos vektora do hostiteľskej bunky, stabilizujúce funkcie, napríklad na pomoc pri udržiavaní vektora v hostiteľskej bunke, klónovacie miesta, štiepne miesta reštrikčných endonukleáz alebo sekvencie kódujúce markery, podľa spôsobov známych v problematike. Vektory môžu ostať ako samostatné entity v hostiteľskej bunke alebo môžu byť, v prípade plazmidových inzerčných vektorov alebo iných inzerčných vektorov, začlenené do chromozómu hostiteľskej bunky. Náhodná nešpecifická integrácia do hostiteľského chromozómu je možná, hoci je výhodná špecifická homologická integrácia. Pre tento krok sú v problematike známe spôsoby (pozri napríklad Pozzi a spol. (1922) J. Res. Microbiol. 143, 449 až 457 a (1996) Gene 169, 85 až 90). Integrácia je „homologická“, pretože plazmidový inzerčný vektor obsahuje segment chromozómovej DNA hostiteľskej bunky.

-11 Príklady reprezentatívnych plazmidov vhodných na expresiu genetických konštruktov, alebo molekuly nukleovej kyseliny podľa vynálezu zahŕňajú pTrpBB (Ôberg a spol., pozri vyššie) alebo jeho deriváty. Podobne, takéto plazmidy možno modifikovať v prípade potreby na odstránenie sekvencii kódujúcich partnera fúzie. Možno použiť akýkoľvek vektor s vysokým počtom kópií začleňujúci promótor Trp alebo podobný promótor.

V problematike je známe množstvo spôsobov a možno ich použiť na zavádzanie takýchto vektorov do prokaryotických alebo eukaryotických buniek na expresiu napríklad bakteriálnych transformačných spôsobov, transfekcie, elektroporácie. Transformované alebo transfekované eukaryotické alebo prokaryotické hostiteľské bunky, t. j. hostiteľské bunky obsahujúce molekulu nukleovej kyseliny podľa vynálezu, podľa definície uvedenej vyššie, taktiež sú súčasťou vynálezu.

Podľa podrobnejšieho opisu v Príkladoch, expresné vektory, osobitne plazmidy, obsahujúce molekuly nukleovej kyseliny podľa vynálezu, majú vo svojich hostiteľoch výhodu genetickej stability; podľa reštrikčného mapovania sa v plazmidoch pripravovaných z kultúr kultivovaných do štádia s vysokou hustotou buniek nezistila nijaká genetická instabilita.

Ďalej súčasný vynález poskytuje spôsob prípravy molekuly nukleovej kyseliny, ktorá kóduje multimérny polypeptid zahŕňajúci viacnásobné kópie inzulínového C-peptidu, kde exprimovaný multimérny polypeptid je schopný následného štiepenia, čím sa získajú jednotlivé kópie inzulínového C-peptidu, uvedený spôsob zahŕňajúci generovanie molekuly nukleovej kyseliny obsahujúcej viacnásobné kópie nukleotidovej sekvencie kódujúce inzulínový C-peptid, spojený do zodpovedajúceho čítacieho rámca.

V problematike je známych množstvo spôsobov na vygenerovanie viacnásobných kópií génu alebo fragmentu génu, ktoré možno použiť v spôsoboch podľa súčasného vynálezu. Napríklad syntetické fragmenty DNA možno polymerizovať opačnými koncami k sebe s použitím označených jednovláknových nepalindró-mových vyčnievajúcich koncov. Spolymerizované DNA fragmenty sa potom dajú priamo napojiť na zodpovedajúce výbežky, ktoré vznikli po enzymatickej reštrikcii (Ljungquist a spol. (1989) Eur. J. Biochem. 186, 563 až 569). Iné spôsoby

-12na dosiahnutie multimerizácie génových fragmentov sú založené na používaní reštrikčných enzýmov triedy IIS, ako je napríklad Bsp Ml (Stahl a spol. (1990) Gene 89, 87 až 193) alebo Bsm I (Haydn a Mandecki (1988) DNA 7, 571 až 577). Alternatívne stratégie zahŕňajú polymerizáciu génového konštruktu a pripojenie adaptérových molekúl obsahujúcich reštrikčné miesta, čím sa umožní ďalšie klónovanie (Aslund a spol. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1399 až 1403, a Irving a spol. (1988) v Technological Advances in Vaccine Development, A. R. Liss Inc., New York 97 až 105). Sú tiež známe aj spôsoby de novo syntézy génov, ktoré zahŕňajú použitie polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), ktorá by bola vhodná na vygenerovanie multimérnych génových fragmentov (Majumder (1992) Gene 110, 89 až 94) a Nguyen a spol. (1994) v Advances in Biomagnetic Separation, Eaton Publishing Co., Natick 73 až 78).

Vo výhodnom uskutočnení spôsobu podľa tohto vynálezu sa vyčistené génové fragmenty (t. j. nukleotidové sekvencie kódujúce inzulínový C-peptid) nechajú polymerizovať opačnými koncami k sebe (multimerizácia) na nepalindrómové výbežky a potom sa napoja do plazmidu natráveného reštrikčným enzýmom, výhodne Sfi I.

V osobitne výhodnom uskutočnení plazmid obsahujúci nukleotidovú sekvenciu (napríklad génový fragment) kódujúcu inzulínový C-peptid sa natrávi, aby sa uvedená sekvencia alebo génový fragment vyčlenil; po multimerizácii sekvencií alebo génových fragmentov sa zapoja späť do natráveného plazmidu. Transformanty možno výhodne sledovať pomocou spôsobu PCR (Stahl a spol. (1993) Biotechniques 14, 424 až 434), ktorý zosilňuje (amplifikuje) segment kódujúci jeden alebo viacero kópií inzulínového C-peptidu. Zosilnené fragmenty možno porovnávať pomocou agarózovej gélovej elektroforézy. V ďalšom výhodnom uskutočnení sa vyizolujú génové fragmenty kódujúce požadovaný počet konkatemerizovaných inzulínových C-peptidov, napríklad tri alebo sedem, a pripoja sa do ďalšieho plazmidu, ktorý bol natrávený s použitím toho istého reštrikčného enzýmu, ktorý sa použil na excíziu fragmentu kódujúceho inzulínový C-peptid. Najvýhodnejšie, tento neskorší plazmid, ktorý sa použije na transformáciu

-13hostiteľských buniek, obsahuje navyše vhodný promótor a sekvenciu kódujúcu vhodného partnera fúzie pre inzulínový C-peptid.

Ďalej vynález zahŕňa produkty uvedených spôsobov, čiže multimér inzulínového C-peptidu a jednotlivé C-peptidy uvoľnené z uvedeného multiméru štiepením.

Osobitne tento vynález poskytuje multimérny polypeptid obsahujúci viacnásobné kópie inzulínového C-peptidu, ktorý sa naštiepi s cieľom získať jednotlivé kópie uvedeného inzulínového C-peptidu. Voliteľne, multimérny polypeptid môže navyše obsahovať partnera fúzie, a/alebo linkerové oblasti obsahujúce štiepne miesto v susedstve každého z uvedených monomérov Cpeptidu.

Tiež sa poskytuje spôsob na prípravu multimérneho polypeptidu zahŕňajúceho viacnásobné kópie inzulínového C-peptidu, ktorý sa naštiepi, aby sa získali jednotlivé kópie uvedeného inzulínového C-peptidu, pričom uvedený spôsob zahŕňa kultiváciu hostiteľskej bunky obsahujúcej molekulu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje uvedený multimérny polypeptid za podmienok, v ktorých sa uvedený multimérny polypeptid exprimuje, a získanie exprimovaného multimérneho polypeptidu.

Hostiteľské bunky možno kultivovať s použitím spôsobov známych v problematike, napríklad vo forme dávkovej alebo priebežnej kultivácie.

Multimérny génový produkt alebo polypeptid možno získať z kultúry hostiteľských buniek štandardnými spôsobmi dobre známymi v problematike, napríklad štandardnou bunkovou iýzou a spôsobmi čistenia proteínov. Ako už bolo uvedené, ak sa partner fúzie zahrnie do multimérneho polypeptidu, čistenie sa dá ľahko dosiahnuť na základe afinitnej väzby partnera.

V problematike je známych mnoho spôsobov na vyizolovanie proteínov alebo polypeptidov z buniek alebo z kultivačného média buniek, a to ako natívnych, tak aj rekombinantne exprimovaných, a možno použiť ktorýkoľvek z nich. Bunkovú lýzu na uvoľnenie vnútrobunkových proteínov/polypeptidov možno urobiť s použitím ktoréhokoľvek z mnohých spôsobov známych v problematike a opísaných v literatúre, a v prípade potreby možno vykonať ďalšie kroky čistenia, opäť na

-14základe spôsobov známych v problematike, v závislosti od toho, či sa používajú dávkové alebo priebežné spôsoby kultivácie.

Zistilo sa, že spôsoby využívajúce teplo na lýzu buniek a získanie polypeptidov sú osobitne účinné v prípade multimérnych polypeptidov inzulínového C-peptidu podľa súčasného vynálezu, napríklad spôsob opísaný v patente W090/00200 a jeho modifikácie. Takéto spôsoby zahŕňajú ohrievanie kultivačného média obsahujúceho hostiteľské bunky napríklad na 50 až 100 °C na určitý čas, ktorý všeobecne nie je dlhší ako 1 hodina, čím sa exprimovaný polypeptid uvoľní do média, výhodne v značne čistej podobe. Predpokladá sa, že je to výsledok selektívneho uvoľňovania exprimovaného polypeptidu. Osobitne, neočakávane sa zistilo, že tento spôsob funguje dobre v prípade rozpustných polypeptidových produktov, ktoré sú po tepelnom spracovaní stabilné, bez ohľadu na to, či sú rekombinantné alebo nie (a spôsob môže mať preto všeobecnejšiu použiteľnosť), avšak osobitne v prípade multimérneho polypeptidu inzulínového C-peptidu podľa vynálezu, kde možno získať prekvapivo vysoký výťažok produktu s vysokou čistotou. Potom sa napríklad takéto tepelné spracovanie môže vykonať ohrievaním na 80 až 100 °C, napríklad na 85 až 99 °C alebo na 90 až 95 °C na 5 až 20 minút, napríklad na 8 až 10 minút, a ochladením napríklad na 0 až 4 °C alebo na ľade.

Po získaní multimérneho polypeptidu možno ho štiepiť s cieľom uvoľniť jednotlivé monoméry inzulínového C-peptidu. Podľa toho ďalší aspekt vynálezu poskytuje spôsob na prípravu inzulínového C-peptidu, pričom uvedený spôsob zahŕňa štiepenie multimérneho polypeptidu podľa uvedenej definície na uvoľňovanie jednotlivých kópií uvedeného inzulínového C-peptidu.

Po naštiepení multimérneho polypeptidu na získanie jednotlivých monomérov C-peptidu tieto monoméry možno tiež ďalej čistiť napríklad až do homogénneho stavu (napríklad SDS-PAGE elektroforézou) s použitím dobre známych štandardných spôsobov na čistenie, napríklad ultrafiltráciou, veľkostnou chromatografiou, vyčírením, reverznou chromatografiou, atď.

Ďalej súčasný vynález sa týka použitia naštiepených peptidových produktov podľa opísaných spôsobov na liečbu. Naštiepený inzulínový C-peptid možno použiť na liečbu cukrovky prvého typu a/alebo diabetických komplikácií. Preto v náplni

-15súčasného vynálezu je tiež spôsob liečby cukrovky prvého typu alebo jej komplikácií, zahŕňajúci podávanie inzulínového C-peptidu pripraveného ktorýmkoľvek z opísaných spôsobov.

Vynález sa nižšie opisuje podrobnejšie formou neobmedzujúcich príkladov a s odkazom na nasledovné obrázky.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 je schematický opis prípravy génových konštruktov podľa súčasného vynálezu zahŕňajúci multimerizáciu génového fragmentu kódujúceho Cpeptid.

Obrázok 2A a B je schematický opis dvoch génových produktov, BB-C3(A) a BB-C7(B) s linkerovými oblasťami priľahlými k C-peptidu označenými písmenovým kódom. Každý C-peptid susedí s arginínovými zvyškami (polotučné).

Obrázok 2C je aminokyselinová sekvencia C-peptidu zapísaná písmenovým kódom (SEQ ID. No. 1).

Obrázok 3 je kópia fotografie SDS-PAGE (10 až 15%) gélu v redukčných podmienkach dvoch fúzovaných proteínov BB-C3 (stĺpec 1) a BB-C7 (stĺpec 2) po afinitnom čistení na HSA-Sepharose. Markerové proteiny s molekulovými hmotnosťami 94, 67, 43, 30, 20 a 14 kDa sú v stĺpci M.

Obrázok 4A je kópia fotografie SDS-PAGE (10 až 15%) gélu v redukčných podmienkach BB-C3 a po rôzne dlhej inkubácii s t ry psí nom a karboxypeptidázou B. V stĺpci 1 sú nenatrávené fúzované proteiny a v stĺpci 2 sú natrávené proteiny po 5 minútach trávenia trypsínom a karboxypeptidázou B. Stĺpec M ukazuje markerové proteiny s molekulovými hmotnosťami 94, 67,43, 30, 20 a 14 kDa.

Obrázok 4B je zhodný s opisom obrázku 4A s výnimkou, že na tomto obrázku je fúzovaný produkt BB-C7.

Obrázok 5 je reverzná chromatografia (RPC) štiepnych zmesí trypsínu a karboxypeptidázy B z ekvimolárneho množstva BB-C7 (hore) a BB-C3 (uprostred). Inzulínový C-peptid firmy Sigma (dole) sa analyzoval ako kontrola.

-16Obrázok 6 znázorňuje prekrývajúce sa chromatogramy (Superdex Peptide,

Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) fúzovaného produktu BB-C7 po rôzne dlhom ovplyvňovaní trypsínom (hmotnostný pomer 5000:1) a karboxypeptidázou B (hmotnostný pomer 2000:1).

Obrázok 7 je reverzná chromatografia inzulínového C-peptidu pochádzajúceho zo spracovaného BB-C7 (A) v porovnaní s štandardami inzulínového Cpeptidu pripraveného firmou Eli Lilly (B) alebo získaného od firmy Sigma (C).

Obrázok 8 je aminokyselinová sekvencia vo forme písmenového kódu peptidového produktu zahŕňajúca partnera fúzie BB a sedem kópií inzulínového Cpeptidu (SEQ ID No. 5).

Obrázok 9 je SDS PAGE (10 až 15%) analýza syntetizovaných fúzovaných proteínov BB-C1 (stĺpec 1), BB-C3 (stĺpec 2) a BB-C7 (stĺpec 3) po afinitnom čistení na HSA-Sepharose. Molekulové hmotnosti sú uvedené v kDa.

Obrázok 10 je RPC analýza štiepnych zmesí trypsínom a karboxypeptidázou B z ekvimolárneho množstva BB-C1, BB-C3 a BB-C7. Komerčne dostupný štandard C-peptidu (Sigma) bol zahrnutý ako kontrola (dole).

Obrázok 11 je agarózová gélová (1%) elektroforéza Kpnl-Pstl reštrikcie plazmidových prípravkov pTrpBB-C7 z kultúr E. coli kultivovaných 0 (stĺpec 1), 7 (stĺpec 2), 27 (stĺpec 3) alebo 31 hodín (stĺpec 4). Stĺpec Kpnl-Pstl je reštrikcia pôvodného pTrpBB-C7 plazmidu použitého na počiatočnú transformáciu buniek E. coli, a stĺpec 6 je neštiepený pTrpBB-C7 po 31 hodinách kultivácie. Markerový (M) stĺpec obsahuje DNA fágu lambda štiepeného s Pstl. Šípka ukazuje polohu fragmentu C7.

Obrázok 12 je SDS-PAGE analýza (v redukčných podmienkach) vzoriek z kultivácie BB-C7. Stĺpec 1: 2 μΙ média z neovplyvnenej kultúry. Stĺpec 2: 0,5 μΙ sonikovanej kultúry. Stĺpec 3: 0,5 μΙ média po tepelnom spracovaní kultúry. Šípka ukazuje polohu fúzovaného proteínu BB-C7. Stĺpec M ukazuje markerové proteíny s molekulovou váhou 94, 67, 43, 30, 20 a 14 kDa.

-17Prikladv uskutočnenia vynálezu

Príklad 1 - Príprava DNA konštruktov

Štyri syntetické oligonukleotidy Jope 10 (5’-CGGCCTCCCA GGCCCGCGAA GCTGAGGACC TGCAAGTTGG TCAGGTTGAA CTGGGCGGTG GCCCGGGTGC AGGC-3’) (SEQ ID No. 6), Jope 11 (5’-TCTTTGCAGC CGCTGGCTTT AGAAGGTTCT CTTCAGCGTA CGGCCTCCCA GGCCGTCGAC TAACTGCA3’) (SEQ ID No. 7), Jope 12 (3-CATGGCCGGA GGGTCCGGGC GCTTCGACTC CTGGACGTTC AACCAGTCCA ACTTGACCCG CCACCGGG-5’) (SEQ ID No. 8) a Jope 13 (3’-CCCACGTCCG AGAAACGTCG GCGACCGAAA TCTTCCAAGA GAAGTCGCAT GCCGGAGGGT CCGGCAGCTG ATTG-5’) (SEQ ID No. 9) sa fosforylovali a po dvoch sa vyžíhali (Jope 10 : Jope 12 a Jope 11 : Jope 13) inkubáciou pri 70 °C 10 minút s následných ochladením na izbovú teplotu. Dva vytvorené linkery sa zmiešali a spojili sa do plazmidu pUC18 natráveného s KpnlPstl (Yanish-Perron a spol., 1985, Gene 33, 103 až 106) (obrázok 1), a ligačná zmes sa preniesla do úcm-Escherichia coli, kmeň GM31 (Marinus, (1973) Mol. Gen. Menet. 127, 47 až 55). Zistil sa transformant (PUC-C1) so správnou nukleotidovou sekvenciou vo vloženom génovom fragmente kódujúcom inzulínový C-peptid s použitím DNA sekvenovania v tuhej fáze na základe PCR (Hultman a spol., (1989) Nucl. Acids Res. 17, 4937 až 4946). Pripravila sa plazmidová DNA z pUCC1 a po reštrikcii s Sfil sa excidovaný génový fragment kódujúci inzulínový C-peptid spolu s vektorovou časťou vyčistili s použitím súpravy Mermaid (sklo - mlieko) (BIO 101 Inc., CA, USA), alebo pomocou súpravy GeneClean (BIO 101 Inc., CA, USA).

Vyčistené génové fragmenty kódujúce inzulínový C-peptid sa nechali polymerizovať opačnými koncami k sebe v dôsledku označených nepalindrómových vyčnievajúcich koncov, a potom sa pripojili späť k vyčistenému plazmidu netrávenému s Sfil. Bunky E.coli RRIAM15 (Riither, (1982) Nucl. Acids Res. 10, 5765 až 5772) sa transformovali s ligačnou zmesou a výsledné transformanty sa prezerali s použitím spôsobu PCR (Stahl a spol., (1993), vyššie). V krátkosti,

-18jednotlivé kolónie sa vybrali do PCR skúmaviek obsahujúcich 50 μΙ reakčnej zmesi PCR (20 mM TAPS, pH 9,3 pri 20 °C, 2 mM MgCI₂, 50 mM KCI, 0,1% Tween-20, 0,2 mM dNTP, 6 pmol z každého priméru (RIT27: 5’-GCTTCCGGCTCGTATGTGTG-3’ (SEQ ID No. 10) a RIT28: 5-AAAGGGGGATGTGCTGCAAG GCG-3’) (SEQ ID No. 11) a 1.0 jednotka Taq polymerázy. Dva PCR primery RIT27 a RIT28 majú žíhacie miesta vpUC18, ktorý je vedľa bodu začlenenia fragmentov inzulínového C-peptidu. Fragmenty amplifikované pomocou PCR z klonov s rôznym počtom včlenených oligonukleotidov sa porovnali agarózovou gélovou elektroforézou, pričom referenčným plazmidom bol pUC18, a zistili sa transformanty s jedným až siedmimi inzertmi. Výsledné plazmidy sa preto označili pUC-C1, pUCC2, atď.

Pripravili sa plazmidy a génové fragmenty obsahujúce požadovaný počet inzertov sa vyrezali natrávením s použitím Kpnl-Pstl. Génové fragmenty kódujúce jeden, tri alebo sedem konkatemerizovaných inzulínových C-peptidov, sa vyizolovali a pospájali do podobne natráveného pTrpBBT1T2, a výsledné plazmidy sa označili pTrpBB-C1, pTrpBB-C3 a pTrpBB-C7. Plazmid pTrpBBT1T2 sa skonštruoval z plazmidu pTrpBB (Ôberg a spol., (1994) v Proc. 6th Eur. Congress Biotechnol; Elsevier Science B.V. 179 až 182) inzerciou terminátorovej sekvencie translácie odvodenej z plazmidu pKK223-3 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko). Terminátorová sekvencia transkripcie sa získala z pKK223-3 s použitím štandardného protokolu PCR amplifikácie (Hultman a spol., (1989), vyššie) a oligonukleotidy HEAN-19,5-CCCCCTGCAGCTCGAGCGCCTTTA ACCTGTTTTGGCGGATG-3’ (SEQ ID No. 12) a HEAN-20, 5’-CCCCAAGCTTAGAGTTTGTAG AAACGC-3’ (SEQ ID No. 13).

Reštrikčné miesta zavedené pomocou PCR sa natrávili s použitím Pstl a HindlII, potom sa uskutočnilo začlenenie do pTrpBB, ktorý bol predtým natrávený tými istými enzýmami. Výsledný expresný vektor pTrpBBT1T2 kóduje afinitnú násadu pozostávajúcu z leader sekvencií odvodených z trp-operónu (osem aminokyselín) a z väzbovej oblasti sérového albumínu BB (25 kDa) (Nygren a spol., (1988), vyššie) odvodenej zo streptokokového proteínu G. Transkripcia je pod

-19kontrolou trp promótoru E. coli. Navyše, plazmid nesie gén rezistencie voči kanamycínu.

Príklad 2 - Expresia a čistenie proteínov

Bunky E. coli obsahujúce pTrpBB-C3 a pTrpBB-C7, a tým kódujúce fúzované proteíny BB-C3 a BB-C7, sa kultivovali cez noc pri 37 °C v trepačkových fľašiach obsahujúcich 10 ml Tryptic Soy Broth (Difco, USA) (30 g/l) obohatený o kvasinkový extrakt (Difco) (5 g/l) a kanamycín monosulfát (50 mg/l). Kultúry inkubované cez noc sa nariedili 10-násobne do 100 ml do trepačkových fliaš s rovnakým typom média a boli kultivované pri 37 °C. Génová expresia sa indukovala v štádiu strednej logaritmickej fázy rastu (A_600nm s 1) pridaním kyseliny βindolakrylovej v množstve 25 mg/l. Bunky sa pozbierali 20 hodín po indukcii centrifugáciou 10 min pri približne 6000 g. Bunky sa resuspendovali v 1/20 objemu kultúry v TST (50 mM Tris-HCI pH 8,0, 200 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM EDTA), lyžovali sa sonikáciou a centrifugovali sa približne pri 40 000 g. Vzorky na sonikovanie sa pripravili sedimentovaním kultúry v trepačkovej fľaši centrifugáciou a potom resuspendovaním buniek v 30 ml studeného tlmivého roztoku TST. Vzorky sa držali na ľade počas 2-minútovej pulznej sonikácie, ktorá sa uskutočnila na sonikátore Vibra Celí (500 W) firmy Sonics and Materials Inc. (Danburry, Connecticut, USA) s použitím 13 mm štandardného hrotu, 70% pracovného cyklu (20 kHz) a s kontrolou výkonu nastavenou na 6,5. Supernatanty obsahujúce rozpustné cytoplazmatické proteíny sa prefiltrovali (0,45 μπι) a nariedili sa na 100 ml s TST. Rozpustné fúzované proteíny sa vyizolovali afinitnou chromatografiou na ľudskom sérovom albumíne (HSA)-Sepharose (Nygren a spol. (1988), vyššie) podľa opisu Stahl a spol. (1989) J. Immunol. Meth. 124, 43 až 52. V eluovaných frakciách sa sledoval obsah proteínov meraním absorbancie pri 280 nm a príslušné frakcie sa lyofilizovali.

Na obrázku 3 je afinitne čistený BB-C3 a BB-C7 po jednokrokovom čistení na

HSA-Sepharose. Produkty špinou dĺžkou prevažovali u oboch fúzovaných

-20proteínov, ktoré tiež migrovali v súlade so svojou molekulovou váhou; 39,1 a 54,2 kDa. Hladiny expresie boli v trepačkových kultúrach u oboch fúzovaných proteínov takmer rovnaké, 130 mg/l u BB-C3 a 120 mg/l u BB-C7.

Príklad 3 - Proteolytické natrávenie fúzovaných proteínov

Trypsín, ktorý C-terminálne štiepi bázické aminokyseliny, sa už dlho používa na štiepenie fúzovaných proteínov. Napriek očakávanej nízkej špecifičnosti sa zistilo, že trypsín je na špecifické štiepenie fúzovaných proteínov užitočný, pričom bázické zvyšky v rámci skladaných proteínových domén necháva bez natrávenia (Wang a spol., (1989) J. Biol. Chem. 264, 21116 až 21121). Trypsín má navyše ďalšiu výhodu v tom, že nie je drahý a je ľahko dostupný. Tu sme použili trypsín v kombinácii s karboxypeptidázou B na spracovanie BB-C3 a BB-C7 s cieľom získať natívny ľudský inzulínový C-peptid. Trypsín by tak štiepil fúzované proteíny každého arginínového zvyšku C-terminálne a karboxypeptidáza B by po natrávení trypsinom odstránila C-terminálny arginín prítomný na každom monoméri inzulínového C-peptidu.

Na analýzu účinnosti spracovania sa tieto dva fúzované proteíny, BB-C3 a BB-C7, rôzne dlhú dobu inkubovali s trypsinom a karboxypeptidázou B a potom sa analyzovali s použitím SDS/PAGE analýzy. Zistilo sa, že oba fúzované proteíny sa spracovali rýchlo a po 5 minútach spracovávania sa v SDS/PAGE analýze nedal zistiť nijaký fúzovaný proteín (obrázok 4A a B).

Okrem toho sa urobila analýza na porovnanie relatívneho výťažku monomérov inzulínového C-peptidu po štiepení fúzovaných proteínov BB-C3 a BBC7. Štiepne zmesi sa po spracovaní ekvimolárneho množstva BB-C3 a BB-C7 trypsinom a karboxypeptidázou B analyzovali reverznou HPLC (250 mm, kolóna Kromasil C8, vnútorný priemer 4,6 mm, veľkosť čiastočiek 7 pm, Hewlett Packard 1090). Elúcia sa uskutočnila s použitím 10 až 40%-ného acetonitrilového gradientu obsahujúceho 0,1% kyselinu trifluóroctovú počas 30 minút pri 40 °C. Pomer medzi produktom inzulínového C-peptidu (čas elúcie približne 25,4 min) a inými štiepnymi produktmi (pôvodu fúzovaného proteínu BB-C7) bol významne vyšší po naštiepení

-21 fúzovaného proteínu BB-C7 v porovnaní so štiepením fúzovaného proteínu BB-C3. Integráciou vrcholových oblastí inzulínového C-peptidu (C7:C3) sa získal pomer vrcholovej oblasti 2,43, čo je blízko k teoreticky vypočítanému pomeru 2,33.

Toto neposkytuje nijaké informácie o tom, kedy sú fúzované proteíny úplne spracované. Na zistenie toho, kedy sa spracovanie trypsínom/karboxypeptidázou B úplne dokončilo, fúzovaný proteín BB-C7 sa spracovával enzymaticky rôzne dlho. Lyofilizovaný fúzovaný proteín BB-C7 sa rozpustil v 100 mM fosfátmi tlmeného roztoku, pH 7,5, obsahujúceho 0,1% (podľa objemu) Tween 20 do koncentrácie proteínov 1 mg/ml. Trypsín (T-2395, Sigma, St. Louis, MO, USA) a karboxypeptidáza B (Boehringer Mannheim) sa pridali do pomeru trypsínu kfúzovanému proteínu 1/5000 (podľa váhy) a karboxypeptidázy B kfúzovanému proteínu 1/2000 (podľa hmotnosti). Po 15, 30, 60 a 120 minútach sa zo štiepnych zmesí odobrali vzorky a trávenie sa zastavilo znížením pH na 3 pridaním HAc. Na stabilizovanie štiepnych produktov sa pridalo až 20% (podľa objemu) acetonitrilu.

Štiepny materiál sa analyzoval chromatograficky (kolóna Superdex Peptide v systéme SMART™, Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) a vzájomným prekrývaním chromatogramov (obrázok 6). Zistilo sa, že BB-C7 bol za týchto podmienok úplne spracovaný po 60 minútach, pretože po predĺžení inkubačného času sa už nezískal nijaký inzulínový C-peptid. Tieto výsledky tiež ukazujú, že by bolo možné získať kvantitatívny výťažok inzulínového C-peptidu zfúzovaných proteínov zahŕňajúcich multimérne formy inzulínového C-peptidu.

Príklad 4 - Charakterizovanie získaného inzulínového C-peptidu: Reverzná chromatografia (RPC) a hmotnostná spektrometria

Na potvrdenie toho, že získaný peptid je skutočne natívny ľudský inzulínový C-peptid, sa urobili dve odlišné analýzy. Po prvé, použila sa reverzná chromatografia (RPC) na porovnanie vyčisteného inzulínového C-peptidu získaného spracovaním BB-C7 na štandardy inzulínového C-peptidu, pričom uvedené štandardy sú C-peptid získaný od firmy Eli Lilly (CA, USA) a komerčne dostupný fragment inzulínového C-peptidu 3-33 (Sigma, USA). Prípravky

-22inzulínového C-peptidu sa analyzovali reverznou chromatografiou (RPC) na kolóne Sephasil C8 5 μιτι SC2. 1/10 s použitím systém SMART™ (Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko). Elúcia sa robila s použitím gradientu 26 až 36%-ného acetonitrilu obsahujúceho 0,1% (podľa objemu) kyseliny trifluóroctovej počas 20 min pri 25 °C. Rýchlosť prietoku bola 100 μΙ/min a absorbancia sa merala pri 214 nm. Zistilo sa, že všetky tri prípravky boli takmer totožné, pričom mali rovnaký retenčný čas a rovnakú nízku hladinu nečistôt (obrázok 7). Po druhé, inzulínový Cpeptid získaný zBB-C7 sa analyzoval hmotnostnou spektrometriou (Tabuľka 1). Váha proteínov bola stanovená pomocou hmotnostného spektrometra JEOL SX102 (JEOL, Japonsko) vybaveného elektro-sprejovou jednotkou. Dobrá zhoda v hmotnosti (Tabuľka 1) spolu spozorovanými podobnosťami k štandardom inzulínovému C-peptidu v porovnávacej RPC analýze naznačuje, že sa získal natívny ľudský inzulínový C-peptid.

Tabuľka 1. Molekulová hmotnosť inzulínového C-peptidu (Da)

Vypočítaná hodnota	3020,3
Experimentálna hodnota	3019,7 ± 1,8

Príklad 5 - Charakterizovanie získaného monoméru inzulínového C-peptidu: rádioimunoanalýza (RIA)

Monomér inzulínového C-peptidu získaný štiepením fúzovaného proteínu BB-C7 sa analyzoval s použitím komerčne dostupnej rádioimunoanalýzy, ktorá bola vyvinutá na sledovanie hladín ľudského inzulínového C-peptidu napríklad v krvi a moči (Euro-Diagnostica, Malmô, Švédsko; katalógové číslo MD 315). Pre porovnanie sa analyzoval aj prípravok inzulínového C-peptidu (Eli-Lilly Co., Indianapolis, Ind, USA), o ktorom sa predtým zistilo, že je biologicky aktívny (Johansson a spol., (1992) Diabetológia 35: 1151 až 1158). Vzorky pre analýzu sa pripravili navažovaním a potom riedením do finálnej koncentrácie 3,31 a 3,30

-23nanomólov/liter oboch prípravkov C-peptidu, v 0,05 M Na-fosfátovom tlmivom roztoku, pH 7,4, 5% ľudskom sérovom albumíne (HSA) a 0,02% Thimerosalu. V krátkosti, analýza zahŕňa králičie antisérum proti ľudskému C-peptidu, ľudský inzulínový C-peptid značený jódom ¹²⁵l, kozie antisérum proti králičiemu Ig - PEG reagencia, štandardy ľudského inzulínového C-peptidu a kontrolné vzorky na kvantifikovanie inzulínového C-peptidu v analyzovaných vzorkách po zostrojení štandardnej krivky. Výsledky analýzy oboch vzoriek sú zhrnuté nižšie v Tabuľke 2. Výsledky ukazujú, že obidva prípravky sú v RIA analýze rozpoznávané a kvantifikované rovnako.

Tabuľka 2. Porovnávacia RIA analýza inzulínového C-peptidu s dokázanou biologickou aktivitou a inzulínový C-peptid získaný štiepením rekombinantného fúzovaného proteínu BB-C7.

Vzorka	Očakávaná koncentrácia (nM)	Zistená koncentrácia (nM)
Inzulínový C-peptid (zo štiepenia fúzovaného proteínu BB-C7)	2,34 (71%)	3,31
Inzulínový C-peptid (od firmy Eli-Lilly)	2,41 (73%)	3,30

Príklad 6 - Expresia, čistenie a proteolytické natrávenie fúzovaných proteínov BBC1, BB-C3 a BB-C7

Tento príklad poskytuje ďalšie komparatívne výsledky ohľadne fúzovaného proteínu BB-C1 pre experimenty uvedené v príklade 2 a 3.

-24Bunky E. coli obsahujúce plazmidy pTrp BB-C1, pTrp BB-C3 alebo pTrp BBC7 (pozri príklad 1) sa kultivovali a fúzované proteíny sa exprimovali, získali, čistili a analyzovali podľa opisu v príklade 2.

Analýza buniek E. coli transformovaných plazmidmi pTrp BB-C1, pTrp BB-C3 alebo pTrp BB-C7 ukázala, že kódované fúzované proteíny BB-C1, BB-C3 a BB-C7 sa akumulovali vnútrobunkovo ako rozpustné génové produkty (údaje nie sú uvedené). Po rozbití buniek sa vytvorené fúzované proteíny účinne vyčistili HSA afinitnou chromatografiou. Na obrázku 9 sú afinitne vyčistené fúzované proteíny BB-C1, BB-C3 a BB-C7 po jednokrokovom čistení na HSA-Sepharose. U všetkých troch fúzovaných proteínov prevažovali produkty s plnou dĺžkou, ktoré aj migrovali v súlade so svojou molekulovou hmotnosťou 31,5, 39,1 a 54,2 kDa. Expresné hladiny z trepačkových kultúr boli reprodukovateľné a podobné pre všetky tri rôzne fúzované proteíny v rozsahu 40 až 60 mg/l.

Na analýzu účinnosti spracovania týchto troch afinitne čistených fúzovaných proteínov sa BB-C1, BB-C3 a BB-C7 rôzne dlho inkubovali strypsínom a karboxypeptidázou B a boli potom analyzované SDS-PAGE chromatografiou. Všetky tri fúzované proteíny boli spracované rýchlo a po 5 minútach sa SDS-PAGE chromatografiou nezistil žiaden fúzovaný proteín s plnou dĺžkou (údaje nie sú uvedené)

Účinnosť proteolytického spracovania sa ďalej analyzovala podľa opisu v príklade 3 a zistilo sa, že BB-C7 bol úplne naštiepený po 60 minútach.

Na lepšie porovnanie relatívnych výťažkov monomérov C-peptidu po naštiepení fúzovaných proteínov BB-C1, BB-C3 a BB-C7 sa urobila reverzná HPLC analýza (podľa opisu v príklade 3). Analyzovali sa štiepne zmesi približne ekvimolárneho množstva BB-C1, BB-C3 a BB-C7 spracovávané 120 minút trypsínom + karboxypeptidázou B. (Sledovala sa hodnota A_220nm.) Výsledky (obrázok 10) ukázali výrazne vyšší pomer medzi C-peptidovým produktom a inými štiepnymi produktmi fúzovaných proteínov BB-C7 a BB-C3 v porovnaní so štiepením fúzovaného proteínu BB-C1. Približne ekvimolárne množstvá z každého fúzovaného proteínu sa naniesli do RPC kolóny, ako to ukázala rovnaká výška vrcholov pochádzajúca z BB-značky natrávenej trypsínom na všetkých troch

-25chromatogramoch (obrázok 10). Integrácia vrcholových oblastí C-peptidu (940, 2324 a 5647 jednotiek absorbancie χ s χ 10“³ pre BB-C1, BB-C3 a BB-C7) viedla k pomeru 2,5 pre C3 : C1 a 6,0 pre C7 : C1, čo je blízko k teoretickým hodnotám 3 a 7.

Výsledky ďalej ukazujú zlepšený výťažok monomérov inzulínového C-peptidu z multimérov inzulínového C-peptidu (C3, C7) v porovnaní s monomérnym fúzovaným proteínom (C1).

Príklad 7 - Skúmanie genetickej stability plazmidu pTrpBB-C7 kódujúceho fúzovaný proteín BB-C7

V tomto príklade sa opisuje stanovenie genetickej stability plazmidu pTrpBBC7 kódujúceho fúzovaný proteín BB-C7. Bunky E. coli obsahujúce plazmid pTrpBBC7 sa kultivovali rôzne dlho a po 0, 7, 27 a 31 hodinách kultivácie sa odoberali vzorky. 31 hodín napodobňovalo kultivačný čas fermentačnej prípravy BB-C7 v priemyselných podmienkach. Plazmidy sa získali zo vzoriek podľa štandardných protokolov (Sambrook a spol., A Laboratory Manual, druhé vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Plazmidy sa natrávili reštrikciou s Kpnl-Pstl, aby sa vyrezal fragment kódujúci konkatamér C7 (pozri obrázok 1). Pôvodný plazmid pTrpBB-C7 použitý na počiatočnú transformáciu buniek E. coli sa zahrnul ako kontrola, a bol preto tak isto vystavený reštrikcii s Kpnl-Pstl. Natrávený fragment mal vo všetkých vzorkách rovnakú veľkosť, čo svedčilo o tom, že plazmid pTrpBB-C7 by bol po dlhšiu dobu geneticky stabilný (obrázok 11).

Príklad 8 - Tepelné spracovanie na selektívne uvoľňovanie BB-C7 do kultivačného média

Tento príklad opisuje, ako sa fúzovaný proteín BB-C7 dal uvoľniť do kultivačného média po vystavení teplu, čím sa výrazne zvýšila čistota počiatočného materiálu na ďalšie čistenie proteínu BB-C7. Pozadie: V porovnaní s najrozšírenejším spôsobom na uvoľňovanie rekombinantných proteínov pripravených

-26vnútrobunkovo v E. coli (včítane centrifugovania a resuspendovania bunkového peletu vo vhodnom tlmivom roztoku a rozbitia buniek vysokotlakovou homogenizáciou) uvoľňovanie génového produktu spôsobom tepelného spracovania má mnohé výhody: (i) produkčná schéma včítane tepelného spracovania má o jeden číriaci krok menej, (ii) stabilita génového produktu sa zvyšuje v dôsledku tepelnej denaturácie proteáz hostiteľských buniek, (iii) získava sa výrazné počiatočné čistenie génového produktu vyzrážaním iných proteínov z E. coli a (iv) uvoľnenie nukleových kyselín sa v porovnaní s celkovým rozbitím buniek zníži. Spôsob by bol vhodný aj na uvoľnenie iných vnútrobunkovo exprimovaných rekombinantných proteínov, ktoré sú rozpustné aj pri vysokých expresných hladinách a ktoré sú po tepelnom spracovaní požadovanom na uvoľnenie proteínu stabilné.

Bunky E. coli obsahujúce plazmid pTrpBB-C7 kódujúci BB-C7 sa kultivovali podľa opisu v príklade 2. Ako alternatíva k opisovanému spôsobu sonikácie (príklad 2) na rozbitie buniek by sa mohlo použiť tepelné spracovanie na selektívne a účinné uvoľnenie BB-C7 do kultivačného média. Kultúra sa na konci kultivácie ponorila na 8 až 10 minút do vodného kúpeľa s vriacou vodou. Po tomto čase kultúra dosiahla teplotu približne 90 °C. Trepačková nádoba sa potom umiestnila na ľad. Pri tejto teplote sa fúzovaný proteín BB-C7 uvoľňuje do kultivačného média bez uvoľnenia väčších množstiev proteínov hostiteľa (obrázok 12, stĺpec 3). Proteíny hostiteľa sa s najväčšou pravdepodobnosťou týmto spôsobom spracovania úplne denaturujú. Naopak, sonikácia (obrázok 12, stĺpec 2) a iné mechanické spôsoby na rozbíjanie buniek by uvoľnili aj bunky hostiteľa spolu s nukleovými kyselinami, čo by viedlo k veľmi heterogénnemu počiatočnému materiálu pre ďalšie čistenie proteínu BB-C7. Kultúra E. coli obyčajne vylučuje len veľmi málo proteínov (obrázok 12, stĺpec 1). Zistilo sa, že BB-C7 je stabilný po tepelnom spracovaní a mohol sa ďalej čistiť a spracovávať na uvoľňovanie monomérov C-peptidu podľa opisu v príkladoch 1 až 3.

-27Zoznam sekvencii (1) Všeobecné informácie:

(i) Prihlasovateľ:

(A) Meno: Creative Peptides Sweden AB (B) Ulica: Dahlbergstigen 6 (C) Mesto: Djursholm (E) Krajina: Švédsko (F) Poštové smerovacie číslo: S-182 64 (i) Prihlasovateľ:

(A) Meno: Štefan Stahl (B) Ulica: clo Royal Inštitúte of Technology (C) Mesto: Štokholm (E) Krajina: Švédsko (F) Poštové smerovacie číslo: S-100 44 (i) Prihlasovateľ:

(A) Meno: Mathias Uhlén (B) Ulica: c/o Royal Inštitúte of Technology (C) Mesto: Štokholm (E) Krajina: Švédsko (F) Poštové smerovacie číslo: S-100 44 (i) Prihlasovateľ:

(A) Meno: Per-Ake Nygren (B) Ulica: c/o Royal Inštitúte of Technology (C) Mesto: Štokholm (E) Krajina: Švédsko (F) Poštové smerovacie číslo: S-100 44

-28(1) Prihlasovateľ:

(A) (A) Meno: Per Jonasson (B) Ulica: c/o Royal Inštitúte of Technology (C) Mesto: Štokholm (E) Krajina: Švédsko (F) Poštové smerovacie číslo: S-100 44 (ii) Názov vynálezu: Rekombinantné expresia inzulínového C-peptidu (iii) Počet sekvencií: 14 (iv) Počítačová forma:

(A) Typ média: Disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Softvér: Patentln vydanie 1.0, verzia 1.30 (EPO) (2) Informácie o SEQ ID No. 1:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 31 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 1:

Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 15 10 15

Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin 20 25 30 (2) Informácie o SEQ ID No. 2:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 7 aminokyselín

-29(B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 2:

Arg Thr Ala Ser Gin Ala Arg 1 5 (2) Informácie o SEQ ID No. 3:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 5 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 3:

Ala Ser Gin Ala Arg 1 5 (2) Informácie o SEQ ID No. 4:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 8 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 4:

Arg Thr Ala Ser Gin Ala Val Asp 1 5

-30(2) Informácie o SEQ ID No. 5:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 521 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 5:

Met Lys 1

Ala

íle

Phe 5

Val

Leu

Asn

Ala

Gin 10

His

Asp

Glu

Ala

Val 15

Asp

Ala Asn

Phe

Asp 20

Gin

Phe

Asn

Lys

Tyr 25

Gly

Val

Ser

Asp

Tyr 30

Tyr

Lys

Asn Leu

íle 35

Asn

Asn

Ala

Lys

Thr 40

Val

Glu

Gly

Val

Lys 45

Asp

Leu

Gin

Ala Gin 50

. Val

Val

Glu

Ser

Ala 55

Lys

Lys

Ala

Arg

íle 60

Ser

Glu

Ala

Thr

Asp Gly 65

’ Leu

l Ser

- Asp

Phe 70

Leu

Lys

Ser

Gin

Thr 75

Pro

Ala

Glu

Asp

Thr 80

Val Lys

Ser

íle

Glu 85

Leu

Ala

Glu

Ala

Lys 90

Val

Leu

Ala

Asn

Arg 95

Glu

Leu Asp

Lys

Tyr 100

Gly

Val

Ser

Asp

Tyr 105

His

Lys

Asn

Leu

íle 110

Asn

Asn

Ala Lys

Thr 115

Val

Glu

Gly

Val

Lys 120

Asp

Leu

Gin

Ala

Gin 125

Val

Val

Glu

Ser Ala 130

Lys

Lys

Ala

Arg

íle 135

Ser

Glu

Ala

Thr

Asp 140

Gly

Leu

Ser

Asp

Phe Leu

Lys

Ser

Gin

Thr

Pro

Ala

Glu

Asp

Thr

Val

Lys

Ser

íle

Glu

145

150

155

160

Leu

Ala

Glu

Ala

Lys

Val

Leu

Ala

Asn

Arg

Glu

Leu

Asp

Lys

Tyr

Gly

165

170

175

Val

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Lys

Asn

Leu

íle

Asn

Asn

Ala

Lys

Thr

Val

Glu

180

185

190

Gly

Val

Lys

Ala

Leu

íle

Asp

Glu

íle

Leu

Ala

Ala

Leu

Pro

Lys

Thr

195

200

205

Asp

Thr

Tyr

Lys

Leu

íle

Leu

Asn

Gly

Lys

Thr

Leu

Lys

Gly

Glu

Thr

210

215

220

Thr

Thr

Glu

Ala

Val

Asp

Ala

Ala

Thr

Ala

Arg

Ser

Phe

Asn

Phe

Pro

225

230

235

240

íle

Leu

Glu

Asn

Ser

Ser

Ser

Val

Pro

Ala

Ser

Gin

Ala

Arg

Glu

Ala

245

250

255

Glu

Asp

Leu

Gin

Val

Gly

Gin

Val

Glu

Leu

Gly

Gly Gly

Pro

Gly

Ala

260

265

270

Gly

Ser

Leu

Gin

Pro

Leu

Ala

Leu

Glu

Gly

Ser

Leu

Gin

Arg

Thr

Ala

275

280

285

Ser

Gin

Ala

Arg

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gin

Val

Gly

Gin

Val

Glu

Leu

290

295

300

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Ser

Leu

Gin

Pro

Leu

Ala

Leu

Glu

Gly

305

310

315

320

Ser

Leu

Gin

Arg

Thr

Ala

Ser

Gin

Ala

Arg

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gin

325

330

335

Val

Gly

Gin

Val

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Ser

Leu

Gin

340

345

350

Pro

Leu

Ala

Leu

Glu

Gly

Ser

Leu

Gin

Arg

Thr

Ala

Ser

Gin

Ala

Arg

355 360 365

Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro

370

375

380

Gly

Ala

Gly

Ser

Leu

Gin

Pro

Leu

Ala

Leu

Glu

Gly

Ser

Leu

Gin

Arg

385

390

395

400

Thr

Ala

Ser

Gin

Ala

Arg

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gin

Val

Gly

Gin

Val

405

410

415

Glu

Leu

Gly

Gly Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Ser

Leu

Gin

Pro

Leu

Ala

Leu

420

425

430

Glu

Gly

Ser

Leu

Gin

Arg

Thr

Ala

Ser

Gin

Ala

Arg

Glu

Ala

Glu

Asp

435

440

445

Leu

Gin

Val

Gly

Gin

Val

Glu

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Ser

450

455

460

Leu

Gin

Pro

Leu

Ala

Leu

Glu

Gly

Ser

Leu

Gin

Arg

Thr

Ala

Ser

Gin

465

470

475

480

Ala

Arg

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gin

Val

Gly

Gin

Val

Glu

Leu

Gly

Gly

485

490

495

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

Ser

Leu

Gin

Pro

Leu

Ala

Leu

Glu

Gly

Ser

Leu

500

505

510

Gin

Arg

Thr

Ala

Ser

Gin

Ala

Val

Asp

515

520

-33Informácie o SEQ ID No. 6:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 74 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „oligonukleotid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 6:

CGGCCTCCCA GGCCCGCGAA GCTGAGGACC TGCAAGTTGG TCAGGTTGAA CTGGGCGGTG

GCCCGGGTGC AGGC (2) Informácie o SEQ ID No. 7:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 68 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „oligonukleotid“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 7:

TCTTTGCAGC CGCTGGCTTT AGAAGGTTCT CTTCAGCGTA CGGCCTCCCA GGCCGTCGAC

TAACTGCA (2) Informácie o SEQ ID No. 8:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 68 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina

-34(A) Opis: /dese = „oligonukleotid“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 8:

CATGGCCGGA GGGTCCGGGC GCTTCGACTC CTGGACGTTC AACCAGTCCA ACTTGACCCG 60

CCÄCCGGG G 8 (2) Informácie o SEQ ID No. 9:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 74 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „oligonukleotid“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 9:

CCCACGTCCG AGAAACGTCG GCGACCGAAA TCTTCCAAGA GAAGTCGCAT GCCGGAGGGT 60

CCGGCAGCTG ATTG 74 (2) Informácie o SEQ ID No. 10:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „oligonukleotid“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 10:

GCTTCCGGCT CGTATGTGTG *^u (2) Informácie o SEQ ID No. 11:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 23 párov báz

-35(B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „oligonukleotid“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 11:

AAAGGGGGAT GTGCTGCAAG GCG ₂· (2) Informácie o SEQ ID No. 12:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 41 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „oligonukleotid“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 12:

CCCCCTGCAG CTCGAGCGCC TTTAACCTGT TTTGGCGGAT G 41 (2) Informácie o SEQ ID No. 13:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 27 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „oligonukleotid“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 13:

CCCCAAGCTT AGAGTTTGTA GAAACGC

-36(2) Informácie o SEQ ID No. 14:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 4646 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „vektor“ (xi) Opis sekvencie: SEQ IĎ No. 14:

GCGGCCGCTA ATTCATGCTG TGGTGTCATG GTCGGTGATC GCCAGGGTGC CGACGCGCAT 60

CTCGACTGCA CGGTGCACCA ATGCTTCTGG CGTCAGGCAG CCAATCGGAA GCTGTGGTAT 120

GGCTGTGCAG GTCGTAAATC ACTGCATAAT TCGTGTCGCT CAAGGCGCAC TCCCGTTCTG 180

GÄTAATGTTT TTTGCGCCGA CATCATAACG GTTCTGGCAA ATATTCTGAA’ ATGAGCTGTT 240

GACAATTAAT CATCGAACTA GTTAACTAGT ACGCAAGTTC ACGTAAAAAG GGTATCTAGA 300

ATTATGAAAG CAATTTTCGT ACTGAATGCG CAACACGATG AAGCCGTAGA CGCGAATTTC 360

GACCAATTCA ACAAATATGG AGTAAGTGAC TATTACAAGA ATCTAATCAÄ CAATGCCAAA 420

ACTGTTGAAG GCGTAAAAGA CCTTCAAGCA CAAGTTGTTG AATCAGCGAA GAAAGCGCGT 4 80

ATTTCAGAAG CAACAGATGG CTTATCTGAT TTCTTGAAAT CACAAACACC TGCTGAAGAT 540

ACTGTTAAAT CAATTGAATT AGCTGAAGCT AAAGTCTTAG CTAACAGAGA ACTTGACAAA 600

TATGGAGTAA GTGACTATCA CAAGAACCTA ATCAACAATG CCAAAACTGT TGAAGGTGTA 660

AAAGACCTTC AAGCACAAGT TGTTGAATCA GCGAAGAAAG CGCGTATTTC AGAAGCAACA 720

GATGGCTTAT CTGATTTCTT GAAATCACAA ACACCTGCTG AAGATACTGT TAAATCAATT 780

GAATTAGCTG AAGCTAAAGT CTTAGCTAAC AGAGAACTTG ACAAATATGG AGTAAGTGAC 840

-37TATTACAAGA ACCTAATCAA CAATGCCAAA ACTGTTGAAG GTGTAAAAGC ACTGATAGAT 900

GAAATTTTAG CTGCATTACC TAAGACTGAC ACTTACAAAT TAATCCTTAA TGGTAAAACA 960

TTGAAAGGCG AAACAACTAC TGAAGCTGTT GATGCTGCTA CTGCAAGATC TTTCAATTTC 1020

CCTATCCTCG AGAATTCGAG CTCGGTACCG GCCTCCCAGG CCCGCGAAGC TGAGGACCTG 1080

CAAGTTGGTC AGGTTGAACT GGGCGGTGGC CCGGGTGCAG GCTCTTTGCA GCCGCTGGCT 1140

TTAGAAGGTT CTCTTCAGCG TACGGCCTCC CAGGCCCGCG AAGCTGAGGA CCTGCAAGTT 1200

GGTCAGGTTG AACTGGGCGG TGGCCCGGGT GCAGGCTCTT TGCAGCCGCT GGCTTTAGAA 1260

GGTTCTCTTC AGCGTACGGC CTCCCAGGCC CGCGAAGCTG AGGACCTGCA AGTTGGTCAG 1320

GTTGAACTGG GCGGTGGCCC GGGTGCAGGC TCTTTGCAGC CGCTGGCTTT AGAAGGTTCT 1380

CTTCAGCGTA CGGCCTCCCA GGCCCGCGAA GCTGAGGACC TGCAAGTTGG TCAGGTTGAA 1440

CTGGGCGGTG GCCCGGGTGC AGGCTCTTTG CAGCCGCTGG CTTTAGAAGG TTCTCTTCAG 1500

CGTACGGCCT CCCAGGCCCG CGAAGCTGAG GACCTGCÄAG TTGGTCAGGT TGAACTGGGC 1560

GGTGGCCCGG GTGCAGGCTC TTTGCAGCCG CTGGCTTTAG AAGGTTCTCT TCAGCGTACG 1620

GCCTCCCAGG CCCGCGAAGC TGAGGACCTG CAAGTTGGTC AGGTTGAACT GGGCGGTGGC 1680

CCGGGTGCAG GCTCTTTGCA GCCGCTGGCT TTAGAAGGTT CTCTTCAGCG TACGGCCTCC 1740

CAGGCCCGCG AAGCTGAGGA CCTGCAAGTT GGTCAGGTTG AACTGGGCGG TGGCCCGGGT 1800

GCAGGCTCTT TGCAGCCGCT GGCTTTAGAA GGTTCTCTTC AGCGTACGGC CTCCCAGGCC 1860

GTCGACTAAC TGCAGCTCGA GCGCTTAACT GTTTTGGCGG ATGAGAGAAG ATTTTCAGCC 1920

TGATACAGAT TAAATCAGAA CGCAGAAGCG GTCTGATAAA ACAGAATTTG CCTGGCGGCA 1980

-38GTAGCGCGGT GGTCCCACCT GACCCCATGC CGAACTCAGA AGTGAAACGC CGTAGCGCCG 2040

ATGGTAGTGT GGGGTCTCCC CATGCGAGAG TAGGGAACTG CCAGGCATCA AATAAAACGA 2100

AAGGCTCAGT CGAAAGACTG GGCCTTTCGT TTTATCTGTT GTTTGTCGGT GAACGCTCTC 2160

CTGAGTAGGA CAAATCCGCC GGGAGCGGAT TTGAACGTTG CGAAGCAACG GCCCGGAGGG 2220

TGGCGGGCAG GACGCCCGCC ATAAACTGCC AGGCATCAAA TTAAGCAGAA GGCCATCCTG 2280

ACGGATGGCC TTTTTGCGTT TCTACAAACT CTAAGCTTTG GTGCAGGGGG GGGGGGGAAA 2340

GCCA.CGTTGT GTCTCAAAAT CTCTGATGTT ACATTGCACA AGATAAAAAT ATATCATCAT 2400

GAACAATAAA ACTGTCTGCT TACATAAACA GTAATACAAG GGGTGTTATG AGCCATATTC 2460

AACGGGAAAC GTCTTGCTCG AGGCCGCGAT TAAATTCCAA CATGGATGCT GATTTATATG 2520

GGTATAAATG GGCTCGCGAT AATGTCGGGC AATCAGGTGC GACAATCTAT CGATTGTATG 2580

GGAAGCCCGA TGCGCCAGAG TTGTTTCTGA AACATGGCAA AGGTAGCGTT GCCAATGATG 2640

TTACAGATGA GATGGTCAGA CTAAACTGGC TGACGGAATT TATGCCTCTT CCGACCATCA 2700

AGCATTTTAT CCGTACTCCT GATGATGCAT GGTTACTCAC CACTGCGATC CCCGGGAAAA 2760

CAGCATTCCA GGTATTAGAA GAATATCCTG ATTCAGGTGA AAATATTGTT GATGCGCTGG 2820

CAGTGTTCCT GCGCCGGTTG CATTCGATTC CTGTTTGTAA TTGTCCTTTT AACAGCGATC 2880

GCGTATTTCG TCTCGCTCAG GCGCAATCAC GAATGAATAA CGGTTTGGTT GATGCGAGTG 2940

ATTTTGATGA CGAGCGTAAT GGCTGGCCTG TTGAACAAGT CTGGAAAGAA ATGCATAAAC 3000

TTTTGCCATT CTCACCGGAT TCAGTCGTCA CTCATGGTGA TTTCTCACTT GATAACCTTA 3060

TTTTTGACGA GGGGAAATTA ATAGGTTGTA TTGATGTTGG ACGAGTCGGA ATCGCAGACC 3120

GATACCAGGA TCTTGCCATC CTATGGAACT GCCTCGGTGA GTTTTCTCCT TCATTACAGA 3180

-39AACGGCTTTT TCAAAAATAT GGTATTGATA ATCCTGATAT GAATAAATTG CAGTTTCATT 3240

TGATGCTCGA TGAGTTTTTC TAATCAGAAT TGGTTAATTG GTTGTAACAC TGGCAGAGCA 3300

TTACGCTGAC TTGACGGGAC GGCGGCTTTG TTGAATAAAT CGAACTTTTG CTGAGTTGAA 3360

GGATCAGATC ACGCATCTTC CCGACAACGC AGACCGTTCC GTGGCAAAGC AAAAGTTCAA 3420

AATCACCAAC TGGTCCGGAT CCCGGTGCCT CACTGATTAA GCATTGGTAA CTGTCAGACC 3480

AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA TTTTTAATTT AAAAGGATCT 3540

AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC 3600

ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC 3660

GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG 3720

ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA 3780

ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT GTAGCACCGC 3840

CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC GATAAGTCGT 3900

GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA 3960

CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC 4020

TACAGCGTGA GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC 4080

CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG GGAAACGCCT 4140

GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT 4200

GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC 4260

TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC GTTATCCCCT GATTCTGTGG 4320

ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG CCGCAGCCGA ACGACCGAGC 4380

-40GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG 4440

CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTGGC ACGACAGGTT TCCCGACTGG AAAGCGGGCA 4500

GTGAGCGCAA CGCAATTAAT GTGAGTTAGC TCACTCATTA GGCACCCCAG GCTTTACACT 4560

TTATGCTTCC GGCTCGTATG TTGTGTGGAA TTGTGAGCGG ATAACÄATTT CACACAGGAA 4620

ACAGCTATGA CCATGATTAC GAATTA

Claims (20)

1. Spôsob prípravy inzulínového C-peptidu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa expresiu multimérneho polypeptidu v hostiteľskej bunke, ktorý obsahuje viacnásobné kópie uvedeného inzulínového C-peptidu, a štiepenie uvedeného exprimovaného polypeptidu na uvoľnenie jednotlivých kópií inzulínového C-peptidu.

2. Molekula nukleovej kyseliny zahŕňajúca viacnásobné kópie nukleotidovej sekvencie kódujúcej inzulínový C-peptid, ktorá kóduje multimérny polypeptid, ktorý možno štiepiť s cieľom získať jednotlivé kópie uvedeného inzulínového C-peptidu.

3. Spôsob prípravy molekuly nukleovej kyseliny, ktorá kóduje multimérny polypeptid obsahujúci viacnásobné kópie inzulínového C-peptidu, pričom exprimovaný multimérny polypeptid sa dá následne štiepiť s cieľom získať jednotlivé kópie inzulínového C-peptidu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa generovanie molekuly nukleovej kyseliny obsahujúcej viacnásobné kópie nukleotidovej sekvencie kódujúcej inzulínový C-peptid, pospájaný do zodpovedajúceho čítacieho rámca.

4. Multimérny polypeptid zahŕňajúci viacnásobné kópie inzulínového Cpeptidu, ktorý sa dá štiepiť s cieľom uvoľniť jednotlivé kópie uvedeného inzulínového C-peptidu.

5. Spôsob prípravy multimérneho polypeptidu zahŕňajúci viacnásobné kópie inzulínového C-peptidu, ktorý možno štiepiť s cieľom získať jednotlivé kópie uvedeného inzulínového C-peptidu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultivovanie hostiteľských buniek obsahujúcich molekulu nukleovej kyseliny kódujúcu uvedený multimérny polypeptid za podmienok, v ktorých sa uvedený multimérny polypeptid exprimuje, a získanie exprimovaného multimérneho polypeptidu.

-426. Spôsob prípravy inzulínového C-peptidu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa štiepenie multimérneho polypeptidu podľa nároku 4.

7. Spôsob, molekula nukleovej kyseliny alebo multimérny polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že viacnásobné kópie uvedeného inzulínového C-peptidu alebo nukleotidová sekvencia kódujúca inzulínový C-peptid sú usporiadané za sebou.

8. Spôsob, molekula nukleovej kyseliny alebo multimérny polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že multimérny polypeptid zahŕňa 2 až 30 kópií inzulínového C-peptidu.

9. Spôsob, molekula nukleovej kyseliny alebo multimérny polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že multimérny polypeptid zahŕňa 3 až 7 kópií inzulínového C-peptidu.

10. Spôsob, molekula nukleovej kyseliny alebo multimérny polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že multimérny polypeptid ďalej zahŕňa partnera fúzie.

11. Spôsob, molekula nukleovej kyseliny alebo multimérny polypeptid podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že partner fúzie je jeden z páru afinitných väzbových partnerov alebo ligandov.

12. Spôsob, molekula nukleovej kyseliny alebo multimérny polypeptid podľa nároku 10 alebo nároku 11,vyznačujúci sa tým, že partner fúzie je 25 kDa väzbová oblasť pre sérový albumín - BB odvodená zo streptokokového proteínu G.

13. Spôsob, molekula nukleovej kyseliny alebo multimérny polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že monoméry

-43inzulínového C-peptidu v multimérnom polypeptide susedia s linkerovými oblasťami zahŕňajúcimi štiepne miesto.

14. Spôsob, molekula nukleovej kyseliny alebo multimérny polypeptid podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že štiepne miesto sa dá štiepiť proteolytickým enzýmom.

15. Spôsob, molekula nukleovej kyseliny alebo multimérny polypeptid podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že štiepne miesto zahŕňa arginínové zvyšky na štiepenie trypsínom a karboxypeptidázou B.

16. Spôsob alebo molekula nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3a7 až 14, vyznačujúci sa tým, že molekula nukleovej kyseliny zahŕňa jednu alebo viacero regulačných alebo expresných kontrolných sekvencii.

17. Expresný vektor, ktorý zahŕňa molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 a 7 až 16.

18. Expresný vektor podľa nároku 17, ktorým je plazmid.

19. Expresný vektor podľa nároku 18, ktorý je odvodený od plazmidu pTrpBB (SEQ ID No. 14) alebo jeho derivátu.

20. Hostiteľská bunka, ktorá obsahuje molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 a 7 až 16.

21. Inzulínový C-peptid pripravený spôsobom podľa nároku 1 alebo 6.