KR20070033965A - 에스트로젠 수용체 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20070033965A
KR20070033965A KR1020067020936A KR20067020936A KR20070033965A KR 20070033965 A KR20070033965 A KR 20070033965A KR 1020067020936 A KR1020067020936 A KR 1020067020936A KR 20067020936 A KR20067020936 A KR 20067020936A KR 20070033965 A KR20070033965 A KR 20070033965A
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자오 이 왕
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Abstract

본 발명은 서열 20에 70％ 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는, ER-α36 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 폴리펩티드에 결합하는 제제를 확인하는 방법, 이러한 폴리펩티드를 검출하는 방법, 및 이러한 폴리펩티드의 활성을 변화시키는 방법을 제공한다. 또한 서열 1에 서술된 아미노산 서열, 또는 그의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체가 제공되고, 이러한 항체를 제조하고 사용하는 방법이 제공된다.
에스트로젠, 에스트로젠 수용체, ER-α, 유방암

Description

에스트로젠 수용체 및 사용 방법{ESTROGEN RECEPTORS AND METHODS OF USE}
<계속 출원 데이터>
본 출원은 본원에 참조로 인용된, 2004년 3월 10자로 출원된 미국 가출원 제60/552,067호, 및 2005년 1월 13일자로 출원된 제60/643,469호를 우선권 주장한다.
<정부 후원>
본원에 기술된 발명은 미국 보건복지부로부터 승인번호 CA84328호로 지원을 받아 전개되었다. 미국 정부는 본 발명에 대한 임의의 권리를 갖는다.
에스트로젠은 난소, 고환, 혹은 부신피질에서 형성되는 스테로이드 화합물의 총칭이다. 에스트로젠 및 에스트로젠 활성을 갖는 화합물의 예로는 디에틸스틸베스트롤, 포스페스트롤, 헥세스트롤, 폴리에스트라디올 포스페이트, 브로파로에스트롤, 클로로트리아니센, 디엔에스트롤, 디에틸스틸베스트롤, 메테스트롤, 콜포르몬, 에퀼레닌, 에퀼린, 에스트라디올, 에스트리올, 에스트론, 에티닐 에스트라디올, 메스트라놀, 멕세스톨, 퀴네스트라디올 및 퀴네스트롤이 있다. 에스트로젠은 생식조직, 및 유방, 심혈관, 뼈, 간 및 뇌 조직에서의 다양한 생리학적 과정을 조절한다. 에스트로젠은 또한 경구 피임약에 사용된다. 에스트로젠의 다른 용도로는 폐경기 불쾌감의 제거, 유즙분비 저해, 및 골다공증, 절박유산 및 다양한 기능성 난소 장 애의 치료가 있다. 항에스트로젠은 전이성 유방암 및 진행성 전립선암을 치료하는데 사용된다.
에스트로젠의 효과는 에스트로젠 수용체에 의해 매개된다. 제1 에스트로젠 수용체(ER)는 1986년에 클론화되었다(그린(Green) 등의 문헌[Nature, 320:134(1986)] 및 그린(Greene) 등의 문헌[Science, 231:1150(1986)]). 1995년에 이르기까지, 오직 하나의 에스트로젠 수용체만이 천연 및 합성 에스트로젠 및 항에스트로젠의 모든 생리학적 및 약리학적 효과의 원인이라고 가정되었다. 그러나, 1995년에, 또 다른 에스트로젠 수용체가 클론화되었다(쿠이퍼(Kuiper) 등의 문헌[PNAS, 93:5925(1996)]). 발견된 제1 에스트로젠 수용체를 이제 에스트로젠 수용체-알파(ER-α)라고 부르고, 제2 에스트로젠 수용체를 에스트로젠 수용체-베타(ER-β)라고 부른다.
ER-α 및 ER-β는 공통의 구조적 체계를 공유한다(장(Zhang) 등의 문헌[FEBS Letters, 546:17(2003)] 및 콩(Kong) 등의 문헌[Biochem. Soc. Trans., 31:56(2003)]). 이들은 둘다 3가지의, 독립적이면서도 상호 작용하는 기능성 도메인, N-말단 A/B 도메인, C 또는 DNA-결합 도메인, 및 D/E/F 또는 리간드-결합 도메인으로 이루어진다(도 1). ER-α의 N-말단 도메인은 리간드-비의존성 활성화 기능(AF-1), 공활성화제와의 상호작용에 관련된 영역, 및 표적 유전자의 전사 활성화를 암호화한다. DNA-결합 도메인 또는 C 도메인은 수용체 이량체화 및 특이적 DNA 서열에 대한 결합에서 중요한 역할을 하는 두 징크-핑거(zinc-finger) 구조를 함유한다. C-말단 D/E/F 도메인은 리간드 결합, 수용체 이량체화, 핵 전위, 및 리간드- 의존성 트랜스-활성화(transactivation) 기능(AF-2)을 매개하는 리간드-결합 도메인이다. AF-1 및 AF-2가 전사 조절에 발휘하는 상대적 기여도는 세포-특이성 및 DNA 프로모터(promotor)-특이성 방식으로 변한다(베리(Berry) 등의 문헌[EMBO J., 9:2811(1990)] 및 추커만(Tzukerman) 등의 문헌[Mol. Endocrin., 8:21(1994)]).
ER-α 유전자의 전장 유전자 생성물의 처음 173개 아미노산(A/B 또는 AF-1 도메인)이 없는 46-kDa ER-α 동형은 엑손(exon) 1을 건너 뜀으로써 ER-α 유전자의 또 다른 스플라이싱(splicing)으로부터 유도되는 것으로 나타났다(플루리어트(Flouriot) 등의 문헌[EMBO J., 19:4688(2000)]). ER-α66과 이형이량체를 형성할 수 있다(플루리어트 등의 문헌[EMBO J., 19:4688(2000)]). 이러한 또 다른 스플라이싱 단계는 원래의 개방형 해독틀(open reading frame)의 나머지를 갖는 틀에서의 해독 개시에 유리한 코작(Kozak) 서열에 AUG를 갖는 mRNA를 생성한다. 따라서, ER-α의 이러한 새로운 동형을 ER-α46이라고 명명하고, 원래의 것을 ER-α66이라고 명명하였다(플루리어트 등의 문헌[EMBO J., 19:4688(2000)]). ER-α46은 동형이량체를 형성하고, 에스트로젠 반응 요소(estrogen response element, ERE)에 결합하고, 또한 ER-α46 동형이량체는 ER-α66 동형이량체보다 ERE에 더 높은 친화성을 나타낸다. 또한, ER-α46/66은 ER-α66 동형이량체보다 우선적으로 형성되고, ER-α46은 리간드 결합된 ER-α66의 AF-1 도메인에 의해 매개되는 트랜스-활성화를 저해하도록 경합적으로 작용하지만, AF-2-의존성 트랜스-활성화를 가져오지는 않는다(플루리어트 등의 문헌[EMBO J., 19:4688(2000)]). 따라서, ER-α46은 ER-α66의 AF-1 도메인에 의해 매개되는 에스트로젠 신호전달을 조절하는, 천연에 존재하 는 ER-α의 동형이라고 생각된다.
ER-α는 내강 상피세포의 약 15 내지 30％에서 발현되고, 정상적인 인간 유방내 임의의 다른 세포 유형에서는 전혀 발현되지 않는다. 이중표지 면역형광 기법에 의해 ER-α-발현 세포는 정상적인 인간 및 설치류 유선에서 증식 마커(marker)로 표지된 것과 분리된다(클라크(Clarke) 등의 문헌[Cancer Res., 57:4987(1997)]). ER-α 발현은 유관 증식증의 매우 초기 단계에서 증가하고, 비정형성이 증가함에 따라 더욱 더 증가하므로, 비정형성 유관 증식증 및 저급 및 중급 핵 등급의 제자리 유관암의 대부분의 세포는 ER-α를 함유한다(칸(Khan) 등의 문헌[Cancer Res., 54:993(1994)] 및 로손(Lawson) 등의 문헌[Lancet, 351:1787(1994)]). ER-α 발현이 증가함에 따라, 수용체 발현과 세포 증식 사이의 반비례 관계는 이상조절된다(쇼커(Shoker) 등의 문헌[Amer. Jour. Path., 155:1811(1999)]). 침입성 유방암의 약 70％는 ER-α를 발현하고, 이들 종양중 대부분은 ER-α-양성 증식 세포를 함유한다(클라크 등의 문헌[Cancer Res., 57:4987(1997)]).
에스트로젠 수용체는 다수의 생리학적 과정을 제어하는 리간드-활성화된 전사 인자의 핵 수용체 상과의 일원이다. 이러한 제어는 종종 유전자 전사의 조절을 통해 일어난다(카체넬렌보젠(Katzenellenbogen) 및 카체넬렌보젠 의 문헌[Breast Cancer Res., 2:335(2000)]; 훌(Hull) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 276:36869(2001)]; 맥도넬(McDonnell) 및 노리스(Norris)의 문헌[Science, 296:1642(2002)]). 에스트로젠 수용체는 다수의 메카니즘을 사용하여 그의 표적 유전자의 전사를 활성화하거나 억제한다. 이러한 메카니즘으로는 (a) 에스트로젠 반응 요소에서의 리간드-점유(ligand-occupied) 수용체와 DNA의 직접 상호작용에 이어서, 전사 조절보체 또는 매개체 복합체의 보충, (b) 리간드-점유 ER과 다른 전사 인자(예: AP-1(쿠쉬너(Kushner) 등의 문헌[J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 74:311(2000)]), Sp1(사페(Safe)의 문헌[Safe, Vitam. Horm., 62:231(2001)]) 또는 NF-κB(맥케이(McKay) 및 시들로우스키(Cidlowski)의 문헌[Endocr. Rev., 20:435(1999)]))의 상호작용, 또는 (c) 일반적/공통 전사 성분의 격리에 의한 유전자 전사의 간접적 조정(하니쉬(Harnish) 등의 문헌[Endocrinology, 141:3403(2000)] 및 스페어(Speir) 등의 문헌[Circ. Res., 87:1006(2000)]). 또한, 이러한 다양한 메카니즘을 통해 전사를 조절하는 에스트로젠 수용체의 능력은, 아마도 각각의 세포 유형에서 이용가능한 전사 조절보조 인자의 보체의 차이로 인하여, 세포 유형 특이성인 것으로 보인다(체릴로(Cerillo) 등의 문헌[J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 67:79(1998)]; 에반스(Evans) 등의 문헌[Circ. Res., 89:823(2001)]; 마렛(Maret) 등의 문헌[Endocrinology, 140:2876(1999)]). 또한, 전사 조절은 리간드의 특질에 의존하는데, 다양한 천연 및 합성 선택적 에스트로젠 수용체 조정자는 상기 다양한 각 메카니즘을 통해 에스트로젠 수용체 작동약 또는 길항약으로서 작용한다(생(Shang) 및 브라운(Brown)의 문헌[Science, 295:2465(2002)]; 카체넬렌보젠 및 카체넬렌보젠의 문헌[Science, 295:2380(2002)]; 마기트(Margeat) 등의 문헌[J. Mol. Biol., 326:77(2003)]; 댕(Dang) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 278:962(2003)]).
'비표준적', '비게놈성' 또는 '막 신호전달' 경로라고도 알려진, 세포질 단백질, 성장인자 및 다른 막-개시성 신호전달 경로를 필요로 하는, 에스트로젠에 의해 매개되는 다른 신호전달 경로가 존재한다(세가스(Segars) 등의 문헌[Trends Endocrin. Met., 13:349(2002)]). 다음의 몇몇 세포간 신호전달 경로는 빠른 에스트로젠-개시성 효과를 신호방해하는 것으로 나타났다: 아데닐레이트 시클라제 경로(아로니카(Aronica) 등의 문헌[PNAS, 91:8517(1994)]), 포스포리파제 C 경로(르 멜라이(Le Mellay) 등의 문헌[J. Cell. Biochem., 75:138(1999)]), G-단백질-결합된 수용체-활성화 경로(라잔디(Razandi) 등의 문헌[Mol. Endocrin. 13:307(1999)]) 및 분열촉진인자 활성화된 단백질 키나제(mitogen activated protein kinase, MAPK) 경로(와터스(Watters) 등의 문헌[Endocrinology, 138:4030(1997)]). 그러나, 오늘날까지 기술된 모든 막 형태는 ER-β가 아니라 ER-α에 관한 것이다(세가스 등의 문헌[Trends Endocrin. Met., 13:349(2002)]).
에스트로젠 신호전달은 병리학적으로 유방암 및 자궁내막암에 대한 증가된 위험과 관련되었다(섬머(Summer) 및 푸쿠와(Fuqua)의 문헌[Semin. Cancer Biol., 11:339(2001)]; 터너(Turner) 등의 문헌[Endocr. Rev., 15:275(1994)]; 파하트(Farhat) 등의 문헌[FASEB J., 10:615(1996)]; 베아토(Beato) 등의 문헌[Cell, 83:851(1995)]; 도브르직카(Dobrzycka) 등의 문헌[Endo. Rel. Cancer, 10:517(2003)]). 따라서, 에스트로젠 수용체는 상기 암중 대부분의 개시 및 진행에 필수적인 것으로 밝혀졌다. 에스트로젠 수용체-양성 유방암에 대한 현재의 엔도크린 치료법은 주로 에스트로젠 수준, 에스트로젠 수용체 수준, 또는 에스트로젠 과 에스트로젠 수용체의 활성을 표적으로 하도록 설계된다. 초기 유방암의 관리에서 부분 항에스트로젠인 타목시펜을 사용하면, 비발병률 및 총 생존율이 둘다 증가하는 것으로 분명히 나타났다. 또한, 최근의 연구에 의하면, 타목시펜은 호르몬-의존성 유방암의 화학예방제로서 사용될 수 있다고 나타났다. 타목시펜에 의한 장기간 치료의 주된 걱정은 그의 자궁향성 효과인데, 이 효과는 자궁내막암의 위험을 증가시키고, 타목시펜에 대한 후천적 임상 저항성을 일으킨다. 이로써 다양한 에스트로젠 반응성 표적 조직에서 최적인 작동 또는 길항 활성을 나타내는 더 우수한 선택적 에스트로젠 수용체 조정자(selective estrogen receptor modulator, SERM)의 추적이 활발해졌다.
따라서, 필요한 것은 에스트로젠 신호전달을 조정하는 제제에 대한 선별에 사용될 수 있는 추가의 방법 및 물질, 및 에스트로젠 신호전달을 조정하는데 사용될 수 있는 방법 및 물질이다.
발명의 요약
본 발명은 서열 1에 서술된 아미노산 서열, 또는 그의 면역원성 단편, 바람직하게는 서열 1의 아미노산 13 내지 27번에 서술된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 임의로는, 항체는 인간화 항체이다. 항체는, 예를 들어 화학요법 제제 또는 검출가능한 마커(예: 형광 마커)와 같은 화합물에 공유결합할 수 있다. 항체는 조성물에 존재할 수 있고, 그 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체를 포함하는 키트(kit)가 또한 제공된다.
본 발명은 또한 항체의 제조 방법을 제공한다. 항체는 다클론성 또는 단클론성일 수 있다. 이 방법은 서열 1에 서술된 아미노산 서열, 또는 그의 면역원성 단편, 바람직하게는 서열 1의 아미노산 13 내지 27번에 서술된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 동물에게 투여함을 포함한다. 이 방법은 또한 동물로부터 항체를 단리함을 추가로 포함하고, 이때 단리된 항체는 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다. 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 소단위(subunit)는 운반 폴리펩티드에 공유 결합할 수 있다. 단리는 항체를 생성하는 세포를 동물로부터 얻고, 그 세포를 사용하여 단클론성-항체 생성 하이브리도마(hybridoma)를 만듬을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 이 방법에 의해 생성된 다클론성 항체 및 이 방법에 의해 생성된 단클론성 항체를 포함한다.
본 발명은 또한 서열 20을 포함한 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 암호화 영역을 포함하는 세포에 관한 것이다. 암호화 영역은 서열 20과 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 수 있는데, 폴리펩티드는 ER-α36 활성을 갖는다. 암호화 영역은 구성 프로모터에 조작가능하게 결합될 수 있다. 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포일 수 있다. 또한 본 발명에 의해 이러한 폴리펩티드를 발현하는 세포가 제공된다.
본 발명은 또한 폴리펩티드에 결합하는 제제를 확인하는 방법을 제공한다. 이 방법은 서열 1에 서술된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 제제를 혼합하고, 상기 제제와 폴리펩티드 사이의 복합체 형성을 검출하고, 폴리펩티드 또는 그의 혼합물의 활성 변화를 검출함을 포함한다. 폴리펩티드에 대한 제제의 결합은 폴리펩티드에 대한 제제의 결합을 직접 검출하거나, 경합 결합 검정을 사용하여 폴리펩티드 또는 그의 혼합물에 대한 제제의 결합을 검출하거나, 또는 이들을 병행함으로써 검출될 수 있다. 임의로는, 이 방법은 또한 제제가 서열 18을 포함한 폴리펩티드에 결합하는지를 결정함을 포함한다.
또한 본 발명에 의해 폴리펩티드를 검출하는 방법이 제공된다. 하나의 양상에서, 이 방법은 세포를 제공하고, 세포를 ER-α36 활성 및 36kDa의 분자량(나트륨 도데실 술페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 후 측정됨)을 갖는 폴리펩티드에 대하여 분석하고, 세포가 폴리펩티드를 발현하는지를 결정함을 포함한다. 세포는 생체외 또는 생체내일 수 있다. 세포는, 예를 들어 유방 종양 세포와 같은 종양 세포일 수 있다. 분석은 서열 1에 서술된 아미노산 서열 또는 그의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체와 세포를 접촉시킴을 포함할 수 있다. 분석은 mRNA 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜 증폭된 폴리뉴클레오티드를 형성함을 포함할 수 있다. 증폭은 세포로부터 얻은 폴리뉴클레오티드를, 서열 22 또는 서열 25를 포함하는 mRNA 폴리뉴클레오티드 또는 그의 혼합물을 증폭시킬 프라이머(primer) 쌍과 접촉시킴을 포함하고, 증폭된 폴리뉴클레오티드의 존재는 세포가 폴리펩티드를 발현함을 나타낸다. 프라이머 쌍중 하나의 프라이머는 서열 22의 뉴클레오티드, 서열 25의 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 세포의 ER-α36 활성을 저해하는 방법을 제공한다. 이 방법은 서열 1에 서술된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 세포를, ER-α36 활성을 저해하는 화합물과 접촉시킴을 포함한다. 이러한 화합물은 서열 1의 아미노산 13 내지 27번에 서술된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 세포는 생체내 또는 생체외일 수 있고, 임의로는 ER-α66 음성, ER-α46 음성, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 일부 양상에서, 이러한 화합물은 항에스트로젠성이 아니다.
또한, 본 발명에 의해 서열 1의 아미노산 13 내지 27번에 서술된 아미노산 서열, 바람직하게는 서열 1에 서술된 아미노산 서열, 더 바람직하게는 서열 20에 서술된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드이다. 다른 양상에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 20과 70％ 이상 동일하고, 폴리펩티드는 ER-α36 활성을 갖는다. 본 발명은 또한 서열 1의 면역원성 단편을 포함한다.
"포함한다"라는 용어 및 그의 변형어는 이들 용어가 상세한 설명 및 청구의 범위에 보이는 제한적 의미를 갖지 않는다. 달리 명시하지 않는 한, "하나의", "그" 및 "하나 이상"은 호환적으로 사용되고, 하나 또는 하나보다 많음을 뜻한다.
도 1은 인간 에스트로젠 수용체-알파(ER-α) 동형의 도메인 구조 표시를 설명한 것이다. 도메인(표지된 A-F), 아미노산 서열 번호부여, AF-1 및 AF-2, DNA 결합 도메인, 리간드-결합 도메인, 및 이량체화 도메인이 도시되어 있다. 포스포릴화 부위 및 각 도메인의 기능도 또한 지시되어 있다.
도 2는 막과 ER-α의 게놈 신호전달 경로 사이의 가능한 신호방해를 개략적으로 도시한다. Cav-1은 카베올린-1을 나타내고, ER-α는 에스트로젠 수용체-알파 를 나타내고, RTK는 수용체 티로신 키나제를 나타내고, Ras는 Ras 암유전자를 나타내고, Mek는 MAP/ERK 키나제를 나타내고, MAPK는 분열촉진인자 활성화된 단백질 키나제를 나타내고, PI3K는 포스포이노시톨-트리포스페이트 키나제를 나타내고, AKT는 단백질 키나제 13을 나타내고, PDK1은 포스포이노시톨-의존성 단백질 키나제를 나타내고, RSK는 p90 리보솜 S6 키나제를 나타낸다.
도 3은 pRET-유도성 MCF10A 세포가 연질 한천에서 에스트라디올(E2)의 존재하에 큰 콜로니를 증식시킴을 나타내는 사진이다. ST1 클론은 E2-함유 연질 한천에서 가속화된 증식을 나타낸다. MCF7 및 MCF10A 세포는 각각 양성 및 음성 대조군으로서 포함된다.
도 4는 pRET-감염된 MCF10A 세포에서의 카베올린-1(Cav-1) 발현의 하향조절을 나타내는 웨스턴 블롯(Western blot)이다. 여러 세포주로부터의 동일량의 총 세포 추출물을 토끼 항-Cav-1 항체(N20)를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. Cav-1의 위치를 화살표로 나타내고, 각각의 레인(lane)에서 분석된 세포 추출물을 상기 각 레인에 나타낸다.
도 5는 pRET-감염된 MCF10A 세포에서의 ER-α 발현의 상향조절을 나타내는 웨스턴 블롯이다. 다양한 세포주로부터의 동량의 총 세포 추출물을 ER-α에 대한 항체(H222) 및 ER-β에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. ER-α 및 ER-β의 위치를 화살표로 표시하고, 각 레인에서 분석된 세포 추출물을 각 레인의 위에 표시한다.
도 6은 pRET-감염된 MCF10A 세포에서 ERK1/2 포스포릴화의 활성화를 나타내 는 웨스턴 블롯이다. 세포주로부터의 동량의 총 세포 추출물을 ERK1/2 및 포스포릴화 ER-K1/2에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
도 7은 Cav-1 일배체-결핍(haploinsufficient) 세포, ST1 및 ST3, 및 MCF7 유방암 세포에서의 3가지 ER-α 단백질의 존재를 나타내는 웨스턴 블롯이다. 세포주로부터의 동량의 총 세포 추출물을 ER-α에 대한 H222 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. ER-α66, ER-α46 및 ER-α36의 위치를 화살표로 표시하고, 각 레인에서 분석된 세포 추출물을 각 레인의 위에 표시한다.
도 8은 인간 ER-α 유전자의 게놈 조직을 설명한다. 다수의 프로모터의 위치를 화살표로 나타낸다. 해독 개시 및 정지 부위는 AUG 및 UGA로 표시한다. 엑손은 번호가 매겨진 상자로서 나타낸다. 인트론(intron) 1은 또한 상자에 엑손 1'과 함께 나타낸다. 아래 부분은 ER-α 동형의 mRNA 구조를 나타낸다. 폴리 A 부위는 AAA로 표시한다.
도 9는 PCR에 의해 ER-α36의 개방형 해독틀을 암호화하는 cDNA의 단리를 나타내는 한천 겔의 사진이다. 겔에서 cDNA의 위치는 화살표를 표시한다.
도 10은 ER-α36의 개방형 해독틀의 예상 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 위치는 아미노산 서열(서열 20)의 왼쪽에 번호로 표시된다. ER-α36에 독특한 마지막 27개 아미노산이 밑줄 그어져 있다.
도 11은 ER-α66, ER-α46 및 ER-α36의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. ER-α66, ER-α46 및 ER-α36으로 표시된 레인은 표시된 에스트로젠 수용체 동형을 암호화하는 발현 플라스미드로 형질감염시키고 형질감염시킨 지 2일 후에 용해시킨 HEK 293 세포의 분리된 배양물을 나타낸다. 각 형질감염체의 용해물을 항-ER-α 항체(H222)로 면역검출하였다. MCF7 세포로부터의 세포 추출물을 양성 대조군으로서 사용하였다. ER-α66, ER-α46 및 ER-α36의 위치를 화살표로 표시한다.
도 12a는 ER-α36을 암호화하고 ER-α36 프로모터를 포함하는 유전자의 5' 근접 서열(서열 22)의 DNA 서열을 나타내고, 도 12b는 ER-α36을 암호화하고 엑손 9에 의해 암호화되는 뉴클레오티드를 포함하는 유전자의 3' 근접 서열(서열 25)의 DNA 서열을 나타낸다. 5' 근접 서열에서 추정의 전사 결합 부위가 밑줄 그어져 있고, 핵산 서열에 결합하는 단백질도 또한 표시되어 있다. cDNA의 시작 부위도 또한 화살표로 표시한다.
도 13은 상이한 유방암 세포 MCF10A, TA7D, MCF7 및 MDA-MB-231에서의 ER-α36의 노던 블롯(Northern blot) 분석을 나타낸다. ER-α36 및 액틴(actin)의 위치를 화살표로 표시한다.
도 14는 ER-α66 및 ER-β의 AF-1 및 AF-2 도메인에 의해 매개되는 전사 트랜스-활성화 작용의 ER-α36에 의한 저해를 나타낸다. (+E2)는 E2로 처리된 세포이고; (-E2)는 E2로 처리되지 않은 세포이다.
도 15a 내지 도 15d는 ER-α36이 E2에 의해 촉진되는 막-개시성 MAPK 키나제 경로를 매개함을 나타낸다. 도 15a에서 웨스턴 블롯은 ER36-293 세포를 에스트라디올-17β(E2β)로 처리하여 각각 Mek1/2 및 ERK1/2의 고속 포스포릴화를 유도함을 나타내고, P-Mek1/2 및 P-ERK1/2는 각각 Mek1/2 및 ERK1/2의 포스포릴화 형태이다. 도 15b에서는 혈청이 대조군 벡터-293 세포에서 ERK1/2의 포스포릴화를 유도하지 만, E2β는 그렇지 않다. P-ERK1/2는 ERK1/2의 포스포릴화 형태이다. 도 15c에서 상이한 에스트로젠 및 항에스트로젠은 ER36-293 세포에서 ERK1/2의 고속 포스포릴화를 유도함을 나타낸다. P-ERK1/2는 ERK1/2의 포스포릴화 형태이다. 도 15d는 타목시펜 처리가 ER36-293 세포에서 ERK1/2 포스포릴화를 구성적으로 촉진함을 나타내고, P-ERK1/2는 ERK1/2의 포스포릴화 형태이다.
도 16a 및 도 16b는 ER-α36이 E2β 유도된 MAPK 키나제 핵 신호전달을 매개하고 세포 증식을 촉진함을 나타낸다. 도 16a는 MAPK 키나제 핵 신호전달에 대한 E2β의 효과를 나타낸다. ER36-293 및 대조군 벡터-293 세포는 5×Gal4-LUC(5개의 Gal4 DNA 결합 부위를 함유하는 루시퍼라제 리포터(reporter) 플라스미드), 및 Gal4 DNA 결합 도메인(위쪽 부분)과 융합된 ELK 전사 활성화 도메인을 함유하는 Gal-ELK 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포 배양물을 에스트로젠 비함유 배지내에서 36시간동안 유지시킨 후, E2β(1nM 또는 10nM)를 12시간동안 첨가하였다. 표준 편차를 갖는 루시퍼라제 활성은 2번씩 수행한 3가지보다 많은 실험을 나타낸다. 도 17b에서 E2β 및 항에스트로젠은 ER36-293 세포의 증식을 촉진한다. 490㎚에서의 흡광도 데이터를 나타낸다. 5가지보다 많은 독립적 실험의 결과를 평균내었고; 평균 및 SEM을 나타낸다. 이들 결과의 통계학적 유의성은 또한 쌍체 t-검정(paired t-test)에 의해 평가하였다. P값은 ER36-293 및 벡터-293 세포의 경우 <0.001이었다.
도 17a 및 도 17b는 ER-α36이 주로 막에 근거하는 에스트로젠 수용체임을 나타낸다. 도 17a는 상이한 확립된 유방암 세포주에서의 ER-α36 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 동일한 블롯을 소거하고 항액틴 항체로 탐색하여 동일 부하를 확실히 하였다. 도 17b는 ER-α36 형질감염된 293 세포에서의 ER-α36의 세포내 정위를 나타낸다. ER-α36 특이성 항체를 갖는 상이한 세포내 분획내 ER-α36의 면역블롯(immunoblot)을 나타낸다. W는 전세포 용해물이고; PM은 세포막이고; C는 시토졸이고; N은 핵이다. 세포내 분획 순도는 세포막, 시토졸, 핵 및 골지체에 대한 다양한 단백질 마커를 면역블롯함으로써 검사하였다. 5' NT는 5' 뉴클레오티다제이고; D4-GDI는 GDP 해리 저해제이고; mSin3A는 히스톤 리모델링 복합체의 성분이고; COPB는 β 코팅 단백질이다.
도 18은 E2β가 연질 한천에서 ER-α66 음성 유방암 세포, MDA-MB-231의 증식을 촉진함을 나타낸다. MDA-MB-231 세포는 연질 한천에서 3주동안 E2β(0)의 부재하 및 10nM E2β(E2) 10nM E2β 및 10nM 타목시펜(E2+TAM) 및 10nM 타목시펜 단독(TAM)의 존재하에 증식되었다.
도 19는 E2β가 ER-α66 음성 유방암 세포 MDA-MB-231에서 막 개시성 에스트로젠 신호전달을 유도함을 나타낸다. 에스트라디올-17β(E2β)에 의한 MDA-MB-231 세포의 처리는 ERK1/2의 고속 포스포릴화를 유도하였다. 세포를 상이한 시간대에서 E2β(10nM)로 처리하고, 용해하고, 포스포릴화 의존성 및 비의존성 항체를 사용하는 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
카베올린-1(Cav-1) 시스템의 하향조절은 구성적으로 분열촉진인자 활성화된 단백질 키나제(MAPK)를 활성화하고, 에스트로젠 수용체-알파(ER-α)의 발현을 활성화하고, 양성 에스트로젠 신호전달을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견은, 처음으로, 활성화된 MAPK 신호전달과 유방 종양형성, 특히 에스트로젠에 의해 촉진되는 유방암 진행 사이에 분명한 관련을 제공하였다. 이 발견은 Cav-1이 MAPK와 에스트로젠 신호전달 경로 사이의 신호방해를 조정함으로써 유방 상피세포의 정상적인 증식을 유지시키는데 중요한 역할을 하고, 그의 하향조절은 결국 유방 종양형성을 일으키는 상기 두 중요한 경로의 이상조절의 원인이 될 수 있음을 강하게 나타낸다. 에스트로젠 신호전달 경로 및 MAPK 신호전달 경로의 개략도는 도 2에 제시되어 있다.
에스트로젠 수용체-알파 동형이 또한 확인되고 클론화되었다. 에스트로젠 수용체-알파의 이러한 36-kDa 동형(ER-α36)은 원래의 66-kDa ER-α(ER-α66) 유전자의 제1 인트론에 위치하는 프로모터로부터 생성된다. ER-α36은 전사 활성화 도메인(AF-1 및 AF-2)은 없으나 DNA-결합, 이량체화 및 대부분의 리간드-결합 도메인을 보유하기 때문에, ER-α66과 다르다. ER-α36의 구조는 ER-α36이 에스트로젠 신호전달의 조절자임을 나타낸다. ER-α36은 또한 세포막위, 및 시토졸과 핵내에서 주로 발현되기 때문에 에스트로젠 신호전달의 막 효과를 매개할 수 있다.
ER-β는 ER-α66 매개성 에스트로젠 신호전달의 구성적 조절자로서 제안되었다. AF-1 도메인이 결여된 ER-α46이 ER-α66으로 이량체화하고 ER-α66의 AF-1 도메인에 의해 매개되는 트랜스-활성화 작용을 저해할 수 있다는 발견은, ER-α46이 ER-α66의 AF-1 도메인에 의해 매개되는 기능적 활성에서 조절적 역할을 함을 나타낸다. 따라서, ER-α36은 ER-α66의 AF-1 및 AF-2 둘다에 의해 매개되는 생물학적 기능, 및 ER-α46의 AF-2 매개된 기능을 저해하는 것으로 생각된다. 상이한 조직에서 상이한 수준으로 발현될 수 있는 ER-α36 및 ER-α46에 의해 매개되는 조절에 있어서, ER-α66은 상이한 표적 조직에서 상이하게 기능할 수 있다. 이러한 메카니즘은 상이한 생물학적 과정에서 에스트로젠 신호전달의 다면적(pleiotrophic) 역할에 대한 설명을 제공하는 것으로 생각된다.
본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드유사체
본 발명은 폴리펩티드를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"란 용어는 넓게는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 둘 이상의 아미노산의 중합체를 가리킨다. 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이란 용어는 모두 폴리펩티드의 정의내에 포함되고, 이들 용어는 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 특정한 길이의 아미노산의 중합체를 내포하지 않고, 폴리펩티드가 재조합 기법, 화학적 또는 효소적 합성에 의해 생성되든지 또는 천연에 존재하든지를 뜻하거나 구별하지 않을 것이다. 본 발명의 범주에 속하는 폴리펩티드의 다수 예가 본원에 개시 및 기술되어 있다. 천연의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 경우에서, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 단리되고, 임의로는 정제되는 것이 바람직하다. "단리된" 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 자연 환경으로부터 분리되고 별개인 것이다. "정제된" 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 회합되어 있는 다른 성분들이 60％ 이상, 바람직하게는 75％, 가장 바람직하게는 90％가 없는 것이다. 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드가 천연에 존재하는 유기체의 밖에서 생성되는(예컨대, 화학적 또는 재조합 방법에 의해) 폴리펩티드 및 뉴클레오티드는, 자연 환경에서는 존재하지 않기 때문에, 당연히 단리되고 정제되어야 한다고 생각된다. "외인성 폴리펩티드"란 외래 폴리펩티드, 즉 세포내에 정상적으로 존재하지 않는 폴리펩티드, 또는 세포내에 정상적으로 존재하지만 실험 과정에 의해, 예컨대 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의해 세포내로 도입된 폴리펩티드를 가리킨다.
본 발명의 폴리펩티드는 생물학적으로 활성일 수 있다. 이러한 생물학적 활성을 본원에서 "ER-α36 활성"으로 부른다. 본 발명의 폴리펩티드가 생물학적으로 활성인지를 결정하는데 사용될 수 있는 생물검정법의 예는 이 폴리펩티드를 발현하는 세포를 에스트로젠 또는 항에스트로젠과 접촉시키고, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하지 않는 대조군 세포에서의 MAPK 활성에 비하여, 에스트로젠 또는 항에스트로젠의 존재하에, MAPK 경로의 활성이 증가 또는 감소하는지를 결정함을 포함한다. 바람직하게는, MAPK 활성은 ERK 1/2 및 Mek 1/2의 포스포릴화이고, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드에 의해 유도되는 ERK 1/2의 포스포릴화는 항에스트로젠의 존재하에 감소하지 않는다. 바람직하게는, ER-α36 활성은 막 개시성이다. ER-α36 활성은 ER-α36 활성을 가질 수 있는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 상이한 리간드에 노출시킴으로써 측정할 수 있다. 사용할 수 있는 리간드의 비제한적인 예로는 에스트론(E1), 17α-에스트라디올(E2α), 17β-에스트라디올(E2β), 에스트리올(E3), 에스테트롤(E4), 또는 막 불투과성 분자에 결합된 에스트로젠(예를 들어, 소 혈청 알부민(BSA))이 있다. 일반적으로, 측정되는 ER-α36 활성이 막 개시성 ER-α36 활성에 한정되는 경우, 막 불투과성 분자에 결합된 에스트로젠이 사용된다. 사용되는 에스트로젠의 양은 변할 수 있고, 바람직하게는 1nM 내지 10nM의 범위이다. 에스트로젠에 노출되는 세포는 바람직하게는 휴지기 세포이다. 5 내지 90분동안 노출시킨 다음, 세포를 용해시키고, 세포내에 존재하는 폴리펩티드를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분해시킨다. 분해된 폴리펩티드를 막으로 옮긴 후, ERK 1/2 및 Mek 1/2의 비포스포릴화 및 포스포릴화 형태에 대한 항체를 사용하여 MAPK 경로의 활성화를 평가한다. 임의로는, ERK 1/2의 포스포릴화가 항에스트로젠에 민감하지 않는지를 결정하기 위하여 타목시펜, 4OH-타목시펜 또는 ICI-182,780과 같은 항에스트로젠이 포함될 수 있다.
본 발명은 서열 20에 서술된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 이 폴리펩티드 및 본원에 기술된 관련 폴리펩티드를 또한 본원에서 ER-α36, ER-α 동형, 및 ER 수용체 α36-소단위로 부른다. 도 1에 도시된 바와 같이, ER-α36 동형은 아미노-말단 아미노 잔기 1 내지 183번, 카르복실-말단 아미노산 잔기 430 내지 595번이 없고, ER-α66 동형에 비하여 그의 C-말단에 27개의 아미노산 잔기가 부가되어 있다(도 1 참조). 에스트로젠 수용체 알파 이성질체로는 ER-α36, ER-α46, ER-α66이 있다. 에스트로젠 수용체 베타 이성질체로는 ER-β가 있다. 본 발명은 또한 ER-α36 동형을 포함하는 에스트로젠 수용체를 제공한다. 제한시키려는 것이 아니라, ER-α36 동형은 ER-α66, ER-α46 또는 ER-β와의 이량체를 형성함으로써 에스트로젠에 대한 세포의 반응을 에스트로젠 수용체 기능의 조절을 통해 조정하는 것으로 생각된다. 또한, ER-α36은 촉진 인자 1(AF-1) 및 촉진 인자 2(AF-2) 활성이 없는 것으로 생각되고, 따라서 ER-α36은 본질적인 전사 활성이 없다. 그러나, ER-α36은 ER-α36을 ER-α46, ER-α66 또는 ER-β와 이량체화시키는 완전 이량체화 도메인을 보유하는 것으로 생각된다. 이러한 상호작용은 ER-α36이 에스트로젠 수용체를 함유하는 ER-α46, ER-α66 및 ER-β의 활성을 조정하도록 하는 것으로 생각된다.
Figure 112006072778663-PCT00001
Figure 112006072778663-PCT00002
Figure 112006072778663-PCT00003
본 발명의 폴리펩티드는 서열 20에 70％ 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 폴리펩티드로는 서열 20에 70％보다 한 단위 비율 이상 많이 동일한, 예를 들어 서열 20에 71％, 72％, 73％ ... 100％ 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 바람직한 정도가 증가하는 순서로, 서열 20과 약 80％ 이상, 약 90％ 이상 또는 약 95％ 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 것을 포함한다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 생물학적으로 활성이다. 바람직하게는, 폴리펩티드의 분자량은 나트륨 도데실 술페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔상에서의 전기영동 후에 측정하였을 때 36kDa이다. 전형적으로, ER-α66의 포스포릴화에 관련된 잔기, 예컨대 S236, K302 및 K303은 보존되는데, 이들 잔기는 DNA 결합 도메인, 리간드 결합 도메인, 및 ER-α66의 이량체화 도메인의 기능에 관련되기 때문이다. DNA 결합, 리간드 결합 및(또는) 이량체화에서 기능하는 잔기는 당업계에 공지되어 있다.
두 폴리펩티드 서열 사이의 동일 비율은 일반적으로 두 아미노산 서열의 잔기를 정렬하여 이들의 서열의 길이를 따라 동일한 아미노산의 수를 최적화함으로써 결정하고; 동일한 아미노산의 수를 최적화하기 위하여 정렬시키는데 있어서 하나 또는 두 서열 사이에 끊김(gap)이 허용되지만, 각 서열의 아미노산은 그럼에도 불구하고 적당한 순서로 남아 있어야 한다. 바람직하게는, 타투소바(Tatusova) 등의 문헌[FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250(1999)]에 의해 기술되고 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html의 월드 와이드 웹(world wide web)에서 이용가능한 바와 같이, 블라스트(BLAST) 2 검색 알고리즘의 Blastp 프로그램(2.0.9판)을 사용하여 두 아미노산 서열을 비교한다. 바람직하게는, 모든 블라스트 2 검색 변수에 대하여 다음과 같은 초기설정 값이 사용된다: 매트릭스=BLOSUM62; 끊김 벌점(open gap penalty=11), 확장 끊김 벌점(extension gap penalty=1, 끊김 x_dropoff=50, 예상=10, 단어 크기=3, 및 임의로는 필터(filter) 켜짐. 블라스트 검색 알고리즘을 사용한 두 아미노산 서열의 비교에서, 구조적 유사성을 "동일성"이라고 부른다.
ER-α36 에스트로젠 수용체 동형의 단편인 폴리펩티드도 또한 본 발명에 의해 제공된다. 바람직하게는, 단편은 면역원성이다. 일부 양상에서, 단편은 ER-α36 활성을 갖는다. 면역원성 단편의 예는 서열 1의 아미노산 13 내지 27번, 더 바람직하게는 서열 1의 아미노산 1 내지 27번에 서술된 아미노산 서열이다. 이러한 단편은 ER-α36 에스트로젠 수용체 동형에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기에 유용하다. 단편의 예로는, 단편이 연속되는 5개 이상의 아미노산, 더 바람직하게는 연속되는 7개 이상의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 연속되는 10개 이상의 아미노산, 가장 바람직하게는 연속되는 12개 이상의 아미노산을 함유하기만 한다면, N-말단 또는 C-말단, 또는 둘다에서 하나 이상의 아미노산이 잘려진 에스트로젠 수용체 동형이 있다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 결합되는 운반 폴리펩티드를 갖는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 운반 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드의 용해도를 증가 또는 감소시키기 위하여 사용될 수 있다. 운반 폴리펩티드는 또한 융합 폴리펩티드의 면역원성을 증가시켜 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체의 생성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 운반 폴리펩티드를 본 발명의 폴리펩티드의 단편에 융합시켜 ER-α36에 특이적으로 결합하는 항체의 생성을 촉진할 수 있다. 이러한 단편의 예는 서열 1의 아미노산 13 내지 27번을 갖는 폴리펩티드이다. 본 발명은 본 발명의 융합 폴리펩티드를 생성하는데 사용되는 운반 폴리펩티드의 유형에 의해 제한되지 않는다. 운반 폴리펩티드의 예로는 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemacyanin), 소 혈청 알부민, 오브알부민, 쥐 혈청 알부민, 토끼 혈청 알부민 등이 있다. 운반 폴리펩티드는 또한 융합 폴리펩티드의 분리 또는 검출을 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 운반 단백질의 예로는 글루타치온-S-트란스페라제, 말토즈-결합 단백질, 치틴-결합 단백질, 및 다음의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 있다: QFFGLM(서열 2), EQKLISEEDL(서열 3), KAEDESS(서열 4), YPYDVPDYA(서열 5), DYKDDDDK(서열 6), YTDIEMNRLGK(서열 7), MASMTGGQQMS(서열 8), DTYRYI(서열 9), TDFYLK(서열 10), HHHHHH(서열 11), HPOL(서열 12), QYPALT(서열 13), QRQYGDVFKGD(서열 14), EYMPME(서열 15), EFMPME(서열 16), 및 RYIRS(서열 17). 따라서, 융합 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드의 운반 폴리펩티드 부분에 결합하는 다른 성분과의 상호작용에 의해 검출 또는 단리될 수 있다. 예를 들어, 운반 폴리펩티드로서 아비딘을 갖는 융합 폴리펩티드는 공지의 방법을 사용하여 비오틴에 의해 검출 또는 분리될 수 있다. 운반 폴리펩티드는 또한 융합 폴리펩티드가 세포내에서 발현될 때 봉입체를 형성하도록 사용될 수 있다. 운반 폴리펩티드는 또한 세포 밖으로 융합 폴리펩티드를 내보내거나, 또는 융합 폴리펩티드를 세포내의 구획(예: 세포질)로 보내는 보내기 신호일 수 있다.
본 발명은 또한 하나의 아미노산 쇄내로 연속적으로 연결되는 본 발명의 둘 이상의 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드를 본원에서 폴리펩티드라고 부른다. 폴리펩티드는 연결자(linker)에 의해 연결될 수 있다(스탈(Stahl) 등의 미국 특허 제6,558,924호 참조). 이러한 폴리펩티드는 단리된 다음, 절단되어 본 발명의 폴리펩티드 또는 결합된 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 폴리단백질은 화학적 또는 프로테아제 절단과 같은 다수의 방법을 사용하여 절단할 수 있다. 따라서, 연결자는 특정 프로테아제 또는 약품에 의해 절단되도록 설계될 수 있다. 본 발명의 폴리단백질을 절단하도록 사용될 수 있는 화합물의 예로는 약품 및 효소이다. 약품의 예로는 시아노젠 브로마이드, 포름산과 열, 히드록실아민과 열, 아세트산내 요오도소벤조산-2-(2-니트로페닐)-3-메틸-3-브로모인돌-닌 등이 있다. 효소의 예로는 Ala-64 섭틸리신, 클로스트리파인, 콜라게나제, 엔테로키나제, Xa 인자, 레닌, α-트롬빈, 트립신, 키모트립신, 토바코 에치(tobacco etch) 바이러스 프로테아제 등이 있다. 폴리단백질을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드의 생성 효율을 증가시킬 수 있다. 폴리단백질을 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(쿨리지(Coolidge) 등의 미국 특허 제6,127,150호 참조).
본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 연속 또는 불연속 아미노산의 부가, 치환 또는 결실에 의해 변경될 수 있거나, 또는 예컨대 리포터 기의 결합에 의해, N-말단, C-말단 또는 다른 작용기 변경 또는 유도체화에 의해, 또는 환화에 의해 화학적으로 또는 효소적으로 변경된 유사체를 포함하며, 단 유사체는 생물학적 활성을 보유하고 있거나 ER-α36에 결합하는 항체의 생성을 촉진할 수 있다. 따라서, 유사체가 폴리펩티드의 말단중 하나 또는 둘다에 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 유사체는 면역원성이고, 더 바람직하게는 유사체는 면역원성이고 ER-α36 활성을 갖는다. 일부 양상에서, 본 발명은 유사체가 아닌 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드내 아미노산의 치환은 바람직하게는 그 아미노산이 속하는 부류의 다른 원들중에서 선택되는 보존성 치환이다. 예를 들어, 특정 크기 또는 특징(예: 전하, 친수성 및 소수성)을 갖는 아미노산의 군에 속하는 아미노산은 일반적으로 폴리펩티드의 구조를 실질적으로 변화시키지 않고 다른 아미노산으로 치환될 수 있음이 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신이 있다. 극성 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 있다. 양전하의(염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 있다. 음전하의(산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산이 있다. 바람직한 보존성 치환의 예로는 양전하를 유지하기 위하여 Arg 대신 Lys 및 그 반대를 포함하고; 음전하를 유지하기 위하여 Asp 대신에 Glu 및 그 반대를 포함하고; 자유 -OH가 유지되도록 Thr 대신에 Ser을 포함하고; 자유 NH2를 유지하도록 Asn 대신에 Gln을 포함한다. 관련 아미노산(예: 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린, 호모시스테인, 2-아미노아디프산, 2-아미노피멜산, γ-카르복시글루탐산, β-카르복시아스파르트산), 아미노산 아미드(오르니틴, 호모아르기닌, N-메틸 리신, 디메틸 리신, 트리메틸 리신, 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산, 호모아르기닌, 사르코신 및 히드록실리신) 및 치환된 페닐알라닌, 노르류신, 노르발린, 2-아미노옥탄산, 2-아미노헵탄산, 스타틴, β-발린, 나프틸알라닌, 테트라히드로이소퀴논린-3-카르복실산, 및 헬로겐화 티로신이 유사한 아미노산으로 교환되었다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 펩티드유사체를 제공한다. 펩티드유사체는 하나 이상의 펩티드 결합이 비펩티드 결합(예: 약학 산업에서 비펩티드 약물로서 흔히 사용되는 것)으로 대체된 폴리펩티드를 기술하고, 그 특성은 주형 폴리펩티드의 특성과 유사하다(파우체레(Fauchere)의 문헌[J. Adv. Drug Res., 15:29(1986)], 에반스(Evans) 등의 문헌[J. Med. Chem., 30:1229(1987), 및 잔다(Janda) 등의 미국 특허 제6,664,372호). 펩티드유사체는 펩티드 결합을 갖는 폴리펩티드와 구조적으로 유사하지만, 당업계에 공지된 방법에 의해 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO-와 같은 연결기에 의해 임의로 대체되는 하나 이상의 펩티드 연결기를 갖는다. 천연 폴리펩티드 실시양태에 비하여 펩티드유사체의 이점으로는 더 경제적인 생산, 더 큰 내약품성, 변화된 특이성 및 증진된 약리학적 특성(예: 반감기, 흡수율, 역가 및 효능)이 있을 수 있다.
폴리펩티드 또는 펩티드유사체내의 하나 이상의 아미노산을 동일한 유형의 D-아미노산으로 치환하는 방법을 사용하여, 예를 들어 내인성 프로테아제에 더 안정하고 더 내성인 폴리펩티드 및 펩티드유사체를 생성할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드유사체는 생체내 사용하기 위하여 아미노-말단 및(또는) 카르복실-말단에서 생체내 분해를 감소시키기 위한 차단제의 첨가에 의해 변경될 수 있다. 이는 폴리펩티드 말단이 생체내에서 프로테아제에 의해 분해되는 경향이 있는 상황에서 유용할 수 있다. 이러한 차단제는 본 발명의 폴리펩티드 또는 펩티드유사체의 아미노 및(또는) 카르복실 말단 잔기에 결합될 수 있는 추가의 관련되거나 관련되지 않은 펩티드 서열을 비제한적으로 포함할 수 있다. 이는 화학 합성중에, 또는 당업자에게 익숙한 방법에 의해 재조합 DNA 기법에 의해 이루어질 수 있다. 또 다르게는, 피로글루탐산과 같은 차단제, 또는 당업계에 공지된 다른 분자를 아미노 및(또는) 카르복실 말단 잔기에 결합시킬 수 있거나, 또는 아미노 말단의 아미노 기 또는 카르복실 말단의 카르복실 기를 상이한 잔기로 대체할 수 있다. 따라서, 본 발명은 차단된 폴리펩티드 및 펩티드유사체, 아미노 말단, 카르복실 말단, 또는 이들의 혼합물을 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 백터로 형질전환되는 세포 또는 미생물을 비제한적으로 포함하는 다수의 발현 시스템을 사용하여 소규모 또는 대규모로 생성될 수 있다. 이러한 재조합 벡터 및 그의 사용 방법을 이후 기술한다. 이러한 벡터를 사용하여 다양한 유기체를 형질전환시킬 수 있다. 이러한 균주의 예로는 세균(예를 들어, 이 콜리(E. coli) 또는 비 서브틸리스(B. subtilis)); 효모(예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 피치아(Pichia)); 곤충(예를 들어, 바쿨로바이러스); 식물; 또는 포유동물 세포(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, VERO, HeLa, MDCK, W138, 및 NIH 3T3 세포)가 있다. 벡터로 형질감염된 포유동물로부터 직접 얻은 1차 또는 2차 세포도 또한 숙주 세포로서 유용하다.
본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드유사체를 생성하기 위하여 합성 방법이 또한 사용될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 일상적이다. 예를 들어, 고상 펩티드 합성 방법은 확립되어 있고 널리 사용되는 방법이다. 폴리펩티드는 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카겔 또는 음이온-교환 수지(예: DEAE)상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱(chromatofocusing); SDS-PAGE; 암모늄 술페이트 침전; 예를 들어 세파덱스(Sephadex) G-75를 사용하는 겔 여과; 리간드 친화성 크로마토그래피 등에 의해 쉽게 정제될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 융합 폴리펩티드를 분리 매질에 결합시킨 후, 융합 폴리펩티드를 절단하여 정제된 폴리펩티드를 유리시킴으로써 쉽게 정제할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드와 운반 폴리펩티드 사이에 Xa 인자 절단 부위를 포함하는 융합 폴리펩티드가 생성될 수 있다. 융합 폴리펩티드를 융합 폴리펩티드의 운반 폴리펩티드 부분이 결합하는 친화성 칼럼에 결합시킬 수 있다. 그 다음, 융합 폴리펩티드를 Xa 인자로 절단하여 폴리펩티드를 유리시킬 수 있다. 이러한 시스템을 본 발명의 폴리펩티드의 정제를 위한 Xa 인자 제거 키트와 함께 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. "폴리뉴클레오티드"란 용어는 넓게는 5'→3' 배향으로 공유 결합된 둘 이상의 뉴클레오티드의 중합체를 가리킨다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 암호화 서열, 및 비암호화 서열(예: 조절성 서열)을 포함하는, 상이한 기능을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 암호화 서열, 비암호화 서열 및 조절성 서열을 이하에 규정한다. 폴리뉴클레오티드 및 상기 용어의 정의에 포함되는 핵산, 핵산 분자 및 올리고뉴클레오티드 및 단백질이란 용어는 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 뉴클레오티드의 특정한 길이의 중합체를 내포하지 않고, 폴리뉴클레오티드가 재조합 기법, 화학적 또는 효소적 합성에 의해 생성되든지 또는 천연이든지를 뜻하거나 구별하지 않을 것임은 물론이다.
폴리뉴클레오티드는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있고, 상보적인 제2 가닥의 서열은 제1 가닥의 서열에 의해 결정된다. 따라서, "폴리뉴클레오티드"란 용어는 넓게는 단일가닥의 핵산 중합체, 그의 상보체 및 그에 의해 형성된 듀플렉스(duplex)를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 폴리뉴클레오티드의 "상보성"이란 두 단일가닥 폴리뉴클레오티드의 서로 염기쌍 짓는 능력을 가리키고, 이때 하나의 폴리뉴클레오티드의 아데닌은 또 다른 폴리뉴클레오티드의 티미딘(또는 RNA의 경우에는 우라실)과 염기쌍 지을 것이고, 하나의 폴리뉴클레오티드의 시티딘은 또 다른 폴리뉴클레오티드의 구아닌과 염기쌍 지을 것이다. 두 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 또 다른 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 지을 수 있을 때 서로 상보성이다. 예를 들어, 5'-ATGC 및 5'-GCAT는 완전 상보성이고, 5'-GCTA 및 5'-TAGC도 마찬가지이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 예는 서열 21이다(표 1 참조, 또한 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 234-1166번은 진뱅크(GeneBank) 수탁번호 BX640939호에 존재하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 234-1166번). 본 발명의 바람직한 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 "실질적으로 상보성인" 뉴클레오티드 서열, 또는 이러한 뉴클레오티드 서열의 상보체를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "실질적으로 상보성인" 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기쌍 불일치를 포함할 수 있지만, 두 폴리뉴클레오티드는 여전히 히브리드화 능력을 가질 것이다. 예를 들어, 두 DNA 분자 5'-AGCAAATAT 및 5'-ATATATGCT 각각의 중간 뉴클레오티드는 염기쌍 짓지 않을 것이지만, 이들 두 폴리뉴클레오티드는 본원에서 규정된 바와 같이 실질적으로 상보성이다. 두 폴리뉴클레오티드는 이들이 55℃에서 2×SSC(SSC: 150mM NaCl, 15mM 트리나트륨 시트레이트, pH 7.6)에 의해 예시되는 히브리드화 조건하에 히브리드화한다면 두 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 상보성이다. 본 발명을 위하여 실질적으로 상보성인 폴리뉴클레오티드는, 바람직하게는 공유 영역의 뉴클레오티드 동일성이 60％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 더 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상인 20개 이상의 뉴클레오티드 길이의 하나 이상의 영역을 공유한다. 특히 바람직한, 실질적으로 상보성인 폴리뉴클레오티드는 다수의 이러한 영역을 공유한다. 바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 서열 21에 70％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 더 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 서열 21에 70％보다 한 단위 비율 이상 많이 동일한, 예를 들어 서열 21에 71％, 72％, 73％ ... 100％ 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 더욱 더 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 서열 21에 80％ 이상, 90％ 이상 또는 95％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 가장 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 서열 21에 100％ 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 서열 21에 70％ 이상 동일한 폴리뉴클레오티드는 ER-α36 활성을 갖는다.
두 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 동일한 비율은 일반적으로 두 폴리뉴클레오티드 서열의 염기를 정렬하여 이들의 서열의 길이를 따라 동일한 염기의 수를 최적화함으로써 결정하고; 동일한 염기의 수를 최적화하기 위하여 정렬시키는데 있어서 하나 또는 두 서열내에 끊김이 허용되지만, 각 서열의 염기는 그럼에도 불구하고 적당한 순서로 남아 있어야 한다. 바람직하게는, 타투소바 등의 문헌[FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250(1999)]에 의해 기술되고 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html의 월드 와이드 웹에서 이용가능한 바와 같이, 블라스트 2 검색 알고리즘의 Blastn 프로그램(2.0.11판)을 사용하여 두 폴리뉴클레오티드 서열을 비교한다. 바람직하게는, 모든 블라스트 2 검색 변수에 대하여 다음과 같은 초기설정 값이 사용된다: 일치 가산점=1, 불일치 감점=-2, 끊김 벌점=5, 확장 끊김 벌점=2, 끊김 x_dropoff=50, 예상=10, 단어 크기=11, 및 임의로는 필터 켜짐. 두 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 서열 동일성의 정위 및 수준은 또한 www.ebi.ac.uk/clustalw/의 월드 와이드 웹에서 이용할 수 있는 CLUSTALW 다중 서열 정렬 소프트웨어(톰슨(J. Thompson) 등의 문헌[Nucl. Acids Res., 22:4673-4680(1994)])를 사용하여 쉽게 결정할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 천연 게놈 또는 cDNA 뉴클레오티드 서열 전부 또는 그의 일부를 함유하는 폴리뉴클레오티드에 한정되지 않지만, 유전학적 암호의 다의성(degeneracy)의 결과로서 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 부류의 폴리뉴클레오티드를 포함함은 물론이다. 예를 들어, 천연 폴리뉴클레오티드 서열인 서열 21은 아미노산 서열 20을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 부류의 오직 하나의 일원이다. 선택된 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 부류는 크지만 한정되어 있고, 이 부류의 각 일원의 뉴클레오티드 서열은 표준의 유전학적 암호를 참조하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 이때 동일한 아미노산을 암호화하는 상이한 뉴클레오티드 트리플렛(triplet)(코돈)은 공지되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 "암호화"하는 폴리뉴클레오티드는 임의로는 암호화 영역 및 비암호화 영역을 둘다 포함하며, 따라서 달리 반대로 명확하게 기술하지 않는 한, 폴리펩티드를 "암호화"하는 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 암호화하지만 암호화 영역 밖(즉, 5' 또는 3'→암호화 영역)의 다른 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는 뉴클레오티드 서열에 구조적으로 한정되지 않는다. "암호화 영역" 또는 "암호화 서열"은 폴리펩티드를 암호화하고 적당한 조절성 서열의 제어하에 놓일 경우 암호화된 폴리펩티드를 발현하는 뉴클레오티드 서열이다. 암호화 영역의 경계는 일반적으로 그의 5' 말단의 해독 개시 코돈 및 그의 3' 말단의 해독 정지 코돈에 의해 결정된다. "외인성 암호화 영역"이란 외래 암호화 영역, 즉 세포내에 정상적으로 존재하지 않는 암호화 영역, 또는 세포내에 정상적으로 존재하지만 실험 과정에 의해 세포내로 도입되거나, 정상적으로 조작가능하게 연결되지 않은 조절성 영역에 조작가능하게 연결되거나, 이들이 혼합된 암호화 영역을 가리킨다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 위상학적으로 선형 또는 원형일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 벡터의 일부일 수 있다. 벡터는 추가의 클론화(폴리뉴클레오티드의 증폭), 즉 벡터의 클론화를 제공하거나, 또는 암호화 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 즉 발현 벡터의 발현을 제공할 수 있다. 백터는 비제한적으로 플라스미드, 파지미드(phagemid), F-인자, 바이러스, 코스미드 또는 파지를 포함할 수 있다. 벡터는 이중가닥 또는 단일가닥의 선형 또는 원형 형태일 수 있다. 벡터는 또한 세포내 게놈내로의 삽입에 의해 원핵 또는 진핵 숙주를 형질전환시킬 수 있거나 염색체외 존재한다(예컨대, 복제 기점을 갖는 자율 복제 플라스미드로서). 벡터내의 폴리뉴클레오티드는 시험관내 또는 숙주세포(예: 진핵 세포 또는 미생물, 예컨대 세균)내 전사를 위한 적당한 프로모터 또는 다른 조절성 서열의 지배하에 있을 수 있고, 조작가능하게 연결될 수 있다. 진핵 세포의 바람직한 예로는 MDA-MB-231, Hela, CHO, 및 MCF10A 세포주가 있다. 조절성 서열 또는 조절성 영역이란 암호화 서열의 상류에, 암호화 서열내에 또는 암호화 서열의 하류에 위치하고 암호화 서열에 조작가능하게 연결되어 있는 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 조절성 서열의 예로는 증진자, 프로모터, 해독 선도 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 신호 서열이 있다. 이들은 합성 및 천연 서열의 혼합일 수 있는 서열 뿐만 아니라 천연 서열 및 합성 서열을 포함한다. 조절성 서열은 프로모터에 한정되지 않는다. 그러나, 본 발명에서 유용한 일부 적합한 조절성 서열은 비제한적으로, 구성 프로머터, 조직-특이성 프로모터, 발생-특이성 프로모터, 유도성 프로모터 및 바이러스성 프로모터를 포함할 것이다. "조작가능하게 연결되어 있다"라는 용어는 성분들이 이들을 소기의 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계이 있도록 하는 성분들의 병렬 상태를 가리킨다. 조절성 서열은 암호화 영역의 발현이 조절성 서열과 양립성인 조건하에 달성되는 방식으로 연결될 때 암호화 영역에 "조작가능하게 연결된다".
벡터는 다수의 숙주에서 기능하는 셔틀 벡터(shuttle vector)일 수 있다. 벡터는 또한 외래 DNA 서열이 결정가능한 방식으로 삽입될 수 있는 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위중 하나 또는 소수를 전형적으로 함유하는 클론화 벡터일 수 있다. 이러한 삽입은 암호화 벡터의 본질적인 생물학적 기능의 손실없이 일어날 수 있다. 클론화 벡터는 또한 클론화 벡터로 형질전환된 세포의 동정 및 선택에 사용하기에 적합한 마커 유전자를 함유할 수 있다. 마커 유전자의 예는 테트라사이클린 내성 또는 암피실린 내성이다. 많은 클론화 벡터는 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, 스트라타진(Stratagene), 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 클론테크(Clonetech)). 벡터는 발현 벡터내로 삽입되는 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 조절성 서열을 함유하는 발현 벡터일 수 있다. 다수의 벡터가 상업적으로 입수가능하고 당업계에 공지되어 있다(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진; 미국 매사츄세츠주 비벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스). 발현 벡터는 시험관내 전사 및 해독 분석평가에 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 벡터내로 도입하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, N. Y.(2001)]). 간단하게는, 폴리뉴클레오티드가 삽입될 벡터를 하나 이상의 제한 효소(제한 엔도뉴클레아제)로 처리하여 평활 말단, 5' 또는 3' 돌출부를 갖는 "점성" 말단, 또는 이들의 임의의 혼합물을 갖는 선형화된 벡터를 생성한다. 벡터는 또한 제한 효소로 처리하고 이어서 다른 변경 효소(예: 폴리머라제, 엔도뉴클레아제, 포스파타제 또는 키나제)로 처리하여, 폴리뉴클레오티드의 벡터내로의 연결에 유용한 특징을 갖는 선형화된 벡터를 생성할 수 있다. 벡터내로 삽입되는 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 제한 효소를 처리하여, 평활 말단, 5' 또는 3' 돌출부를 갖는 "점성" 말단, 또는 이들의 임의의 혼합물을 갖는 선형화된 분절을 생성한다. 폴리뉴클레오티드는 또한 제한 효소로 처리하고 이어서 다른 DNA 변경 효소로 처리할 수 있다. 이러한 DNA 변경 효소로는 비제한적으로 폴리머라제, 엑소뉴클레아제, 포스파타제 또는 키나제가 있으며, 폴리뉴클레오티드의 벡터내로의 연결에 유용한 특징을 갖는 폴리뉴클레오티드를 생성한다.
그 다음, 처리된 벡터 및 폴리뉴클레오티드를 함께 연결하여 당업계에 공지된 방법에 따라 폴리뉴클레오티드를 함유하는 구조물을 형성한다(샘브룩 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y.(2001)]). 간단하게는, 처리된 핵산 단편 및 처리된 벡터를 적합한 완충제 및 리가제의 존재하에 혼합한다. 그 다음, 혼합물을 적당한 조건하에 배양하여 리가제가 핵산 단편을 벡터내로 연결시키도록 한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법 및 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 생물학적, 효소적 및 화학적 방법, 및 이들의 혼합 방법을 포함하고, 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 표준의 재조합 DNA 기법을 사용하여 숙주세포에서 발현시킬 수 있거나, 폴리뉴클레오티드는 세포-비함유 RNA계 시스템을 사용하여 효소적으로 시험관내 합성될 수 있거나, 또는 폴리뉴클레오티드는 고상 펩티드 합성과 같은 화학적 기법을 사용하여 합성될 수 있다. 재조합 DNA 기법이 사용되는 경우, 숙주세포는, 예를 들어 세균 세포, 완전 세포, 효모 세포, 또는 포유동물 세포일 수 있다.
본 발명은 또한 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명의 프로모터는 서열 22에 서술된 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 일부를 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명의 프로모터는 서열 22에 70％보다 한 단위 비율 이상 많이 동일한, 예를 들어 서열 22에 71％, 72％, 73％ ... 100％ 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 동일성 비율을 결정하는 방법은 본원에 기술되어 있다. 더욱 더 바람직하게는, 프로모터는 서열 22에 80％ 이상, 90％ 이상 또는 95％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 본 발명의 프로모터는 에스트로젠 수용체(ER) 조절 활성을 갖는다. 본원에 사용되는 바와 같이, ER 조절성 활성이란 ER-α66의 존재하에, 바람직하게는 에스트로젠에 결합된 ER-α66의 존재하에, 조작가능하게 연결된 암호화 영역의 증가된 발현을 가리킨다. 본 발명의 프로모터는 에스트로젠 의존성 및 비의존성 방식으로 발현된다. 본 발명의 프로모터는 마커 폴리펩티드를 포함한 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 영역에 조작가능하게 연결될 수 있다. 마커 폴리펩티드의 예로는 검출가능한 마커(예를 들어, 형광 단백질, 효소, 항원성 마커 등) 및 선택가능한 마커(약물 내성, 약물 민감성 또는 영양 결핍을 일으키거나, 또는 영양 결핍 등을 고치는 폴리펩티드)가 있다.
항체
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드유사체에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드에 "특이적으로 결합할 수 있는" 항체는 항체의 합성을 유도한 항원의 항원결정기와만 상호작용하거나, 또는 구조적으로 관련된 항원결정기와 상호작용하는 항체이다. 항원결정기에 "특이적으로 결합하는" 항체는 적당한 조건하에, 심지어 다양한 가능한 결합 표적의 존재하에 항원결정기와 상호작용할 것이다. 일부 양상에서, 본 발명의 항체는 ER-α36 또는 그의 일부에 특이적으로 결합하고, ER-α66 또는 ER-α46에는 특이적으로 결합하지 않는다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드유사체 및 이들의 단편을 항원으로서 사용하여 베르테브레이트 항체, 히브리드 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 변화된 항체, 일가 항체, 단클론성 및 다클론성 항체, Fab 단백질, 및 단일 도메인 항체를 포함한 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 서열 1 또는 그의 단편을 갖는 폴리펩티드(예: 서열 1의 아미노산 13-27번)를 사용하여 ER-α36에 특이적으로 결합하는 항체를 생성할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 펩티드유사체, 또는 이들의 단편은 이들을 면역원성 운반체(예: 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민, 오브알부민, 마우스 혈청 알부민, 토끼 혈청 알부민 등)에 공유 결합시킴으로써 변경시킬 수 있다.
다클론성 항체가 바람직하다면, 선택된 동물(예컨대, 쥐, 토끼, 염소, 말 또는 조류(예: 닭))을 바람직한 항원으로 면역화할 수 있다. 면역화된 동물로부터 혈청을 수집하고 공지의, 일상적인 방법에 따라 처리한다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 다클론성 항체를 함유하는 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 함유한다면, 다클론성 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 다클론성 항혈청을 생성하고 가공하기 위한 기법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 할로우(Harlow) 등의 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pub. 1988] 참조).
본 발명의 폴리펩티드 또는 펩티드유사체 또는 이들의 단편에 대한 단클론성 항체는 또한 당업자에 의해 쉽게 생성될 수 있다. 하이브리도마에 의해 단클론성 항체를 제조하는 일반적인 방법론은 널리 공지되어 있다(예를 들어, 할로우 등의 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pub. 1988] 참조). 죽지 않는 항체-생성 세포주(하이브리도마)는 세포 융합에 의해 또한 종양원성 DNA에 의한 B 림프구의 직접 형질전환 또는 엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스에 의한 형질감염과 같은 다른 기법에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드유사체에 대하여 생성된 단클론성 항체의 군을 다양한 특성에 대하여, 예를 들어 항원결정기 친화성에 대하여 선별할 수 있다. 항체를 제조하기 위한 다른 널리 공지된 방법은 파지 표시 기법의 사용을 포함한다(예를 들어, 케이(Kay) 등의 문헌[Pharge display of peptides and proteins: A laboratory manual. San Diego: Academic Press(1996)] 참조).
본 발명의 항체는 "인간화된" 단클론성 항체로부터 유도될 수 있다. 인간화된 단클론성 항체는 쥐 면역글로불린의 가변적인 중쇄 및 경쇄로부터의 쥐 상보성 결정 영역을 인간의 가변성 도메인내로 옮긴 다음, 틀 영역내의 인간 잔기를 쥐 상대잔기로 치환함으로써 생성될 수 있다. 인간화된 단클론성 항체로부터 유도된 항체 성분의 용도는 쥐의 일정 역역의 면역원성과 관련된 가능한 문제들을 미연에 방지한다. 쥐의 면역글로불린 가변성 도메인을 클론화하기 위한 일반적인 기법(올란디(Orlandi) 등의 문헌[Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86:3833(1989)]), 및 인간화된 단클론성 항체를 생성하기 위한 기법(존스(Jones) 등의 문헌[Nature, 321:522(1986)]; 리흐만(Riechmann) 등의 문헌[Nature, 332:323(1988)]이 기술되어 있다.
본 발명의 항체 단편은 항체의 단백질분해성 가수분해를 포함하는 일상적인 공지의 방법에 의해 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 이 콜리내 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체 단편은 통상의 방법에 의해 전 항체의 분해(예를 들어, 펩신 또는 파파인에 의한)에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 항체를 펩신으로 효소적 절단하여 F(ab')2로 표시되는 5S 단편을 제공하여 생성할 수 있다. 이러한 단편은 티올 환원제를 사용하고, 임의로는 디술파이드 연결기의 절단에 의해 술프히드릴 기에 대한 차단기를 사용하여 추가로 절단하여 3.5S Fab' 1가 단편을 생성할 수 있다. 또 다르게는, 펩신을 사용한 효소적 절단에 의해 두개의 1가 Fab' 단편 및 Fc 단편이 직접 생성된다.
단편이 완전 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한, 항체를 절단하는 다른 방법, 예를 들어 중쇄를 분리하여 1가의 경-중쇄 단편을 형성하는 방법, 단편의 추가 절단 방법 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전학적 기법을 사용할 수 있다.
항체를 선별하여 이들이 결합하는 항원결합기의 신원을 결정할 수 있다. 항원결정기는 항체의 항원결합부위가 결합하는, 본 발명의 폴리펩티드와 같은 항원위의 부위를 가리킨다. 항원결정기는 일반적으로 분자(아미노산 또는 당 측쇄)의 화학 활성 표면 군으로 이루어지고, 특별한 3차원 구조 특징 및 특정한 전하 특징을 가질 수 있다. 항원결정기를 동정하는데 사용될 수 있는 방법은 당업계에 공지되어 있다(할로우 등의 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, page 319(Cold Spring Harbor Pub. 1988)] 참조).
항체를 본 발명의 폴리펩티드 또는 펩티드유사체에 특이적으로 결합하는 그의 능력에 대하여 선별할 수 있다. 예를 들어, ER-α46 또는 ER-α66 동형이 아니라 ER-α36 동형 또는 그의 일부에 특이적으로 결합하는 항체는 당업계의 일상적인 방법을 사용하여 선택될 수 있다(기타지마(Kitajima) 등의 미국 특허 제6,534,281호 및 할로우 등의 문헌[[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pub. 1988] 참조).
본 발명의 항체는 다양한 화합물에 결합될 수 있다. 이러한 화합물의 예로는 검출가능한 마커가 있다. 이러한 검출가능한 마커의 예로는 항체를 검출하게 하는 형광 마커, 효소, 방사성 동위원소 등이 있다(예: 아비딘 또는 비오틴). 검출가능한 마커에 항체를 결합시키는 방법 및 유용한 검출가능한 마커는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 항체는 ER-α36의 검출을 위한 자동화 시스템내에서 유용하다. 항체는 화학치료제에 공유 결합될 수 있다. 유방암 및 전립선암과 같은 암의 치료에 유용한 화학치료제는 당업계에 공지되어 있다. 화학치료제의 예로는 센트크로만, 델마디논 아세테이트, 드롤록시펜, 이독시펜, 타목시펜, 랄록시펜, 토레미펜, 비스포스포네이트인 훌베스트란트 및 파슬로덱스, 칼시토닌, 트리볼론, 부갑상선 호르몬 또는 스트론튬 라넬레이트가 있다. 다른 예로는 시토킨, 또는 독소(예: 디프테리아 독소 A 쇄)가 있다.
조성물
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드, 펩티드유사체, 또는 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 전형적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학 투여와 상용성인 식염수, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균제 및 항진균제, 등장성 흡수 지연제 등을 포함한다. 추가의 활성 화합물을 또한 조성물내로 도입할 수 있다.
본 발명의 조성물은 정제, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 수용액, 현탁액 및 리포솜 및 다른 서방형 제형(예: 형상화된 중합체 겔)을 포함하는 다수의 형태로 제조될 수 있다. 경구 투여 형태는 폴리펩티드, 펩티드유사체 또는 항체가 위를 통과한 후 소장으로 방출되도록 제형화될 수 있다. 이러한 제형화는 홍(Hong) 등의 미국 특허 제6,306,434호 및 그안에 함유된 참조문헌에 기술되어 있다.
경구 액체 조성물은, 예를 들어 수성 또는 오일상 현탁액, 용액, 유화액, 시럽 또는 엘릭서르(elixir)의 형태일 수 있거나, 또는 사용하기 전에 물 또는 다른 적합한 부형테로 구성되는 건조 제품으로서 제공될 수 있다. 이러한 액체 조성물은 통상의 첨가제, 예를 들어 현탁제, 유화제, 비수성 부형제(식용 오일을 포함할 수 있는) 또는 방부제를 함유할 수 있다.
조성물은 비경구 투여(예컨대, 주사, 예를 들어 농축괴 주사 또는 연속 주입에 의해)를 위해 제형화될 수 있고, 앰풀, 예비충전된 주사, 방부제가 첨가된 소체적 주입 용기 또는 다수회 투여 용기내 단위 투여형에 존재할 수 있다. 조성물은 오일상 또는 수성 부형제내 현탁액, 용액 또는 유화액과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정화제 및(또는) 분산제와 같은 배합제를 함유할 수 있다.
직장 투여에 적합한 조성물은 단위 투여 좌제로서 제조될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체로는 식염수 용액에 의해 예시되는 것 및 당업계에서 흔히 사용되는 기타 물질이 있다.
흡입에 의한 투여에 있어서, 조성물은 흡입기, 분무기, 또는 에어로졸 분사기를 전달하기 위한 가압 팩 또는 기타 편리한 수단으로부터 편리하게 전달될 수 있다. 가압 팩은 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 기체와 같은 적합한 분사제를 포함할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위하여 밸브를 제공함으로써 쉽게 결정될 수 있다.
또 다르게는, 흡입 또는 통기에 의한 투여에 있어서, 조성물은 건조 분말 조성물(예를 들어, 조절제의 분말 믹스(mix)) 및 적합한 분말 베이스(예: 락토즈 또는 전분)의 형태를 취할 수 있다. 분말 조성물은, 예를 들어 캡슐 또는 카트리지, 예컨대 분말이 흡입기 또는 통기기에 의해 투여될 수 있는 젤라틴 또는 투명포장내 단위 투여형으로 존재할 수 있다. 비내 투여에 있어서, 조성물은 플라스틱 병 분무기와 같은 액체 스프레이에 의해 투여될 수 있다.
조성물은 경피 투여를 위해 제형화될 수 있다. 조성물은 또한 수성 용액, 현탁액 또는 분산액, 수성 겔, 유중수형 유화액, 또는 수중유형 유화액으로서 제형화될 수 있다. 경피 제형은 또한 조성물을 중합체내에 캡슐화함으로써 제조할 수 있다. 투여형은 로션, 크림, 고약과 같이 피부에 직접 적용되거나, 또는 패치(patch)의 사용에 의해 적용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 향료, 색소, 항균제 및 방부제와 같은 기타 성분을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 호르몬, 항괴사제, 혈관확장제, 약학 제제 등과 같은 약학 활성 성분들을 포함할 수 있다.
이러한 조성물의 독성 및 치료 효능은, 예컨대 LD50(집단의 50％를 치사시키는 양) 및 ED50(집단의 50％에서 치료유효적인 양)을 결정하기 위하여, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준의 약학 과정에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 투여량 비는 치료 지수이고, 이는 LD50/ED50로서 표현할 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.
세포 배양물 분석 및 동물 실험으로부터 얻어진 데이터를 인간에게 사용하기 위한 일정한 투여량을 제형화하는데 사용할 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없이 ED50을 포함하는 일정한 순환 농도내에 있다. 투여량은 사용된 투여형 및 사용되는 투여 경로에 따라 좌우되는 상기 범위내에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 화합물에 있어서, 치료유효량은 처음에 세포 배양물 분석으로부터 어림잡을 수 있다. 투여량은 동물 모델에서 세포 배양물에서 결정된 IC50(즉, 증상의 반-최대 저해를 이루는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 얻도록 제형화될 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 인간에게 유용한 투여량을 더 정확하게 결정할 수 있다. 혈장내 수준은, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 하나의 양상에서, 인간에게 사용하기 위한 투여량 범위는 10μM 이상, 바람직하게는 25μM 이상, 더 바람직하게는 50μM인 혈청 농도를 일으키기에 충분한 양이다.
조성물은 1일 1회 이상 내지 1주일에 1회 이상(격일에 1회 포함) 투여될 수 있다. 당업자라면, 질환 또는 장애의 위중도, 사전 치료, 환자의 전체적인 건강 및(또는) 연령 및 존재하는 다른 질환을 포함하여(비제한적으로), 환자를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 적당한 시기에 임의의 인자가 영향을 줄 수 있음을 알 것이다. 또한, 환자의 유효량의 조성물로의 처리는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
검출 방법
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 전형적으로 세포를 제공하고, 이 세포를 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 분석하고, 세포가 폴리펩티드를 발현하는지를 결정함을 포함한다. 세포는 생체외 또는 생체내일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "생체외"란 용어는 분리된, 예를 들어 환자의 몸으로부터 단리된 세포를 가리킨다. 생체외 세포는, 예를 들어 1차 세포(예컨대, 환자로부터 최근에 제거하고 조직 배양 배지에서 제한된 증식 또는 유지가 가능한 세포) 및 배양 세포(예컨대, 조직 배양 배지에서 연장된 증식 또는 유지가 가능한 세포)를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "생체내"란 용어는 환자의 체내에 있는 세포를 가리킨다. 생체내 세포는 기관 또는 종양내에 존재하는 세포일 수 있다. 세포는 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들어 쥐, 설치류, 또는 영장류(예컨대, 원숭이, 인간), 바람직하게는 인간이다. 세포의 바람직한 예로는 유방 세포(예: 유방 종양 세포) 및 전립선 세포(예: 전립선 종양 세포)가 있다. 세포는, 예를 들어 인간 유방 또는 전립선 조직의 생검에 의해 환자로부터 얻을 수 있다. 거의 임의의 유형의 조직으로부터 얻어진 샘플을 사용할 수 있다. 대조군 세포를 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내 배양할 수 있다. ER-α36 kDa 에스트로젠 수용체를 발현하지 않고 따라서 음성 대조군으로서 사용될 수 있는 세포로는 HEK293 세포가 있다. 양성 대조군 세포로는 혈청의 존재하에 낮은 세포밀도로 증식된 세포, 및 BRCA1 음성 세포가 있다. 바람직하게는, 세포는 혈청의 존재하에 낮은 밀도로 증식된다. 대조군 세포는 또한 예를 들어 생검을 통해 조직 샘플로부터 얻을 수 있다.
하나의 양상에서, 본 방법은 세포를 본 발명의 항체와 접촉시킴으로써 세포를 분석함을 포함한다. 세포가 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는지의 여부는 당업계에서 일상적으로 공지되어 있는 검출 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 면역검정의 예로는 방사면역검정, 면역효소 검정, 면역형광 검정 또는 효소면역측정 검정과 같은 경합성 및 비경합성 측정법이 있다. 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 또는 다른 화학발광 검출 제제를 사용하는 화학발광 방법을 또한 사용할 수 있다. 웨스턴 블로팅 및 크로마토그래피 분석은 또한 본 발명의 방법내에서 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 검출하는데 사용되는 본 발명의 항체를 검출가능한 마커에 결합시킴으로써 질접 검출될 수 있거나, 또 다른 항체를 사용할 수 있다. 세포의 상이한 구역에서 폴리펩티드의 검출을 허용하는 검출 방법이 사용되는 경우, ER-α36을 발현하는 세포는 전형적으로, 폴리펩티드가 주로 세포막 및 세포질과 회합되어 있고 신호의 20％ 미만이 핵과 회합되어 있을 때 ER-α36 양성으로 간주된다.
다른 양상에서, 본 방법은 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 RNA 폴리뉴클레오티드(예컨대, mRNA)를 증폭시켜 증폭된 폴리뉴클레오티드를 형성함으로써 세포를 분석함을 포함한다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 연쇄중합반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해, 바람직하게는 역전사효소(reverse transcriptase, RT) PCR에 의해 증폭된다. RNA 폴리뉴클레오티드로부터 DNA 폴리뉴클레오티드를 합성하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며 일상적이다. 세포로부터 얻어진 폴리뉴클레오티드를, 서열 22 또는 서열 25 또는 이들의 혼합 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 프라이머 쌍과 접촉시킨다. 이러한 프라이머 쌍으로부터 생성된 증폭된 폴리뉴클레오티드의 존재는 세포가 에스트로젠 수용체를 발현시킴을 나타낸다. 본원에 사용되는 바와 같이, "프라이머 쌍"이란 용어는 증폭될 폴리뉴클레오티드의 영역의 측면에 위치하도록 계획된 두 올리고뉴클레오티드를 가리킨다. 하나의 프라이머는 증폭될 폴리뉴클레오티드의 하나의 말단에서 센스(sense) 나선에 존재하는 뉴클레오티드에 상보성이고, 증폭될 폴리뉴클레오티드의 다른 말단의 안티센스(antisense) 나선에 존재하는 뉴클레오티드에 상보성이다. 증폭될 폴리뉴클레오티드를 주형 폴리뉴클레오티드라고 부를 수 있다. 프라이머가 상보성인 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드를 표적 서열이라고 부를 수 있다. 프라이머는 약 15개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 약 25개 이상의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 폴리펩티드를 PCR에 의해 증폭시키기 위한 조건은 사용된 프라이머의 뉴클레오티드 서열 및 이러한 조건을 결정하는 방법은 당업계에 일상적이다.
증폭 후, 증폭된 폴리뉴클레오티드의 존재는, 예를 들어 겔 전기영동에 의해 결정될 수 있다. 증폭된 폴리뉴클레오티드는 염색(예컨대, 에티듐 브로마이드) 또는 당업자에게 공지되어 있는 적합한 표지로 표지함으로써 가시화된다. 전형적인 방사능 표지로는 33P가 있다. 비방사능 표지의 예로는 리간드(예: 비오틴 또는 디곡시제닌) 및 효소(예: 포스파타제 또는 퍼옥시다제), 또는 다양한 화학발광(예: 루시페린) 또는 형광 및 그의 유도체와 같은 형광 화합물이 있다.
임의로는 세포내에서의 ER-α66 폴리펩티드, ER-α46 폴리펩티드, ER-β, 또는 이들의 혼합물의 존재도 또한 결정될 수 있다. ER-α66, ER-α46, ER-β, 또는 이들의 혼합물의 존재를 검출하는 방법은 항체를 사용하는 면역학적 검출 방법 또는 폴리뉴클레오티드 기반 검출 방법(예: 폴리뉴클레오티드의 증폭)의 사용을 포함한다. 세포의 상이한 구역에서의 폴리펩티드의 검출을 허용하는 검출 방법을 사용하는 경우, ER-α66 또는 ER-α46을 발현하는 세포는, 폴리펩티드가 주로 세포의 핵과 관련되어 있을 때(예를 들어, 90％보다 많은 신호가 핵과 관련됨) 전형적으로 ER-α66 또는 ER-α46 양성인 것으로 간주된다.
모든 유방암의 약 70 내지 80％는 ER-α66을 발현하고, ER-양성 유방암으로 불린다. 이러한 종양은 일반적으로 더 천천히 증식하고, 더 잘 분화하고, 더 우수한 전체적인 예후와 관련된다(클라크, 해리스(Harris JR)의 문헌[Diseases of the breast, volume 2. Lippincott Williams ＆ Wilkins, 38:103-116(2000)]). 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법은 에스트로젠-양성 및 에스트로젠-음성 암, 바람직하게는 유방암을 구별하는 진단용 마커로서 유용하다. 본원의 실시예에 개시된 결과는 ER-α36에 의해 매개되는 에스트로젠 신호가 유방 종양형성의 원인이 됨을 강력하게 지적하고, ER-α36이 ER-α66 음성 유방암의 종양형성에 관련될 수 있음을 제안한다. 본원의 실시예에 개시된 결과는 본 발명의 폴리펩티드를 고도로 발현하는 세포가 더 낮은 투여량의 항에스트로젠(예를 들어, 타목시펜)에 대하여 더 높은 수준의 ER-α66 및 더 낮은 수준의 ER-α36을 발현하는 세포보다 더 내성이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위한 방법은 신규한 부류의 환자, 즉 ER-α66 음성 및 ER-α36 양성 환자의 확인을 허용한다. 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위한 방법은 또한 항에스트로젠에 대한 세포의 민감성을 결정하고, 예를 들어 개인의 적당한 치료 과정의 결정에 관련되는 정보를 제공함에 있어서 유용하다. 예를 들어, 주치의는 ER-α36 양성 유방 종양 세포를 갖는 환자가 더 낮은 수준에 대한 내성을 극복하기 위하여 더 높은 투여량의 타목시펜을 필요로 할 수 있다고 결정할 수 있다.
ER-α66, ER-α46, ER-α36, ER-β, 또는 이들의 혼합물의 존재의 검출은 또한 에스트로젠 수용체의 비를 비교할 수 있게 한다. 둘 이상의 에스트로젠 수용체의 비를 결정하면 항에스트로젠(예를 들어, 타목시펜)에 대한 세포의 민감성을 예상할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 양상에서 세포내 ER-α36 대 ER-α46의 비, ER-α36 대 ER-α66의 비, ER-α36 대 ER-β의 비, 또는 이들의 혼합을 결정하고, 대조군 세포내의 상응하는 비와 비교한다. 이러한 비를 본원에서 ER-α36 비라고 부른다. 하나의 실시예에서, 대조군 세포는 항에스트로젠에 의한 치료에 저항력이 없는 세포이다. 시험 세포에서 결정된 전술된 ER-α36 비가 대조군 세포에서 기술된 ER-α36 비와 동일하다면, 시험 세포는 대조군 세포의 상태에 따라 분류된다. 예를 들어, 시험 세포의 ER-α36 대 ER-α66 비가 타목시펜 치료에 저항력이 있는 것으로 알려진 대조군 세포의 ER-α36 대 ER-α66 비와 같다면, 시험 세포는 타목시펜 치료에 저항력이 있는 것으로 분류된다. 그러나, 시험 세포의 ER-α36 대 ER-α66 비가 타목시펜 치료에 저항력이 없는 대조군 세포의 ER-α36 대 ER-α66 비와 같다면, 시험 세포는 타목시펜 치료에 저항력이 없는 것으로 분류된다. 다른 실시예에서, 시험 세포에서 결정된 ER-α36을 타목시펜 치료에 저항력이 있는 것으로 알려진 대조군 세포의 상응하는 비와 비교하고, 타목시펜 치료에 저향력이 없는 것으로 알려진 대조군 세포의 비와 비교한다. 그 다음, 시험 세포는 전술된 바와 같이 타목시펜 처리에 저항력이 있는 것으로, 또는 타목시펜 치료에 저항력이 없는 것으로 분류된다. 타목시펜 치료에 저항력이 없는 것으로 알려진 대조군 세포의 예는 MCF7(ATTC 콜렉션(ATTC Collection) 수탁번호 HTB-22)이다. 소투여량의 타목시펜 치료에 저향력이 있는 것으로 알려진 대조군 세포의 예는 MDA-MB-231이다. 타목시펜 치료에 저항력이 있는 것으로 알려진 유방암 세포는 또한 시험 세포의 ER-α36 비를 비교함으로써 대조군 세포로서 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 제제의 확인
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 제제를 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 또한 선별 검정으로서 불린다. 이 방법은 본 발명의 폴리펩티드를 제제와 혼합하고, 그 제제가 폴리펩티드에 결합하는지를 결정함을 포함한다. 전형적으로, 제제가 폴리펩티드에 결합하는지를 결정하는 것은 제제와 폴리펩티드간의 복합체의 형성을 검출함을 포함한다. 복합체를 결정하는 방법은, 예를 들어 폴리펩티드에 대한 제제의 결합을 직접 검출하고, 경합 결합 분석법을 사용하여 폴리펩티드에 대한 제제의 결합을 검출함을 포함한다. 분석은 에스트로젠 또는 항에스트로젠의 존재 또는 부재하에 수행될 수 있다. 임의로는, 이 방법은 또한 제제가 ER-α66 폴리펩티드, 예를 들어 서열 18에 서술된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합하는지를 결정함을 포함한다. 바람직하게는, 제제는 ER-α66 폴리펩티드에 결합하지 않는다.
제제는 당업계에 공지된 조합 라이브러리(combinatorial library)(생물학적 라이브러리, 공간적으로 주소화가능한(addressable) 평행 고상 또는 용액상 라이브러리, 역승(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법, "하나의 비드 하나의 화합물" 라이브러리 방법, 및 친화성 크로마토그래피 선택을 사용하는 합성 라이브러리 방법 포함)에서 임의의 다수의 시도를 사용하여 제제를 얻을 수 있다. 생물학적 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리를 포함하지만, 다른 네 접근법은 펩티드, 비펩티드 올리고머, 또는 화합물의 소분자 라이브러리에 적용가능하다(램(Lam)의 문헌[AnticancerDrug Des. 12:145(1997)]). 분자 라이브러리의 합성 방법의 예는 당업계에서 찾을 수 있다(예를 들어, 드위트(DeWitt) 등의 문헌]Proc. Natl. Aca. Sci. USA 90:6909(1993)]; 에르브(Erb) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422(1994)]; 주커만(Zuckermann) 등의 문헌[J. Med. Chem. 37:2678(1994)]; 조(Cho) 등의 문헌[Science 261:1303(1993)]; 캐럴(Carrell) 등의 문헌[Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059(1994)]; 카렐(Carell) 등의 문헌[Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061(1994)]; 갤럽(Gallop) 등의 문헌[J. Med. Chem. 37:1233(1994)] 참조). 선별되는 가능한 제제의 출처로는, 예를 들어 세균 및 진균의 발효 배지, 식물 및 다른 초목의 세포 추출물이 있다.
화합물의 라이브러리는, 예를 들어 용액내에(예컨대, 호크텐(Houghten)의 문헌[Bio/Techniques 13:412(1992)]), 또는 비드(램의 문헌[Nature 354:82-84(1991)]), 조각(포도르(Fodor)의 문헌[nature 364:555-556(1993)]), 세균(미국 특허 제5,223,409호), 포자(미국 특허 제5,571,698호; 제5,403,484호; 및 제5,223,409호), 플라스미드(쿨(Cull) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869(1992)], 또는 파지(스코트(Scott) 등의 문헌[Science 249:386-390(1990)]; 데블린(Devlin)의 문헌[Science 249:404-406(1990)]; 퀄라(Cwirla) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382(1990)]; 및 펠리치(Felici)의 문헌[J. Mol. Biol. 222:301-310(1991)])상에 제공될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 제제의 능력을 결정하는 것은, 예를 들어 복합체내 표지된 화합물을 검출하여 본 발명의 폴리펩티드에 대한 제제의 결합을 결정할 수 있도록 제제를 방사성동위원소 또는 효소 표지와 결합시킴으로써 이행될 수 있다. 예를 들어, 제제는 125I, 35S, 14C 또는 3H(직접적으로 또는 간접적으로), 및 방사성방출의 직접 계수 또는 섬광 계수에 의해 검출되는 방사성동위원소로 표지될 수 있다. 또 다르게는, 제제는 예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제 또는 루시퍼라제로 효소적으로 표지될 수 있고, 효소 수준은 적당한 기질의 생성물로의 변환을 결정하여 검출할 수 있다.
유사한 방식으로, 폴리펩티드의 공지의 리간드, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드가 결합하거나 상호반응하는 분자에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합을 변화시키는(예컨대, 자극하거나 저해하는) 제제의 능력을 결정할 수 있다. 이러한 리간드의 예는 에스트로젠, 및 항에스트로젠(예: 타목시펜)이다. 바람직한 양상에서, 리간드에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합을 변화시키는 제제의 능력은 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 모니터링(monitoring)함으로써 결정할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 분석법은 본 발명의 폴리펩티드를 제제와 접촉시키고, 폴리펩티드에 결합하는 제제의 능력을 결정함을 포함한다. 폴리펩티드에 대한 제제의 결합은 전술된 바와 같이 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다. 바람직한 양상에서, 분석법은 본 발명의 폴리펩티드를, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 것으로 알려진 리간드와 접촉시켜 분석 혼합물을 형성시키고, 분석 혼합물을 제제와 접촉시키고, 리간드에 비하여 폴리펩티드에 우선적으로 결합하는 제제의 능력을 결정함을 포함한다.
다른 양상에서, 분석법은 본 발명의 폴리펩티드를 제제와 접촉시키고, 본 발명의 폴리펩티드의 활성(예컨대, 자극하거나 저해하는)을 변화시키는 제제의 능력을 결정함을 포함한다.
추가의 양상에서, 분석은 예를 들어 ER-α66의 AF-1 및(또는) AF-2 도메인에 의해 매개되는 활성을 포함하여 에스트로젠 반응 요소의 전사 트랜스-활성화를 조절하는 본 발명의 폴리펩티드의 능력을 변화시키는(예를 들어, 촉진하거나 저해하는) 제제에 대한 선별을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제자 도메인을 갖는 폴리펩티드가 사용된다. 전사 활성화 도메인을 갖는 폴리펩티드의 예는 VP-16이고, 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제자 도메인을 갖는 다른 유용한 폴리펩티드가 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 융합 폴리펩티드는 프로모터의 상류의 에스트로젠 반응 요소 및 조작가능하게 연결되는 암호화 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 함께 사용된다. 예를 들어, 티미딘 키나제 프로모터를 포함한 다양한 프로모터가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 조작가능하게 연결된 암호화 영역은 검출가능한 마커(예: 루시퍼라제) 또는 형광 폴리펩티드(예: 초기 형광 단백질)를 암호화한다. 하나의 양상에서, 전사 활성화 도메인을 갖는 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 제제를 제제의 부재하에 폴리뉴클레오티드에 존재하는 암호화 영역의 발현을 촉진하는 조건하에 혼합하고, 전사를 변화시키는 제제의 효과를 결정한다. 임의로는, ER-α66 폴리펩티드 및(또는) ER-β 폴리펩티드가 존재할 수 있고, ER-α66 폴리펩티드 또는 ER-β의 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 전사 활성을 조절하는 본 발명의 폴리펩티드의 능력을 변화시키는(예컨대, 촉진하거나 저해하는) 제제를 확인하는데 상기 분석을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 프로모터의 상류에 에스트로젠 반응 요소 및 조작가능하게 연결된 암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 세포에 존재한다. 제한하려는 것이 아니라, 전사 트랜스-활성화를 조절하는 본 발명의 폴리펩티드의 능력을 변화시키는 제제는 능력을 증가시키거나 감소시키도록 본 발명의 폴리펩티드의 구조를 변화시키는 제제를 포함할 수 있다.
분석에서, 본 발명의 폴리펩티드, 그의 리간드, 또는 하나 또는 두 분자의 비착화 형태로부터 착화 형태의 분리를 촉진하는 제제를 고정화하고, 분석의 자동화를 도모하는 것이 바람직할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드를 매트릭스에 결합시키는 도메인을 첨가하는 융합 단백질을 제공할 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 갖는 융합 폴리펩티드를 글루타티온 세파로스 비드(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼(Sigma Chemical) 또는 글루타티온-유도체화 미세적정 평판상에 흡착시킨 다음, 제제와 혼합시키고, 이 혼합물을 복합체 형성에 도움이 되는 조건하에 배양한다(예컨대, 염을 위한 생리학적 조건 및 pH). 배양 후, 비드 또는 미세적정 평판 웰을 세척하여 임의의 비결합된 성분을 제거할 수 있고, 복합체 형성을, 예를 들어 전술된 바와 같이 직접적으로 또는 간접적으로 측정한다. 또 다르게는, 매트릭스로부터 복합체를 해리시킬 수 있고, 결합 수준을 결정할 수 있다.
본 발명의 선별 분석에 매트릭스에 폴리펩티드를 고정화하기 위한 다른 기법을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 비오틴 및 스트렙타비딘의 접합을 사용하여 고정화할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 널리 공지된 기법(예컨대, 미국 일리노이주 락포드 소재의 피어스 케미칼스(Pierce Chemicals)의 비오티닐화 키트)으로 비오틴-NHS(N-히드록시-숙신이미드)를 사용하여 비오티닐화할 수 있고, 예를 들어 스트렙카비딘-코팅된 96-웰 평판의 웰에 고정화할 수 있다. 또 다르게는, 본 발명의 폴리펩티드와 반응성인 항체를 평판 웹에 유도체화하고, 본 발명의 비결합된 폴리펩티드를 항체 접합에 의해 웰내에 포획할 수 있다. 이러한 복합체를 검출하는 방법으로는, GST-고정화 복합체에 대하여 기술된 것 이외에, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체와 반응성인 항체를 사용하는 복합체의 면역검출법이 있다.
본 발명은 또한 전술된 선별 분석에 의해 동정되는 신규 제제, 및 본원에 기술된 바와 같은 치료를 위한 그의 용도를 포함한다.
치료 방법
본 발명은 또한 환자의 임의의 질환을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 환자는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 본원에 사용된 바와 같이, "질환"이란 용어는 환자의 일부분, 기관 또는 시스템, 또는 이들의 혼합물의 정상적인 구조 또는 기능으로부터의 임의의 이탈 또는 이들의 중단을 가리킨다. 질환은 스테로이드 호르몬 수용체, 예를 들어 에스트로젠 수용체를 경유한 신호에 의존하는 암을 포함한다. 이러한 암의 예는 에스트로젠 관련 암으로 불리고, 유방암 및 전립선암을 포함한다. 전형적으로, 환자가 질환이 있는지 및 환자가 치료에 반응하는지 여부는 질환과 관련된 증상의 평가에 의해 결정한다. 본원에 사용된 바와 같이, "증상"이란 용어는 환자에 존재하는 질환의 객관적인 증거를 가리킨다. 본원에 언급된 질환에 관련된 증상 및 이러한 증상의 평가는 당업계에서 일상적이며 공지되어 있다. 스테로이드 호르몬 수용체를 경유하는 신호에 의존하는 암 증상의 예로는, 종양의 존재 및 크기, 및 생물지표의 존재 및 양이 있다. 생물지표는 환자에 존재하는 화합물, 전형적으로는 폴리펩티드이고, 암의 진행을 나타낸다. 생물지표의 예로는 Her-2 발현, 및 사이클린 D1 발현이 있다.
질환의 치료는 예방적이거나, 또 다르게는 질환의 발병 후에 개시될 수 있다. 환자가 질환의 증상을 나타내기 전에 개시되는 예방적인 치료는, 예를 들어 질환이 발병할 "위험"에 있는 환자의 치료로서 본원에 언급된다. 질환이 발병할 위험에 있는 환자의 예는 질환과 관련된 위험인자(예: 유전학적 마커)를 갖는 사람이다. 환자가 유방암 또는 전립선암과 같은 임의의 암을 발병시키는 경향을 가짐을 나타내는 유전학적 마커의 예로는 BRAC1 및(또는) BRAC2 유전자가 있다. 치료는 본원에 기술된 질환의 발병 전에, 발병중에 또는 발병 후에 수행될 수 있다. 질환의 발병 후에 개시되는 치료는 하나의 상태의 증상의 위중도를 감소시키거나 그 증상을 완전히 제거할 수 있다.
일부 양상에서, 본 방법은 전형적으로 세포를 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 저해하는 유효량의 제제, 예를 들어 본원에 기술된 방법을 사용하여 동정된 제제와 접촉시킴을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 제제는 본 발명의 폴리펩티드에 결합한다. 일부 양상에서, 제제는 바람직하게는 항에스트로젠이 아니다. 본원에 사용되는 바와 같이, "유효량"이란 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 세포내에서 저해하거나, 질환과 관련에 증상을 감소시키거나, 또는 이들을 함께 나타내기에 유용한 양이다. 하나의 양상에서, 조성물은 유효량의 본 발명의 항체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 타목시펜과 같은 화학치료제에 공유 결합된다. 조성물은 임의로는 다른 화학치료제를 포함할 수 있다. 제제 또는 항체, 바람직하게는 항체가 본 발명에서 기능할 것으로 예상되는지 여부는 생체외 모델 및 동물 모델을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 모델은 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 질환의 전형 또는 인간을 치료하는 방법으로서 인정된다. 이러한 동물 모델의 바람직한 예는 무모 쥐이다. 예를 들어, 유방암 세포를 난소 적출된 암컷 무모(nude) 쥐의 유방 팻패드(fatpad)에 접종하고, 병변을 형성하고, 예를 들어 촉진, 버니어 캘리퍼스(vernier calipers)에 의한 측정, 및 종양 중량에 의해 평가할 수 있다. 유전자이식 동물 모델이 또한 이용가능하다. 예를 들어, TRAMP 모델과 같은 전립선암의 연구를 위한 모델(예를 들어, 그린버그(Greenberg) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:2429-3443(1995)] 참조) 및 MMTV-Wnt-1 모델과 같은 유방암(예를 들어, 쓰카모토(Tsukamoto) 등의 문헌[Cell, 55:619-625(1988)] 참조)의 연구를 위한 모델이 인간 질환의 모델로서 흔히 인정된다.
다른 양상에서, 세포를 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물과 접촉시키는데, 이때, 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 영역의 전사후 휴지(silencing)를 일으킨다. 휴지 폴리뉴클레오티드를 RNA 폴리뉴클레오티드로서, 또는 RNA 폴리펩티드를 암호화하고 발현할 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서 세포내로 도입할 수 있다. 하나보다 많은 유형의 폴리뉴클레오타드를 투여할 수 있다. 예를 들어, 동일한 mRNA를 유지시키도록 설계된 둘 이상의 폴리뉴클레오티드를 혼합하고 본원의 방법에 사용할 수 있다. 또 다르게는, 폴리뉴클레오티드각 각각 상이한 mRNA를 유지시키도록 설계되는 경우 둘 이상의 폴리뉴클레오티드를 함께 사용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드"란 용어는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태, 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드 또는 이들의 혼합물을 가리키고, 단일가닥 분자 및 이중가닥을 둘다 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 천연 공급원으로부터 직접 얻을 수 있거나, 또는 재조합, 효소적 또는 화학적 기법에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 단리한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "표적 암호화 영역" 및 "표적 암호화 영역"이란 그 발현이 휴지 폴리뉴클레오티드에 의해 저해되는 암호화 영역을 가리킨다. 본원에 사용되는 바와 같이, "표적 mRNA"는 표적 암호화 영역에 의해 암호화되는 mRNA이다. 표적 암호화 영역의 예는, 엑손 9에 의해 암호화되는 뉴클레오티드 서열(서열 25)을 포함하여, ER-α36을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열 21), 5' 근접 뉴클레오티드(서열 20), 또는 3'측 뉴클레오티드 서열이다.
휴지 폴리뉴클레오티드는 이중가닥 RNA(dsRNA) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 휴지 폴리뉴클레오티드의 서열은 본원에서 센스(sense) 가닥으로 불리는, 16 내지 30개의 뉴클레오티드(예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드)의 하나의 가닥을 포함한다. 센스 가닥은 표적 mRNA에 실질적으로 동일하고, 바람직하게는 동일하다. 본원에 사용되는 바와 같이, "동일"이란 용어는 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열이 표적 mRNA의 일부와 동일한 뉴클레오티드 서열을 가짐을 뜻한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 동일한"이란 용어는 센스 가닥의 서열이 표적 mRNA의 서열과 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 1개의 뉴클레오티드가 다르고, 나머지 뉴클레오티드는 mRNA의 서열과 동일함을 뜻한다. 휴지 폴리뉴클레오티드가 표적 mRNA에 실질적으로 동일한 센스 가닥을 포함하는 경우, 1, 2 또는 3개의 비상보성 뉴클레오티드가 바람직하게는 센스 가닥의 중간에 위치한다. 예를 들어, 센스 가닥의 길이가 21개의 뉴클레오티드이면, 비상보성 뉴클레오티드는 전형적으로 9, 10, 11 또는 12개, 바람직하게는 10 또는 11개의 뉴클레오티드이다. 본원에서 안티센스(anti-sense) 가닥으로 불리는, dsRNA 폴리뉴클레오티드의 다른 가닥은 센스 가닥에 상보적이다. "상보적"이란 용어는 서로 염기 짝짓는 두 단일가닥 폴리뉴클레오티드의 능력을 가리키는데, 이때 하나의 폴리뉴클레오티드의 아데닌은 또 다른 폴리뉴클레오티드의 티민 또는 우라실과 염기 짝지을 것이고, 하나의 폴리뉴클레오티드의 시토신은 또 다른 폴리뉴클레오티드의 구아닌에 염기 짝지을 것이다. 유지 폴리뉴클레오티드는 또한 dsRNA 폴리뉴클레오티드에 상응하는 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 개시된 센스 가닥 및 안티센스 가닥에 상응하는 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오티드 및 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오티드가 또한 포함된다. 본원에 DNA 서열로서 개시된 서열은 각각의 티미딘 뉴클레오티드를 우라실 뉴클레오티드로 대체함으로써 DNA 서열로부터 RNA 서열로 변환될 수 있음은 물론이다. 제한하려는 것이 아니라, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 표적 암호화 영역의 전사후 휴지를 일으킨다. 휴지에 사용하기 위한 폴리에 대한 변경은 당업계에 공지되어 있고, 휴지 폴리뉴클레오티드도 또한 변경될 수 있다.
본 발명의 dsRNA 휴지 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 또한 전형적으로 뉴클레오티드로 구성된 스페이서(spacer)에 의해 공유 결합될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드를 종종 당업계에서 짧은 헤어핀(haripin) RNA(shRNA)로서 언급된다. 센스 및 한티센스 가닥의 염기가 짝 지어지면, 스페이서 영역은 루프(loop)를 형성한다. 루프를 구성하는 뉴클레오티드의 수는 변할 수 있고, 3 내지 23개의 뉴클레오티드의 루프가 보고된 바 있다(스이(Sui) 등의 문헌[Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 99, 5515-5520(2002)] 및 쟈크(Jacque) 등의 문헌[Nature, 418, 435-438(2002)]).
휴지 폴리뉴클레오티드는 표적 암호화 영역의 발현의 전사후 저해(휴지라고도 부름)를 일으킨다. 이론에 의해 제한하려는 것이 아니라, 휴지 폴리뉴클레오티드는 세포내로 도입된 후에 표적 mRNA 및 신호 세포 엔도뉴클레아제와 히브리드화하여 표적 mRNA를 절단할 것이다. 결과는 mRNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 발현의 저해이다. 표적 암호화 영역의 발현이 저해되는지 여부는, 예를 들어, 세포내 표적 mRNA 양의 감소를 측정하거나, mRNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드 양의 감소를 측정하거나, 또는 mRNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 활성 감소를 측정함으로써 결정될 수 있다. 휴지 폴리뉴클레오티드는 별개의 두 상보적 폴리뉴클레오티드로서 벡터내에 존재할 수 있는데, 이들은 각각 dsRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 생성하도록 발현될 수 있거나, 또는 센스 가닥, 루프 영역 및 안티센스 가닥을 함유하는 하나의 폴리뉴클레오티드는 dsRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 RNA 폴리뉴클레오티드를 생성하도록 발현될 수 있다.
휴지 폴리뉴클레오티드는 당업계에서 일상적이고 공지되어 있는 방법을 사용하여 설계될 수 있다. 예를 들어, 휴지 폴리뉴클레오티드는 암호화 영역 AA 디뉴클레오티드 서열을 주사하여 확인할 수 있고, 각각의 AA 및 mRNA의 하류의 (3') 연속되는 16 내지 30개 뉴클레오티드를 후보 폴리뉴클레오티드의 센스 가닥으로서 사용할 수 있다. 후보 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 폴리펩티드중 하나의 발현을 감소시키는지를 결정하기 위하여 시험되는 폴리뉴클레오티드이다. 후보 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 암호화하는 영역에 위치하거나 또는 mRNA의 해독되지 않은 5' 또는 3' 영역에 위치하는 뉴클레오티드와 일치할 수 있다. 임의로 및 바람직하게는, 후보 폴리뉴클레오티드를 1, 2 또는 3개, 바람직하게는 1개의 비상보성 뉴클레오티드를 포함하도록 변경할 수 있다. 후보 폴리뉴클레오티드를 설계하고 선택하기 위한 다른 방법이 당업계에 공지되어 있고 일상적으로 사용된다. 휴지 폴리뉴클레오티드는 센스 가닥의 5' 말단에서 디뉴클레오티드 AA로 시작할 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 후보 폴리뉴클레오티드는 또한 전형적으로 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 둘다의 3' 말단에 1, 2 또는 3개 뉴클레오티드의 돌출물을 포함할 수 있다. 후보 폴리뉴클레오티드는 대중적으로 이용가능한 알고리즘(예컨대, BLAST)을 사용하여 선별하여 암호화 서열을 갖는 후보 폴리뉴클레오티드 서열을 비교한다. 비표적 암호화 영역에 의해 발현되는 mRNA와 이중 나선을 형성할 가능성이 있는 것은 전형적으로 추가의 고려없이 제겨된다. 그 다음, 나머지 후보 폴리뉴클레오티드를 이들이 본원에 기술된 하나의 폴리펩티드의 발현을 저헤하는지를 결정하기 위하여 시험한다.
일반적으로, 후보 폴리뉴클레오티드는 이들을 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포내로 도입함으로써 개별적으로 시험한다. 후보 폴리뉴클레오티드를 시험관내 제조한 다음, 세포내로 도입할 수 있다. 시험관내 합성을 위한 방법의 예로는 통상의 DNA/RNA 합성기에 의한 화학 합성이 있다. 합성 폴리뉴클레오티드 및 이러한 합성을 위한 시약의 상업적 공급사는 널리 공지되어 있다. 시험관내 합성을 위한 방법은 또한, 예를 들어 세포 비함유 시스템에 원형 또는 선형 벡터를 사용하는 시험관내 전사를 포함한다.
후보 폴리뉴클레오티드는 또한 후보 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 구조물을 세포내로 도입함으로써 제조될 수 있다. 이러한 구조물은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 후보 폴리뉴클레오티드의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 암호화하고 발현하는 벡터, 및 조작가능하게 연결된 조절 서열(예: RNA 폴리머라제 III 프로모터 및 RNA 폴리머라제 III 종결자(terminator))의 옆에 위치하는 후보 폴리뉴클레오티드의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 암호화하는 서열을 포함하는, RNA 폴리뉴클레오티드를 생성시키는 RNA 발현 카세트(cassette)를 포함한다.
후보 폴리뉴클레오티드가 본원에 기술된 폴리펩티드중 하나의 발현을 저해하는 기능을 하는지를 평가하기 위하여, 후보 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포내의 표적 mRNA의 양을 측정하여 후보 폴리뉴클레오티드를 함유하지 않는 동일한 유형의 세포와 비교할 수 있다. 세포내 mRNA 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 일상적이다. 이러한 방법으로는 정량적 RT-PCR이 있다. mRNA의 증폭을 위한 프라이머 및 구체적인 조건은 mRNA에 따라 변하고, 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 다른 방법으로는, 예를 들어 노던 블로팅 및 검정 분석이 있다.
후보 폴리뉴클레오티드가 본원에 기술된 폴리펩티드중 하나의 발현을 저해하는 기능을 하는지를 평가하기 위한 다른 방법으로는 폴리펩티드의 모니터링이 있다. 예를 들어, 검정은 mRNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드 양의 감소를 측정하거나 또는 mRNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드 활성의 감소를 측정하는데 사용할 수 있다. 폴리펩티드 양의 감소를 측정하는 방법은 후보 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포에 존재하는 폴리펩티드에 대하여 검정 분석하고 후보 폴리뉴클레오티드를 함유하지 않는 동일한 유형의 세포에 비교함을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 하체는, 예를 들어 웨스턴 면역블롯, 면역침전 또는 면역조직화학에 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 폴리펩티드 활성의 감소를 측정하는 방법이 또한 사용될 수 있다.
키트
본 발명은, 예를 들어 세포가 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는지를 결정함을 포함하는, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 시약을 함유하는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 포장재 및 본 발명의 항체를 함유할 수 있다. 이러한 키트는 또한 본 발명의 항체를 함유하는 조성물(예: 약학 조성물)의 제형화를 위하여 의료인에 의해 사용될 수 있다.
포장재는 항체에 보호된 환경을 제공한다. 예를 들어, 포장제는 항체가 오염되지 않도록 할 수 있다. 또한, 포장재는 용액내 항체가 건조하게 되지 않도록 할 수 있다. 포장재로 사용될 수 있는 적합한 물질의 예로는 유리, 플라스틱, 금속 등이 있다. 이러한 물질은 포장재에 대한 항체의 부착을 피하기 위하여 실란화될 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명은 포장재, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 제1 항체, 및 ER-α66 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 제2 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 임의로는 완충제, 반응 용기, 제2 항체 및 주사기와 같은 추가의 성분을 포함할 수 있다.
실시예 1
카베올린-1 일배체-결핍은 ER-α 발현의 활성화 및 정상적인 유방 상피세포의 에스트로젠 촉진성 형질전환을 일으킨다.
미국 하바드 의대의 필립 레더(Philip Leder) 박사의 실험실로부터 얻은 폴리-A 포획 레트로바이러스 벡터(RET)를 사용하여 정상적인 인간 유방 상피 MCF10A 세포로부터의 세포 클론의 유전자-포획된 라이브러리를 제조하였다(이시다(Ishida) 등의 문헌[Nucl. Acid Res., 27:580(1999)]). 간단하게는, 이 벡터는 표적 세포에서의 기능성 유전자의 발현 상태에 상관없이 기능성 유전자의 효율적인 동정을 위한 개선된 폴리-A 포획 전략을 사용하였다. 강한 스플라이스 수용체(splice acceptor)와 효과적인 폴리아데닐화 신호의 혼합은 "포획된" 유전자의 기능의 완전한 붕괴를 보장한다. RET 벡터내로의 프로모터 비함유 GFP cDNA의 봉입은 포획된 유전자의 발현 패턴을 생세포에서 쉽게 모니터링할 수 있게 한다. RET 백터를 함유하는 레트로바이러스를 사용하여 MCF10A 세포를 감염시켰다. 그 다음, 세포를 G418-내성에 대하여 선별하여 MCF10A 세포의 유전자-포획된 라이브러리를 수립하였다. G418에 의해 3주동안 선택한 후, "포획된" 유전자의 내인성 프로모터의 조절하에, GFP 발현을 모니터링한 다음, G418 내성 및 GFP 발현 클론을 선택하였다. 이 라이브러리는 기능성 유전자의 하나의 대립 유전자가 RET 벡터에 의해 붕괴된 3 ×105개의 독립된 감염 클론을 나타내었다.
종양 억제 활성을 갖는 유전자의 발현 손실이 정상적인 MCF10A 세포에 형질전환된 표현형을 제공할 수 있다고 생각되었다. 연질 한천 클론화 검정을 수행하고, 형질전환된 표현형의 특징인, 앵커리지(anchorage)-비의존성 증식을 획득한 유전자-포획된 세포로부터의 세포를 동정하였다. G418-내성 세포의 라이브러리로부터의 100개보다 많은 양성 콜로니(≥30개 세포)가 연질 한천에서 증식하였고, 모 MCF10A 세포는 그렇지 않았다. 20개의 세포 클론을 단리하고, 확장한 다음, 표준 혈청 및 10-8M 17b-에스트라디올(E2), 및 스테로이드 호르몬이 없는 덱스트린 코팅된 목탄-소거 혈청을 함유하는 연질 한천에서 3주동안 다시 선택하였다. 여분의 E2를 함유하는 연질 한천에서 증식을 촉진한 4개의 세포 클론(ST1, ST3, ST4 및 ST6)을 단리하고 확장하였다(도 3).
후보 유전자의 엑손과 폴리-A 꼬리 사이에 있는 미지의 3' mRNA 서열의 포획을 허용하는 3'-RACE를 사용하여, 붕괴되면 MCF10A 세포 형질전환을 일으키는 가능한 유전자를 클론화하는데 사용하였다. MCF10A 세포의 형질전환은 양성 에스트로젠 신호에 의한 것으로 생각되었다. RACE 과정에서 생성된 정제된 PCR 단편을 클론화하고 서열결정하였다. BLASTN 검색을 사용하여, 두 클론(ST1 및 ST3)으로부터의 DNA 서열은 크로모솜 7(진뱅크 수탁번호 XM048930)에 위치한 카베올린-1(Cav-1) 엑손-3의 서열에 동일하게 일치시켰다. 이 결과, Vav-1 유전자의 대립 유전자는 2개 이상의 클론에서 붕괴된 것으로 나타났다. Cav-1 이외에, 다른 두 유전자는 동 일한 기법을 사용하여 동정되었다. 클론 ST4에서 붕괴된 유전자는 각질화된 세포엔벨로프(envelope)의 구조적 조직화에 관련되는 코니핀(cornifin)/작은 고프롤린 단백질류중 하나인 SPRR1B(진뱅크 수탁번호 NT-004441.5번)이었다. 클론 ST6으로부터 다른 유전자는 알려진 기능이 없는 추정의 신규 유전자(진뱅크 수탁번호 6599139번)이다.
모 MCF10A 세포에서 Cav-1 단백질 수준을 분석하여 Cav-1 유전자 포획된 세포에서 Cav-1의 발현 수준이 감소되었는지를 시험하였다. 전술된 4가지 세포 클론(ST1, 3, 4 및 6), 및 MCF10A-Ha-ras(Ha-ras 돌연변이체에 의해 형질변환된 MCF10A 세포)를 분석하였다. 모 MCF10A 세포에서의 수준에 비하여, Cav-1 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 증명된 바와 같이 모든 형질전환된 세포에서 약 2배 낮았다(도 4). 이 데이터는 cav-1 유전자의 오직 하나의 기능성 대립 유전자가 ST1 및 ST3 세포에서 기능성일 경우 감소되는 Cav-1 발현에 일치한다. 이는 "유전자 포획"에 의해 생성된 Cav-1 일배체-결핍성에 의해 E2에 의해 촉진되는 형질전환이 일어남을 나타낸다.
Cav-1 일배체-결핍성이 에스트로젠-촉진성 세포 증식 및 형질전환을 일으키는 메카니즘을 결정하기 위하여, 전술된 형질전환 세포내의 ER-α 및 ER-β의 발현 수준을 검사하였다. 4가지의 모든 형질전환된 세포는 Ha-ras 형질전환된 세포에 필적하지만, 다른 정상적 포유동물 상피 세포주인 모 MCF10A 세포 및 HBL-100 세포는 검출불가능한 수준의 ER-α를 발현한 것으로 나타났다(도 5). ER-β 발현은 시험한 모든 세포에서 임의의 변화가 없었다(도 5). 이 데이터는 ER-α 발현이 활성 화되고, 이들 형질전환 세포에서의 에스트로젠 신호가 연질 한천에서의 에스트로젠-촉진성 세포 증식의 원인인 것으로 나타났다. 이는 ER-α 발현 및 에스트로젠 신호 모두가 Ha-ras 형질전환 세포에서 활성화되기 전에 나타났다(쉐카(Shekhar) 등의 문헌[Int. J. Oncol., 13:907(1998)] 및 쉐카 등의 문헌[Am. J. of Pathl., 152:1129(1998)]). 이 결과는 ER-α 발현 및 양성 에스트로젠 신호의 조절에 Ras/MAPK 경로가 관련됨을 나타낸다.
이들 형질전환 세포내의 MAPK 경로의 활성화는 인-특이성 항체를 사용하여 ERK1/2의 포스포릴화 수준을 검사함으로써 분석하였다. ERK1/2는 MCF10A 세포를 제외한 모든 형질전환 세포에서 고도로 그리고 본질적으로 포스포릴화되어 있는 것으로 밝혀졌다(도 6).
이들 데이터는, 함께 고려할 때, Cav-1/Ras/MAPK 경로는 인간 유방암 진행중에 ER-α 발현의 활성화에 관련되고, 에스트로젠 신호 경로화 협력하여 형질전환 세포 증식을 촉진함을 나타낸다.
실시예 2
에스트로젠 수용체 알파(ER-α36)의 동형의 확인, 클론화, 발현 및 특징화
전술된 작업의 과정중에, 리써치 다이어그노스틱 인코포레이티드(Research Diagnostic, INC.)의 래트 항-ER-α 항체(클론 H222)를 사용한 웨스턴 블롯 분석에서 3개의 단백질 밴드(66-KDa, 46-KDa 및 36-KDa)가 일정하게 관찰되었다. H222 항체는 ER-α의 리간드-결합 도메인을 인식한다. 46-KDa 및 36-KDa 단백질 밴드가 ER-α66의 분해 생성물일 가능성을 배제하기 위하여, 선행 보고서에서 제안된 바와 같이(아본단자(Abbondanza) 등의 문헌[Steroids, 58:4(1993)]), 8M 우레아를 함유하는 완충제를 사용하여 배양 평판에서 세포를 용해시키고 웨스턴 블롯 분석에 의해 시험하였다. Cav-1 일배체-결핍 세포, ST1 및 ST3, 및 MCF7 유방암 세포에서 3개의 뚜렷한 밴드가 쉽게 관찰되었다(도 7). 이러한 결과는 항체 H222에 의해 인식되는 유사한 항원결정기를 공유하는 ER-α 동형의 존재를 나타내었다.
문헌 검색을 통하여, ER-α66의 AF-1 도메인에 의해 매개되는 트랜스 활성화의 우성-음성 저해제로서 기능하는 ER-α의 46-kDa 동형이 클론화된 것으로 나타났다(플루리어트 등의 문헌[EMBO J., 19:4699(2000)]). 계속된 검색 결과, 5.4kb cDNA를 함유하는 정상적인 인간 자궁내막 cDNA 라이브러리(RZPD 클론 번호: DKFZp686N23123)로부터 클론을 동정하였다. 이 cDNA 클론은 이론적으로 35.7kDa의 예상 분자량을 갖는 단백질을 생성할 수 있는 310개 아미노산 개방형 해독틀을 가지고 있다. 개방형 해독틀의 cDNA 서열은 ER-α66 유전자의 엑손 2 내지 6의 DNA 서열과 100％ 일치하였다. cDNA의 5' 비해독 영역(5'UTR)은 734로부터 907에 이르는 ER-α66 유전자의 제1 인트론의 DNA 서열에 100％ 상동성을 나타내었다(ER-α66 유전자의 34,233bp의 제1 인트론의 제1 염기 쌍을 1로서 명명하였음). 따라서, ER-α의 전사는 ER-α66 유전자의 제1 인트론에서 이미 확인되지 않은 프로모터로부터 개시되는 것으로 결정되었다.
ER-α66 유전자의 제1 인트론의 734 내지 907의 작은 비암호화 신규 엑손을 "엑손 1'"로서 명명하였다. 그 다음, 엑손 1'을 ER-α66 유전자의 엑손 2로 직접 스플라이싱시키고, ER-α66 유전자의 엑손 2로부터 엑손 6까지 연속시킨다. 그 다 음, 엑손 6을 ER-α66 유전자(진뱅크 수탁번호 AY425004번, 표 1 참조)의 64,141bp 하류에 위치하는 엑손으로 스플라이싱시킨다. 마지막 27개 아미노산을 암호화하는 cDNA 서열 및 4,293bp의 3' 비해독 영역은 크로모솜 6q24.2-25.3(진뱅크 수탁번호 AL078582번))상의 클론 RP1-1304의 게놈 서열로부터의 연속 서열에 100％ 일치하였고, 이는 이 신규 ER-α 동형의 나머지 cDNA 서열은 앞서 보고된 ER-α66 유전자의 4,374bp 하류에 위치한 하나의 엑손으로부터 전사됨을 나타낸다. 따라서, 이 엑손은 앞서 보고된 8개의 엑손 외에 여분의 엑손을 반영하도록 엑손 9로 명명하였다. 이러한 모든 스플라이싱 사건은 스플라이스 연결점에서의 완벽한 스플라이스 공여체 및 수용체의 확인에 의해 지지된다. 단백질 ER-α36은 제2 엑손에 위치하는, ER-α46을 생성하는데 사용되는 동일한 개시 코돈인 완벽한 코작(Kozak) 서열로부터 생성될 수 있다(플루리어트 등의 문헌[EMBO J., 19:4688(2000)]). ER-α36은 전사 활성화 도메인인 AF-1 및 AF-2가 둘다 없지만 이량체화, DNA-결합 및 부분 리간드-결합 도메인은 보유한다는 점에서 ER-α66과 상이하다. ER-α36은 또한 여분의 독특한 27개 아미노산 도메인을 가져 ER-α66의 엑손 7 및 8에 의해 암호화되는 마지막 138개 아미노산을 대체한다(도 1). 이때, ER-α의 이러한 신규 동형을 본원에서 ER-α36으로 명명한다.
제조법에 의해 기술되는 과정에 따라 인간 태반 RNA(클론테크)로부터 제조된 마라톤 레디(Marathon Ready) cDNA로부터 PCR을 사용하여, ER-α36을 암호화하는 개방형 해독틀을 얻었다. PCR 프라이머 쌍은 DKFZp686N23123의 cDNA 서열에 따라 설계한다. 5' 프라이머는 말단에 EcoRI 부위를 갖는 5'- CGGAATTCCGAAGGGAAGTATGGCTATGGAATCC-3'(서열 23)이고, 3' 프라이머는 말단에 BamHI 부위를 갖는 5'-CGGGATCCAGAGGCTTTAGACACGAGGAAAC-3'(서열 24)이다. PCR 생성물을 1％ 아가로스 겔에서 전기영동에 적용시키고, 예상되는 1.1kb DNA 단편이 관찰되었다(도 9). DNA 단편을 EcoRI 및 BamHI로 정제하고, 분해하고, pBluescript 벡터(pBS-ER-α36)으로 클론화하고, 완전히 서열결정한다. 서열은 cDNA 클론 DKFZp686N23123에 100％ 동일함을 나타내었고, 이는 ER-α36이 다른 공급원으로부터 클론화될 수 있는 천연의 ER-α의 동형이다. 개방형 해독틀에 의해 암호화되는 예상되는 아미노산 서열은 도 10에 나타나 있다.
클론화된 cDNA가 ER-α36 단백질을 생성할 것인지를 시험하기 위하여, ER-α66, ER-α46 및 ER-α36을 함유하는 발현 벡터를 사용하여 인간 배아 신장 293 세포에서 임시 형질감염 검정을 수행하였다. 이들 형질감염 세포 및 MCF7 세포로부터의 전체 세포 추출물을 ER-α의 리간드-결합 도메인에 대하여 생성된 단일클론성 항체 H222를 가지고 웨스턴 블롯 분석에 적용시켰다(아본단자 등의 문헌[Steroids, 58:4(1993)]). H222 항체에 의해 인식된 36kDa 단백질은 ER-α36 벡터 형질감염된 세포에서 생성되었다(도 11). 이 단백질의 크기, 및 ER-α66의 B-도메인에 보내지는 항체 H226, ER-α66의 C-말단을 인식하는 항체 HC20과의 반응 실패는 ER-α66의 N-말단 및 C-말단이 둘다 없어서 AF-1 및 AF-2 도메인이 없는 ER-α가 없다.
ER-α36 단백질에 대하여 일련의 컴퓨터 검색을 수행하였다. FindMOd 및 SCANPROSITE 알고리즘은 ER-α36에서 미리스토일화(myristoylation) 부위를 예상하였는데, 이는 미리스토일화 부위는 주변 막에 위치할 있음을 제안한다. 이는 각각 ER-α36의 21.7％, 24.8％, 17.4％ 및 26％가 핵, 세포질, 미토콘드리아, 및 막 분획에 국소화됨을 예상하는 k-최단 근접(k-nearest neighbor)(PSPORT II) 알고리즘과 일치한다. 이는 ER-α46에 대한 예상과 유사하다(각각 26.1％, 30.4％, 17.4％ 및 26.1％). 대조적으로, ER-α66의 73,9％, 8,7％, 0.1％ 및 17.3％는 비교용 예상을 갖는다. 따라서, ER-α66, ER-α46, 및 ER-α36의 상이한 구획화는 각 수용체의 기능성 부위 및 제1 역할이 상이할 수 있음을 나타낸다.
ER-α66 유전자의 제1 인트론에 위치하는 ER-α36을 암호화하는 유전자의 추정의 5' 근접 영역에 대하여 또한 컴퓨터 검색을 수행하였다. TATA 결합 단백질(TBP) 인식 서열은 cDNA 개시 부위의 상류에 있고, Ap1 결합 부위는 5' 근접 영역에 있는 것으로 나타났다(도 12). 완벽한 반에스트로젠 반응 요소(ERE) 부위는 ER-α36의 5' 상류 영역에서 확인되었고, 이는 ER-α36이 E2-매개성 전사 조절에 적용됨을 나타낸다.
실시예 3
ER-α36은 막-개시성 에스트로젠 신호를 매개하고 ER-음성 유방암에서 발현된다.
방법
세포 배양물, 안정한 세포주 및 E2-BSA-FITC로의 막-표지의 수립. MCF10A 세포는 미국 미주리주 디트로이트 소재의 카마노스 캔서 인스티튜트(Karmanos Cancer Institute)로부터 구하였고, 인간 배아 신장 293 세포 및 모든 유방암 세포 는 ATCC로부터 구하였다. 모든 세포는 37℃, 5％ CO2 분위기에서 적당한 조직배양 배지내에서 유지하였다. 재조합 ER-α36을 발현하는 안정한 세포를 수립하기 위하여, HEK293 세포를 60㎜ 접시당 1×105 세포의 밀도로 도말하고, 24시간 후에 FuGene6 형질감염 시약(롯슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals))을 사용하여 사이토메갈로바이러스(cytomagalovirus, CMV) 프로모터에 의해 유도된 ER-α36 발현 벡터로 형질감염시켰다. ER-α36 발현 벡터는 pBS-ER-α36으로부터의 1.1-kb EcoRI 및 BamHI cDNA 단편을 포유동물 발현 벡터 pCB6+의 EcoRI 및 BamHI 부위로 클론화함으로써 구성하였다. 빈 벡터를 또한 세포에 형질감염시켜 대조군으로서 사용하였다. 형질감염시킨 지 48시간 후에, 세포를 다시 만들고 2주동안 G418(인비트로젠(Invitrogen)) 500㎍/㎖로 선택하였다. 생성된 G418-내성 세포의 클론화되지 않는 집단을 확장하여 추가의 분석에 사용되는 세포를 생성하였다. 재조합 ER-α36 세포를 발현하는 안정한 세포의 세포 표면을 표지하기 위하여, 세포를 4℃에서 15분동안 E2β-헤미숙시네이트(시그마(Sigma))에 공유결합된 1μM 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC)-표지된 BSA로 표지하고, 갓 제조한 4％ 파라포름알데히드에 고정시키고, 현미경 평가를 위하여 DAPI를 함유하는 봉입액으로 표본제작하였다.
에스트로젠 및 항에스트로젠으로의 세포 자극, 및 MTT 검정.
치료하기 전에, 세포를 2.5％ 덱스트린-코팅된 목탄-소거 소태아 혈청을 갖는 페놀-레드 비함유 배지에서 48 내지 72시간동안 배양한 다음, PBS로 세척하고, BSA 0.1㎍/㎖ 및 인슐린 5㎍/㎖를 함유하는 새로운 페놀 레드-비함유 혈청이 없는 배지에 12시간동안 위치시켰다. 휴지기 세포의 자극은 37℃, 혈청 비함유 배지내에서 상이한 시간동안 수행하였다. 상이한 에스트로젠 및 항에스트로젠을 스테랄로이즈 인코포레이티드(Steraloids Inc.)로부터 구입하였다. BSA-E2β는 시그마로부터 구하였다.
3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 위하여, 현탁액내 세포를 96-웰 배양 평판의 각 웰에 1×103 세포/웰의 최종 농도로 첨가하고, CO2 배양기내에서 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 10nM E2β, 10nM 타목시펜 또는 4OH-타목시펜 또는 7.2nM UO126(칼바이오켐(Calbiochem))을 함유하는 배지를 48시간동안 각 웰에 첨가하였다. MTT 검정은 제조사에서 권장한 대로 셀타타이터96(CellTiter96) 수성 1용액 세포 증식 검정 키트(Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit)(바이오 라드(Bio Rad))로 수행하였다. 미소평판 판독기(프로메가(Promega))를 사용하여 490㎚에서의 흡광도를 측정하였다.
세포 분할 검정. 마르퀘즈(Marquez) 등의 문헌[Oncogene, 20, 5420-5430(2001)]에 기술된 바와 같이 세포 분할을 행하였다.
웨스턴 블롯 분석, 간접 면역형광법 및 항체. 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 세포를 리파(RIPA) 완충제로 붕괴하고, 겔 부하 완충제에서 끓이고, 10％ SDS-PAGE 겔에서 분리하였다. 전기영동 후, 단백질을 PVDF 막(밀리포어(Millipore))에 형질감염시켰다. 필터를 다양한 항체로 탐색하고 적당한 HRP-접합 2차 항체(산타 크루 즈 바이오테크날러지(Santa Cruz Biotechnology)) 및 ECL 시약(퍼킨 엘머 라이프 사이언시스(Perkin Elmer Kife Scences))로 가시화하였다.
ERK2/1(K-23)에 대한 항체는 산타 크루즈 바이오테크날러지로부터 구입하였다. MAP 키나제 경로의 활성화를 분석하기 위하여 사용된 항체는 Mek1 및 ERK2/1의 포스포릴화 형태를 포함하였고, 쎌 시그널링 테크날러지(Cell Signaling Technology)로부터 구하였다. 래트 항-ER-α 항체(H222)는 리써치 다이어그노스틱스 인코포레이티드로부터 구입하였다. COPB(Y-20), mSin3A(AK-11), 및 5' 뉴클레오티다제(H-300)는 산타 크루즈 바이오테크날러지 인코포레이티드로부터 구입하였다. DA-GDI(클론 97A1015)를 업스테이트 바이오테크날러지(Upstate Biotechnology)로부터 구하였다.
다클론성 항-ER-α36 항체는 ER-α36(알파 다이어그노스틱 인코포레이티드(Alpha Diagnostic Inc.))에 독특한 ER-α36의 C-말단의 마지막 15개 아미노산에 따라 합성된 펩티드 항원에 대하여 토끼에서 수립하였다. 항체를 수립하는데 사용된 합성 펩티드의 친화성 칼럼을 사용하여 항체를 정제하였다. 항체의 특이성은 또한 내인성 ER-α36을 발현하지 않는 ER-α36 발현 벡터 형질감염된 HEK293 세포에서 시험하였다. 면역형광 검정은 항-ER-α36 항체의 면역반응성 신호가 오직 ER-α36-발현 벡터에 의한 임시 형질감염체에서만 검출되고, C-말단이 없는 돌연변이 ER-α36을 발현하는 형질감염체에서는 검출되지 않음을 나타냈는데, 이는 ER-α36 항체가 매우 특이성임을 나타낸다.
DNA 형질감염 및 루시퍼라제 검정. 임시 형질감염 검정에 있어서, 60-웰 접 시에 종배양된 HEK293 세포를 페놀-레드 비함유 배지 및 2.5％ 스테로이드-비함유 소태아 혈청내에서 60 내지 70％ 융합도(confluence)로 증식시켰다. 세포를 세척하고, FuGene6 시약(롯슈 몰레큘러 바이오케미칼스)을 사용하여 플라스미드(발현 벡터 pSG5 1.5㎍, pSG hERα66 1.5㎍ 또는 pSG hERβ 1.5㎍ 단독과 함께, 또는 ER-α36 발현 벡터 1.5㎍과 함께 정보제공 플라스미드 2×ERE-tk-Luc 2㎍) 총 5㎍으로 일시적으로 형질감염시켰다. 티미딘 키나제 프로모터(2×ERE-tk-Luc, 스웨덴 소재의 카로린스카 인스티튜트(Karolinska Institute)의 카타린 피터슨(Katarine Pettersson) 박사로부터 얻음)의 상류에 위치된 두 ERE(닭 비텔로제닌(Vitellogenin) A2 유전자 -331 내지 -289의 서열)를 함유하는 정보제공 플라스미드를 사용하였다. ER-α66 및 ER-β를 함유하는 발현 벡터도 또한 카타린 피터슨 박사로부터 구하였다. ER-α46의 발현 벡터를 자파 나와즈(Zafar Nawaz) 박사(미국 네브라스카주 오마하 소재의 크레이톤 유니버시티 메디컬 센터(Creighton University Medical Center))로부터 구하였다. 세포를 루시퍼라제 활성에 대하여 검정하기 전 12시간동안 E2(10nM)로 처리하거나 처리하지 않았다. 루시퍼라제 검정은 프로메가(Promega)의 루시퍼라제 검정 키트를 사용하여 수행하였다. 값은 3가지보다 많은 별개의 형질감염 실험의 평균±표준편차에 상응한다.
RNA 추출 및 노던 블롯 분석. 제조사의 지시에 따라 트리졸(Trizol)(인비트로젠)을 사용하여 총 세포 RNA를 단리하였다. 총 RNA 10㎍을 1.2％ 포름알데히드/포름알데히드 겔에서 전기영동에 의해 분리하고 나일론 막(하이본드-엔(Hybond-N), 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))에 블로팅하였다. 블롯 을 1시간동안 미리 히브리드화하고 65℃의 고속-히브리드화 용액(아머샴 파마시아 바이오테크)에서 2시간동안 히브리드화하였다. 프로브(probe)는 ER-α36에 독특한 ER-α36의 3' 비해독 영역으로부터의 410bp cDNA 단편, 및 BD 클론테크(BD Clonetech)의 β-액틴 DNA 프로브를 포함하였다. DNA 프로브를 32P dCTP 및 레디프라임(Rediprime) II DNA 표지 키트(아머샴 바이오테크)로 표지하였다. 블롯은 -70℃에서 밤새 증감지를 사용하여 오토래디오그래피(autoradiography)하였다. 동일한 막을 가늘고 길게 잘라내어 표지된 β-액틴 DNA 프로브로 재탐색하여 동일 부하를 확인하였다.
유방암 시험편 및 면역조직화학 검정. 파라핀-매립된 인간 유방암 시험편은 중국 항주 소재의 서 런 런 샤우(Sir Run Run Shaw) 병원 병리학부로부터 구하였다. 면역조직화학 염색은 제조사의 지시에 따라 울트라센시티브(UltaSensitive™) S-P 키트(중국 소재의 마익신-바이오(Maixin-Bio))를 사용하여, 각각 1차 항체로서 ER-α66 특이성 항체(미국 소재의 랩비젼 코포레이션(LabVision Corporation) 및 ER-α36 특이성 항체를 가지고 행하였다.
결과
ER-α36이 ER-α66의 천연의 동형임을 추가로 확인하기 위하여, 정상적인 유방 상피세포주 MCF10A, 및 ER-양성 및 ER-음성(즉, ER-α66-양성 및 ER-α66-음성) 유방암 세포로부터의 총 RNA의 노던 블롯 분석을 수행하였다. DNA 프로브는 ER-α36에 독특한 ER-α36의 3' 비해독 영역(5'GCAAAGAAGAGAATCCTGAACTTGCATCCT(서열 26) 및 5'TTAGTCAGGTATTTAATAACTAGGAATTG(서열 27)에 따라 설계된 프라이머 쌍을 가지고 RT-PCT 방법을 사용하여 합성하였다. 노던 블롯 분석 결과, 추정 크기가 5.6kb인 하나의 mRNA가 ER-양성(즉, ER-α66-양성) 유방암 세포 MCF7에서 확인되고 MCF10A 세포에서는 확인되지 않은 것으로 나타났다(도 13). 놀랍게도, ER-α36도 또한 널리 공지된 ER-음성(즉, ER-α66-음성) 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포에서 발현되었다. 이 데이터는 예상된 크기의 ER-α36 mRNA를 갖는 전사체가 유방암 세포 및 심지어 ER-α66이 없는 유방암 세포에서도 발현됨을 나타낸다.
ER-α36은 리간드-결합 및 리간드-비결합 ER-α66 및 ER-β의 트랜스-활성화 작용을 저해한다. 본 발명자들은 먼저 AF-1 및 AF-2 도메인이 둘다 없는 ER-α36이 임의의 전사 활성을 보유하는지를 시험하였다. 일시 형질감염 검정을 수행하였다. 티미딘 키나제 프로모터(2×ERE-tk-Luc)의 상류에 위치된 두 에스트로젠 반응 요소(ERE)를 함유하는 루시퍼라제-발현 리포터 구조물을 사용하여 HEK293 세포에서 수행하였다. HEK293 세포주는 ER-α66의 AF-1 및 AF-2가 HEK293 세포내에서 똑같이 잘 기능하는 것으로 이전에 보고되었기 때문에 선택되었다(덴저(Denger) 등의 문헌[Mol. Endocrinol., 15, 2064-2077(2001)]). 도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 ER-α36에 두 전사 촉진 도메인이 없다는 사실에 일치하게, ER-α36이 E2β의 존재하 및 부재하에 본질적인 전사 활성을 나타내지 않음을 발견하였다. 그 다음, 본 발명자들은 ER-α66의 AF-1 및 AF-2 도메인에 의해 매개되는 전사 트랜스-활성화 작용에서 ER-α36의 조절성 기능을 평가하였다. ER-α36의 동시발현은 E2β의 존재하 및 부재하에 ER-α66의 트랜스-활성화 작용을 강하게 저해하였는 데(도 14), 이는 ER-α36이 ER-α66의 AF-1 및 AF-2 도메인에 의해 매개되는 트랜스-활성화 작용을 저해함을 시사한다. 또한, ER-α36은 또한 ER-β의 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 트랜스-활성화 작용을 저해하였다(도 14).
ER-α36은 막-개시성 에스트로젠 신호 경로를 매개한다. 이전에 보고에 의하면, E2β가 MAPK/ERK 경로의 신속한 활성화를 촉진하는 것으로 나타났다(라잔디 등의 문헌[Mol. Endocrinol., 13, 307-319(1999)], 와터스 등의 문헌[Endocrinol. 138, 4030-4033(1997)], 및 미글리아시오(Migliaccio) 등의 문헌[EMBO J., 15, 1292-1300(1996)]). ER-α36이 이 신호전달 경로에 관련되는지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 내인성 ER-α를 발현하지 않는 HEK293 세포에서 외인성 ER-α36을 발현하는 안정한 세포를 수립하였다. 전 ER-α36 형질감염된 HEK293 세포를 막 불투과성인 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC)-접합 E2β-BSA(E2β-BSA-FITC)로 배양하였다. ER-α36 형질감염 세포의 세포 표면은 E2β-BSA-FTIC로 강하게 표지하고, 반면에 빈 벡터로 형질감염된 대조군 세포는 E2β-BSA-FTIC로 표지하지 않았다. E2β(10nM)로 다양한 시간동안 처리되거나 처리되지 않은 휴지기 세포로부터 세포 용해물을 제조하였다. ERK 활성화는 포스포릴화 상태-의존성 및 포스포릴화-비의존성 항체를 사용하는 면역블롯법에 의해 측정하였다. 5분 이내에 ER-α36 발현 벡터로 형질감염된 세포에서 45분동안 계속된 ERK1/2의 포스포릴화에서 10배 증가가 관찰되었고, 빈 벡터로 형질감염된 대조군 세포에서는 관찰되지 않았다(도 15a 및 도 15b). 그러나, 혈청(10분동안 20％)은 이러한 대조군 세포에서 ERK1/2를 활성화할 수 있었는데(도 15b), 이는 이들 세포에서 MAPK 신호전달 경로의 전체 적인 결함이 없음을 나나탠다. 또한, ERK1/2를 포스포릴화하고 활성화하는 키나제는 또한 ER-α36 형질감염된 세포에서 E2β에 반응하여 활성화된다(도 15a). 막-개시성 에스트로젠 신호전달에 의한 ERK1/2의 활성화의 추가의 증가를 제공하기 위하여, ER-α36 형질감염된 세포를 또한 E2β의 막 불투과성 형태인 E2β-BSA로 처리하였다. ERK1/2 포스포릴화의 강한 활성화도 또한 E2β-BSA 처리된 세포에서 관찰되었다(도 15a).
ER-α36은 상이한 에스트로젠 및 항에스트로젠에 의해 촉진되는 MAPK 신호전달 경로의 활성화를 매개한다. 본 발명자들은 또한 ER-α36 형질감염된 세포를 에스트론(E1), 17β-에스트라디올(E2β), 17α-에스트라디올(E2α), 에스트리올(E3), 또는 에스테트롤(E4)로 10분동안 처리하고, E1을 제외한 상기 모든 에스트로젠이 매우 유사한 수준으로 ERK1/2 포스포릴화를 활성화하였음을 발견하였는데, 이는 ER-α36이 상기 에스트로젠을 유사한 수준으로 인식할 수 있음을 나타낸다(도 15c). 그 다음, 본 발명자들은 ER-α 매개성 에스트로젠 신호전달이 항에스트로젠에 민감한지를 시험하기 위한 실험에 타목시펜, 4OH-타목시펜, ICI-182, 780을 포함한 항에스트로젠을 포함시켰다. 타목시펜, 4OH-타목시펜 및 순수한 항에스트로젠 ICI-182, 78-은 ER-α36에 의해 매개되는 ERK1/2 활성화를 방해하지 않았다. 반대로, 그 효과는 E2β 단독에 의해 매개된 효과에 비하여 훨씬 강하였다(15e). ER-α36 형질감염된 세포를 1μM 타목시펜 단독으로 처리한 경우, ER-α66 및 ER-β 둘다를 평활말단화할 수 있는 농도에서 8시간보다 길게 지속된 강하고 영구적인 ERK1/2 활성화가 관찰되었다(도 15d). 그러나, 동일한 농도의 타목시펜은 빈 발현 벡터로 형질감염된 대조군 293 세포에서 효과가 없었다.
ER-α36은 E2-촉진성 세포 증식을 매개한다. 에스트로젠이 ER-α36에 의해 매개되는 에스트로젠 활성화된 MAPK 경로가 세포 핵에서의 전사 신호전달을 일으킬 수 있는지를 추가로 결정하기 위하여, 본 발명자들은 MAPK/ERK 신호전달 경로의 하류 효과인자인 전사 인자 Elk를 활성화하는 막-개시성 에스트로젠 신호전달의 능력을 검사하였다. 본 발명자들은 ER-α36 발현 293 세포를, 인간 Elk1의 ERK-반응성 트랜스-활성화 도메인에 융합된 효모 전사 인자 GAL4의 DNA-결합 도메인으로 이루어진 ERK-반응성 GAL-Elk 키메라 전사 인자로 일시적으로 형질감염시키고, E2β의 존재하에 GAL4-결합 리포터 유전자의 발현에 대한 그의 생채내 활성을 측정하였다. 리포터 유전자는 5개의 Gal4 DNA 결합 부위를 함유하는 루시퍼라제 리포터 플라스미드인 5×GAL4-LUC였다. 세균 β-갈락토시다제 발현 벡터를 사용하여 형질감염 효율을 제어할 수 있었다. 형질감염 후, 세포 배양물을 에스트로젠 비함유 배지에서 36시간동안 유지시킨 후, E2β(10nM)를 12시간동안 첨가하였다. 표준편차를 갖는 루시퍼라제 활성은 2번씩 수행된 3가지보다 많은 실험을 대표한다. ER-α36 형질감염된 세포의 에스트로젠 처리는 리포터 유전자의 Elk/Gal4 융합 단백질-매개성 트랜스-활성화의 약 2배 증가를 유도한 반면, E2β는 빈 벡터로 형질감염된 대조군 세포에서 Elk/Gal4 융합 단백질의 전사 활성에 효과를 나타내지 않았다(도 16a).
다음으로 본 발명자들은 ER-α36이 에스트로젠-촉진성 세포 증식을 매개할 수 있는지를 검토하였다. E2β의 존재하 및 부재하에 ER-α36 형질감염된 세포 및 대조군 세포의 증식을 MTT 검정에 의해 평가하였다. ER-α36 형질감염 세포의 증 식은 E2β 처리에 의해 촉진된 반면, E2β는 빈 발현 벡터로 형질감염된 대조군 세포의 증식에는 효과가 없었다(도 16b). 타목시펜 및 4OH-타목시펜을 포함한 항에스트로젠의 봉입체는 E2β-촉진성 세포 증식을 방해하지 않았다(도 16b). 타목시펜 또는 4OH-타목시펜은 단독으로 ER-α36 형질감염된 세포의 증식을 강하게 촉진하였다. 그러나, MAPK 경로의 특이적인 저해제인 UO126은 E2β-촉진성 세포 증식을 강하게 저해하였다. 이들 데이터는 ER-α36-매개성 막 에스트로젠 신호전달이 MAPK/ERK 신호전달 경로의 활성화를 통하여 세포 증식을 촉진함을 나타낸다. 이들 데이터는 또한 항에스트로젠이 ER-α36을 통한 세포 증식도 촉진함을 나타낸다.
ER-α36은 주로 막에 근거하는 에스트로젠 수용체이다. ER-α36을 더 특징화하기 위하여, 본 발명자들은 ER-α36에 독특한 ER-α36의 C-말단 영역의 15개 아미노산에 대하여 수립된 다클론성 항-ER-α36 항체를 성공적으로 개발하였다. 항체를 수립하는데 사용된 합성 펩티드의 친화성 칼럼을 사용하여 항체를 정제하였다. 이러한 항체를 사용하여 정상적인 유방 상피세포 및 확인된 유방암 세포주로부터 제조된 단백질의 웨스턴 블롯 분석한 결과, 일부 유방암 세포에서 37-kDa 분자량의 하나의 단백질 밴드가 나타났고, 정상적인 유방 상피세포에서는 나타나지 않았다(도 17a). ER-α36은 널리 공지되어 있는 ER-α66 음성 유방암 세포주 MDA-MB-231, MDA-MB36 및 HB3396 세포에서 발현되고, 또한 ER-α66 양성 유방암 세포 MCF7에서 발현되지만, T47D에서는 발현되지 않는데(도 17a), 이는 ER-α36이 ER-α66 음성 유방암 세포에서 발현된다는 본 발명자들의 노던 블롯 데이터와 일치한다. ER-α36이 ER-α66 음성 유방암 세포에서 발현되는 가능성을 추가로 평가하기 위하 여, 항-ER-α36 특이성 항체를 사용하여 투과화된 DMA-MB-231 세포에서의 간접 면역형광 검정 및 공초점 현미경 분석한 결과, ER-α36은 ER-α66 음성 유방암 세포 MDA-MB-231의 세포막, 세포질 및 핵에서 발현되는 것으로 나타났다.
세포내 ER-α36 구획화를 추가로 평가하기 위하여, 아세포 분획화 검정을 수행하여 ER-α36 형질감된 HEK293 세포로부터의 핵, 세포질 및 시토졸을 단리하였다. ER-α36은 상이한 분획으로부터 면역검출법에 의해 확인되었다. 고비율의 ER-α36(~50％), 및 저비율의 ER-α36이 시토졸내(~40％) 및 핵내(~10％)에 편재화되어 있다. 상이한 분획의 교차 오염을 배제하기 위하여, mSin3A(핵), GDP 해리 저해제(시토졸), 5'뉴클레오티다제(세포막), 및 β-COP(골지체)를 포함하는 상이한 마커 단백질을 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 분획 순도를 검사하였다. 이들 결과로부터 상이한 분획중에 오염이 없었음을 확인하였다. 이 실험은 ER-α36이 주로 막에 근거하는 에스트로젠 수용체임을 입증한다(도 17b).
ER-α36은 ER-α66 음성 유방암 시험편에서 발현된다. 인간 유방암에 대한 ER-α36의 관련성을 추가로 결정하기 위하여, 본 발명자들은 특이성 항-ER-α36 항체를 사용하는 면역조직화학 검정에 의해 인간 유방암 시험편에서 ER-α36 발현 패턴을 검사하였다. 인간 유방 조직의 제자리 분석 결과, 유방암에서 ER-α36의 상향조절이 나타났다. 헤마톡실린에 의해, ER 단백질에 대하여 양성인 세포는 갈색으로 염색되었고 핵은 청색으로 염색되었다. 검사된 35가지의 유방암 시험편중에서, 21가지(60％)는 ER-α36에 대하여 양성인 것으로 염색되었고, 이들중 21가지(60％)는 ER-α66에 대하여 양성이었다(표 2). 노던 블롯 및 웨스턴 블롯 분석과 일치하게, ER-α66에 대하여 음성인 것으로 염색된 14가지의 유방암 시험편중 11가지(78％)가 ER-α36에 대하여 양성으로 염색되었고, 이는 대부분의 ER-음성(즉, ER-α66-음성) 유방암이 여전히 ER-α36을 발현함을 나타낸다. 인간 관내 암종에서 발견되는 조직의 정상 부분에서 ER-α36의 제자리 염색은 내강 상피세포에서만 ER-α36 발현을 나타내고, 주로 세포질 및 세포막에 편재되는 ER-α36 발현을 나타내었다. 종양 부분은 인간 침윤성 관내 암종 및 침입성 관내 암종에서 구하였다. 모든 21가지의 ER-α 양성 시험편은, ER-α66의 주로 핵 염색과는 대조적으로, 주로 핵 바깥에서 ER-α36 면역염색 패턴을 나타내었다. ER-α66과 마찬가지로, 인접한 정상 조직의 일부 관내 상피세포도 또한 ER-α36에 대하여 양성인 것으로 염색되었다. 이들 결과는, ER-α66과 마찬가지로, ER-α36이 검사된 인간 유방암중 3분의 2에서 발현됨을 나타내고, ER-α36이 ER-α66-음성 유방암의 발병에 관련있음을 나타낸다.
ER-α36 및 ER-α66 발현: 인간 유방암에서의 면역염색 조사
경우 번호 ER-α66 ER-α36
04-06108D +++ +
04-06278G +++ +
03-19482D +++ ++
03-13610E +++ +
01-09182D ++ +
02-17950B ++ +
02-07748H ++ +
01-13537G ++ +
00-0319D ++ ±
03-04069G + ±
00-02787D ++ -
02-18513F ++ -
04-08474J ++ -
02-01265M ++ -
03-07870E + -
02-04206F ++ -
02-12985F +++ -
03-08862G ++ -
02-09537B +++ -
03-22792D ++ -
04-10881D + -
03-10071F - ++
03-22971M - +
01-08119D - ±
02-02018D - +
02-04567E - +
04-07055E - +
03-05946C - +
03-22586I - +
01-02877A - +
01-17570C - ±
00-08489G - ±
00-02202F - -
98-03989D - -
03-04898B - -
이 연구에서, ER-α의 신규한 변이체인 ER-α36을 동정하고, 클론화하고, 특징화하였다. 이러한 ER-α 동형은 ER-α66 유전자의 제1 인트론내의 이전에 미확인된 프로모터로부터 개시된 전사체의 생성물이다. ER-α36의 추정의 프로모터 영역은 ER-α36 cDNA 출발 부위의 상류에 있는 TATA 결합 단백질(TBP) 인식 서열, 및 몇몇 Sp1, NF-kB 및 Ap1 결합 부위를 함유한다(도 12). 본 발명자들은 ER-α36의 5' 근접 영역을 클론화하였고, 이것이 강한 프로모터 활성을 가짐을 확인하였다. 게다가, ER-α36의 5' 근접 영역에서 완전 반ERE 부위가 확인되었는데, 이는 ER-α36이 ER-매개성 전사 조절받음을 나타낸다.
ER-α36 단백질은 ER-α66 유전자의 엑손 2-6에 의해 암호화되는 ER-α66 단백질과 동일하다. 이러한 동형은 이전에 트랜스-활성화 작용을 갖는 것으로 확인된 도메인 AF-1 및 AF-2가 전혀 없다. 사실, ER-α36 트랜스-활성화 작용의 분석 결과, ER-α36은 본질적인 전사 활성이 없는 것으로 나타났다. 그러나, ER-α36은 리간드-결합 및 리간드-비결합 ER-α66 및 ER-β의 AF-1 및 AF-2 도메인에 의해 매개되는 트랜스-활성화 작용을 효율적으로 억제하며, 이는 ER-α36이 게놈성 에스트로젠 신호전달의 강력한 저해제임을 나타낸다. 이러한 발견은 AF-1 도메인이 없는 ER-α46이 ER-α66의 AF-1 활성을 억제하는 강력한 경합자로서 기능한다는 이전의 보고에 필적한다.
신속한 에스트로젠 신호전달을 개시시키는 세포막에 근거하는 ER의 존재는, 이 수용체의 분자적 정체가 확립되지 않았기 때문에, 장시간동안 논쟁의 여지가 있었다. 이전에, 형질감염 검정을 사용하여 라잔디는 ER-α66 및 ER-β가 둘다 막 에스트로젠 신호전달을 개시할 수 있지만 이들중 매우 작은 비율만이 세포 표면에서 발현되었다고 보고하였는데(라잔디 등의 문헌[Mol. Endocrinol., 13, 307-319(1999)]), 이는 이들 ER류가 게놈성 에스트로젠 신호전달에서의 전통적인 역할 이외에 막-개시성 에스트로젠 신호전달에 관련될 수 있음을 나타낸다. 최근에, ER-α의 46-kDa 동형은 세포 표면에 편재화되어 있고, 에스트로젠-촉진성 eNOS 포스포릴화를 매개하는 것으로 밝혀졌다(리(Li) 등의 문헌[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 4807-4812(2003)]). 본원에서, 본 발명자들은 다른 ER-α 변이체인 ER-α36이 주로 세포막에 편재되어 있고 막-개시성 에스트로젠 신호전달에 의해 유도되는 MAPK/ERK 경로의 활성화를 매개함을 증명하였다. 게다가, ER-α36은 전체적으로 본질적인 트랜스-활성화 작용이 없고, 오직 게놈성 에스트로젠 신호전달의 조절자로서 기능하기 때문에, ER-α36은 주로 막에 근거하는 에스트로젠 수용체로서 작용하여 막-개시성 에스트로젠 신호전달을 매개할 수 있다. 이전에, 일부 E2β-매개성 신속 작용이 ER-α 유전자 탈락(ER-α gene knockout, αERKO) 쥐의 뉴론에서 일어나고, 이들 작용은 ICI 182,780에 의해 방해받지 않음이 보고된 바 있는데(구(Gu) 등의 문헌[Endocrinology, 140, 660-666(1999)]), 이는 하나보다 많은 막-개시성 에스트로젠 신호전달 경로의 존재를 나타낸다. 본원에서 본 발명자들은 항에스트로젠이 ER-α36 매개성 MAPK/ERK 활성화를 방해하지 않았음을 증명하였고, 이는 ER-α36이 전술된 항에스트로젠 비민감성 신호전달 경로에 관련됨을 나타낸다. αERKO 쥐는 쥐 ER-α 유전자의 제1 암호화 엑손(ER-α36의 전사체의 생성에서 건너뛴 엑손)의 삽입에 의한 붕괴에 의해 생성되었기 때문에, ER-α36의 쥐 대응물의 생성이 이들 유전자 탈락 쥐에서 정상인 채로 남을 가능성이 있다. 따라서, ER-α36은 이들 쥐에서 관찰되는 나머지 에스트로젠 효과에 기여할 수 있다. 최근에, 토란-알러란드(Toran-Allerand) 등의 문헌[J. Neuroscience 22, 8391-8401(2002)]에 추측 분자량이 63 내지 65kDa인 신규한 세포막-관련 에스트로젠 수용체(ER-X)의 존재가 보고되었다. ER-X는 ER-α36과 약간의 유사성을 나타내는데, 그 예는 ER-α66의 리간드-결합 도메인에 대한 항체와 반응하고 E2α 및 E2β에 똑같이 잘 반응함이다. 그러나, 이들 두 수용체의 분자적 정체는 ER-X의 클론화 및 서열결정을 기대한다.
본 발명자들은 또한 ER-α36이 에스트로젠-촉진성 세포 증식을 일으키는 MAPK/ERK 경로의 막-개시성 활성화를 촉진함을 입증하였다. 따라서, 본질적인 전사 활성이 전혀 없는 ER-α36은 에스트로젠-촉진성 세포 증식을 촉진하기에 충분한데, 이는 ER-α66의 전사 비활성 돌연변이체가 DNA 합성을 유도한다는 이전의 보고를 지지한다. 이들 데이터는 함께 ER의 전사 활성이 에스트로젠-촉진성 세포 증식을 촉진하는데 필요하지 않을 수 있음을 나타낸다. 놀랍게도, 본 발명자들은 또한 타목시펜과 같은 항에스트로젠이 MAPK/ERK 신호전달을 활성화하고 실험 기간동안(48시간) 세포 증식을 촉진하였음을 관찰하였다. 이러한 발견은 타목시펜이 에스트로젠 신호전달의 작동약 및 길항약으로서 기능한다는 생각과 잘 일치하고, ER-α36이 또한 막-개시성 항-에스트로젠 신호전달에 관련될 수 있음을 나타낸다.
ER-α66 양성 표현형(ER-양성 유방암)을 갖는 유방암 세포는 ER-α-음성 종양보다 더 분화되고 더 낮은 전이성 전위를 가짐이 널리 공지되어 있다(맥과이어(McGuire, W. L.)의 문헌[Prognostic factors in primary breast cnacer, Cancer Surv. 5, 527-536(1986)]). ER-α36이 ER-α66-양성 유방암의 부분집합에서 뿐만 아니라 검사된 대부분의 ER-α66-음성 유방암에서도 발현함은 흥미롭다. 이러한 결과를 입증하자면, 에스트로젠 신호전달이 에스트로젠 길항약에 의해 방해받지 않을 수 있는 MDA-MB-231 세포내 PI3K/Akt 경로의 신속한 활성화를 유도함이 보고된 바 있고, 이는 ER-비의존성 경로를 통한 에스트로젠 신호전달로서 설명되었다. 고농도의 타목시펜은 또한 MDA-MB-231 세포에서의 세포사멸을 유도하는 것으로 나타났다(만들레커(Mandleker) 등의 문헌[Apoptosis 6, 469-477(2001)]). 이들 데이터는 ER-α66-음성 유방암이 막-개시성 신호전달에 의해 매개되는 에스트로젠 또는 항에스트로젠 효과를 여전히 보유할 수 있음을 강하게 나타낸다.
ER-α36은 또한 ER-α66의 12개 나선중 마지막 5개 나선(나선 8-12)을 ER-α36의 리간드-결합 특이성 및 친화성을 변화시킬 수 있는 독특한 27개 아미노산 도메인으로 대체함으로써 독특한 리간드-결합 도메인을 갖는다. 사실, 본 발명자들은 ER-α36이 E2α 및 E2β, E3 및 E4에 반응하여 똑같이 잘 막-개시성 신호전달을 이끌어 내는 것을 발견하였다. 따라서, ER-α36은 ER-α66보다 훨씬 더 넓은 리간드-결합 스펙트럼을 갖는 것으로 보이고, 이는 ER-α36을 가능하게는 분열촉진성 신호전달의 더 강력한 매개체로 만든다. ER-α36의 리간드-결합 특이성 및 친화성을 추가로 분석하면, ER-α 음성(즉, ER-α66-음성) 유방암을 치료하는데 사용될 수 있는 ER-α36에 특이성인 항에스트로젠의 설계에 도움이 될 것이다.
실시예 4
E2β는 연질 한천에서의 ER-α66 음성 MDA-MB-231 세포의 증식을 촉진한다.
E2β 및 타목시펜의 존재하(함께 또는 따로따로) 및 부재하에 연질 한천에서의 앵커리지-비의존성 생식을 결정하기 위하여, 500개의 MDA-MB231 세포를, 페놀 레드-비함유 DMEM/F12 배지 및 10％ E2-비함유 소태아 혈청을 함유하는 3.5％(wt/vol) 한천 3㎖에 현탁시켰다. 그 다음, 세포를 5개의 복제 60㎜ 접시에 페놀-레드 비함유 DMEM/F12 배지 및 10％ E2-비함유 소태아 혈청을 함유하는 0.7％(wt/vol)위에 도말하였다. 연질 한천위의 세포를 1nM E2β, 또는 1nM 타목시펜과 혼합된 1nM E2β의 존재하 또는 부재하의 배지 및 10％ E2-비함유 소태아 혈청으로 덮었다. 3주 후, 도립 현미경을 사용하여 콜로니를 계수하였다. 도 18에서 볼 수 있듯이, 본 발명자들은 E2 처리가 연질 한천내의 ER-α66 음성 MDA-MB-231 세포의 앵커리지-비의존성 증식을 강하게 촉진하였지만, 항에스트로젠 타목시펜은 E2β의 효과를 저해함을 발견하였는데, 이는 ER-α66 음성 MDA-MB-231 세포가 생각컨대 ER-α36을 통해 에스트로젠 신호전달에 대한 반응성을 보유함을 나타낸다.
실시예 5
E2β는 ER-α66 음성 MDA-MB-231 세포에서 막-개시성 에스트로젠 신호전달을 촉진한다.
E2β가 ER-α 음성 MDA-MB-231에서 막 개시성 에스트로젠 신호전달을 유도하는지를 결정하기 위하여, 혈청 결핍된 MDA-MB-231 세포를 상이한 시간동안 1nM E2β로 처리하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 세포를 EIPA 완충제로 붕괴시키고, 겔 부하 완충제에서 끓이고, 10％ SDS-PAGE 겔에서 분리하였다. 전기영동 후, 단백질을 PVDF 막(밀리포어)으로 옮겼다. 필터를 ERK1/2(K-23)(산타 크루즈 바이오테크날러지)에 대한 항체, 또는 ERK1/2(쎌 시그널링 테크날러지)의 포스포릴화 형태에 대하여 사용된 항체로 탐색하였다. 도 19에서 볼 수 있듯이, MDA-MB-231 세포를 에스트라디올-17β(E2β)로 처리하면 ERK1/2의 신속한 포스포릴화가 유도되었다. 이들 데이터는 E2β가 ER-α66 음성 MDA-MB-231 세포에서 MAPK 경로의 활성화를 촉진함을 강하게 나타낸다.
모든 문헌, 특허 및 특허출원이 본원에 참조로 인용되어 있다. 상기 명세서에서, 본 발명을 그의 임의의 바람직한 실시양태에 관하여 기술하였고, 많은 상세한 내용이 설명을 위하여 기술되었지만, 당업자라면 본 발명이 추가의 실시양태가 가능하고 본원에 기술된 임의의 상세한 내용이 본 발명의 기본 원리로부터 벗어나지 않고 상당히 변화될 수 있음을 알 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> CREIGHTON UNIVERSITY <120> ESTROGEN RECEPTORS AND METHODS OF USE <130> 180.0012 0201 <140> PCT/US 2005/007857 <141> 2005-03-10 <150> 60/552,067 <151> 2004-03-10 <150> 60/643,469 <151> 2005-01-13 <160> 27 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus of SEQ ID NO:20 <400> 1 Gly Ile Ser His Val Glu Ala Lys Lys Arg Ile Leu Asn Leu His Pro 1 5 10 15 Lys Ile Phe Gly Asn Lys Trp Phe Pro Arg Val 20 25 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier protein <400> 2 Gln Phe Phe Gly Leu Met 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier protein <400> 3 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier protein <400> 4 Lys Ala Glu Asp Glu Ser Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier protein <400> 5 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> 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gctaccatta tggagtctgg 600 tcctgtgagg gctgcaaggc cttcttcaag agaagtattc aaggacataa cgactatatg 660 tgtccagcca ccaaccagtg caccattgat aaaaacagga ggaagagctg ccaggcctgc 720 cggctccgca aatgctacga agtgggaatg atgaaaggtg ggatacgaaa agaccgaaga 780 ggagggagaa tgttgaaaca caagcgccag agagatgatg gggagggcag gggtgaagtg 840 gggtctgctg gagacatgag agctgccaac ctttggccaa gcccgctcat gatcaaacgc 900 tctaagaaga acagcctggc cttgtccctg acggccgacc agatggtcag tgccttgttg 960 gatgctgagc cccccatact ctattccgag tatgatccta ccagaccctt cagtgaagct 1020 tcgatgatgg gcttactgac caacctggca gacagggagc tggttcacat gatcaactgg 1080 gcgaagaggg tgccaggctt tgtggatttg accctccatg atcaggtcca ccttctagaa 1140 tgtgcctggc tagagatcct gatgattggt ctcgtctggc gctccatgga gcacccagtg 1200 aagctactgt ttgctcctaa cttgctcttg gacaggaacc agggaaaatg tgtagagggc 1260 atggtggaga tcttcgacat gctgctggct acatcatctc ggttccgcat gatgaatctg 1320 cagggagagg agtttgtgtg cctcaaatct attattttgc ttaattctgg agtgtacaca 1380 tttctgtcca gcaccctgaa gtctctggaa gagaaggacc atatccaccg agtcctggac 1440 aagatcacag acactttgat ccacctgatg gccaaggcag gcctgaccct gcagcagcag 1500 caccagcggc tggcccagct cctcctcatc ctctcccaca tcaggcacat gagtaacaaa 1560 ggcatggagc atctgtacag catgaagtgc aagaacgtgg tgcccctcta tgacctgctg 1620 ctggagatgc tggacgccca ccgcctacat gcgcccacta gccgtggagg ggcatccgtg 1680 gaggagacgg accaaagcca cttggccact gcgggctcta cttcatcgca ttccttgcaa 1740 aagtattaca tcacggggga ggcagagggt ttccctgcca cagtctga 1788 <210> 20 <211> 310 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 20 Met Ala Met Glu Ser Ala Lys Glu Thr Arg Tyr Cys Ala Val Cys Asn 1 5 10 15 Asp Tyr Ala Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys 20 25 30 Lys Ala Phe Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met Cys 35 40 45 Pro Ala Thr Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser Cys 50 55 60 Gln Ala Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys Gly 65 70 75 80 Gly Ile Arg Lys Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg 85 90 95 Gln Arg Asp Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp 100 105 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cgagtttaaa 720 acaagccata tggaagcaca agtgcttaaa aa 752 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cggaattccg aagggaagta tggctatgga atcc 34 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cgggatccag aggctttaga cacgaggaaa c 31 <210> 25 <211> 4359 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 25 ctggtatctc acatgtagaa gcaaagaaga gaatcctgaa cttgcatcct aaaatatttg 60 gaaacaagtg gtttcctcgt gtctaaagcc tctggtcata aggcctcaca gtatcctgca 120 gatcatcaaa tccgtgtgtg gacgtgggga cattttgttt tgaggcagtt acatgaccat 180 gggcaagtgg attggtctct ctggccttca gttttctcat ttgcaatgat tcaatggttt 240 gccttaaagt gtcttaagaa ggataggata gctacccaca aactttggat caaattttct 300 tcaaaacatc cttcccctga ctttaaaata tgccctggca accaacactc aacacccgta 360 gctagatgag ttataacaga gtgactgaag agagctccca caattcctag ttattaaata 420 cctgactaat tttcattagg agacatttaa gaactttagt gatgggaaga tttacatata 480 taattgatag tacaatctga cagagctgaa tagctcctgt ttgtcaactg ttaaattctt 540 tgtgcaatta ggtcaaagat caagatcaaa acaagggctg cccattgacc tgttcactcc 600 tgagaaaaat ggcaaaccat tgaatcataa atcatgacag ccaaaataat tttaggatat 660 taatgcaccc ctcatctttg caagtgagaa aactgaaggc cagagagact aatttacttg 720 cccatttttg ataaaaatgt caccatttac agaatgtgga ctcctatgtt ggagtctgtt 780 gaaggacatg gcacatttaa cagcatcaga gcatttttta ttaaaattta atttgtgcat 840 gacttctaat gctgaagaac gccaagctag gaagaagtca tgggctgaga tggggacaga 900 gagaacacac aatattcagt gactgtccgt gcagctggct gcccttgaaa atatccgaac 960 tatccactgg gaaaatgcct gtccccttgg ggtaattacc agagtttcaa catgcccaaa 1020 gctgcctcat cttcaggggg aacttgttct agcgatttta gtatcaagaa gctaatggtc 1080 ccagggaaag ggttattttt aatatttagc tactgtgcta aaaatcacct aagtttctag 1140 agtcttggga aatttcataa gggaaagaac aaaggcaact tgttgactac ccactggtca 1200 ttctcctctg gtcttattac atacatggat gccagtttag attgtgttta tataggaaaa 1260 tttaaatgtg tgagcctcct taaggaacat catcaataca gatatatcag atagttctgt 1320 ccagcaaaaa acgtgcttat ttgctacaag taaattttta tttatttttc tcacttccct 1380 cactccttca aatttccagg taaatagctg cccaggagtt gcttcatctc tgtcccaaaa 1440 tacctagaca attgcgggat aaggagaatg gcagggaggg agtagtggct aaaatcacac 1500 ccttcaaaag aaagtgtgta ggacacacaa ttgtgagaag tctgaatgcc atgcacatag 1560 ggtatgactc actttgaaaa ttgtttataa tcaaggaaat gaaaatgagt taatttcgtg 1620 catgcatcat ttaaagccaa atgagaagaa acttctaatt tattttgtta cttttcggct 1680 aacactggca gtatgtaaca gatttatttt gcagaaacat ctagattgtc cgtgatcttg 1740 atcctgccct tatgtgtctt gtctttgaaa cccagtgttt cctggatata tggttcagga 1800 gacaagtttc cagaatcaag ttaggaccca ggtcttcttt ttttccaaac caaacattct 1860 tgctaatcct aaactacctg aggcagcctg tggtggcctc agctctaaaa ccattgttta 1920 aaggcttcta cccatcaatg gcccttcagc agagtggtac ggttaacggg gtagggtctg 1980 gagtcagggg agacctgggt tcaaatccta catctttaca cctctaatcc ccagtgtcct 2040 tgtctataaa ttgggaatat agccatgtca tgggattctt gtgagggtta aatgaggtaa 2100 aacacataca atgcttagca tgtatacaat taagcactaa ataattgaaa cacattaagt 2160 actaaatgaa tgtcagcagc ttatcactat tatctgtata atgataccaa gggtgtgccg 2220 actcataccc ttaggggttg gctggattcg gccttttctc tcgggaaaac atacctgatt 2280 tattaatagt gctttcaagc atgtgataaa tttctcaaac tgcctgtctt gttccctaga 2340 aacaccagga aggcctacct caaatagcaa cagagaaacc tatcggagcc ttaccctaca 2400 gctttccttg gggcacgggt gagcaatctg ccttagaggg gagaggctct gtgctgaggc 2460 tctttgaatg ctttgaataa atagatcccc agataatgaa aagacttcaa aacaaattct 2520 acaagaaact gagtagtgtt tatagtgagg ccctagtgta catgcaaaaa acccccactg 2580 cccttgctta aatgtatctg attaacttga atacattttt aaatgagggc tttttttccc 2640 tctttcagtg tttcggccag tcatttgcca cttctcattc catcttagtt ctctgtaaag 2700 aaggtgccag agacctaagg tgcccaaggc aattttgcat tttacaattc taagctttag 2760 aatgaagtca tcaatttgct acatccggac tacagtgcaa ttattccttt gccttgctgg 2820 aaattggagt gaaatctttc tagctgtcaa tttcaactca gttgcagtag tgttttgaag 2880 aattaatggc gataaggtta gaaaatttta agtcaaacgt agggaaaaag taccagctag 2940 accatcataa gcatttgctt tgaaagcatg cttctaaagt gtgtttaacc tcaaataaca 3000 gtcacaaata tggttattat gaatgtatgc acagattttt atgtttctaa ttttaagaag 3060 ttctagggag ctccctgtaa cgatttaggg aatctctaga ttctgatata ctgcaagtct 3120 tttaatggta ggaatcacat tgaattaatt ttgtaggccc agggcctaaa tttagtaggt 3180 gttcagtacc tattggcatc aattcatatg taggtttaaa atactgtatg aagatacaga 3240 atcaccacca tcaaatcaaa ttgaaatatg taacaggcta gtataatatt aacatctgac 3300 tttaaacaac aacaaagaaa ccaaatgagt aactcctccc ttcaaactaa tagtcagttt 3360 cttccaactc agtctctttc tcctctcagg aagaatgcgt atctaaaaat ttcccattgc 3420 agactgctgg aaacaacatt ctaaactatt tatgcttctg caataacctt tccaatttgc 3480 tggaccagtg caagattaaa cacgagatat ctcaagtctc aatgtaaagg aacaccacga 3540 cagcctggac tgtgggtgaa gttcattctt ccccagcaga ctctgccttt cattctcggg 3600 gttgggtgtg ccccaaacag aggtaccgac ggtaacgaag cccaagaatg ttcaaccaca 3660 acctgtctgt gaaggtgttg gatgacgttt gccattcagg tgaagattat ttatgttcca 3720 gtcccacctg agtagcaaag tgaacactgt gctgaatgct cagaaagatg ttaatgaacc 3780 gtgctggaca gagcagagct gaaaggcgcc ttgcgagtgt cgtagtgaga atgtggctgt 3840 cccagctgca aagccctgtt aggaggcatg aggaagcact tgctgcccta agaaacgatg 3900 ccttcgacat tttcaaaaga tctatgtggc tgtctgaaac aatgcggaga gcagatagac 3960 gcaatatttg ggaaccaaag agtgactgct gttggcgttg catcataaca taagcgcttt 4020 cccccttctc gtcactatca tttgtatcaa ccaaagaact gatctctggt atcctcgaag 4080 gaatgctgtg gggatattct tcatctctgt tcatggtaca tcagcaattt gtggggaaaa 4140 gatggactat ataacacaat gatctgccta aaagaaactg tctctactta tagggggctg 4200 agcaaacctt agagcatctg cggatgctcg tcattatctt caaaagtccc caagagtttt 4260 tctccatact ttattattgc tattttgttt aggctagaaa aaaaaaaaac tcataaaatt 4320 gtcttcaaac caaaccaaag gaaaaaaaaa aaaaaaaaa 4359 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gcaaagaaga gaatcctgaa cttgcatcct 30 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ttagtcaggt atttaataac taggaattg 29 1

Claims (52)

  1. 서열 1에 서술된 아미노산 서열 또는 그의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 단클론성 항체인 항체.
  3. 제1항에 있어서, 다클론성 항체인 항체.
  4. 제1항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
  5. 제1항에 있어서, 화합물에 공유결합되어 있는 항체.
  6. 제5항에 있어서, 화합물이 화학요법 제제인 항체.
  7. 제5항에 있어서, 화합물이 검출가능한 마커(marker)인 항체.
  8. 제7항에 있어서, 검출가능한 마커가 형광 마커인 항체.
  9. 제1항에 있어서, 서열 1의 아미노산 13 내지 27번에 서술된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체.
  10. 제1항의 항체를 포함하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  12. 서열 1에 서술된 아미노산 서열 또는 그의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드를 동물에게 투여하고, 동물로부터 상기 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체를 단리함을 포함하는, 항체의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 소단위(subunit)가 운반 폴리펩티드에 공유결합되어 있는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 단리 단계가 동물로부터 항체를 생성하는 세포를 얻음을 포함하는 것이고, 상기 세포를 사용하여 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마(hybridoma)를 제조함을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제12항의 방법에 의해 생성된 다클론성 항체.
  16. 제14항의 방법에 의해 생성된 단클론성 항체.
  17. 서열 20을 포함하는 제1 폴리펩티드, 또는
    서열 20에 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며 ER-α36 활성을 갖는는 제2 폴리펩티드
    를 암호화하는 외인성 암호화 영역을 포함하는 세포.
  18. 제17항에 있어서, 암호화 영역이 구성 프로모터(promotor)에 조작가능하게 연결되어 있는 세포.
  19. 제17항에 있어서, 진핵 세포인 세포.
  20. 제17항에 있어서, 원핵 세포인 세포.
  21. 서열 20을 포함하거나, 또는 서열 20에 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며 ER-α36 활성을 갖는 외인성 폴리펩티드를 발현하는 세포.
  22. 제21항에 있어서, 암호화 영역이 구성 프로모터에 조작가능하게 연결되어 있는 세포.
  23. 제21항에 있어서, 진핵 세포인 세포.
  24. 제21항에 있어서, 원핵 세포인 세포.
  25. 서열 1에 서술된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제제와 혼합하고; 제제와 폴리펩티드 사이의 복합체 형성을 검출함을 포함하는, 폴리펩티드에 결합하는 제제를 확인하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 폴리펩티드에 대한 제제의 결합이, 폴리펩티드에 대한 제제의 결합의 직접적인 검출 및 경합 결합 검정을 사용한 폴리펩티드에 대한 제제의 결합의 검출로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의해 검출되는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 제제가 서열 18을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는지를 결정함을 추가로 포함하는 방법.
  28. 제25항에 있어서, 제제가 폴리펩티드의 ER-α36 활성을 저해하는지를 결정함을 추가로 포함하는 방법.
  29. 세포를 제공하고; ER-α36 활성을 가지고 전기영동 후에 나트륨 도데실 술페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔에서 측정된 분자량이 36kDa인 폴리펩티드에 대하여 세포를 분석하고; 세포가 상기 폴리펩티드를 발현하는지를 결정함을 포함하는, 폴 리펩티드의 검출 방법.
  30. 제29항에 있어서, 세포가 생체외인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 세포가 종양 세포인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 종양이 유방 종양인 방법.
  33. 제29항에 있어서, 세포가 생체내인 방법.
  34. 제30항에 있어서, 세포가 종양 세포인 방법.
  35. 제31항에 있어서, 종양이 유방 종양인 방법.
  36. 제29항에 있어서, 분석 단계가, 서열 1에 서술된 아미노산 서열 또는 그의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체와 세포를 접촉시킴을 포함하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 항체가 검출가능한 마커에 공유결합되어 있는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 검출가능한 마커가 형광 마커인 방법.
  39. 제29항에 있어서, 분석 단계가 mRNA 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜 증폭된 폴리뉴클레오티드를 형성함을 포함하고, 이때 증폭이 세포로부터 얻어진 폴리뉴클레오티드를 서열 22 또는 서열 25, 또는 그의 혼합 서열을 포함하는 mRNA 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 프라이머(primer) 쌍과 접촉시킴을 포함하고, 증폭된 폴리뉴클레오티드의 존재는 세포가 폴리펩티드를 발현함을 나타내는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 프라이머 쌍중 하나의 프라이머가 서열 22의 뉴클레오티드, 서열 25의 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되고, 각각의 프라이머가 15개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 것인 방법.
  41. 서열 1의 아미노산 13 내지 27번에 서술된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포를, ER-α36 활성을 저해하는 화합물과 접촉시킴을 포함하는, 세포의 ER-α36 활성을 저해하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 화합물이 서열 1의 아미노산 13 내지 27번에 서술된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 세포가 생체내인 방법.
  44. 제41항에 있어서, 세포가 ER-α66 음성인 방법.
  45. 제41항에 있어서, 세포가 ER-α46 음성인 방법.
  46. 제41항에 있어서, 화합물이 항에스트로젠이 아닌 방법.
  47. 서열 1의 아미노산 13 내지 27번에 서술된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  48. 제47항에 있어서, 서열 1의 아미노산 1 내지 12번을 추가로 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  49. 제48항에 있어서, 서열 20에 서술된 아미노산 서열을 추가로 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  50. 폴리펩티드가 ER-α36 활성을 갖는, 서열 20에 70％ 이상 동일한 단리된 폴리뉴클레오티드.
  51. 서열 1의 면역원성 단편.
  52. 서열 1에 서술된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 및 포장재를 포함하는 키트(kit).
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070033965A (ko) 2004-03-10 2007-03-27 크레이톤 유니버시티 에스트로젠 수용체 및 사용 방법
JP5265556B2 (ja) * 2006-10-25 2013-08-14 シェノゲン・ファーマ・グループ・リミテッド エストロゲンレセプタ関連疾患を治療するための化合物および方法
HU0700534D0 (en) 2006-11-24 2007-10-29 Mezoegazdasagi Biotechnologiai Transgenic animal with enhanced immune response and method for the preparation thereof
US20110311517A1 (en) * 2009-02-10 2011-12-22 Shenogen Pharma Group, Ltd. Antibodies and methods for treating estrogen receptor-associated diseases
CN102307595A (zh) * 2009-02-10 2012-01-04 盛诺基医药科技有限公司 治疗雌激素受体相关疾病的抗体及方法
US8815779B2 (en) 2009-09-16 2014-08-26 SwitchGear Genomics, Inc. Transcription biomarkers of biological responses and methods
US8841269B2 (en) * 2010-02-23 2014-09-23 Creighton University Polynucleotides for use in treating and diagnosing cancers
EP2627671A1 (en) * 2010-10-15 2013-08-21 Université Libre de Bruxelles Estrogen receptor alpha polypeptide sequence, diagnostic and therapeutic applications thereof
EP3514267B1 (en) * 2011-09-22 2020-11-25 Expression Pathology, Inc. Multiplex mrm assay for evaluation of cancer
JP6265119B2 (ja) * 2012-03-30 2018-01-24 コニカミノルタ株式会社 生体物質検出方法
CN105263962B (zh) * 2013-03-19 2019-12-31 北京盛诺基医药科技股份有限公司 抗体及用于治疗与雌激素受体相关疾病的方法
EP2976362B1 (en) * 2013-03-19 2019-10-23 Beijing Shenogen Pharma Group Ltd. Antibodies and methods for treating estrogen receptor-associated diseases
WO2015010596A1 (zh) * 2013-07-22 2015-01-29 北京盛诺基医药科技有限公司 一种乳腺癌预后诊断的方法
US11610644B2 (en) * 2014-10-24 2023-03-21 Koninklijke Philips N.V. Superior bioinformatics process for identifying at risk subject populations
GB201505305D0 (en) * 2015-03-27 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors
KR101763580B1 (ko) 2015-09-15 2017-08-01 숙명여자대학교산학협력단 인간 글루타티온 s-전달효소 p1-1을 이용한 에스트로겐 수용체 매개된 질환 치료제 스크리닝 방법
CN108191976A (zh) * 2017-12-18 2018-06-22 青岛珅奥基生物工程有限公司 一种抗ER-α36单克隆抗体
CN107987164B (zh) * 2017-12-18 2021-02-19 青岛珅奥基生物工程有限公司 雌激素受体ER-α36抗原多肽及其单克隆抗体
CN114874326B (zh) * 2022-06-21 2023-01-17 图凌(杭州)生物医药有限公司 一种检测雌激素受体α的单克隆抗体及其制备方法和应用

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4036945A (en) 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4784949A (en) 1984-04-19 1988-11-15 Cetus Corporation Universal dominant selectable marker cassette
DE3583940D1 (de) 1984-10-02 1991-10-02 Harry M Meade Herstellung von streptavidinaehnlichen polypeptiden.
US5560922A (en) 1986-05-30 1996-10-01 Rutgers, The State University Of New Jersey Transdermal absorption dosage unit using a polyacrylate adhesive polymer and process
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5788983A (en) 1989-04-03 1998-08-04 Rutgers, The State University Of New Jersey Transdermal controlled delivery of pharmaceuticals at variable dosage rates and processes
US5312752A (en) 1989-07-31 1994-05-17 Trustees Of Boston University Specific antibodies against the DNA-binding domain of and immunoassays to determine the presence and functional status of estrogen receptor proteins
US5053133A (en) 1990-02-09 1991-10-01 Elias Klein Affinity separation with activated polyamide microporous membranes
US5595887A (en) 1990-07-16 1997-01-21 Bionebraska, Inc. Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment
EP0703989B1 (en) * 1993-06-18 1997-11-05 Oy Biotie Therapies COMPOSITIONS AND DIAGNOSTIC METHODS USING MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST CD44v6
EP0888543A4 (en) 1996-03-20 2004-04-07 Scripps Research Inst CHANNEL ESTIMATION DEVICE
US6306434B1 (en) 1997-02-12 2001-10-23 Chong Kun Dang Corp. Pharmaceutical composition comprising cyclosporin solid-state microemulsion
GB9716790D0 (en) 1997-08-07 1997-10-15 Creative Peptides Sweden Ab Recombinant DNA molecules comprising multimeric copies of a gene sequence and expression thereof
US6365146B1 (en) 1999-04-23 2002-04-02 Rutgers, The State University Of New Jersey Polymer encapsulation of hydrophobic materials
US6416758B1 (en) 1999-04-28 2002-07-09 Board Of Regents, The University Of Texax System Antibody conjugate kits for selectively inhibiting VEGF
IT1313552B1 (it) * 1999-06-29 2002-09-09 European Molecular Biology Lab Embl Isoforme del recettore alfa degli estrogeni umano
CA2400915A1 (en) * 2000-02-22 2001-08-30 Pe Corporation (Ny) Estrogen receptor alpha variants and methods of detection thereof
DE60130852T2 (de) 2000-06-12 2008-07-17 Fujirebio Inc. Immuntest zur Messung des humanen C-Peptides sowie Reagenzienkit hierfür
CN1511040A (zh) * 2001-05-25 2004-07-07 ����˹���ѷ��ѧ 作为多种治疗模式基础的蛋白质的选择性剪接形式
US20060287226A9 (en) 2001-06-15 2006-12-21 Deecher Darlene C Characterization of a membrane estrogen receptor
US20060240016A1 (en) * 2001-12-18 2006-10-26 Luc Aguilar Activity of THAP-family chemokine-binding domains
US20070015271A1 (en) * 2002-04-04 2007-01-18 Rosen Craig A Human secreted proteins
WO2004016653A2 (en) 2002-08-15 2004-02-26 Leukotech A/S Bactericidal, anti-apoptotic, pro-inflammatory and anti-inflammatory peptides of heparin-binding protein (hbp) or human neutrophil elastase
US20030044412A1 (en) 2002-08-26 2003-03-06 Pietras Richard J. Membrane estrogen receptor-directed therapy in breast cancer
KR20070033965A (ko) 2004-03-10 2007-03-27 크레이톤 유니버시티 에스트로젠 수용체 및 사용 방법
US20110311517A1 (en) * 2009-02-10 2011-12-22 Shenogen Pharma Group, Ltd. Antibodies and methods for treating estrogen receptor-associated diseases
US8841269B2 (en) * 2010-02-23 2014-09-23 Creighton University Polynucleotides for use in treating and diagnosing cancers

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