JPH11503029A

JPH11503029A - Ｉｌ―１６の多量体形態、それらを生産するための方法及びそれらの使用

Info

Publication number: JPH11503029A
Application number: JP52328697A
Authority: JP
Inventors: ランク，クルト; クルト，ラインハルト; ベーエル，ミヒァエル; バネルト，ノルベルト; メッツネル，カリン; ベルナー，アルドレフト
Original assignee: Bundesrepublik Deutschland
Current assignee: Bundesrepublik Deutschland
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-17
Publication date: 1999-03-23
Anticipated expiration: 2016-12-17
Also published as: CA2240392C; MX9805060A; JP3172968B2; DE19547933A1; AU1196297A; WO1997023615A1; AU701709B2; CA2240392A1; ZA9610766B; EP0870029A1; DE19681159D2

Abstract

(57)【要約】本発明は、所定の量において金属イオンを任意に含み、そして周知のIL−16より活性のあるIL−16の多量体形態に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 IL−16の多量体形態、それらを生産するための方法及びそれらの使用本発明は、IL−16活性を有するポリペプチドの多量体形態、それを生産するための方法及びそれらの使用に関する。 IL−16（インターロイキン−16）は、リンパ球化学誘引因子(LCF)又は免疫不全ウイルス抑制リンホカイン（ISL）としても呼ばれるリンホカインである。ISL 及びその特性は WO 94／28134，WO 96／31607 に記載され、並びにCruikshank， W.W.ら（Proc.Natl.Acad.Sci．USA 91（1994）5109〜5113）及びBaier，M.ら(Na ture 378（1995）563)により開示される。IL−16の組換え生産もこれらの文献に記載される。これらによれば、単量体IL−16は分子量13,385Ｄのタンパク質である。Cruikshankは、50〜60kD及び55〜60kDの分子量の多量体形態として ISLが分子ふるいクロマトグラフィーにおいて溶出することも見い出した。その化学誘引活性がこの多量体形態に関与している。分子量28kDのIL−16のホモダイマー形態が Baierにより開示される。しかしながら、Cruikshankら（J.Immunol．146（19 91）2928〜2934）により開示される化学誘引活性及び Baierにより開示される組換えヒトIL−16の活性は極めて小さい。本発明の目的は、IL−16の活性を改善すること及び治療的適用に有利に適する IL−16の形態を再現可能に提供することである。本発明の目的は、（ゲルろ過HPLCで測定して）少くとも約70kDの分子量を有し及び／又は所定量の金属イオンを有するIL−16サブユニットの生物学的に活性な多量体形態により達成される。驚くことに、４超のサブユニットを含むIL−16サブユニットの多量体形態が単量体、二量体又は三量体形態よりかなり高いIL−16活性を有することが判明した。これらの多量体の分子量は、Baierら及びCruikshankらにより記載されるIL−16の形態からかなり異なる。驚くことに、不活性であるとして Baierらにより記載される28kDの分子量を有するIL−16の二量体形態は、金属イオンとのインキュベーションにより、以下、二量体と区別するために四量体として言及される分子量45±４kDのより高分子量の活性形態に転化することができる。 IL−16を含む溶液への金属イオンの添加によるこのIL−16の四量体形態の生産及びこの方法で得ることができる（サブユニットの分子量に依存する）少くとも 45±４kDの分子量のIL−16の四量体形態が本発明の更なる対象である。更に、IL−16の四量体形態を、本発明の対象でもある少くとも約70kDの分子量を有するIL−16の重合体に変えることができることを見い出した。少くとも約70kDの分子量を有するIL−16の多量体形態は、好ましくは所定の数のサブユニットを含み、ここでその多量体形態におけるサブユニットの数は６を超え、好ましくは６〜32の間、特に好ましくは８〜16の間である。８又は16サブユニットを有するIL−16の多量体形態及びそれらの混合物が特に好ましい。 IL−16の活性が、金属イオンの存在により更に増加され得ることも判明した。この関連において、IL−16サブユニットの活性な単量体又は多量体形態の調製物はその溶液中に存在するIL−16サブユニットのモル濃度の少くとも50％のモル濃度で金属イオンを含むことが好ましい。サブユニット当りの金属イオンの割合は、好ましくは、0.5〜２の間、特に好ましくは 0.5〜１の間である。またこの場合、本発明によるIL−16形態は前記範囲内で所定含有量の金属イオンを有することが好ましい。このための好ましい調製物は、 −サブユニット当り１の金属イオンを含む約13〜35kDの分子量を有するIL−16 サブユニット、 −１又は２の金属イオンを含むIL−16サブユニットの二量体、 −２又は４の金属イオンを含むIL−16サブユニットの四量体である。本発明の範囲内のIL−16の調製物は、例えば、水性の、好ましくは緩衝された溶液又は凍結乾燥物である。その調製物は、好ましくは治療的適用のため又は医薬剤の生産のために適する。この場合において、IL−16の濃度は治療に有効な範囲である。この調製物は、更に、補助物質及び特に医薬的補助物質、例えば可溶化剤、充填剤等を含み得る。 IL−16の生物活性は、この目的のため本発明の開示の対象である、CD４レセプターによりＴ細胞に結合する特性及び好ましくは国際出願 WO 96／31607 に記載されるような HIV及び SIVの複製を抑制する特性として理解される。用語IL−16は、本発明の範囲内において、IL−16の活性を有するポリペプチドとして理解される。好ましい実施形態において、IL−16は、WO 94／28134 に記載され、この目的のため本発明の対象である免疫調節活性を有する。その免疫調節特性は、IL−16 で、成長因子、例えばIL-２で、又は抗CD３抗体での細胞分割の刺激により測定することができる。このような方法は、WO 94／28134 に記載される。特に、IL−16は、次の特性： −CD４レセプターによるＴ細胞への結合、 −IL−２レセプターの発現及び／又はCD４⁺リンパ球上のHLA-DR抗原の刺激、 −IL-２の存在下でのＴヘルパー細胞の増殖の刺激、 −抗CD３抗体で刺激されたＴヘルパー細胞の増殖の抑制、 −ウイルス、好ましくは HIV−１， HIV−２又は SIVの複製の抑制のうちの１つ又はいくつかを示す。 IL−16サブユニット（IL−16単量体）は、多量化後にIL−16活性を有し、そしてａ）配列番号：１による DNA配列又は相補配列によりコードされ、ｂ）ストリンジェント条件下で配列番号：１とハイブリダイズする DNA配列によりコードされるポリペプチドとして理解される。そのポリペプチドは好ましくは、国際出願 WO 96／31607 に記載されるテスト手順において上述した機能を示し又は WO 94／28134 に従って細胞分割を刺激する。 IL−16サブユニットの配列はその DNA配列によりコードされるタンパク質配列からある程度、異なり得る。このようなアミノ酸バリエーションは、アミノ酸置換、欠失又は付加であり得る。しかしながら、IL−16のアミノ酸配列は、好ましくは少くとも75％、特に好ましくは少くとも90％、配列番号：１及びその中に含まれるIL−16の活性領域と同一である。この領域は、配列番号：１と比べて、Ｎ末端及び／又はＣ末端で端を切り取られている。サブユニットの分子量は、好ましくは約13〜35kDである。用語“ストリンジェント条件下でハイブリダイズする”とは、２つの核酸フラグメントが例えばSambrookら（“Expression of clone d genes in E．coli”in Molecular Cloning: A laboratory manual(1989)，Col d Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA）に開示されるような標準化されたハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることを意味する。このような条件は、例えば約45℃での 6.0×SSC 中でのハイブリダイゼーション、次の50℃での２×SSC での洗浄ステップである。ストリンジェンシーを選択するために、洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば低ストリンジェンシーについて50℃で 2.0×SSC 及び高ストリンジェンシーについて50℃で 0.2×SSC の間で選択され得る。更に、洗浄ステップの温度は、低ストリンジェンシーについて室温約22℃及び高ストリンジェンシーについて65℃の間で変えることができる。本発明の範囲内で多数の金属イオンが金属イオンとして適する。アルカリ土類金属及び側鎖基の要素が適切であることが判明している。アルカリ土類金属、コバルト、亜鉛、セレン、マンガン、ニッケル、銅、銀、マグネシウム、カルシウム、モリブデン及び銀が特に適する。鉄は、一価、二価、三価又は四価であり得る。二価イオン、特にCu（II）イオンが特に好ましい。それらのイオンは、好ましくは、MgCl₂，CaCl₂，MnCl₂，BaCl₂，LiCl₂，Sr(NO₃)₂，Na₂MoC₄，AgCl₂，Cu （II）アセテートの溶液として添加される。 IL−16は、好ましくは、原核又は真核宿主細胞において組換えで生産される。このような生産方法は、例えばこの目的のため本発明の開示の対照でもある WO 94／28134 及び WO 96／31607 に記載される。しかしながら、規定されかつ再現可能な様式で組換え生産によりIL−16の本発明による形態を得るために、当業者に周知である組換え生産のための方法を超える基準がとられなければならない。それゆえ、本発明は、原核又は真核宿主細胞中でのIL−16をコードする核酸の発現、並びに生産及び精製の間、IL−16サブユニット当り少くとも0.25の金属イオン、好ましくは少くとも 0.5の金属イオンが存在し、IL−16の所定のオリゴマー化を触媒することを特徴とする前記多量体形態の単離による、IL−16の生物学的に活性な多量体形態の生産のための方法に関する。その生産方法において、いくつかの多量体IL−16形態の混合物も形成され得る。この混合物は、その個々の構成物に分離した時又は混合物としてのいずれかで、好ましくは精製の後に、例えば治療に用いることができる。驚くことに、本発明による方法は、IL−16活性を有するポリペプチドを、規定されかつ再現可能な様式で多量体化することを可能にする。この方法において、IL−16は、所定範囲の反応条件（例えば温度、pH値等）に依存するオリゴマー化において得られる。金属イオンの添加は、発酵の間又は精製の間に行うことができる。本発明によるIL−16形態は、形成される組換えIL−16のグラム当り約 0.1μmol／ｌ〜10mmo l／ｌの金属イオンが発酵の間、存在する場合に得られることが判明している。この関連において、金属イオン濃度の上限は重要でなく、単に、微生物又は細胞系がこれらの金属イオンを許容する能力に、及び用いる金属化合物又は塩の可溶性による。0.5μmol／ｌ〜10mmol／ｌの金属イオン濃度が好ましくは用いられる。金属イオンの発酵媒体への添加による活性金属タンパク質の収率の増加は、例えば、Hoffmanら（Protein Expression & Purific．６（1995）646-654）により開示される。金属イオンがそれから分離され得る金属イオン又は金属化合物の添加は、好ましくは、発酵調製物の溶菌の間、精製の間又は精製されたIL−16の段階で行われる。適用又は溶離緩衝液における透析又はクロマトグラフィーステップの前又はそれらの間に金属イオンを用いることが好都合である。 IL−16サブユニットの多量体形態の調製は、本発明によるIL−16 形態の組換え生産において得られる。ここでサブユニットの数は好ましくは、６〜32であり、原核生物における組換え生産の生産物として哺乳動物細胞が実質的に存在しないか、又は真核生物における組換え生産の生産物として天然のヒトタンパク質は実質的に存在しない。本発明の更なる実施形態は、単量体IL−16サブユニット又はIL−16二量体を金属イオンとインキュベートすることにより多量体IL−16を生産するための方法に関する。この方法は、そのIL−16サブユニットが組換え法で単離されたか他の手段（例えば合成で又は天然のソースから）によるかにかかわらず、用いることができる。本発明は、更に、IL−16サブユニットの単量体又は二量体形態の多量体化の程度を増加させるための方法に関する。この方法において、その単量体又は二量体形態は、１又は複数のより高い多量体化したIL−16の形態がその手段により形成される金属イオンとインキュベートされる。多量体化は、好ましくは、サブアルカリ、中性又は酸性の範囲で、好ましくは pH３〜９の間、特に好ましくはpH３〜８の間の範囲で行われる。多量体形態の収率及び多量体化の時間は塩酸グアニジン又は尿素のような変性剤を加えることにより改善することができる。このような変性剤は０〜８ mol／ｌの濃度で加えることが好都合である。金属イオンとのインキュベーションにおいて、変性剤の濃度は、希釈又は透析により好ましくは変性しない濃度（塩酸グアニジンについて例えば約０〜２ mol／ｌ）に削減することができる。金属イオン依存性多量体化は、キレート化剤、例えばEDTAにより、又は精製に用いられる金属アフィニティーキレート Sepharose上の金属イオンのための遊離結合部位により阻害することができる。特に有効な四量体化は、ほぼ等しいモル濃度において又はIL−16 に対して過剰量において金属イオンをIL−16とインキュベートした時に短時間で達成される。ここでその反応速度はその反応物の濃度による。それゆえ、金属イオン濃度が低い場合、それはかなり長い時間、インキュベートしなければならない。四量体化は、広いpH範囲、特にpH 2.5〜10の範囲で行われる。四量体化の後、更なる多量体化は、更なる金属イオンの添加なしでも、pH５〜７又は 7.5の間で好ましくは行うことができる。見掛け分子量約70kD超、好ましくは90〜150kD で、分析用分子ふるいHPLCカラムから、分離したピークとして溶出するIL−16多量体が特に好ましい。ポリマー形成は、先の金属イオン依存性四量体化によって誘導することができる。更に、多量体化の程度は、各々の緩衝液組成（緩衝液の型、例えばイミダゾール、MES 、酢酸、グリシン、クエン酸、pH値、GdmCl濃度）によって影響を受ける。生物学的に活性なIL−16の更に好ましい実施形態は、少くとも45±４kDの分子量を有し、単量体又は二量体の金属イオンとのインキュベーションによって得ることができる。このようなIL−16調製物は、治療組成物における治療的使用に特に適する。このような組成物は、有利には、通常の充填剤、補助物質及び添加物も含む。以下の実施例及び出版物、配列プロトコル及び図面は、特許の請求の範囲から明らかになる本発明の範囲を説明する。その記載される発明は、改良された後でも本発明の対照をなお記載する例として理解されるはずである。図１：１）トロンビンでの開裂前、２）トロンビンでの開裂後及び３）−５） Q-Sepharoseによる開裂及び精製の後（種々の画分）における還元条件下でのIL −16(0.1Ｍ DTEでのサンプル)のSDS-PAGE。図２：トロンビンでの開裂及び Q-Sepharoseによる精製後のIL−16の RP-HPLC 溶出ダイアグラム。図３Ａ、図３Ｂ：Ａ）トロンビンでの開裂前のIL−16融合タンパク質の、Ｂ）トロンビンでの開裂及び Q-Sepharoseによる精製後のIL−16の、分子ふるいHPLC溶出ダイアグラム。図４：0.1Ｍ Tirs／HCl、250μＭ Cu(II)アセテート、pH 8.5中の変性したIL −16の再生後の二量体（RT＝11.4分）及び四量体（RT＝10.06分）IL−16の分子ふるいHPLC溶出ダイアグラム（実施例４を参照のこと）。図５：BSA(MW 66kD; RT 9.17分)、オブアルブミン（MW 43kD; RT 9.98分）、キモトリプシノーゲン(MW 25kD; RT 11.89分)及びリボヌクレアーゼＡ(MW 13.7k D; RT12.87分)を用いるHPLCふるいカラムの検定ラン。図６：137μＭ IL−16の、250μＭ Cu(II)アセテートとのインキュベーション後の四量体IL−16の分子ふるいHPLC溶出ダイアグラム（実施例１０を参照のこと）。図７：50mM MES、250μＭ Cu(II)アセテートpH 5.5中の16時間のIL−16のインキュベーション後の二量体（３％；RT 11.66分）、四量体（32％；RT 10.30分）及びポリマー（65％；RT 7.39分）の分子ふるいHPLC溶出ダイアグラム。配列番号：１は、ヒトIL−16の配列を示す。配列番号：２は、配列番号：１に従うアミノ酸配列を示す。配列番号：３〜８は、プライマー配列を示す。配列番号：９〜11は、ペプチド配列を示す。実施例１ IL−16のクローニング及び発現 1.1 RNAの単離（ヒト又はサルからの）５×10⁷PBMCを10μｇ／mlのユンカナバリンＡ及び 18 0Ｕ／mlのIL−２と共に、48時間、培養した。RNAを調製するために、その細胞を PBSで一回、洗い、そして次に５ml変性溶液(RNA単離キット、Stratagene)で溶解した。そのライゼートを、１ml Naアセテート、５mlフェノール及び１mlクロロホルム／イソアミルアルコール（24：１）を添加した後15分、氷上に維持した。次にその水性相を、RNAを沈殿させるために６mlのイソプロパノールと混合し、−20℃で２時間、保存した。その沈殿を最後に純粋なエタノールで１回、洗い、150μｌの H₂Oに溶かした。その収率を光度測定により決定し、それは 120μ ｇであった。 1.2 cDNA合成 cDNA合成のための混合物は15μｌの量で10μｇの RNA、0.2μｇのオリゴ−dT 、13mMの DTT及び５μｌのバルク第１鎖反応混合物(第１鎖cDNA合成キット、Pha rmacia)を含んでいた。その混合物を37℃で１時間、インキュベートし、次に後の使用のため−20℃で保存した。 1.3 IL−16 cDNA の増幅及びクローニング PCRによるIL−16 cDNA の増幅のため及び次にクローニングのため、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。これらのプライマーは、更なる NdeＩ又はBamHＩ開裂部位を導入する。それら PCR混合物(100μｌ反応容量)は、各々１μｌのcDNA（セクション３での合成からのもの）、50pmolのプライマー１及び２、12.5μmol の dNTPs、10μｌの10× TAQ緩衝液及び 2.5ユニットの Taqポリメラーゼ（Perkin -Elmer）を含んでいた。そのサイクル条件は30秒、94℃、１分、53℃及び１分、72℃であった。35サイクルを行った。 1.4 トロンビン開裂部位での発現クローンの調製その PCR産物を精製し、NdeＩ及びBamHＩで37℃で16時間、消化した。クローニング調製のため、ベクターpET15b(Novagen)も NdeＩ及びBamHＩで開裂し、次にアガロースゲルで精製した。 100ngのベクター、25ngの PCR産物（挿入）、２μｌの10×リガーゼ緩衝液及び 0.2μｌのリガーゼ(New England Biolabs)を含む20μｌの混合物中で、室温で２時間、連結を行った。2.5kV、25μFarad、200ohm(BIO-RADエレクトロポレーター)での大腸菌内へのエレクトロポレーションによる形質転換の後、その細胞をアンピシリン耐性プレート上においた。適切な大腸菌、例えばDH５は当業者に周知である。組換えクローンをプラスミド調製物（pMISLB）の制限分析により同定し、要求されるタンパク質発現のために大腸菌に形質転換した。ヌクレオチド配列を決定することによりIL−16のクローニングを更に確認することが可能であった。見い出された配列は、コドン96の不一致を除き、公開された LCF配列（Cruikshank， W.W.，ら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 91（1994）5109〜5113）に相当する。公開された配列と対照的に、コドン96は塩基配列 TTGではなく配列 TTTからなる。独立した PCR増幅から得られた更なるIL−16クローンの配列決定は、コドン96における本当のIL−16配列が実際に配列 TTTにより表されることを明らかに示した。 1.5 短縮化したIL−16のための発現クローンの生産クローニング例IL−16： IL−16 cDNA の増幅のため及び次の発現クローニングのため以下のオリゴヌクレオチドを合成した。 IL−16遺伝子での PCRの後、pUC内のlacZ融合物、６のヒスチジンコドン及びエンテロキナーゼ開裂部位のためのコドン(DDDDK；配列番号：９)を形成するために、プライマーISL1をEcoRＩ開裂部位及び“ｔ”に挿入した。 IL−16遺伝子での PCRの後、pUC内のlacZ融合物を作るために、EcoRＩ開裂部位及び“ｔ”にプライマーISL2を挿入した。プライマーISL3をプライマーISL1と同じ場所及びAAA（Lys）コドンの後の更なる ATGに更に挿入する。プライマーISL4は、ISL1〜ISL3に対するカウンタープライマーであり、それを BamHＩ及びIL−16遺伝子の３′末端におけるHindIII開裂部位に挿入する。上述のプライマーの適切な組換え及び PCR産物の適切なベクターへのクローニングにより、大腸菌内で種々の型のIL−16を発現することが可能である。 ISL1及びISL4の組合せは、発現した時に６のＮ末端ヒスチジン及び１のエンテロキナーゼ開裂部位を含むIL−16において、例えば PCRの後、その生成物をEcoR Ｉ及びHindIIIで再び開裂し、例えば lacプロモーターの後をクローニングし、そしてプロセッシング及びエンテロキナーゼでの開裂後にＮ末端 Metのない成熟 IL−16を生成する（Ｎ−末端の PDLNS；配列番号：10）。 ISL2及びISL4の組合せは、PCR後の配列MPDLNS（配列番号：11）で開始する発現、その生成物のEcoRＩ及びHindIIIでの再開裂及び例えば lacプロモーターの後のクローニング後に、成熟IL−16を生成する。 ISL3及びISL4の組合せは、PCR、その生成物のEcoRＩ及びHindIIIでの再開裂及び例えば lacプロモーターの後ろのクローニングの後、Ｎ末端の配列MPDLNS（配列番号：11）で開始する発現及びエンテロキナーゼでの開裂の後、成熟IL−16を生成する。 lacZ融合物は、用いるプラスミドにより（例えば pUCプラスミド内のクローニングの場合に）形成することができる。大腸菌内で十分に機能するいずれかのプロモーターを、lacプロモーターに加えて用いることができることが明らかである。例は、例えば、tacプロモーター又は mglプロモーターであろう。低複製及び高複製プラスミドがプラスミドとして考慮に入れられる。実施例２ IL−16のための大腸菌発現クローンの10ｌ発酵及び高圧破砕プレ培養物を保存培養物（−20℃で保存したプレートスミア又はアンプル）からセットアップし、それを振とうしながら37℃でインキュベートした。次のより大きい寸法への接種容量は各々の場合、１〜10容量％である。プラスミド損失に対して選択するために、プレ培養及び主培養においてアンピシリン（50〜100 mg ／ｌ）を用いる。Ｎ−及びＣ−源としての酵素で消化したタンパク質及び／又はイースト抽出液並びに更なるＣ−源としてのグリセロール及び／又はグルコース栄養素として用いる。その培地をpH７に緩衝し、生理的に許容される濃度で金属塩を加えて発酵過程を安定させる。その発酵は、イースト抽出液／Ｃ源混合物を投与したフィードバッチとして行う。その発酵温度は25〜37℃である。その解かした酸素分圧(p O₂)を、エレーション速度、r.p.m.制御及び投与比の手段により20％未満に維持する。その増殖を 528nmでの光学密度（OD）を決定することにより決定する。IL −16の発現を、IPTGにより誘導する。約10時間の発酵期間の後、その生物量をOD 停止における遠心により収集する。その生物量を50mMのリン酸ナトリウム、５mM のEDTA、100mMの塩化ナトリウム、pH７にとり、連続的な高圧プレスにより1000b ar で破砕する。この方法で得られた懸濁液を再び遠心し、その溶けたIL−16を含む上清を更に処理する。実施例３組換えIL−16の精製 50mMリン酸ナトリウム、５mM EDTA、100mM NaCl、pH 7.2中の 550ml溶解上清を55mlの５ＭのNaCl、60mMの MgCl₂、pH 8.0と混合し、30分、撹拌し、そして次に20,000ｇで30分、遠心した。400mlの上清を、先に30μMol の NiCl₂／mlゲルを充填しそして50mMリン酸ナトリウム、0.2Ｍ NaCl、pH 8.0で平衡化したニッケル−キレート Sepharoseカラム(Ｖ＝60ml；Pharmacia)にとった。次にそのカラムを 300mlの50mMリン酸ナトリウム、0.5Ｍ NaCl、pH 7.0で洗い、次にそのIL− 16融合タンパク質を、50mMのリン酸ナトリウム、0.1ＭのNaCl、pH 7.0中の０Ｍ〜300mM のイミダゾール、pH 7.0（２^*0.5ｌ勾配容量）で溶出した。IL−16を含む画分をSDS-PAGEにより同定し、プールした。この方法で得られた融合タンパク質 300mgを20ｌの20mMイミダゾール、pH 5.5 に対して４℃で透析し、次に濁りを除くために20,000ｇで30分、遠心した。次にその遠心の上清をNaOHでpH 8.5に調節し、0.3ｇのトロンビン（Boehringer Mann heim GmbH）と混合し、そして37℃で４時間、インキュベートした。次に、その開裂混合物をHClでpH 6.5に調節し、そしてその伝導度をH₂Oでの希釈により 1.7 msにセットした。そのサンプルを、先に20mMイミダゾールpH 6.5で平衡化したQ- Sepharose FFカラム(45ml；Pharmacia)に適用した。IL−16を20mMイミダゾール、pH 6.5中の0〜0.3 ＭのNaClの勾配を用いて溶出した。IL−16を含む画分をSDS -PAGEにより同定し、プールした。IL−16の同定を、質量分析（分子量13,566± ３Ｄ）及び自動Ｎ末端配列分析により確認した。濃度を決定するために、IL−16 のUV吸光度を 280nmにおいて決定し、この波長における5540Ｍ^-1cm^-1の計算したモル吸光係数（Mackら(1992)Analyt.Biochem．200，74〜80）及び13,566Dの分子量を用いた。この方法で得られたIL−16は、還元条件下でのSDS-PAGEにおいて95℃超の純度を有した。この分子種とした約27,000Ｄの見掛け分子量（図３を参照のこと）で、BSA、オグアルブミン、キモトリプシノーゲン及びリボヌクレアーゼＡで検定した分析用HPLCゲルろ過カラム（Superdex HR75; Pharmacia）から溶出したIL−16を、以下、“二量体”と呼ぶ。その分析用Superdex 75 FPLCカラム(Pharmacia)を、25mMのNaホスフェート、0 .5ＭのNaCl、10％のグリセロール、pH 7.0で、１ml／分の流速で溶出した。100 〜150μｌの量で適用したタンパク質の量は 1.5〜15μｇのタンパク質であった。検出は 220nmにおいてであった。 RP-HPLCにより純度を分析するために、Vydac，Protein & Peptide C18、４×1 80mm カラムを用いた。それは、１ml／分の流速で30分以内に、０％〜80％のＢの勾配（溶媒Ｂ：0.1％ TFA中90％アセトニトリル；溶媒Ｂ：水中 0.1％ TFA）で溶出した。検出は 220nmにおいてであった。 Cruikshank W.W.ら（Proc.Natl.Acad.Sci．USA 91（1994）5109〜5113）は、活性分子種として50〜60kDの見掛け分子量のIL−16のポリマー形態を記載するので、この方法で単離した高純度のIL−16を用いて、変性及び再生実験により二量体形態をポリマー形態に変えることを試みた。実施例４ IL−16の変性及び再生（ａ）IL−16の再生／四量体化へのpH値、EDTA及び酢酸銅（II）の影響 37mgのIL−16を20mMのリン酸ナトリウム、pH 7.0に対して透析し、次に 7.1mg ／mlの濃度に濃縮した。IL−16を、１mlの８Ｍ GdmCl、0.1Ｍグリシン／HCl、２ mM EDTA、１mM DTE、pH 1.8を加えることにより変性して 0.5mlのIL−16濃縮物とした。１時間のインキュベーションの後、この溶液の 100μｌアリコートを、室温（23＋／−３℃）で、表１に記載される再生緩衝液 2.2ml中に希釈した。ポリマーIL−16の形成を、分子ふるいHPLCにより、少くとも２時間のインキュベーション後に分析した。表１から見ることができるように、先にＮ₂を通しEDTAを含んでいる緩衝液中で再生を行った場合にはpHと独立して高分子IL−16種は形成されなかった。驚くことに、EDTAなしかつ窒素通気なしの緩衝液中で、特に酢酸銅の存在下でのみ、高分子IL−16会合物が形成された。その高分子形態は、分析用分子ふるいHPLCカラムから、均一なピークとして溶出し（図４を参照のこと）、約45±４kDの見掛け分子量を有する。それを“二量体”形態から区別するために、この分子種は以下、“四量体 ”と呼ぶ。ジスルフィド架橋の酸化的形成のために銅イオンを用いるので、四量体化への酸化還元系を、以下より詳細に検査した。（ｂ）IL−16の“四量体化”への酸化還元系及び金属イオンの変性の影響 7.1mg／mlの濃度の実施例１に記載の濃縮物 400μｌを、１） 800μｌの 8.0Ｍ GdmCl、0.1Ｍグリシン／HCl、１mM DTE、pH 1.8（＝変性IL-16）又は２） 800μｌの20mMのリン酸ナトリウム、pH 7.0（＝ネイティブ IL−16）に希釈し、１時間インキュベートした。次にこれらの希釈物各々 100μｌを、0. 1Ｍ Tris／HCl、pH 8.5及び表２に記載される添加物の水溶液 2.2mlに希釈した。２）からの“ネイティブIL−16”を更に希釈した緩衝液は、全ての再生溶液が同一の GdmCl濃度を有するように、0.23Ｍの GdmClを含んでいた。表２に示すように、GSH及びGSSGを含むタンパク質のための通常の酸化還元系がいずれの効果も有さないので、酸化還元反応は四量体化にいずれの影響も有するようでない。更に、銅イオンに加えて、マグネシウム及びカルシウムイオンも四量体化を誘導することができるので、金属イオンは四量体を安定化させるために本質的であるようである。高濃度の変性剤によるIL−16の変性は、これが、IL −16の先の変性なしでもおこることから、四量体化に明らかに必要でない。平衡の調節において及び秒オーダーの会合反応においても予想されるであろうように、表２で酢酸銅について見ることができるように、金属イオンの濃度が増加するにつれて四量体IL−16の収率も更に増加する。実施例５四量体化への GdmClの影響 IL−16の完全な変性は四量体化に明らかに必要でないので、低 GdmCl濃度の影響を検査した。このため、実施例４ａに記載されるIL−16濃度を、表３に記載される添加物を更に含む 0.1Ｍ Tris／HCl、pH 8.5で71倍に希釈した。表３で見ることができるように、四量体化は種々の金属イオンについての非変性濃度の変性剤の添加により低IL−16濃度で支持することができる。実施例６ IL−16の酢酸銅（II）の四量体化の速度 IL−16の四量体化は、少くとも１秒又はより高いオーダーの反応であるので、酢酸銅（II）の存在下での四量体化の速度を検査した。このため、実施例４ａに記載されるIL−16濃縮物20μｌを 800μｌの 0.1Ｍ Tris／HCl、250μＭ酢酸銅（II）、0.25M GdmCl、pH 8.5に希釈し、そしてサンプルを、分析用分子ふるいHPLCカラムにより、種々のインキュベーション期間の後に、それらの四量体の含有量について検査した。表４で見ることができるように、四量体化は比較的ゆっくりとした反応であるが、その速度は反応物の濃度に依存する。実施例７酢酸銅（II）によるIL−16の四量体化へのEDTAの影響 EDTAは、二価金属イオンと高アフィニティー複合体を形成する。それゆえ、ED TAによる四量体化の阻害は、これが二価金属イオンにより誘導されることを証明する。このため、実施例４ａに記載されるIL−16濃縮物を、0.1Ｍ Tris／HCl、0.25 Ｍ GdmCl、250μＭ酢酸銅（II）、pH 8.5及び増加濃度のEDTAから構成される緩衝液で40倍に希釈した。四量体の含有量を、少くとも１時間のインキュベーション期間後に分子ふるいHPLCにより再び決定した。表５の結果が示すように、酢酸銅（II）に対して等モル濃度のEDTAは、実際に、IL−16の四量体化を阻害することができる。実施例８ａ）短いインキュベーション時間でのIL−16の四量体化への酢酸銅（II）の濃度の影響 IL−16が金属タンパク質であるなら、単量体又は二量体に対する化学量論的量が四量体形態を安定化させるために必要であろうことが予測されるだろう。対照的に、例えば最適条件下でのIL−16の酸化の場合には、Cu²⁺イオンの触媒的機能のために、より少量で十分であるはずである。実施例４ａに記載されるIL−16濃縮物を、増加する濃度の酢酸銅（II）に加えて、50mM MES、250mM GdmCl、pH 6.5を含む緩衝液中で15μＭの濃度に希釈した。これらの希釈液のサンプルを、少くとも９時間のインキュベーションの後、分子ふるいHPLCにより、それらの四量体の含有量について検査した。表５ａで見ることができるように、触媒量の酢酸銅（II）は四量体化のためのこれらの条件下で十分でない。ｂ）長いインキュベーション時間でのIL−16の四量体化への酢酸銅（II）の濃度の影響 IL−16濃縮物を、増加する濃度の酢酸銅（II）に加えて、50mMの HEPES、250m Mの GdmCl、pH 7.5を含む緩衝液中で10μＭ（0.14mg／ml）の濃度に希釈した。これらの希釈液のサンプルを約 100時間のインキュベーション時間の後、分子ふるいHPLCによりそれらの四量体の含有量について検査した。次の表５ｂで見ることができるように、触媒量の酢酸銅（II）は、この場合に用いた最も低い濃度の酢酸銅(2.5μＭ)はIL−16濃度（10μＭ）よりかなり低いが、約80％の分子が四量体化するので、四量体化のためのこれらの条件下に適切である。実施例９ IL−16の四量体化への種々の金属イオンの影響 IL−16の金属結合の特異性及び種々の金属イオンについてのアフィニティーの影響を得るために、実施例４ａに記載されるIL−16濃縮物を、各々の場合 500μ Ｍの濃度において異なる金属塩を含む緩衝液(0.1Ｍ Tris／HCl、0.25Ｍ GdmCl 、１mM EDTA、pH8.5)中 0.2mg／mlの濃度に希釈した。そのサンプル中の四量体の含有量を、希釈後及び次のGdmCl（第１の透析）も金属塩（第２の透析）も含まない緩衝液に対して透析した後、３時間に、分子ふるいHPLCにより検査した。表６に見ることができるように、原則として種々の金属イオンがIL−16の四量体化を誘導することができる。酢酸銅（II）と比べて低い四量体の収率は、特定の非生理的緩衝液条件が原因であり得、他の条件下では本質的により高い。実施例10 GdmClあり及びなしでの高タンパク質濃度におけるIL−16の四量体化及びその複合体の安定化四量体IL−16の調製用の生産のために、20mMイミダゾール、150mM NaCl、pH 6 .5中に1.85mg IL−16／ml(137μＭ IL−16)を含むIL-16溶液を、0.25Ｍの Gdm Clの存在及び欠如下で 250μＭの酢酸銅（II）と混合し、90分後に、分子ふるい HPLCにより四量体の量を決定した。表７から見ることができるように、GdmCl濃度と独立したこれらの条件下で、四量体化はほとんど完全である。次に、20mMのリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、pH 7.0に対しての主に四量体を含むこれらのサンプルの透析において、四量体の大きな減少は観察することができなかった。実施例11 0.25 GdmClの存在下でのpH値へのIL−16の四量体化及びポリマーか依存性実施例４ａに記載されるIL−16保存溶液を、各々 250μＭの酢酸銅（II）及び 0.25Ｍの GdmClを含む種々のpH値において緩衝液中 0.2mg／mlの濃度に希釈した。四量体の量を分子ふるいHPLCにより分析した。この過程において、酸性pH範囲で形成され、約 100kDの見掛け分子量で溶出し、そして以下、IL−16の二量体及び四量体形態からそれを区別するために“ポリマー”と呼ぶIL−16の新しいポリマー種を検出した。IL−16は、緩衝液条件と独立して、３つの別個の会合状態（二量体、四量体及びポリマー）で明らかに存在することができる。四量体化は本質的に金属イオンに依存し、広い至適pHを有するのに対して、ポリマー化は比較的せまいpH範囲でおこる。実施例12 GdmClの欠如下でのpH値へのIL−16の四量体化及びポリマー化の依存性四量体化が GdmClの欠如下でもおこり得ることは上述の実施例から明らかであるので、この反応のpH値依存性を、GdmClの欠如下でも、実施例10と同様に研究した。表９に示すように、四量体化のpH域はこれらの条件下でよりせまく、そして上述の全てのポリマーはpH 5.5においてほぼ単独で形成される。 65％のポリマーIL−16の増加した収率は、IL−16インキュベーションを表９で用いた 0.2mlのIL−16のかわりに 0.4のタンパク質濃度において、50mM MES、pH 5.5中で行った場合及び透析前のインキュベーション時間を約３時間から16時間に増加させた場合に達成された。これにより、条件を最適化することにより、ポリマーIL−16 はおそらくほとんど定量的に生産することができる。

【手続補正書】【提出日】１９９８年７月１０日【補正内容】請求の範囲１．IL−16サブユニットの生物学的に活性な多量体形態を生産するための方法であって、単量体形態及び／又は二量体形態のIL−16サブユニットを金属イオンとインキュベートし、そしてその過程において形成されたIL−16サブユニットの多量体形態を個々に又は混合物として単離することを特徴とする方法。２．出発形態であるIL−16サブユニットの単量体及び／又は多量体形態の多量体化の程度を増加させるための方法であって、前記単量体又は多量体形態を金属イオンとインキュベートし、ここでその間に１又は数種類のIL−16サブユニットのより高度に多量体化した形態を形成し、そして該より高度に多量化した形態を前記出発形態から分離することを特徴とする方法。３．変性剤を更に添加することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。４．前記変性剤がグアニジン塩酸又は尿素であることを特徴とする請求項３に記載の方法。５．前記インキュベーションがpH３〜９で行われることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。６．前記インキュベーションがpH５〜7.5 で行われることを特徴とする請求項５に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クルト，ラインハルトドイツ連邦共和国，デー―63303 ドライエルフ，エルレンベーク４ (72)発明者ベーエル，ミヒァエルドイツ連邦共和国，デー―60138 フランクフルト，エケンハイメルラントシュトラーセ 57アー (72)発明者バネルト，ノルベルトドイツ連邦共和国，デー―60322 フランクフルト，アディケザレー 13 (72)発明者メッツネル，カリンドイツ連邦共和国，デー―60594 フランクフルト，ブリュッケンシュトラーセ 17 (72)発明者ベルナー，アルドレフトドイツ連邦共和国，デー―69469 バインハイム，プランケルシュトラーセ 30

Claims

【特許請求の範囲】１．少くとも約70kD（ゲルろ過HPLC）の分子量を有する生物学的に活性な多量体IL-16形態。２．前記IL−16形態が所定の数のサブユニットからなり、そして該サブユニットの数が６〜32、好ましくは８〜16の間であり得ることを特徴とする請求項１に記載のIL−16形態。３．所定の含有量の金属イオンを有する単量体IL−16サブユニット又は多量体 IL−16サブユニットの生物学的に活性な形態であって、前記金属イオンの数がサブユニット当り 0.5〜２の間、好ましくはサブユニット当り 0.5〜１の間であることを特徴とする生物学的に活性な形態。４．二量体又は四量体当り 0.5〜２金属イオンの金属イオンの含有量を有する IL−16サブユニットの生物学的に活性な二量体又は四量体形態。５．IL−16サブユニットの生物学的に活性な単量体又は多量体形態の調製物であって、存在するIL−16サブユニットのモル濃度の少くとも50％のモル濃度で金属イオンを含む調製物。６．サブユニット当り１の金属イオンを含む約13〜35kDの分子量を有するIL− 16サブユニットの調製物。７．IL−16サブユニットの二量体、四量体又は八量体の請求項６に記載の調製物。８．原核宿主細胞又は真核宿主細胞中でのIL−16をコードする核酸の発現及び該IL−16タンパク質の単離によりIL−16サブユニットの多量体の生物学的に活性な形態を生産するための方法であって、前記生産又は精製の過程において金属イオンが存在することを特徴とする方法。９．IL−16サブユニットの生物学的に活性な多量体形態を生産するための方法であって、単量体形態及び／又は二量体形態におけるIL−16サブユニットを金属イオンとインキュベートし、そしてこの過程において形成されたIL−16サブユニットの多量体形態を個々に又は混合物として単離することを特徴とする方法。 10．IL−16サブユニットの単量体及び／又は多量体形態（最初の形態）の多量体化の程度を増加させるための方法であって、前記単量体又は多量体形態を金属イオンとインキュベートしてこの間にIL−16の１又は複数のより高度に多量化した形態を形成し、そして前記より高度に多量化した形態を前記最初の形態から分離することを特徴とする方法。 11．塩酸グアニジン又は尿素のような変性剤が更に添加されることを特徴とする請求項８〜10のいずれかに記載の方法。 12．前記インキュベーションがpH３〜９において、好ましくはpH５〜7.5 において行われることを特徴とする請求項９〜11のいずれかに記載の方法。