JPH04166085A - 新規プロテアーゼ - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
酸残基のカルボキシル基側を特異的に開裂する新規プロ
テアーゼ、該プロテアーゼの、バシラス属菌からの製造
方法、該プロテアーゼをコードするDNA配列、該DN
A配列を有する発現ベクター、該発現ベクターを導入し
て得られる形質転換体、および該形質転換体を用いたプ
ロテアーゼの製造方法に関する。
(Glu)残基のカルボキシル基側を特異的に開裂する
酵素として、スタフィロコッカス アウレウス(Sta
phylococcus aureus) V8株由来
のv8プロテアーゼが知られている(Gabriel
R,Drapeauら、 J、Biol、 Che
m、 247. 20. 6720−6726(19
72))。
rmonaら(N u c l、Ac1ds Res、
、 15.6757(1987))は、この酵素をコー
ドするDNA配列をクローン化している。
ス クリセウス (Streptomyces gri
seus)由来の酸性アミノ酸特異的エンドペプチダー
ゼが知られている (Norio Yoshidaら、
J、Biochem。
バシラスン酸特異的エンドペプチダーゼも知られている
(新留意琢部ら、生化学61.9.833 (198
9)、第62同日本生化学会大会抄録号)。
ンパクを上記位置で特異的に切断したい場合;遺伝子組
換え技術により目的タンパクを融合タンパクとして生産
させた場合に、該融合タンパクを切断して目的のタンパ
クを得る場合などに有用である。後者の場合では1例え
ば、目的タンパクをGlu残基を介して他のタンパクと
結合させて生産した後、この酵素で切断処理することに
より目的タンパクを分離することができる。そのため、
上記以外にもこのような酵素活性を有するプロテアーゼ
がさらに求められている。
異的に開裂する酵素活性を有する新規のプロテアーゼ、
該プロテアーゼをコードするDNA配列。
導入して得られる形質転換体、および該形質転換体を用
いたプロテアーゼの製造方法を提供することにある。
テアーゼなどの酵素と同様の活性を有するプロテアーゼ
を得ようと種々の検討を行った。その結果、、バシラス
リケニホルミス ATCC14580株由来の上記性
質を有する新規プロテアーゼを見出した。さらに、この
プロテアーゼをコードするDNA配列、該DNA配列を
有する発現ベクター、該発現ベクターを導入して得られ
る形質転換体、および該形質転換体を用いたプロテアー
ゼの製造方法を見出し1本発明を完成するに至った。
ゼであって、ペプチドのグルタミン酸残基のα位のカル
ボキシル基を含むペプチド結合を切断する性質を有する
。
+222位のG1nまでのアミノ酸配列を有し、ペプチ
ドのグルタミン酸残基のα位のカルボキシル基を含むペ
プチド結合を切断する性質を有する。
。
して得られる。
を産生じ得るバシラス リケニホルミスを培地中で培養
する工程、および生産されたプロテアーゼを該培地から
採取する工程を包含する。
培養する工程、および生産されたプロテアーゼを該培地
から採取する工程を包含する。
る)は、バシラス属菌、特にバシラス リケニホルミス
ATCC14580株により生産される。本菌株はア
メリカンタイプ カルチャー コレクション(ATCC
)から人手できる。
用いられる。例えば、グルコース、大豆粉、肉エキス、
コーンステイープカー、各種塩類などを含有する培地が
用いられる。培養p+(は5〜9、好ましくはp+1約
7゜0.培養温度は15〜50℃。
は振盪しながら約36時間培養を行う。本発明のBLa
seは、主として細胞外に分泌される。
造法が単独で、もしくは併用して利用され得る。例えば
、培養物をフィルタープレスし。
れを適当な手段で精製することにより本発明の酵素が得
られる。例えば、上記濃縮液をイオン交換クロマトグラ
フィーで粗分離した後、S〜セファロースを用いたクロ
マトクラフィーを行い。
により1本酵素が得られる。後述の実施例1においては
、このような方法により、 1.9X10’〜2.4
x 103U/mg (後述の活性測定法により測定)
の酵素標品が得られた。後述の酵素の性質は、この酵素
標品を用いて測定された。
ゾキシ基。
とし、該基質を、最終濃度が0.2mMとなるように、
50mM Tris−HCI (pH7,5,2m
MCaC]2および2%DMFを含有する)に溶解させ
る。これに酵素液を加え、37℃にて10分間反応させ
る。酵素反応により遊離する反応液中のp−ニトロアニ
リンの吸光度を’1.10nn+にて測定する。吸光度
が1.0となるような酵素量を1単位(IJ)とする。
を以下に示す。
HCI 〔2mMCaC]2および表1に示す割合でジ
メチルホルムアミド(DMF)またはジメチルスルホキ
シド(DMSO)を含有する; pf17.5]に溶解
させた。これに本酵素を加えて、25℃にて反応させた
。酵素反応により遊離する反応液中のp−ニトロアニリ
ンの吸光度(410nm)を測定することにより、1m
gの基質から1分間に遊離されるp−ニトロアニリンの
量(nmol)を算出した。その結果を表1に示す。
、該基質に対する本酵素およびスフフィロコツカス ア
ウレウス由来のv8プロテアーセ゛の作用を次のように
して比較した。まず、酸化インシュリンBを50mM
NH48CO3,pH7,8,に溶解させ。
ように本酵素または上記v8プロテアーゼを加えて、所
定時間反応させた。反応混合物を、 Vydac Pr
ote1n C<300人。
け、0,1%TFA中O%から50%の了セトニトリル
を用いるリニアグラジェントで溶出を行った(アセトニ
トリルは1分間当り1.67%上昇させた)。このよう
にして。
いた場合にもGlu残基のカルボキシル基を含むペプチ
ド結合が切断されており、酵素分解による生成物は一致
した。
タミン酸残基のカルホキシル基を含むペプチド結合を切
断する。クルクミン酸特異的エンドペプチダーゼ゛であ
ることが明らかである。
、該基質を10%DMFおよび2mMCaCl2を含む
50mM Tris−HCI溶液に溶解させた。これに
本酵素を加え、37℃にて15分間反応させた。酵素反
応により遊離する反応液中のp−ニトロアニリンを吸光
度410nmにて測定した。上記反応液のpHを変化さ
せて反応を行なったところ9反応の至適p++は8.0
であることがわかった。
保持した後、活性測定法に準じて反応を行ない。
5〜85であることがわかった。
,8にて各種温度条件下で15分間保持した後、活性測
定法に準じて反応を行なった。その結果9本酵素は」1
記条件において60℃まで安定であることがわかった。
50℃まで安定であった。
)により完全に阻害される。このことから本酵素はセリ
ンプロテアーゼに分類されることがわかる。
完全に阻害される。このことからも本酵素はクルクミン
酸特異的エンドペプチダーゼであることがわかる。
阻害率約72%)。このEDTAによる阻害は、金属イ
オンを低濃度で添加することにより (10−3〜10
−4MのOa2+、 Mg2+などを添加)完全に回復
した。
であり、その安定性に金属イオンが関与していると考え
られる。
;分子量マーカー:Amersham製 RAINB
OIII” Prote1n Mo1ecular
WeightMarker)により分子量の測定を
行った結果1本酵素の分子量は26.000と算出され
た。後述する木酵累の遺伝子配列分析から明らかとなっ
たアミノ酸配列をもとにしてその分子量を計算すると2
3.567となり、 5O3−PへGBの値とはやや
異なる。しかし。
伝子配列から明かとなった性状と良く一致する。従って
、 5O8−PへG[Eにより得られた分子量は本来の
分子量より少し高く現れていると考えられる。
malite ;pH3,0−10,0)を用いて調べ
た結果1本酵素の等電点はpH9,0以上となり、正常
な値は得られなかった。
アミノエチル)インドールを含む〕を用いて110℃で
所定の時間(24,48および72時間)加水分解した
。それぞれの加水分解産物を日立アミノ酸分析機(Mo
del 835)にかけてアミノ酸分析を行った。
ノ酸の破壊を補正した値を示した。本酵素のDNA配列
(後述)から明らかとなったアミノ酸配列をもとにし=
ご算出したアミノ酸組成もあわせて表2に示す。これら
の結果はよく一致することが明らかである。
ノ酸部分配列 ■アミノ酸N末端配列 アプライド バイオシステムズ社477A Prote
1nSequencerを用いてN末端付近のアミノ酸
配列分析を行った。分析にあたっては、予めDFPで阻
害された本酵素を用いた。N末端から23残基までのア
ミノ酸配列を表3に示す。
ゼ゛A (CPase八)また(まカルボキシペプチダ
ーゼ立アミノ酸分析a (Model 835)で定量
した。その結果,いずれのCPaseを用いた場合にも
C末端を決定することができなかった。しかし、C末端
付近にG1n, Ser, Aha, Asnなどが存
在することが確言点された。
下に1本発明を説明するうえで用いられる用語を説明す
る。
する。オリゴヌクレオチドは、既知の方法により化学合
成することができる。本発明に用いるオリゴヌクレオチ
ドは、特に明示しない限り、化学合成され、セファデッ
クスG50を用いたゲルクロマトグラフィーおよび逆相
シリカゲルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィ=
(HPLC)により精製して得られる。
Polymerase cha1n reaction
)の略であり、 DNA上の一定の領域を酵素的に増幅
させる方法を意味する (Saikiら、 5cie
nce、 239. 487−497(198B))
。
補的なオリゴヌクレオチドプライマー(センス釦および
アンチセンス鎖の2種類)をアニーリングさせる。次に
、Dj轄ポリメラーゼの作用によってそれぞれのプライ
マーからD N A 鎖の伸長反応を行わせる。この一
連の反応を繰り返すことにより、目的のDNAを10万
倍〜100万倍に増幅することができる。
たDNA断片に目的の遺伝子が含まれているかどうかを
検定するだめの方法である。ザザン分析を行うには、ま
ず一本鎖DNA上の特異的な塩基配列を認識してDNA
を切断する制限酵素でDNAを消化する。得られた消化
物の1%アガロースゲル電気泳動を行い、アルカリ処理
より変性させて1本川とし、ナイロンフィルターに移す
。一方1問題とする遺伝子の一部であるオリゴヌクレオ
チドもしくはDNA断片を卆備し、標識を施してプロー
ブとする。このプローブとナイロンフィルター上の1本
川DNAとのハイブリッド形成により分析がなされる。
断片の間にホスホジエステル結合を形成させることを意
味する。その際、二本鎖DNA断片自身の自己結合を防
止するため、一方の1祈片の脱リン酸処理を常法(T、
Maniatisら、 Mo1ecular Clo
n1ng。
、 T4DN八リガーゼ(こより行うことができる。
宿主細胞)内に導入することにより、該細胞の遺伝形質
が変化する現象を指す。形質転換後の細胞は形質転換体
と呼ばれ、外来DNAを該細胞の染色体外成分として、
または染色体に組み込まれて。
定方法を、工程の順に説明する。このDNA配列は。
ノムDNAを、 PCR解析、サザン分析、直接シーク
エンス法などを組み合わせて分析することにより決定さ
れた。
をコートするDNA配列は9例えば、ゲノムDNAから
得ることができる。それには、まずノ\シラス リケニ
ホルミス へTC口14.580株のゲノムIINAを
、該菌株の培養細胞から既知の方法(M、Sta旧ら、
Journal of Bacteriology
、154,406−412(1983)) +こ従って
ε男前する。このゲノムDNAを。
オリゴヌクレオチドプライマーは、上記■項(8)で得
られる精製酵素のN末端付近のアミノ酸配列:および該
酵素を部分分解して得られるペプチドのアミノ酸配列に
基づいて、常法により合成することができる。例えば、
BLaseのアミノ酸配列のN末端側第12位から1
9位に相当するアミノ酸配列Thr AsnThr T
hr Ala Tyr Pro Tyrをコードするオ
リゴヌクレオチド (但し、C末端のTyrのコードす
るトリプレットの2番目の塩基まで: 23mer)を
センスプライマーBL8とする。
ゼで部分分解して得られたペプチドを配列決定したなか
で、最も信頼度の高いペプチドを選び、これをもとにオ
リゴヌクレオチドを合成する。
Pro Gly ASII Lysの配列が得られたの
で、このアミノ酸配列をコードするオリコヌクレオチド
に相補的な18merをアンチセンスプライマーBシ8
3とする。
ンチセンスプライマーBに83を用いてPCRを行うこ
とにより、ゲノムDNA中の目的DNAIが伸長され、
増幅される。得られたPCR産物をアガロースゲル電気
泳動により解析すると、約370bp長のDNA断片が
得られる。このDNA断片を適当なベクターに組み込み
、サブクローニングを行なった後、サンガー法によりD
NA配列が決定される。上記アンチセンスプライマーB
シ83の作成の基本となったアミノ酸配列Gly Ty
r Pro Gly Asp Lysは131〜136
位に位置するアミノ酸であることがわかる。
諏14580株由来のゲノムDNAを、制限酵素Sal
■で消化し、これをアガロースゲル電気泳動にかけて分
離した後、該DNA断片をナイロンメンブランフィルタ
−にプロッティングし、ザザン分析を行う。ハイブリダ
イゼーション用プローブは、(1)項で得られるBL8
−BL83のPCR産物を32P−clcTPを常法に
より標識して用いる。この818−BL83とハイブリ
ダイズした陽性DNA断片は、約3.1kbのハンドと
して認められる。
決定(1)項で得られたバシラス リケニホルミスへT
CC14580株のゲノムDNAを5alIで消化し、
これを適当なベクター、例えばplJc119ベクター
に組み込み、既知のDNA配列の一部分をプライマーと
して用いPCR反応を行う。例えば、上記ゲノムDNへ
の上流側に位置するpUc119のDNA配列の一部を
センスプライマーRVとし、上記(2)項で解析された
375bpのDNA断片の3′末端付近の配列に相補的
なl]NA配列をアンチセンスプライマー旧25とする
。
25 : 5’ −TGTC[:CAΔ[1:AAG
TGATG八上記PCへ反応を行なうことにより約10
50bpのDNA断片が得られる。このDNA断片の配
列は、直接DNA塩基配列決定法[Gibbsら、 P
ro、Natl、Acad、 Sci。
される。このようにしてBLaseをコードするDNA
配列のN末端から中途部分までの配列が決定される。
配列の決定が行われる。まず、上記と同様に、バシラス
リケニホルミス八TCC14580株のゲノ1.DN
Aを5allで消化し、約3.1kbの断片を単離する
。これをM13mpHに組み込み、 PCR反応を行う
。プライマー、=しては、(2)項で解析された375
bpのDNA断片の一部 (上記アンセンスプライマー
B125よりも上流側)の配列がセンスプライマー34
0として、そして、ゲノムDNAの下流側に位置する旧
3mpHのDNA配列の一部に相補的なりNA配列がア
ンチセンスプライマーM4として用いられる。
AGCCM4へへ : 5’−GTTTTCCC八G
TC八[1へGACへ記PCR反応を行なうことにより
約2.2kbのDNA断片が得られる。このDNA断片
の配列は、直接DNA塩基配列決定法により決定される
。このようにして。
される。
A配列およびそれにより決定されるアミノ酸配列を第1
図に示す。第1図から4本発明のバシラス リケニホル
ミス由来の成熟タンパクをコードする遺伝子は、−94
位のfM吋から−1位のLysまでの94個のアミノ酸
でなるシクプールペプテドをコードするDNA配列;お
よび→−1位のセリンから+222位のSerまでの2
22個のアミノ酸でなる成熟タンパクをコードするDN
A配列を有することがわかる。通常はATGがfMet
をコードするが、ここではTTG′h(IJJ訳開始コ
ドンであると考えられる。5゛非翻訳領域のSal■部
位から332bpの範囲には、−35領域およびプリブ
ナウ配列を含むプロモーター領域およびSD配列が存在
(上記推定翻訳開始コドンTTGの9塩基上流に存在)
する。3″非翻訳領域には、終止コドンTAAから8塩
基下流に、13塩基対からなる逆向き反復配列が存在す
る。
11は、第3図に示すように、、バシラス ザチリスA
TCC6051株由来のアルカリ性プロテアーゼノ9−
ミネーターを有するシャトルベクターであるp IIY
300 P L K t tに、第1図で示される本
発明のBLaseをコードするDNΔ断片 (プロモー
ター、シフはルペプチドをコードするDNA配列、
BLase成熟タンパクをコードする配列、およびクー
ミネークーを含む)を組み込むことにより得られる。上
記p HY 300PLKttは、第4図に示すように
5大腸菌と枯草菌のシャトルベクターであるpHY 3
00 P l、Kに、、バシラス ザチリス ATCC
6051株由来のアルカリ性プロテアーゼのターミネー
タ−を組み込むことにより得られる。
ご、ハ゛シラス ザチリス 八TCC6051株がらM
、5ealらの方法(前出)によりゲノムDNΔを単離
し、これを鋳型DNAとする。次にプライマーとして、
、バシラス ザチリス l−168株由来のアルカリプ
ロテアーゼの遺伝子のターミネータ部分の5”末端付近
に相当し、XbaT部位が付加されたDNA配列でなる
断片および3゛末端側近に相当し。
りNA配列でなる断片を化学合成し、これを用いてPC
R反■で分解し、第4図に示す断片■を得る。次に。
分解し、大きい方の断片■を得る。これらの断片■およ
び■を連結することにより、、バシラス ザチリス A
TCC6051株由来のアルカリ性プロテアーゼのター
ミネータを有するシャトルベクターpHY300PLK
ttが構築される。
0株由来の培養細胞からゲノムDNAを単離し、これを
鋳型DNAとする。このDNA配列の5゛末端付近に相
当し、 [EcoRI部位が付加されたDNA配列でな
る断片および3゛末錨;付近に相当し、Xba1部位が
イス1加されたDNA配列に相補的なO贋配列でなる断
片を合成し、これらをセンスプライマーおよびアンチセ
ンスプライマーとする。上記鋳型DNA、およびセンス
プライマーおよびアンチセンスプライマーを用いてPC
R反応を行なう。得られた断片をBcoRIおよびXb
a Iで切断し、 BLaseをコードするDNA断片
断片帯られる (第3図)。この断片■は、プロモータ
ー、シグナルペプチドをコードするDNA配列、成熟B
L a s eをコードするDNA配列、およびター
ミネータを有する。次に、上記1)HY 300 p
L K t tをEcoRとXba Iとで分解し、大
きいほうの断片■が得られる。上記断片■および■を連
結することにより。
られる (第3図)。
tは、 BLaseのプロモーター支配下に、 Bl
、aseの一94位のfMBTから一1イ立のLysで
なるシグナルペプチドド配列,+1位のSerから+2
22位のG1nでなる成熟タンパクをコードするDNA
配列,その下流に存在するターミネータ−を有する3”
非翻訳領域を有し,さらにその下流には、バシラス ザ
チリス 八TCC 6051株由来のアルカリ性プロテ
アーゼのターミ不一クーを有する。
られた発現ベクターは,常法により適当な宿主細胞に導
入される。例えば、上記pHY300BLttは枯草菌
ISW 1214株 (宝酒造)に、 J,Spiz
ienらの方法[Proc, Natl,八cad,
Sci.44. 1072(1958):]により導入
される。得られた形質転換体(Bacillus s
ubtilis pHY300BLtt/IsIII
1214)は、宿主に適した培地で培養することにより
,本発明のBLaseを産生する。この形質転換体の培
養物から,前述の■項に記した方法によりBLaseが
単離,精製される。
。
5%コーンステイープリカー、0.5%(N)I、)2
So4. 0.05%に28P口、、 0.05%
MgSO4−71120,0,01% Fe50.
・ 7H2[]。
℃にて36時間培養した。培養液95Lをフィルタープ
レスし、限外濾過モジュールにットー限外濾過モジュー
ルNTII 2020T P18B(IIF)、 MW
20,000 Cut)および遠心分離機(4200
rpm、 30分)を用いて約141゜に濃縮した。こ
の濃縮除菌液を2 mM CaCl2水溶液で希釈して
約28L、 1.90m5/cmとし1次いで13C1
を加えてpH6,0とした。これに2 mM CaCl
2を含む10mMアセテートバッファー、 pH6,0
で平衡化したAmberlite CG−50約4Lを
加え、4時間室温にて攪拌した。」1清にBLase活
性のないことを確認してからデカンテーションにより上
清を捨て、 Amberlil:eCG−50をガラス
カラム(14X 32cm)に充填した。
0,2mMCaC]+を含む)で洗浄後、0.5M酢酸
す) IJウムバッフy −(pH8,5,2mM [
aCI2を含む)で溶出した。
e活性分画を集め(2,71)、 これを水に対して
2昼夜透析した。
23m5/cm) 。
した約800m1のS−セファD−ス (2mMの口a
Ct2を含有する5mMアセテートバッファー、pH6
,0であらかじめ平衡化)に吸着させた。次いで、この
カラムを」1記平衡化に用いた緩衝成約51、で洗浄後
、O〜0.2M NaClを含む緩衝液7[7で直線濃
度勾配により溶出した。
2 mMCaCL水溶液に対して一晩透析した(約9
50m1゜0、86m5/cm)。この透析白物をpH
7,5に調整後、速やかにアフィニティータロマドクラ
フィーを行った。上記アフィニティータロマドグラフィ
ーにおいて、担体としては口(セファロース4B (P
he Leu−D−G I uOMe)約340m1を
用い、これを3X48cmのカラムに充填して、2mM
のCaCl2を含む5 m!、l Tris−HCI、
pH7,5,で平衡化したものを用いた。上記透析白
物をカラムに吸着させた後、平衡化に使用したものと同
様の緩衝成約5Lで洗浄後、 NaClをO〜0.7M
の割合で含む同緩衝液3.5Lを用いて直線濃度勾配に
より溶出を行なった。
法に準じて測定した。その結果を第5図に示す。別に、
各フラクションの280nmにおける吸光度を測定して
、タンパク濃度の目安とした。その結果をあわせて第5
図に示す。第5図から明らかなように、 NaCl濃度
が0.5M例近で溶出される。得られたB L a s
eは5DS−PAGEで単一なバンドを示した。
03〜2 X 103U/mgの酵素標品833.1m
g (Bio Rad Prote1nassay k
itで定量)が得られ、酵素活性の収率は27.5%で
あった。
で得られた精製BLase (DEP処理済)100μ
gを、 1M尿素を含む0.05M )リス−塩酸(p
H9,0)150μm中において、1μgのりジルエン
ドペプチダーゼ(和光純薬)で37℃で5時間消化した
。
ラム(TO3O11゜4、6 X’ 250mm)を用
いた高速液体クロマトクラフィーで分解精製した。得ら
れた消化断片の−rアミノ酸配列、アプライド ハイオ
システムダ社製4’??A型プロティンシーケンサ−で
調べた。5種類の断片のアミノ酸配列が決定され、その
うちの3種を下記に記す。
(−1)Ala−J Ie−Val−月1s
−Ice (JT
)Ser−Thr−Arg−Tyr−Phe−Ice
−Pro−3er (In )次に、、バシラス
リケニホルミス 八TCC14580株の培養細胞から
、 M、 5talら(前出)の方法に従ってゲノムD
NΔを調製し、該DNAをPCR解析に用いる鋳型DN
Aとした。PCRに用いるオリゴヌクレオチドプライマ
ーは、、バシラス リケニホルミスATCC14580
株が生産するBLaseの既知部分のアミノ酸配列に基
づいて作成した。まず、 B L a s eのアミノ
酸配列のN末端から第12位〜第19位のアミノ酸配列
(表3参照) Thr Asn Thr Thr 八l
a Tyr Pr。
端のTyrをコードするトリプレットの2番目の塩基ま
で: 23mar)を化学合成し、これをセンスプライ
マーBL8とした。
最も信頼度が高いと考えられるアミノ酸配列(I )G
ay Tyr Pro Gay Asp Lysをコー
ドするオリゴヌクレオチドに相補的な18merを化学
合成し。
用いて、 PCR法[5aikiら、 5cience
239.487−491 (1989) 〕によりD
N八を増幅させた。増幅産物の一部を1%アガロースゲ
ル電気泳動で分析したところ、約370bpのDNA断
片が確認された。この断片を単離し、クレノー断片で処
理することにより平滑末端とした後、SmaIで消化さ
れたM 1.3 m p 11にザブクローニンクし、
サンガー法[Sangerら、 Proc。
5467(1977) ]によりDNA配列を決定した
。その結果、 375bpのDNA配列が決定され、
B125に相当するアミノ酸配列は1.31〜136位
に位置することがわかった。さらに」−記(II)およ
び(IIT)のアミノ酸配列は21〜25位、および7
9〜86位にそれぞれ存在することがわかった。
TCC14580株由来のゲノムDNAを、制限酵素S
al■で消化し、これを1%アガロースゲル電気泳動に
かけて分離した後、該DNA断片をナイロンメンブラン
フィルタ−にプロッティングし、ザザン分析を行なった
。ハイブリダイセーション用プローブとしては、(1)
項で得られるBL8−BL83のPCR産物を321”
dcTPを常法により標識したものを用いた。
た陽性DNA断片は、約3. lkbのバンドとして詔
狛られた。
])項で得られた、バシラス リケニホルミスATCC
14580株のゲノムDNAを5alIで消化し、 T
4ON八ポリメラーゼで平滑末端とした。これを脱リン
酸化されたpUc119 Sma T消化ベクターに連
結した。この連結反応は、市販のキット(宝酒造)を用
いて行なった。
ライマー8125を化学合成し、上記連結反応の反応液
の一部に加えてPCR反応を行なった。
位置するp[Ic119のDNA配列の一部であり、ア
ンチセンスプライマー8125は、上記(2)項で解析
された375bpのDNA断片のC末端付近の配列に相
補的なりNA配列である。
GACB125 : 5“−TGTCCCAACAA
GTG八TGへ上記PCR反応を行へうことにより約1
050bpのDNA断片が得られた。このDNA断片の
配列を、直接DNA塩基配列決定法[Gibbsら、
Pro、 Natl、八cad、 Sci。
た。このようにして本酵素をコードするDNA配列のN
末端から中途部分までの配列が決定された。
CC14580株のゲノムDNAを3alIで消化し、
1%アガロースゲル電気泳動にかけて、約3.1kbの
DNA断片を単離した。これをクレノー断片により平滑
末端とし2次いで脱リン酸化されたM13mpH,Sm
a I消化断片と連結された。これを鋳型としてPCR
反応を行なった。プライマーとしては、(2)項で解析
された375bpのDNA断片の配列の一部 (プライ
マーB125よりも上流側)をセンスプライマー840
として、そして、ゲノムDNへの下流側に位置するM1
3mpHのDNA配列の一部に相補的なりNA配列をア
ンチセンスプライマーM4として用いた。
八口日40 : 5’ −AAAACCGTCGC
AACAGCC上記PCR反応を行なうことにより約2
.2kbのDNAI祈片が得られた。このDNA断片の
配列は、直接DNA塩基配列決定法により決定された。
された。
よびそれにより決定されるアミノ酸配列を第1図に示す
。
t tの構築、バシラス ナチリス ATCC605
1株からM、 5tahlらの方法(前出)によりゲノ
ムDNAを単離し、これを鋳型DNAとする。次に、プ
ライマーとして。
テアーゼの遺伝子のターミネータ一部分の5“末端付近
の配列に相当し、 Xba1部位が付加されたDNA配
列の断片(センスプライマーA)および3”末端付近の
配列に相当し1l1ndIff部位が付加されたDNA
配列に相補的なりNA配列の断片(アンチセンスプライ
マーB)を化学合成した。
AへTAG−3’アンチセンスプライマー(B) 5”−GAG八八へへTTG八CへGへG八Aへ八Gへ
G八八へへ3゛上記鋳型DN八と、これらプライマーと
を用いてPCR反応を行った。得られたDNA断片を、
XbaIおよびH1ndlIIで分解し、第4図に示す
断片■を得た(第4図参照)。次に、シャトルベクター
piY300PLK (宝酒造)をXba Iおよび
旧ndlHで分解し、大きい方の断片■を得た(第4図
参照)。これらの断片■および■を連結することにより
、バシラスザチリスATCC6051株由来のアルカリ
性ターミネータ−を有するシャトルベクター p)IY
300PLKttが得られた。
ス リケニホルミス八TCC14580株の培養細胞か
らM、 3tahl らの方法(前出)によりゲノムD
NAを単離し、これを鋳型DNAとした。このDNA断
片の5゛末端付近に相当し、 BcoR1部位が付加さ
れた1本用DNA断片および3′末端例近に相当しXb
a1部位が伺加されたDNA配列に相補的な1本glD
NA断片を合成し、これらをセンスプライマー口および
アンチセンスプライマー口とした。
CCTCC−3’アンチセンスプライマー〇 5’ −TTGTCTAG八ATTTGCへGATC八
GCGGTCへ3’」1記鋳型DNAおよびセンスプラ
イマー口およびアンチセンスプライマーDを用いてPC
R反応を行った。
Iとで分解し、大きい方の断片■を得た。上記断片■お
よび■をT4DNAIJガーゼを用いて連結させた。連
結混合物を用いて、 E、coli K−12(C60
0株)を形質転換し。
ミドDNAを単離し、上記DNA断片■が正しい方向に
挿入されていることを、制限酵素切断パタ一ン(こより
確言忍した。
4〕項で得られた発現ベクターP t(Y 300 B
L t tを枯草菌ISl’11214株(宝酒造)
に、 J、5pizizenらの方法[Proc、Na
tl、Acad、Sci、 44.1072(1958
) 〕により導入した。得られた形質転換体を、テトラ
サイクリン含有平板寒天培地上で培養し、テトラサイク
リン耐性菌(、バシラス サチリスp HY 300
B Ltt/JSII11214>を得た。
0 B Ltt/l5W1214>をl、B培地 (ト
リプトン10g、 イーストエクストラフ)5gおよ
びNaCl 5gに水を加えてILとする; pH7、
2) 5蔵に植菌し、37℃で18時間振盪培養した。
20分間オートクレーブで滅菌済)10艷に加えて28
℃で振盪培養を行った。
クストラクト 1g 炭酸カルシウム 3g 上記培養液を2500X gで5分間遠心分離し、」−
清を得た。この上清の81、ase活性を1発明の詳細
な説明の項に記載の活性測定法により測定した。
、 B L a s 6の比活性を2500単位/ m
gとして換算した。
タミン酸残基のC末端をも“異的に開裂する新規プロテ
アーゼ、該プロテアーゼの、バシラス属菌からの製造方
法、該プロテアーゼをコードするDNA配列、該DNA
配列を有する発現ベクター、該発現ベクターを導入して
得られる形質転換体、および該形質転換体を用いたプロ
テアーゼの製造方法が提供される。このようなプロテア
ーゼは、タンパクの分析、融合タンパクの所望の部位で
のペプチド鎖の切断など1種々の目的に利用され得る。
配列から推定されるアミノ酸配列を示す配列図である。 第2図は、、バシラス ザチリス I−1,68株由来
のアルカリ性プロテアーゼのDNA配列を示す配列図で
ある。 第3図は1本発明の発現ベクターであるpHY300B
L t tの構築を示す概略図である。 第4図は、」1記p fl Y 300 B L t
tの構築に用いるシャトルベクターpHY300PLK
ttの構築を示す概略図である。 第5図は、、バシラス リケニホルミスATCC145
80株培養物の精製工程において、アフィニティーカラ
ムからのB L a s eの溶出の過程を示すクラ7
である。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、バシラス リケニホルミス(¥Bacillus¥
licheniformis)由来のプロテアーゼであ
って、ペプチドのグルタミン酸残基のカルボキシル基を
含むペプチド結合を切断する、プロテアーゼ。 2、バシラス リケニホルミス ATCC 14580
株由来である、請求項1に記載のプロテアーゼ。 3、次の性質を有する請求項1に記載のプロテアーゼ: (1)至適pH範囲:約8.0;および (2)安定pH範囲:25℃において6.5〜8.5。 4、第1図の+1位のSerから+222位のG1nま
でのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のプロテアー
ゼ。 5、第1図の+1位のSerから+222位のG1nま
でのアミノ酸配列を有し、ペプチドのグルタミン酸残基
のカルボキシル基を含むペプチド結合を切断する、プロ
テアーゼ。6、請求項1または5に記載のプロテアーゼ
をコードするDNA配列。 7、第1図の605位のTから1270位のAまでの塩
基配列を有する請求項6に記載のDNA配列。 8、第1図の−94位のfMetから+222位のG1
nまでのアミノ酸配列を含むプロテアーゼをコードする
、請求項6に記載のDNA配列。 9、第1図の323位のTから1270位のAまでの塩
基配列を有する請求項8に記載のDNA配列。 10、請求項6に記載のDNA配列を有する発現ベクタ
ー。 11、バシラス属菌において発現可能な、請求項10に
記載の発現ベクター。 12、請求項10に記載の発現ベクターを宿主に導入し
て得られる形質転換体。 13、前記宿主が、バシラス属菌である、請求項11に
記載の形質転換体。 14、請求項1または5に記載のプロテアーゼを産生し
得るバシラス リケニホルミスを培地中で培養する工程
、および生産されたプロテアーゼを該培地から採取する
工程を包含する、プロテアーゼの製造方法。 15、請求項12に記載の形質転換体を培養する工程、
および生産されたプロテアーゼを該培地から採取する工
程を包含する、プロテアーゼの製造方法。
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