PT99322B - Processo para a preparacao de proteases - Google Patents

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PT99322B
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Hiroshi Teraoka
Mikio Tamaki
Etsuo Nakamura
Masaru Shin
Nobuo Yoshida
Hiroshige Tsuzuki
Takashi Fujiwara
Koichi Matsumoto
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Shionogi & Co
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Description

DESCRIÇÃO
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
1. Campo da invenção:
A presente invenção refere-se a uma nova protease que cinde de modo específico a ligação peptídica nas extremidades carboxi-terminais dos resíduos de ácido glutãmico nas sequências de ácidos aminados de polipeptídeos, a um método para a preparação da protease a partir de bactérias do género Bacillus, a uma sequência de ADN que codifica para a pro tease, a um vector de expressão que contém a sequência de ADN, a transformantes obtidos por introdução deste vector de expressão num hospedeiro e a um processo para a preparação da protease usando o transformante.
2. Descrição da técnica anterior:
A protease V8 derivada da estirpe V8 de Staphylococcus aureus é jã conhecida como uma enzima que actua sobre proteínas (isto é, polipeptídeos) e que cinde de modo específico a ligação peptídica na extremidade carboxi-terminal dos resíduos de ãcido glutâmico (Glu) (Gabriel R. Drapeau et al
J. Biol. Chem. 247, 20, 6720-6726, 1972). £sta enzima é classificada como uma protease de serina. C. Carmona et al. clonaram a sequência de ADN que codifica para esta enzima (Nucl. Acids Res. 15, 6757, 1987).
É também conhecida «ma enzima semelhante, uma endopeptidase que é específica para resíduos de ãcidos aminados acídicos e que é derivada de uma bactéria actinomicete Streptomyces griseus (Norio Yoshida et al., J. Biochem. 104, 451-456, 1988). Para além desta, ê também conhecida uma endopro tease que é específica para resíduos de ãcido glutâmico derivada de Bacillus subtilis (Takuro Niidome, Norio Yoshida, Fusahiro Ogata, Akio Ito e Kosaku Noda, J. Biochem. 108, 965-970, 1990; Abstracts of 62nd General Conference of the Japan Biochemical Society).
As referidas enzimas são úteis quando se pretende uma cisão específica de proteínas nos locais referi dos para fins de análise estrutural de proteínas, etc., ou quan do se utilizam técnicas de ADN recombinante para produzir uma determinada proteína pretendida sob a forma de uma determinada proteína de fusão, a partir da qual se quer obter a proteína pretendida por cisão. Neste último caso, por exemplo, quando a proteína pretendida foi produzida sob a forma de uma proteína de fusão na qual a proteína pretendida se encontra ligada com outra proteína por meio de um resíduo de ácido glutâmico, a pro te ina pretendida pode ser separada por cisão com uma enzima como as referidas. Por esta razão, a disponibilidade de outras proteases que possuam este tipo de actividade enzimática, para além das mencionadas anteriormente, seria altamente desejável.
SUMÃRIO DA INVENÇ&O
A nova protease da presente invenção.
que permite ultrapassar as desvantagens discutidas acima e nume rosas outras desvantagens e deficiências da técnica anterior, ê derivada de Bacillus licheniformis e esta protease cinde as ligações peptídicas nas extremidades carboxi-terminais dos resíduos de ãcido glutâmico em polipeptídeos.
Numa forma de concretização preferida, a protease é derivada de Bacillus licheniformis ATCC NQ. 14580.
Numa forma de concretização preferida, a protease possui as seguintes propriedades:
(1) pH óptimo: aproximadamente 8,0, e (2) Gama de pH de estabilidade: pH 6,5-8,5 a 25S C.
Numa forma de concretização preferida, a protease contém uma sequência de ácidos aminados a partir de se rina na posição -tl até à glutamina na posição +222 da SEQ ID NO:
1.
Numa forma de concretização preferida, a protease contém uma sequência de ãcidos aminados a partir de serina na posição +1 até à glutamina na posição +222 da SEQ ID NO: 1 e cinde a ligação peptídica nas extremidades carboxi-terminais dos resíduos de ãcido glutâmico em polipeptídeos.
A sequência de ADN da presente invenção codifica para a referida protease;Numa forma de concretização preferida, a sequência de ADN contém uma sequência de bases a partir do resíduo de timina na posição 605 até ao resíduo de adenosina na posição 1270 da SEQ ID NO: 1.
Numa forma de concretização preferida, a sequência de ADN codifica para uma protease que contém uma sequência de ácidos aminados a partir da N-formilmetionina na posição -94 atê ã glutamina na posição +222 da SEQ ID NO: 1.
Numa forma de concretização preferida, a sequência de ADN contém uma sequência de bases a partir do resíduo de timina na posição 323 até ao resíduo de adenosina na po sição 1270 da SEQ ID NO: 1.
O vector de expressão da presente invenção contém a referida sequência de ADN.
Numa forma de concretização preferida o vector de expressão é expressãvel em bactérias do género Bacillus
O transformante da presente invenção po de ser obtido por introdução do vector de expressão referido num hospedeiro.
Numa forma de concretização preferida o hospedeiro é uma estirpe que pertence ao género Bacillus.
método para a produção de uma protease da presente invenção compreende as fases de cultivar uma estirpe de Bacillus lichenif ormis com capacidade para a produção da referida protease num meio de cultura e recuperar a protease produzida do meio de cultura.
O método para a produção de uma protease da presente invenção compreende as fases de cultivar o trans formante acima referido num meio de cultura e recuperar a protease produzida do meio de cultura.
Deve compreender-se gue são evidentes várias outras modificações e que podem ser facilmente praticadas por um especialista na matéria sem abandonar o âmbito e o espírito da presente invenção. Deste modo, não se deve considerar o âmbito das reivindicações em anexo como sendo limitado pe la descrição apresentada na presente memória descritiva, pelo contrário deve considerar-se gue as reivindicações abrangem todas as caracteristicas de novidade patenteável gue residem na presente invenção, incluindo todas os aspectos gue seriara trata dos como equivalentes dos descritos pelos especialistas na maté ria do domínio a gue a presente invenção se refere.
Deste modo, a presente invenção descrita na presente memória descritiva torna possíveis os objectivos de:
(1) proporcionar uma nova protease com uma actividade enzimãti^ ca gue consiste na cisão especifica de polipeptldeos na ex tremidade carboxi-terminal dos resíduo de ãcido glutâmico;
(2) proporcionar uma sequência de ADN que codifica para a protease, um vector de expressão que contém essa sequência de ADN, um transformante obtido por introdução do vector de expressão num hospedeiro e um método para a produção da protease por meio do transformante.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A presente invenção pode ser compreendi^ da mais completamente e os seus numerosos objectos e vantagens serão mais facilmente evidentes para os especialistas na matéria por referência aos desenhos anexos como se segue:
As Figuras 1-1 a 1-3 mostram a sequência de ADN da protease da presente invenção e a sequência de ãcidos aminados deduzida da sequência de ADN.
A Figura 2 ê um diagrama esquemático que ilustra a construção do vector de expressão pHY300BLtt da presente invenção.
A Figura 3 é um diagrama esquemático que ilustra a construção do vector lançadeira pHY300BPLKtt usado na construção do vector de expressão pHY300BLtt da presente invenção.
A Figura 4 mostra gráficos que indicam a eluição da enzima da presente invenção a partir de uma coluna de afinidade no processo de extracção e purificação da enzima a partir do meio em que se cultivou a estirpe Bacillus licheniformis ATCC NQ. 14580.
DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE CONCRETIZAÇÃO PREFERIDAS
Os inventores da presente invenção leva ram a efeito vários estudos com o objectivo de obterem proteases que possuíssem a acção enzimática de cindir peptideos nas extremidades carboxi-terminais dos resíduos de ãcido glutãmico a partir de microorganismos que não fossem o anteriormente refe rido Staphylococcus aureus, etc.. Como resultado destas investi gações, os inventores da presente invenção isolaram uma nova protease que possui a propriedade mencionada derivada de Bacil— lus licheniformis ATCC NQ. 14580. Para alêm disso, os inventores da presente invenção definiram também uma sequência de ADN que codifica para esta protease e crearam um vector de expressão que contém esta sequência de ADN bem como um transformante obtido por introdução do vector de expressão num hospedeiro, e estabelecerem um método para a produção desta protease usando o
transformante, completando deste modo a presente invenção.
A protease da presente invenção (em seguida designada na presente memõria descritiva por BLase) é pro duzida por bactérias do gênero Bacillus, em particular por Bacillus licheniformis ATCC NO. 14580. Esta estirpe encontra-se disponível na American Type. Culture Collection (ATCC).
I. Condições de Cultura
Não é necessário um meio especial para a cultura da referida estirpe bacteriana e são adequados para este fim quaisquer dos vários tipos convencionais de meios de cultura. Por exemplo, pode ser usado um meio que contenha gluc<> se, farinha de soja, extracto de carne, licor de maceração de milho e os vários sais inorgânicos, etc.. O pH apropriado do meio ê de 5 a 9, de preferência aproximadamente 7,0; a temperatura apropriada do meio ê de 15 a 500 c, de preferência aproximadamente 28Q C, e as bactérias são cultivadas, por exemplo, ae robicamente com agitação durante aproximadamente 36 horas. A en zima BLase da presente invenção foi segregada principalmente pa ra o espaço extracelular.
II. Recuperação da enzima
Podem ser usados processos conhecidos de recuperação e purificação de enzimas quer isoladamente quer em conjunto para a recuperação e purificação da presente enzima a partir do caldo de cultura. Por exemplo, pode submeter-se o caldo de cultura a filtração por filtro prensa, a ultrafiltração e a separação centrífuga, obtendo-se deste modo um concentrado líquido isento de células. Â enzima da presente invenção pode em seguida ser obtida a partir deste concentrado por um mê todo apropriado de purificação. Por exemplo, o referido concentrado pode ser submetido em primeiro lugar a uma purificação preliminar por cromatografia de permuta iónica e em seguida a cromatograf ia com S-Sepharose e finalmente a cromatografia de afinidade, obtendo-se deste modo a presente enzima. No Exemplo 1 apresentado seguidamente foi obtida uma amostra de enzima com
3 uma actividade de 1,9 x 10 a 2,4 x 10 U/mg (analisada pelo me todo da medição da actividade enzimática descrito em seguida) pelo tipo de procedimento descrito. Esta amostra de enzima foi usada para a determinação de propriedades enzimãticas descritas adiante.
III. Método para a medição da actividade enzimática
Dissolve-se Z-Phe Leu Glu-pNA (em que Z é um grupo carbobenzoxi e pNA ê um grupo p-nitroanilina), usa do como substrato, em tris.HCl 50 mM (pH 7,5, contendo cloreto de cálcio 2 mM e 2% de DMF) de modo a que a concentração final do substrato seja de 0,2 mM. Adiciona-se uma solução enzimática a esta mistura e deixa-se reagir a 37c C durante 10 minutos. Em seguida mede-se a absorvância a 410 nm da p-nitroanilina libertada no líquido pela reacção enzimática. A actividade enzimática presente quando esta absorvância ê 1,0 é definida como 1 uni. dade (U).
IV. Propriedades da enzima
As propriedades enzimãticas e as propriedades químicas da proteína BLase da presente invenção são as seguintes:
(1) Acção enzimática e especificidade para o substrato (i) Prepararam-se os substratos sintéticos apresentados no
Quadro 1 e dissolveu-se cada um destes substratos em 50 ml de tris.HCl (pH 7,5, contendo cloreto de cálcio 2 mM e dimetilformamida (DMF) ou dimetil-sulfóxido (DMSO) nas proporções indicadas no Quadro 1) de modo a que se atingiu a concentração indica da no Quadro 1. Em seguida adicionou-se a presente enzima a esta solução e deixou-se reagir a 25e c. Mediu-se a absorvância a 410 nm da p-nitroanilina libertada no líquido pela reacção en zimãtica e calculou-se a quantidade (nmol) de p-nitroanilina li bertada a partir de 1 mg de substrato por minuto; os resultados obtidos deste modo são apresentados no Quadro 1.
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(ii) Seleccionou-se para substrato proteico a cadeia B da insulina oxidada e compararam-se as acções da presente enzima e da protease V8 derivada de Staphylococcus aureus sobre este subs trato pelo procedimento seguinte. Em primeiro lugar dissolveu-se a cadeia B da insulina oxidada em bicarbonato de amónio 50 mM (pH 7,8), adicionou-se a presente enzima ou a referida protease V8 de modo a que a proporção enzima/substrato fosse de 1/100 (p/p) e deixou-se reagir durante o período de tempo pretendido. Em seguida submeteu-se a mistura reaccional a HPLC usando uma coluna de 4,6 x 250 mm cheia de Vydac Protein (300 angstrõms), que foi eluida sob um gradiente linear de acetonitrilo de 0 a 50% em TFA a 0,1%, aumentando a concentração de acetonitrilo de 1,67%/min. Por mapeamento de peptídeos verificou-se que com qualquer das enzimas as ligações peptídicas nas extremidades carboxi-terminais dos resíduos de ácido glutãmico e os produtos da hidrólise enzimática induzida pelas duas enzimas eram idênticos entre si.
Deste modo, os resultados das referidas anãlises (i) e (ii) demonstram que a presente enzima cinde as ligações peptídicas nas extremidades carboxi-terminais dos resí. duos de ãcido glutâmico e é por conseguinte uma endopeptidase específica em relação ao ácido glutâmico.
(2) pH óptimo e gama de pH de estabilidade
Dissolveu-se um substrato constituído por Ζ-Phe Leu Glu-pNA em tris.HCl 50% contendo 10% de DMF e cio reto de cãlcio 2 mM. Em seguida adicionou-se a presente enzima ã mistura, deixou-se reagir durante 15 minutos a 37c C e mediu-se a absorvância a 410 nm da p-nitroanilina libertada no líqui do pela reacção enzimática. Efectuou-se a referida reacção a vã rios valores de pH. Os resultados revelaram que o pH óptimo para a actividade enzimática é 8,0.
Em seguida manteve-se a presente enzima a 253 C durante 24 horas a vários valores de pH e em cada caso deixou-se a enzima depois deste tratamento reagir com um substrato de acordo com os procedimentos descritos no método para a medição da actividade enzimática mencionado anteriormente. Os resultados indicam que a gama de pH de estabilidade da presente enzima é desde cerca de 4,0 até cerca de 10,0. Numa gama de pH
de 6,5 a 8,5 a actividade enzimática mantém-se a 100% e a valores de pH superiores a 4,0 até menos de 6,5 e superiores a 8,5 até 10,0 a actividade enzimática mantêm-se entre 80 e 100%.
(3) Estabilidade térmica
Manteve-se a presente enzima durante 15 minutos a várias temperaturas numa solução tampão contendo cloreto de cálcio 2 mM a pH 7,8. Em cada caso, deixou-se a enzima depois deste tratamento reagir com o substrato de acordo com os procedimentos descritos no método para a medição da actividade enzimática referido anteriormente. Os resultados indicam gue nas condições referidas a presente enzima ê estável a temperatu ras até um máximo de 60Q C. Quando a presente enzima foi conser vada de modo semelhante em soluções que não continham cloreto de cálcio era estável a temperaturas até um máximo de 50Q C.
(4) Efeito dos inibidores
A presente enzima ê completamente inibi^ da pelo fluorofosfato de diisopropilo (DFP). Este facto indica que a presente enzima é classificada como uma protease de serina.
A presente enzima é também completamente inibida por Ζ-Phe Leu Glu CS^Cl. Este facto indica que a pre sente, enzima é uma endopeptidase específica em relação-ao ácido glutâmico.
A presente enzima é inibida parcialmente por EDTA, com uma taxa de inibição máxima de aproximadamente
72%. Este efeito inibidor de EDTA é completamente anulado pela _ . „ , . - -4 -3 adiçao de ioes metálicos a baixa concentração (10 a 10 M de iões cálcio ou magnésio, etc.).
Os factos anteriormente referidos indicam que a presente enzima ê uma protease de serina típica, cuja estabilidade está relacionada com a presença de iões metálicos.
(5) Peso molecular
O peso molecular da presente enzima foi p
determinado por SDS-PAGE usando gel a 15% (1,0 mm) e Kainbow
Protein Molecular Weight Marker (Amersharn), e foi calculado em
000. O peso molecular foi também calculado a partir da sequência de ácidos aminados determinada com base na análise de sequenciação genética que se descreverá em seguida e o valor assim obtido foi 23 567, o que é algo diferente do valor anteriormente referido obtido por SDS-PAGE. De qualquer modo, os re sultados das várias análises químicas das proteínas que se descrevem em seguida (composição em ácidos aminados, sequências amino-terminais, composição em ácidos aminados na vizinhança da extremidade carboxi-terminal) estão em concordância com a estru tura deduzida a partir da sequência de ADN. Este facto indica que o peso molecular obtido por SDS-PAGE estava, de facto, ligeiramente em excesso em relação ao valor verdadeiro.
(6) Ponto isoeléctrico
Por investigação do ponto isoeléctrico da presente enzima usando o sistema Pharmacia FAST (Pharmalite, pH 3,0 a 10,0) verificou-se que o valor era superior a pH 9,0 e não foi possível obter um valor normal.
(7) Composição em ãcidos aminados
Usando ãcido metanossulfónico 4 M (contendo 0,2% de 3-(2-aminoetil)-indolo), hidrolisou-se a presente enzima a 110Q C para vários intervalos de tempo (24, 48 ou 72 horas). Submeteram-se em seguida os respectivos hidrolisados a análise de ãcidos aminados usando um analisador de ácidos amina dos Hitachi Modelo 835. Os resultados desta análise, corrigidos para a decomposição de ãcidos aminados no processo de hidrólise são apresentados no Quadro 2. A composição em ácidos aminados calculada a partir da sequência de ADN da presente enzima (descrito seguidamente) é também apresentada para comparação no Qua dro 2. Os dois conjuntos de resultados apresentam claramente uma boa concordância.
QUADRO 2
Composigão em ácidos aminados
Ãcido aminado Valor medido (%) Valor calculado (%)
Asp 8.38 8.10
Thr 11.€8 12.61
Ser 13.49 14.41
Glu 5.48 4.95
Pro 4.79 4.50
Gly 13.61 13.06
Ala 5.24 5.41
Cys/2 1.69 1.80
Vai 6.08 5.86
Met 0.93 0.90
lie 6.04 5.86
Leu 2.34 2.25
Tyr 7.97 7.66
Phe 2.38 2.25
Lys 2.70 2.70
His 1.73 1.80
Arg 4.11 4.05
Trp 1.37 1.80
Total 100.01 99.97
(8) Sequências parcial de ácidos aminados (i) Sequência de ácidos aminados na proximidade da extremi dade N.
Usou-se um Sequenciador de Proteínas Mo delo 477A (Applied Biosystems) a fim de analisar a sequência de ácidos aminados da presente enzima na vizinhança da extremidade amino-terminal. As amostras de enzima usadas foram inibidas pré
viamente com DFP. A sequência de ácidos aminados da extremiriarie amino-terminal até ao resíduo 23o é apresentada no Quadro 3.
QUADRO 3
Fase de degradação Acido aminado Recupe ração(%) Fase de degradação Acido aminado Recuperação (%)
1 Ser 24.1 13 Asn 53.2
2 Vai 85.6 14 Thr 30.3
3 Ile 81.6 15 Thr 31.9
4 Gly 90.2 16 Ala 51.5
5 Ser 22.8 17 Tyr 62.3
6 Asp 51.7 18 Pro 42.7
7 Asp 73.1 19 Tyr 45.1
8 Arg 61.3 20 Arg 12.9
9 Thr 39.8 21 Ala 33.4
10 Arg 55.6 22 Ile 24.6
11 Vai 65.3 23 Vai 22.7
12 Thr 36.4
(ii) Sequência de ácidos aminados na proximidade da extremidade C.
Fez-se actuar carboxipeptidase A (CPase A, ou carboxipeptidase Y (CPase Y) sobre amostras da presente enzima inibida préviamente com DFP e as quantidades de ácidos aminados libertados por estas reacções foram medidas com um ana lisador de ácidos aminados Hitachi Modelo 835. No entanto não foi possível determinar com presição a sequência de ácidos aminados na vizinhança da extremidade carboxi-terminal da presente enzima usando qualquer das carboxipeptidases referidas. No entanto foi verificada a presença de glutamina, serina, alanina e asparagina na vizinhança da extremidade carboxi-terminal.
V. Determinação da sequência de ADN que codifica para a BLase
Determinada terminologia empregue na ej5 pecificação da presente invenção é definida como se segue.
Oligonucleótido refere-se a uma molécula curta de ADN de cadeia simples. Os oligonucleotidos podem ser sintetizados por via química de acordo com vários métodos conhecidos. Sempre que nada em contrário seja indicado, os oligonucleõtidos usados no processo da presente invenção são sinte tizados por via química e são purificados por cromatografia em gel usando Sephadex G50 e por cromatografia líquida de alta ef£ ciência (HPLC) com uma coluna de gel de sílica de fase invertida.
PCR é um acrónimo para reacção de po limerase em cadeia (polymerase chain reaction) e refere-se a um método para a amplificação enzimática de uma região de ADN definida (Saiki et al., Science, 239, 487-497, 1988), Em primei, ro lugar, converte-se o ADN a ser amplificado em ADN de cadeia simples por desnaturação térmica e temperam-se iniciadores oligonucleotídicos (de dois tipos, ou seja, cadeias de sentido directo e anti-sentido, cada um possuindo uma sequência complemen tar da região 3'-terminal do referido ADN de cadeia simples) nas regiões nas respectivas extremidades 3'-terminais (ou seja ADN molde) . Em seguida, a extensão das cadeias de ADN a partir dos respectivos iniciadores ê efectuada por uma reacção usando polimerase de ADN. Por repetição desta sequência de reacções, o ADN alvo pode ser amplificado por um factor de 100 000 a 1 000 000.
Mancha de Southern é um método para determinar se um gene determinado estã ou não contido num fragmento de ADN obtido por cisão com uma determinada enzima de res trição. O método de mancha de Southern é efectuado em primeiro lugar por digestão da amostra de ADN sob investigação com uma enzima de restrição que reconhece especificamente uma certa sequência de bases em ÃDN duplex e cinde este ADN em locais específicos. O produto da digestão obtido deste modo é submetido a electoforese em gel de agarose a 1% e em seguida é desnaturado em ADN de cadeia simples por tratamento com um alcali e transfe rido para um filtro de nylon. Em separado, prepara-se um oligonucleõtido ou fragmento de ADN que constitui uma porção do gene em questão e marca-se de modo a obter uma sonda. Usa-se em seguida uma hibridação do ADN de cadeia simples sobre o filtro de
nylon com esta sonda a fim de detectar a presença do gene em questão.
Ligação refere-se à criação da ligação de diêster fosfórico entre dois fragmentos de ADN duplex. Nesta técnica, a fim de evitar a ligação a si próprio de qualquer dos fragmentos de ADN duplex, um dos fragmentos é submetido a um tratamento prévio de desfoforilação pelo método convencional (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, 133-134, 1982). A ligação pode ser efectuada com ligase de ADN T4 usando um tipo bem conhecido de solução tampão e condições de reacção também conhecidas.
Transformação refere-se ao fenómeno em que o genotipo de uma célula (ou seja de uma célula hospedei^ ra) é transformado pela introdução de genes exógenos (ADN) na referida célula. Uma célula que foi submetida a uma transformação deste tipo é conhecida por um transformante e é caracteri^ zada pela capacidade de replicação do ADN exógeno como um compo nente extranuclear ou sob uma forma integrada nos cromossomas da referida célula.
Em seguida, descreve-se o método utilize. do para a determinação da sequência de ADN da BLase da presente invenção na ordem dos processos envolvidos. Esta sequência de ADN foi determinada por análise do ADN genómico do Bacillus licheniformis ATCC NC. 14580 usando uma combinação de análise por PCR, mancha de Southern, técnicas de sequenciação directa, etc..
(1) Análise de PCR da sequência de ADN genómico
É possível obter uma sequência de ADN que codifica para a BLase, por exemplo, a partir de ADN genóraico. A fim de obter o ADN, em primeiro lugar isola-se o ADN genó mico do Bacillus licheniformis ATCC NC. 14580 a partir de células em cultura da referida estirpe pela técnica convencional (M. Stahl et al., J. Bacteriology, 154, 406-412, 1983). Usa-se este ADN genómico como ADN molde para análise de PCR. Os inicia dores oligonucleotídicos usados para a PCR são sintetizados por métodos convencionais com base na sequência de ácidos aminados na vizinhança da extremidade amino-terminal da enzima purificada, determinada pela Secção IV Item (8) anterior, e/ou as se15
quências de ácidos aminados dos peptídeos obtidos por hidrólise parcial da referida enzima. Por exemplo, o oligonucleõtido que codifica para a sequência de ácidos aminados Thr Asn Thr Thr Ala Tyr Pro Tyr que corresponde às posições desde a 12â até à 19& contadas a partir da extremidade amino-terminal da Blase (ver Quadro 3) é usado como iniciador de sentido directo BL8 (apresentado na SEQ ID NO: 2). Este oligonucleõtido é um tricosâmero que codifica para a sequência de ácidos aminados atê à segunda base do codão tripleto para o resíduo de tirosina da ex tremidade C.
TTT A
BL8: 5*- AC AACAC AC GCTTACCC TA
C C C G
Separadamente, sintetiza-se outro iniciador oligonucleotídico com base num peptídeo que é obtido pela decomposição da enzima purificada com lisilendopeptidase seguida por sequenciação e a sequência que é de maior confiança. Conforme descrito no Exemplo 2 em seguida, obtêm-se a sequência Gly Tyr Pro Gly Asp Lys (SEQ ID NO: 8) uma vez que se usa o octadecãmero complementar de um oligonucleõtido que codifica para esta sequência de ácidos aminados como iniciador anti-sentido BL83 (apresentado na SEQ ID NO: 3).
T A T C T
BL83: 5’ - TT TC CC GGATA CC
C G G A G
Em seguida efectua-se a PCR usando o ADN genõmico referido, o iniciador de sentido directo BL8 e o iniciador anti-sentido BL83, prolongando e amplifiçando deste modo as cadeias do ADN alvo no ADN genõmico. Submetem-se os produtos da PCR deste modo obtidos a uma electoforese em gel de agarose, obtendo-se deste modo um fragmento de ADN de aproximadamente 370 pb. Este fragmento de ADN é incorporado num vector adequado e após subclonagem determina-se a sequência de bases do fragmento pela técnica de Sanger. A referida sequência de ácidos aminados Gly Tyr Pro Gly Asp Lys que constitui a base para a preparação do iniciador anti-sentido BL83 foi identificada como sendo a sequência localizada nas posições 131 a 136 da sequência de ácidos aminados
da BLase.
(2) Análise de mancha de Southern do ADN genõmico
Digere-se o ADN genõmico derivado de
Bacillus licheniformis ATCC NQ. 14580, preparado na alínea (1) anterior, com a enzima de restrição Sall e, após separação .
por electoforese em gel de agarose, depositam-se os fragmentos de ADN deste modo obtidos num filtro de membrana de nylon e ana lisa-se pela técnica de Southern. A sonda usada para hibridação é o produto de PCR de BL8-BL83 obtido na alínea (1) anterior 32 marcado com P-dCTP pelo método convencional. 0 fragmento de ADN que apresenta uma hibridação positiva em relação a este pro duto BL8-BL83 é reconhecido sob a forma de uma banda correspondente a cerca de 3,1 kb.
(3) Sequenciação do ADN genõmico por PCR
Digere-se o ADN genõmico do Bacillus licheniformis ATCC NQ. 14580, obtido na alínea (1) anterior, com Sall e em seguida incorpora-se o produto desta digestão num vector adequado, por exemplo o vector pUC119, e efectua-se uma PCR usando uma porção da sequência de ADN conhecida como inicia dor. Por exemplo, usa-se uma porção da sequência do ADN do vector pUC119 localizada a montante do referido ADN genõmico como iniciador de sentido directo RV (apresentado na SEQ ID NO: 4) e usa-se uma sequência de ADN complementar da sequência na vizinhança da extremidade 3’ do fragmento de ADN de 375 pb analisadc na alínea (2) anterior como iniciador anti-sentido B125 (apresentado na SEQ IN NO: 5).
RV: 5' - CAGGAAACAGCTATGAC B125: 5’ - TGTCCCAACAAGTGATGA
Obtém-se por PCR um fragmento de ADN de aproximadamente 1050 pb. A sequência de bases deste fragmento pode ser determinada pelo método de sequenciação directa de ADN (Gibbs et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 86, 1919-1923, 1989). Deste modo, a sequência de ADN que codifica para a BLase pode ser confirmada a partir da extremidade amino-terminal até ao meio da sequência.
Em seguida, é possível determinar-se a porção da sequência no lado 3' do ADN genõmico pelo seguinte procedimento. Em primeiro lugar, do modo anteriormente indicado,
digere-se o ADN genõmico do Bacillus licheniformis ATCC NQ. 14580 com Sali e isola-se om fragmento de aproximadamente 3,1 kb. Insere-se este fragmento em M13mpll e efectua-se uma PCR.
Os iniciadores usados nesta PCR são fragmentos parciais do fra<£ mento de ADM de 375 pb analisado na alínea (2) anterior; um é o iniciador de sentido directo B40 (apresentado na SEQ ID MO: 6) gue estã localizado a montante do referido iniciador anti-senti do B125, e o outro ê o iniciador anti-sentido M4 (apresentado na SEQ ID MO: 7) que possui uma sequência de ADM complementar de ama porção da sequência de ADM de M13mpll e se encontra loca lizado a juzante do ADN genõmico.
B40: 5' - AAAACCGTCGCAACAGCC M4: 5* - GTTTTCCCAGTCACGAC
A referida PCR dá origem a um fragmento de ADM de aproximadamen te 2,2 kb. A sequência de bases deste fragmento de ADM pode ser determinada pelo método da sequenciação de ADM directa. Deste modo, determina-se a sequência de bases desde a extremidade 3' até ao meio do ADM genõmico.
A sequência de ADM completa da BLase de terminada deste modo bem como a sequência de ácidos aminados de terminada a partir desta sequência são apresentadas na SEQ ID MO: 1 a na Figura 1. A partir de SEQ ID MO: 1 e da Figura 1 reconhece-se que o gene que codifica para a proteína madura derivada do Bacillus licheniformis contêm uma sequência de ADN que codifica para um peptídeo de sinal constituído por 94 resíduos de ácidos aminados a partir do residuo de M-formilmetionina na posição -94 até ao resíduo de lisina na posição -1 e uma sequên cia de ADM que codifica para a proteína madura constituída por 222 resíduos de ácidos aminados a partir do resíduo de serina na posição +1 até ao resíduo de glutamina na posição 4-222. Normalmente o tripleto ATG codifica paxa a metionina. mas neste ca so o tripleto TTG (fMet) parece ser o codão de inicio da tradução. Mo segmento de 332 pb da região 5' não traduzida com início no local de cisão Sali existe uma região promotora que contêm uma sequência -35, uma caixa Pribnow e uma sequência de Shine-Dalgarno que estã presente 9 bases a montante do referido codão TTG de presumível inicio de tradução. Ma região 3* não
traduzida está localizada tuna repetição complementar invertida composta por 13 pares de bases 8 bases a jusante do codão de pa ragem TAA.
VI. Construção de vectores de expressão
Conforme se mostra na Figura 2, o vector pHY300BLtt, um exemplo dos vectores de expressão da presente invenção, é obtido a partir do vector lançadeira pHY300PLKtt que contém um terrninador de protease alcalina derivado de Bacil· lus subtilis ATCC no. 6051, por inserção de um fragmento de ADN que codifica para a BLase da presente invenção apresentado na SEQ ID NO: 1 (isto é, um fragmento de ADN que contém um promotor, uma sequência de ADN que codifica para o peptídeo maduro da BLase e um terrninador) no referido vector pHY300PLKtt. Conforme se mostra na Figura 3, o referido vector pHY300FLKtt é ob tido a partir de um vector pHY300PLK que ê um vector lançadeira de B. coli e B. subtilis por inserção de um terrninador de protease alcalina derivado de Bacillus subtilis ATCC NQ. 6051 no vector pHY300PLK.
O referido procedimento será agora explicado mais em pormenor na ordem dós processos envolvidos. Em primeiro lugar, como se mostra na Figura 3, isola-se o ADN genó mico do Bacillus subtilis ATCC NQ. 6051 pelo método de M. Stahl et al. (supra) e utiliza-se este como ADN molde. Em seguida, sintetiza-se por via química um fragmento constituído por uma sequência de ADN que corresponde ã vizinhança da extremidade 5’ da porção do terrninador do gene da protease alcalina derivado de Bacillus subtilis 1-168, como um local de cisão Xbal adicionado, e um fragmento complementar de uma sequência de ADN que corresponde à vizinhança da extremidade 3’ da porção do termina dor, com um local de cisão HindIII adicionado, e efectua-se uma PCR usando estes fragmentos como iniciadores. Cinde-se o fragmento de ADN obtido este modo com Xbal e HindIII, obtendo-se en tão um fragmento (1) apresentado na Figura 3. Em seguida cinde—se o vector pHY300PLK com Xbal e HindIII. obtendo—se deste modo o fragmento maior (2) apresentado na Figura 3. Constroi-se então o vector lançadeira pHY30QPLKtt que contém o terrninador
de protease alcalina derivado de Bacillus subtilis ATCC NQ. 6051, por ligação destes fragmentos (1) e (2)·
Em seguida isola-se o ADN genõmico a partir de células de cultura derivadas de Bacillus lichenniformis ATCC NQ. 14580 e usa-se como ADN molde. Sintetiza-se em seguida um fragmento constituído por uma sequência de ADN que cor responde à extremidade 3’ do ADN molde com um local de cisão Xbal adicionado e usam-se como iniciadores de sentido directo e
anti-sentido, respectivamente. Efectua-se uma PCR usando o refe rido molde de ADN, o iniciador de sentido directo, e o iniciador anti-sentido. Em seguida cinde-se o fragmento deste modo ob tido com EcoRI e Xbal, obtendo-se assim um fragmento de ADN (3) que codifica para a BDase (ver Figura 2). Este fragmento (3) contêm um promotor, uma sequência de ADN que codifica para ua peptideo de sinal, uma sequência de ADN que codifica para a BLase »a^nra e um terminador. Como fase seguinte, cinde-se o re ferido vector pHY300PLKtt com EcoRI e Xbal, obtendo-se deste mo do o fragmento maior (4) . Obtêm-se então o vector de expressão pHY300BLtt da presente invenção por ligação dos fragmentos refe ridos (3) e (4) (ver Figura 2).
Este vector de expressão pHY300BLtt con têm, sob a regulação do promotor da Blase, uma sequência de ADN que codifica para o peptideo de sinal desde o residuo da N-formilmetionina na posição -94 até ao resíduo de Iisina na posição -1; uma sequência de ADN que codifica para o peptideo maduro que se estende desde o resíduo de serina na posição +1 até ao resíduo de glutamina na posição +222 da Blase; e uma região 3' não traduzida que contém um terminador. Ainda mais a jusante, está presente o terminador da protease alcalina derivado de Bacillus subtilis ATCC NQ. 6051.
VII. Preparação dos transformantes e produção da BLase
Introduz-se o vector de expressão obtido na Seccão VI anterior em células hospedeiras adequadas por um método convencional. Por exemplo, é possivel introduzir o . vector referido pHX300BLtt em Bacillus subtilis ISW1214 (Takara 1 Shuzo) pelo método de J. Spiezen et al. (Proc. Natl, Acad» Sei.
O.S.A. 44. 1072. 1958). Cultiva-se o transformante (Bacillus subtilis pHZ300BLtt/ISW1214) em qualquer meio adequado para o hospedeiro, produzindo deste modo a BLase da presente invenção. Por fim isola-se a BLase a partir do caldo de cultura em que se cultivou o transformante e purifica-se pelo processo descrito na Secção IX anterior.
EXEMPLOS
A presente invenção será em seguida explicada em pormenor por referência a exemplos específicos.
EXEMPLO 1
Cultivou-se Bacillus lichenlformis ATCC ΚΘ. 14580 a 280 C durante 36 horas num meio de pH 7,0 contendo 2,0% de glucose, 2,0% de farinha de soja, 0,25% de licor de maceração de milho, 0,5% de sulfato de amónio, 0.05% de hidrogeno fosfato dipotãssio, 0,05% de hepta-hidrato de sulfato de magnésio, 0,01% de hepta-hidrato de sulfato ferroso e 0,3% de carbonato de cãlcio. Filtraram-se através de um filtro-prensa 95 litros do caldo de cultura e concentraram-se atê aproximadamente 14 litros por meio de um módulo de ultrafiltração (Nitto Ultrafiltration Module ΝΤΟ 2020T P188 (HF); limiar de corte p.m.
000) e de uma centrifugação (4200 rpm, 30 minutos). Diluiu-se este caldo concentrado isento de células até aproximadamente 28 litros (1,9 ms/cm) com cloreto de cãlcio 2 mM. Em seguida ajustou-se o pH do caldo diluído isento de células a 6,0 por adição de ácido clorídrico. Adicionaram-se em seguida aproximadamente 4 litros de Amberlite CG-50 que tinha sido equilibrada com tampão de acetato 10 mM (pH 6,0) contendo cloreto de cãlcio 2 mM e agitou-se a mistura durante 4 horas à temperatura ambien te. Após se ter verificado que o sobrenadante não possuia actividade de BLase, desprezou-se o sobrenadante. Em seguida carregou-se a Amberlite cG-50 numa coluna de vidro de 14 x 32 cm. Após lavar com aprnvimadamente 10 litros de tampão de acetato 10 mM (pH 6,0) contendo cloreto de cãlcio 2 mM, efectuou-se a eluição com tampão de acetato de sódio 0,5 M (pH 8,5) contendo também cloreto de cálcio 2 n®l.
As fracções que continham actividade de BLase eluídas da Amberlite CG-50 foram combinadas (o volume total das fracções era de 2,7 litros) e foram dialisadas contra ãgua durante 48 horas. Diluiu-ee o dialisado até 8 litros (2,23 ms/cm) com cloreto de cálcio 2 mM e após ajustar a pH 6,0 adsor veu-se o fluído em aproximadamente 800 ml de S-Sepharose numa coluna de 5 x 40 cm que tinha sido previamente equilibrada com uma solução tampão de acetato 5 mM (pH 6,0) contendo cloreto de cálcio 2 mM. Após lavagem com cerca de 5 litros de solução tampão com a mesma composição que a usada para o equilíbrio referi do anteriormente, submeteu-se a coluna a eluição com 7 litros desta solução tampão sob um gradiente linear de cloreto de sódio de 0 a 0,2 M. Combinaram-se as fracções que tinham activida de de BLase (o volume total das fracções era de 900 ml) e diali sou-se de um dia para o outro contra uma solução aquosa de cloreto de cálcio 2 mM, obtendo-se deste modo aproximadamente 950 ml de dialisado (0,86 ms/cm). Ajustou-se o pH deste dialisado a
7,5 e imediatamente em seguida submeteu-se a cromatografia de afinidade. O veículo usado neste processo de cromatografia de afinidade foi de aproximadamente 340 ml de CH Sepharose 4B (Phe -D-GluQMe) numa coluna de 3 x 48 cm e equilibrada com tris.HCl 5 mM (pH 7,5) contendo cloreto de cálcio 2 mM. Após adsorção do dialisado referido nesta coluna, lavou-se esta com aproximadamente 5 litros de solução tampão com a mesma composição da usada para o equilíbrio da coluna e em seguida submeteu-se a eluição com 3,5 litros da solução tampão da mesma composição sob um gradiente linear de cloreto de sódio de 0 a 0,7 M.
Mediu-se a actividade de BLase de cada fracção obtida deste modo pelo método para a medição da actividade enz imã tica apresentado na Secção III da Descrição das formas preferidas de concretização. Os resultados são apresentados na Figura 4. Mediu-se a absorvância a 280 nm de cada fracção co mo indicação da concentração de proteína. Os resultados obtidos nesta medição sao também apresentados na Figura 4. Ssta figura mostra que a BLase foi eluída a uma concentração de aproximadamente 0,5 M de cloreto de sódio. A BLase obtida deste modo apre sentou unta única banda em SDS-PAfiE. Deste modo, foi obtida uma amostra de 833,1 mg da referida enzima (quantificada com um con junto de análise de proteínas Bio Rad) com uma actividade espe-
do de cultura. O rendimento da actividade enzímática foi de 27,5%.
EXEMPLO 2
Determinação da sequência de bases do ADN que codifica para a
BLase (1) Análise por PCR da sequência de bases interna do ADN genómico
Adicionaram-se 100 pg da BLase purifica da obtida no Exemplo 1 que tinha sido tratada com DFP em 150 pl de tris.HCl 0,05 M (pB 9,0) contendo ureia 1 K e digeriu-se com 1 pg de lisil-endopeptidase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a 37Q C durante 5 horas. O produto resultante da digestão enzímática foi em seguida isolado e purificado por cromatografia líquida de alta eficiência usando uma coluna cheia com TSKgel ODS-120T (4,6 x 250 mm, Toson Co. Ltd.). Investigaram-se as sequências de ácidos aminados dos fragmentos digeridos obtidos deste modo com um Protein Sequencer modelo 477A (Applied Biosystems), determinando deste modo as sequências de ácidos aminados de cinco tipos de fragmentos. Três destas sequências estáo indicadas em seguida bem como em SEQ ID NOSs 8, 9 e 10.
Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Lys
Ala-Ile-Val-His-Ile (D (II)
Ser-Thr-Arg-Tyx-Phe-Ile-Pro-Ser (III)
Em seguida isolou-se o ADN genõmico de Bacillus licheni f ormis ATCC NQ. 14580 pelo método de M. Stahl et al. (supra.) e usou-se o ADN como molde para análise por PCR. Os iniciadores oligo nucleotídicos usados para a PCR foram preparados com base nas proporções conhecidas da sequência de ácidos aminados da BLase produzida por Bacillus licheniformis ATCC NQ. 14580. Em primeiro lugar sintetizou-se por via química um oligonucleótido que
codifica para a sequência àe ãcidos aminados que começa cora a 123 posição e termina com a 193 posição a partir da extremidad* amino-terminal da molécula de BLase (ver Quadro 3), isto é, Th Asn Thr Thr Ala Tyr Pro Tyr (excepto em que o referido oligonucleótido apenas se prolonga através da segunda base do tripleti que codifica para o resíduo de tirooina na extremidade carboxi· -terra-i nal do oligopeptídeo, isto é, o referido oligonucleõtido é um tricosâmero). Este oligonucleõtido foi usado como iniciador de sentido directo BL8 (apresentado na SEQ ID NO: 2).
TTT A
BL8: 5' - AC AACAC AC GCTTACCC TA
CCC G
Em seguida sintetizou-se por via química um octadecãmero compl< mentar que codifica para um fragmento de ãcidos aminados que é o produto obtido na referida digestão por lisil-endopeptidase que possui uma sequência de ãcidos aminados com o maior grau d confiança [isto é, Gly Tyr Pro Gly Asp Lys (apresentada em SEçl ID NO: 8]. Este oligonucleõtido foi usado como iniciador anti-J -sentido BL83 (apresentado na SEQ ID NO: 3). I
T A T C T I
BL83: 5’ - TT TC CC GGATACC I
C G G A G I
Usando o referido ADN molde e iniciadi res oligonucleotídicos, amplificou-se o ADN pelo método da PC] (Saiki et al., Science 239, 487-491, 1989). Analisou-se uma p< ção dos produtos amplificados por electoforese em gel de agari se a 1%, confirmando-se deste modo a presença de um fragmento de ADN de cerca de 370 pb. Isolou-se este fragmento e, apõs a nhar as extremidades com fragmento de Klenow, clonou-se o fra mento em MI3mpll que tinha sido digerido com Smal, e determin -se a sequência de ADN do fragmento pelo método de Sanger (saj ger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. , 74, 5463-5467, 197| Deste modo, determinou-se a sequência de bases de um fragmentj de 375 pb e vezificou-se que a sequência de ãcidos aminados ci respondente a BL83 estava localizada nas posições 131 a 136. | ra além disso, verificou-se que as sequências de ãcidos amincl
dos (il) e (III) estavam localizadas nas posições 21 a 25 e 79 a 86, respectivamente.
(2) Anãlise de mancha de Southern do ADN genómico
Digeriu-se corn a enzima de restrição Sall o ADN genómico de Bacillus licheniformis ATCC NQ. 14580 ob tido pelo procedimento descrito na alínea (1) anterior e, após separação dos produtos por electoforese em gel de agarose a 1%, depositaram-se os fragmentos de ADN num filtro de membrana de nylon e analisou-se pela técnica de Southern. A sonda usada para a hibridação foi o produto de PCR BL8-BL83 obtido na alínea _
(1) anterior marcado com p-dCTP pelo método convencional. Reconheceu-se o fragmento de ADN que apresentava hibridação positiva com este produto BL8-BL83 sob a forma de uma banda correspondente a um comprimento de cerca de 3,1 kb.
(3) Determinação da sequência do ADN genómico por PCR
Digeriu-se com Sall o ADN genómico de Bacillus licheniformis ATCC NQ. 14580 obtido na alínea (1) ante rior e em seguida alinharam-se as extremidades dos fragmentos com polimerase de ADN T4. Ligou-se este fragmento de extremidades alinhadas com um vector pUC119 digerido Smal desfosforilado. Efectuou-se esta reacção de ligação com um conjunto comercial (Takara Shuzo).
Em seguida, sintetizaram-se por via qui mica o iniciador de sentido directo KV (apresentado na SEQ ID NO: 4) e o iniciador anti-sentido B125 (apresentado na SEQ ID NO: 5), com as sequências de bases indicadas abaixo, e adiciona ram-se a uma allquota da mistura reaccional para a reacção de ligação referida, deixando prosseguir a reacção de PCR.
O iniciador de sentido directo KV é uma porção da sequência de ADN de pUC119 e estã localizado a montan te do referido ADN genómico, enquanto que o iniciador anti-sentido BI25 ê uma sequência de ADN complementar de uma sequência na vizinhança da extremidade 3' do fragmento de ADN de 375 pb analisado na alínea (2) anterior.
KV: 5’ - CAGGAAACAGCTATGAC B125: 5* - TGTCCCAACAAGTGÃTGA
Pela referida reacção de PCR obteve-se um fragmento de ADN de
aproximadamente 1050 pb· Determinou-se a sequência de bases des^ te fragmento pelo método da sequenciação directa de ADN (gibbs et al., Proc. Natl. Acfad. Sei. O.S.A., 86, 1919-1923, 1989). Deste modo, confirmou-se a sequência de ADN que codifica para a presente enzima a partir da extremidade 5' atê ao meio da sequência.
Digeriu-se com Sall o ADN genómico de Bacillus lichenlformlg ATCC NO. 14580, obtido na alínea (1) anterior e submeteu-se a electoforese em gel de agarose a 18, iso lado deste modo um fragmento de aproximadamente 3,1 kb. Alinharam-se as extremidades deste fragmento com fragmento de Klenow e ligou-se com fragmentos de M13mpll digeridos com Smal desfosforilados. Usando o fragmento obtido como molde, efectuou-se uma PCR. Os iniciadores usados para esta PCR foram o iniciador de sentido directo B40 (apresentado na SEQ ID NO: 6) que é uma porção do fragmento de ADN de 375 pb na alínea (2) anterior (a montante do referido iniciador B125), e o iniciador anti-sentido M4 (apresentado na SEQ ID NO: 7) que ê uma sequência de ADN complementar da porção da sequência de ADN de M13mpll localizada a jusante do ADN genómico.
M4: 5* - GTTTTCCCAGTCACGAC B40: 5* - AAAACCGTCGCAACAGCC
Por meio da referida PCR obteve-se um fragmento de ADN de cerca de 2,2 kb. Determinou-se a sequência de bases deste fragmento de ADN pelo método ds sequenciação directa de ADN. Deste modo determinou-se a sequência de bases a partir da extremidade 3* até ao meio do ADN genómico.
Em SEQ ID NO: 1 e nas Figuras 1-1 a 1-3 apresentam-se a sequência de ADN completa da BLase determinada deste modo bem como a sequência de ãcidos aminados deduzida a partir da sequência de adn.
A sequência de ADN da BLase bem como se quências de ADN que hibridam com a referida sequência de ADN são também úteis para a produção de uma protease com actividade de BLase que se encontra abrangida nó âmbito da presente invenção. A sequência de ADN que hibrida com a sequência de ADN da BLase pode ser obtida, por exemplo, pelo processo seguinte.
Seleccionam-se como sondas vários fragmentos de ADN, por exemplo fragmentos de ADN derivados de vários organismos, usando a sequência de ADN da BLase integral ou parcial, por exemplo um fragmento de ADN de 1124 pb que se estende desde a A na posição 248 até à T na posição 1371 de SEQ ID NO:
1. Por exemplo, emprega-se a técnica de hibridação de Southern (Southern, E. M., J. Mol. Biol. 98, 503-517, 1975) por utiliza32 - çao de uma sonda marcada com p e de um tampao de hibridação com a composição seguinte.
NaH2PO4 0,5 M (pB 7,2)
EDTA 1 mM
BSA 1 %
SDS 7 %
Depois de se levar a cabo a hibridação a 650 C de um dia para o outro, lava-se 4 vezes à temperatura ambiente com 2 x SSC, SDS a 0,1% um filtro com o qual se hibridou a sonda, sendo cada lavagem efectuada quatro vezes durante 10 minutos ã temperatura ambiente, obtendo-se deste aodo um fragmento de ADN com cerca de 65% de homologia para com a sequência de ADN da BLase. Quando o filtro é lavado uma vez duran te 20 minutos a 500 C, pode obter-se um fragmento de ADN que possui cerca de 80% de homologia para com a sequência de ADN da BLase.
(4) Construção do vector de expressão (4)-l Construção do vector lançadeira pBX300PLKtt
Isolou-se um ADN genómico de Bacillus subtilis ATCC NO. 6051 pelo método de M. Stahl et al. (supra.) e utilizou-se este como ADN molde. Em seguida sintetizaram-se por via química como iniciadores um fragmento constituído por uma sequência de ADN correspondente â vizinhança da extremidade 5* da porção do terminador de um gene de protease alcalina deri^ vado de Bacillus subtilis 1-168 (Journal of Bacteriology 158, 411-418, 1984) com um local de cisão Xbal adicionado (iniciador A de sentido directo, apresentado na SEQ ID NO: 11) e um fragmento complementar da sequência de ADN correspondente â vizi—
nhanca âa extremidade 3' da porç de cisão HindIII adicionado (ini, tado na SEQ ID NO: 12).
Iniciador de sen 5’ - GAGTCTAGAGC Iniciador anti-s 5* - GAGAAGCTTGA
Em seguida efectuou-se uma PCR u tes dois iniciadores. Cindiu-se obtido deste modo com Xbal e H fragmento (1) apresentado na Fig vector lançadeira pHY300PLK (Tai obtendo-se deste modo o fragment Construiu-se em seguida por lig, um vector lançadeira pQ¥300PLK tease alcalina derivado de Baci (4)-2 Construção do vector Isolou-i de células de Bacillus licheni. de M. Stahl et al. (supra.) e u da sintetizaram-se um fragmento pondente ã vizinhança da extrem. local de cisão EcoRI adicionado simples complementar à sequênci midade 3' do ADN molde com um 1 usaram-se para iniciador de se;
SEQ ID NO: 13) e iniciador anti ID NO: 14), respectivamente.
Iniciador de senti 5’ - CAAGAATTCGGC
Iniciador anti-sei 5' - TTGTCTAGAATT'
Levou-se a efeito uma PCR usanc dor de sentido directo C e o ii da cxndru-se o fragmento deste tendo-se deste modo um fragmen
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MCCCGTGCGCCTCC =3 ’ itido Ds féeCGATCAuCGtSC -3’
O rGiSriíiO ίούί íiidlÍGv C 2.m.Wl.í! lidador anti”oopíido D. 3i?. sofjui ίΐ.ύύο cbô-ido ceio i£<sr,RI o SXhal , cb io de ADN (3) yue codifica para a
BLase (ver Figura 2). Em seguida cindiu-se o referido vector pHY300PLKtt com EcoRI e Xbal, obtendo-se deste modo o fragmento maior (4). Os referidos fragmentos (3) e (4) foram ligados cam ligase de ADN T4. Usou-se a mistura de ligação para transformar E, coli K-12 C600. Cultivaram-se os transformantes num meio de agar—agar contendo ampicilina, e seleccionaram-se as colónias resistentes ã ampicilina. Em seguida isolou-se o ADN plasmidico das células das colónias seleccionadas e verificou-se a inserção do referido fragmento de ADN (3) na direcção correcta a par tir dos padrões de cisão por enzimas de restrição.
(5) Preparação de transformantes e produção de BLase
Introduziu-se o vector de expressão pHY300BLtt obtido na alínea (4) em Baclllus substilis ISW1214 (Takara Shuzo) pelo método de J. Spizien et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 44, 1072 (1958)). Em seguida cultivaram-se as bactérias num meio de agar-agar contendo tetraciclina e seleccionaram-se as colónias resistentes à tetraciclina, obtendo-se deste modo o transformante pretendido (Bacillus subtllis pHY300BLtt/ISWl214).
Transplantou-se o transfoxmante para 5 ml de meio LB (10 g triptona, 5 g de extracto de levedura e 5 g de cloreto de sódio com adição de ãgua atê um volume total de 1 litroi pH 7,2) e cultivou-se com agitação a 37o C durante 18 ho ras. Em seguida adicionou-se 1 ml deste caldo de cultura a 10 ml de meio Sc+ gue tinha sido esterilizado numa autoclave a 1200 C durante 20 minutos e cultivou-se com agitação a 280 C.
Amido solúvel Glicerol Bacto soytone CSL
Extracto de levedura Carbonato de cálcio g
g 5 g 2,5g i g 3 g
Adicionou-se água de modo a ajustar o volume final a 1 L (pH 7,0)
Centrifugou-se o caldo de cultura descrito a 2500 x g durante 5 minutos e separou-se o sobrenadante. Mediu-se a actividade de BLase deste sobrenadante pelo método de medição da actividade enzimática descrito na Descrição das formas preferidas de concretização. Apresentam-se no Quadro 4 os resultados destas medições. A quantidade de proteína por litro de caldo de cultura foi calculada tomando como base uma acti vidade específica de BLase de 2500 U/mg.
QPADRO 4
Período de cultura (dias) Actividade de BLase (unidades/ml) Conteúdo em proteína (mg/L)
1 15 6.0
2 56 22.4
3 72 28.8
4 79 31.6
5 69 27.6
Conforme se descreveu anteriormente, a presente invenção proporciona uma nova protease que cinde de mo do específico as ligações peotídicas nas extremidades carboxi-terminais dos resíduos de ãcido glutâmico nas sequências de ácidos aminados de polipeptídeos, um processo para a preparação da protease a partir de bactérias do gênero Bacillus, uma sequência de ADR que codifica para esta protease, um vector de ex pressão que contêm a sequência de ADR, um transformante obtido por introdução do vector de expressão num hospedeiro e um processo para a produção da protease usando o transformante. Este tipo de protease pode ser utilizado para vários fins, como por exemplo para análise de proteínas e cisão das cadeias peptídicas de proteínas de fusão em locais determinados, etc..
SEQ ID NO: 1
TIPO DE SEQUÊNCIA: nucleótido com a protéina correspondente COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 1448 pares de bases
TIPO DE CADEIA: dupla
TOPOLOGIA: linear
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genõmico
ORIGEM
ORGANISMO: Bacillus licheniformis
ESTIRPE: ATCC NO: 14580
CARACTERÍSTICAS:
de 323 a 1270 pb CDS(E) de 323 a 604 pb peptídeo de sinal(E) de 605 a 1270 pb peptídeo maduro(E)
OTRA INFORMAÇÃO:
X na posição -94 da sequência de ácidos aminados: formil meaa tionina
TCGACGGCTT CCCGTGCGCC TCCGGGATCG CTGTGATAAT TGACAACCAC ATTCATCTTT TCTTTTCCAA ACCGTTCTGC AACCGCCTTG CCTATACCTT TTGAAGAGÇG GGTCACAATT GCTGTTTTTC CTTTTAAATC ACTATACAAC CTAAACACCC CTCAATTTCT TTTCTCCATG T&GMPS&GCC GGTATCAATA TATGATCAAA CAAAATGTTA ATACACACCT TTAGTATGAT CTTTTTTAAA CATATGGAAA ATTCAGAAST ATTTTGTTAA TATCTAACTT GTACTTACAA CAAAATAAGG AAGTGATATG AT TTG GTT AGT AAA AAG AGT GTT AAA CGA GGT
Xaa Vai Ser Lys Lys Ser Vai Lys Arg Gly
-94 -90 -95
TTG ATC ACA GGT cre ATT GGT ATT TCT ATT TAT TCT TTA GGT ATG CAC
Leu Ile Thr Gly Leu Ile Gly Ile Ser Ile Tyr Ser Leu Gly Met His
-90 -85 -80
CCG GCC CAA GCC GCG CCA TCG CCT CAT ACT CCT GTT TCA AGC GAT CCT
Pro Ala Gin Ala Ala Pro Ser Pro His Thr Pro Vai Ser Ser Asp Pro
-75 -70 -65
TCA TAC AAA GCG GAA ACA TCG GCT
Ser Tyr Lys -60 Ala GlU Thr Ser Val -55
GAT CAA TAC GGC TTG TAT TCA AAA
Asp Gin -45 Tyr Gly Leu Tyr Ser -40 Lys
AAT GAA ACA AAG GAA AAA GCG GAA
Asn -30 Glu Thr Lys Glu Lys -25 Ala Glu
TAC AGC ATT AAA TCG GTG ATT GGT
Tyr Ser Ile Lys -1 Ser 1 Val Ile Gly
AAC ACA ACC GCA TAT CCG TAC AGA
Asn Thr Thr 15 Ala Tyr Pro Tyr Arg 20
ATC GGT TCA TGC ACC GGA TGG ATG
Ile Gly 30 Ser Cys Thr Gly Trp 35 Met
GCC GGA CAC TGC ATC TAT GAC ACA
Ala 45 Gly His Cys Ile Tyr 50 Asp Thr
GCC ACT GTT TCG CCG GGA CGG AAC
Ala Thr Val Ser Pro 65 Gly Arg Asn
AAA TCG ACG CGC TAC CTT ACT
Val Lys Ser Thr 80 Arg Tyr Phe Ile
ACC AAT TAC GAT TAC GGC GCA ATC
Thr Asn Tyr Asp 95 Tyr Gly Ala Ile 100
ACT GTC GGA TAC TTC GGA TAC TCG
Thr Val 110 Gly Tyr Phe Gly Tyr 115 Ser
ACA ACT GTT ACC ATC AGC GGC TAC
Thr 125 Thr Val Thr Ile Ser 130 Gly Tyr
ACT TAT GAC CCA AAC ACT AAG AGC
Thr Tyr Asp Pro Asn -50 Ile Lys Ser
GCG TCT ACA GGC ACC GGC AAA GTG
Ala Phe Thr Gly -35 Thr Gly Lys Val
AAA AAG TCA CCC GCC AAA GCT CCT
Lys Lys Ser -20 Pro Ala Lys Ala Pro -15
TCT GAT GAT CGG ACA AGG GTC ACC
Ser 5 Asp Asp Arg Thr Arg 10 Val Thr
GCG ATC GCT CAT ACT TCA AGC AGC
Ala Ile Val His Ile 25 Ser Ser Ser
ATC GGT CCG AAA ACC GTC GCA ACA
Ile Gly Pro Lys 40 Thr Val Ala Thr
TCA AGC GGT TCA TCT GCC GGT ACA
Ser Ser Gly 55 Ser Phe Ala Gly Thr 60
GGG ACA AGC TAT CCT TAC GGC TCA
Gly Thr 70 Ser Tyr Pro Tyr Gly 75 Ser
CCG TCA GGA TGG AGA AGC GGA AAC
Pro 85 Ser Gly Trp Arg Ser 90 Gly Asn
GAA CTA AGC GAA CCG ATC GGC AAT
Glu Leu Ser Glu Pro 105 Ile Gly Asn
TAC ACT ACT TCA TCA CCT GTT GGG
Tyr Thr Thr Ser 120 Ser Leu Val Gly
CCA GGC GAT AAA ACA GCA GGC ACA
Pro Gly Asp 135 Lys Thr Ala Gly Thr 140
CAA TGG CAG CAT TCA GGA CCG ATT GCC ATC TCC GAA ACG TAT AAA TTG
Gin Trp Gin His Ser 145 Gly Pro Ile Ala Ile 150 Ser Glu Thr Tyr Lys 155 Leu
CAG TAC GCA ATG GAC ACG TAC GGA GGA CAA AGC GGT TCA CCG GTA TTC
Gin Tyr Ala Met Asp Thr 160 “ Tyr Gly Gly 165 Gin '-Ser Gly Ser Pro 170 Vai Phe
GAÁ GAÁ AGC AGC TCC AGA ACG AAC TGC AGC GGT CCG TGC TCG CTT GCC
Glu Gin Ser 175 Se? Ser Arg Thr Asn 180 Cys Ser Gly Pro Cys 185 Ser Leu Ala
GTA GAC AGA AAT GGA GTA TAC GGC GGC TCC TCG TAC AAC AGA GGC ACC
Vai His 190 Thr Asn Gly Vai Tyr 195 Gly Gly Ser Ser Tyr 200 Asn Arg Gly Thr
CGG ATT ACA AAA GAG GTG TTC GAC AAT TTG ACC AAC TGG AAA AAC AGC
Arg Ile Thr Lys Glu Vai Phe Asp Asn Leu Thr Asn Trp Lys Asn Ser 205 210 215 220
GGA GAA TAATAGACGA AGACAGCCCG CTTCCTTTTG GAACGGGCTG TCACATCTAA Ala Gin
CGGCCGTATA ÇTTAATTTCC TTTAAGCCTG TACTTTTTGC CATCTATTGA
TATCGTGAAA TTTGAAGGAC CGCTGATCGG CAAATAATAG ACAAGCTGAA
ACTCCGCTTC CTCACCAGGT TTGAATGG
3-3 anaggRggn^H^ggjg
SEQ ID NO: 2
TIPO DE SEQUÊNCIA: ácido nuclexco
COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 23 pares de bases
TIPO DE CADEIA: simples
TOPOLOGIA: linear
TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico, ADN sintético
ACYAACACYA CYGCTTACCC RTA 23
SEQ ID NO: 3
TIPO DE SEQUÊNCIA: ácido nuclexco
COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 18 pares de bases
TIPO DE CADEIA: simples
TOPOLOGIA: linear
TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nuclexco, ADN sintático
YTTRTCKCCM GGATAKCC 18
SEQ ID NO: 4
TIPO DE SEQUÊNCIA: ácido nucleico
COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 17 pares de bases
TIPO DE CADEIA: simples
TOPOLOGIA: linear
TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico, ADN sintético
CAGGAAACAG CTATGAC 17
SEQ ID NO: 5
TIPO DE SEQUÊNCIA: ácido nucleico
COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 18 pares de bases
TIPO DE CADEIA: simples
TOPOLOGIA» linear
TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nuclexco, ADN sintético
TGTCCCAACA AGTGATGA
SEQ ID NO: 6
TIPO DE SEQUÊNCIA: ãcido nucleico
COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 18 pares de bases
TIPO DE CADEIA: simples
TOPOLOGIA: linear
TIPO DE MOLÉCULA: outro ãcido nucleico, ADN sintético
AAAACCGTCG CAACAGCC 18
SEQ ID NO: 7
TIPO DE SEQUÊNCIA: ãcido nucleico
COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 17 pares de bases
TIPO DE CADEIA: simples
TOPOLOGIA: linear
TIPO DE MOLÉCULA: outro ãcido nucleico, ADN sintético
GTTTTCCCAG TCACGAC 17
SEQ ID NO: 8
TIPO DE SEQUÊNCIA: ãcido axninado
COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 6 ãcidos aminados
TOPOLOGIA: linear
TIPO DE MOLÉCULA: peptideo
TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
ORIGEM
ORGANISMO: Bacillus licheniformis ESTIRPE: ATCC NO. 14580
Gly Tyr Pro Gly Asp Lys 1 5
SEQ ID NO: 9
TIPO DE SEQUÊNCIA: ácido aminado
COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 5 ácidos aminados
TOPOLOGIA: linear
TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo
TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
ORIGEM
ORGANISMO: Bacillus licheniformis
ESTIRPE: ATCC NO. 14580
Ala Ile Vai His Ile 1 5
SEQ ID NO: 10
TIPO DE SEQUÊNCIA: ácido aminado
COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 8 ácidos aminados
TOPOLOGIA: linear
TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo
TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
OrIGEM
ORGANISMO: Bacillus licheniformis ESTIRPE: ATCC NO. 14580
Ser Thr Arg Tyr Phe Ile Pro Ser 1 5
SEQ ID NO: 11
TIPO DE SEQUÊNCIA: ácido nucleíco
COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 27 pares de bases
TIPO DE CADEIA: simples
TOPOLOGIA: linear
TIPO DE MOLÉCULA: outro ãcido nucleíco, ADN sintético
GAGTCTAGAG CAGCTGCACA ATAATAG 27
SEQ ID NO: 12
TIPO DE SEQUÊNCIA: ãcido nucleíco
COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 26 pares de bases
TIPO DE CADEIA: simples
TOPOLOGIA: linear
TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleíco, ADN sintético
GAGAAGCTTG ACAGAGAACA GAGAAG 26
SEQ ID NO: 13
TIPO DE SEQUÊNCIA: ãcido nucleíco
COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 27 pares de bases
TIPO DE CADEIA: simples
TOPOLOGIA: linear
TIPO DE MOLÉCULA: outro ãcido nucleíco, ADN sintético
CAAGAATTCG GCTTCCCGTG CGCCTCC 27
SEQ ID NO: 14
TIPO DE SEQUÊNCIA: ácido nucleíco
COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 27 pares de bases
TIPO DE CADEIA: simples
TOPOLOGIA: linear
TIPO DE MOLÉCULA: outro ãcido nucleíco, ADN sintético
TTGTCTAGAA TTTGCCGATC AGCGGTC 27

Claims (3)

  1. REIVINDICAÇÕES
    Processo para a preparação de uma protease derivada de Bacillus licheniformis, que cinde as lxqações peptidicas na extremidade carboxi-terminal dos resíduos de ácido glutâmico nos polipeptídeos, caracterizado por compreender as fases de cultivar uma estirpe de Bacillus licheniformis capaz de produzir a protease num meio de cultura e recuperar a protease produzida do meio de cultura.
    - 23 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a estirpe de Bacillus licheniformis utilizada ser a estirpe Bacillus licheniformis ATCC NQ. 14580.
    33 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a protease obtida apresentar as seguintes propriedades:
    (1) pH óptimo: aproximadamente 8,0, e (2) domínio de pH de estabilidade: pH 6,5 a 8,5 a 25QC.
    - 43 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a protease obtida conter uma sequência de ácidos aminados desde a serina na posição +1 até â glutamina na posição +222 representada na SEQ ID NQ. 1.
    - 5a Processo de acordo com qualquer das rei vindicações 1 a 4, caracterizado por a protease obtida conter uma sequência de ácidos aminados desde a serina na posição +1 até à glutamina na posição +222 representada na SEQ ID NQ. 1 e cindir as ligações peptídicas na extremidade carboxi-terminal dos resíduos de ãcido glutâmico nos polipeptídeos.
    - 63 Processo para a preparação de que uma sequência de ADN que codifica para uma protease com as características da protease obtida de acordo com as reivindicações 1 a
  2. 5, caracterizado por se isolar o ADN genómico de Bacillus liche niformis ATCC NQ. 14580 a partir de uma cultura de células, usar este ADN como matriz uma reacção de polimerase em cadeia (PCR) e separar os produtos da PCR por electroforese, isolando-se um fragmento de ADN de aproximadamente 370 p.b..
    - 7a Processo de acordo com a reivindicação
  3. 6, caracterizado por a sequência de ADN obtida conter uma sequência de bases desde o resíduo de tiroina na posição 605 até ao resíduo de adenosine na posição 1270 da SEQ ID NQ. 1.
    8θ
    Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a sequência de ADN obtida codificar para uma pro te ase que contém uma sequência de ãcidos aminados desde a N-formilmetionina na posição -94 atê à glutamina na posição +222 de SEQ ID NO. 1.
    - 93 Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a sequência de ADN obtida conter uma sequência de bases desde o residuo de timina na posição 323 atê ao residuo de adenosine na posição 1270 de SEQ ID NQ. 1.
    - 10S Processo para a preparação de um vector de expressão caracterizado por se incorporar num vector adequado a sequência de ADN obtida de acordo com a reivindicação 6.
    - lia Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o vector de expressão obtido ser expressa vel numa bactéria do gênero Bacillus.
    - 12a Processo para a transformação de uma cé lula caracterizado por se introduzir numa célula hospedeira um vector de expressão obtido de acordo com a reivindicação 10.
    - 13&
    Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a célula hospedeira ser de uma estirpe pertencente ao género Bacillus.
    - 14ô Processo para a preparação de uma protease caracterizado por compreender as fases de cultivar um transformante obtido de acordo com a reivindicação 12 num meio de cultura e recuperar a protease produzida do meio de cultura.
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