CN102387711A - 蛋白质水解产物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供蛋白质水解产物组合物、用于制备蛋白质水解产物组合物的方法、以及包括蛋白质水解产物组合物的食品。大豆蛋白水解产物组合物一般包含富集47kDa片段的多肽的混合物，其中按重量计约10％-约66％的所述多肽是47kDa片段。
Description
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2008年12月31日提交的美国临时申请号61/141,941的优先权，所述文献全文以引用方式并入。
发明领域
本发明涉及包括β-伴球蛋白(β-conglycinin)疏水性核心区域的蛋白质水解产物组合物(所述组合物具有较高的白度指数和独特的粘弹特性，包括在较低温度下变稠)、制备所述蛋白质水解产物组合物的方法、以及包含所述蛋白质水解产物组合物的食品。
发明背景
世界范围内增加的蛋白消费连同动物蛋白和乳品蛋白的有限可用性和提高的费用一起，已经导致对植物蛋白如大豆蛋白的兴趣增长。
虽然大豆是一种优异的蛋白质来源，其颜色趋于灰色使其不适用于一些食品。大豆蛋白的灰色或浅米色常对大豆蛋白在多种产品中的使用造成挑战，所述产品如饮料、全肌产品、和干酪。消费者并不总是喜欢灰色或浅米色。因此所需的是具有提高白度的大豆蛋白产物。此外，大豆蛋白通常需要高热和高固体含量以凝结；因此制备特性类似于乳品基干酪的大豆干酪一直是困难的。仅需施加很少的热就能凝结的大豆蛋白将是有益的。
发明概述
本发明的多个方面中的其中一个是提供包含富集β-伴球蛋白的疏水性核心区域(47kDa片段)的蛋白质水解产物组合物。所述蛋白质水解产物组合物包含富集47千道尔顿(kDa)片段的多肽的混合物，其中按重量计至少约10％至约66％的多肽是47kDa片段。
本发明还公开了包含富集的疏水性β-伴球蛋白核心区域的蛋白级份。β-伴球蛋白及其衍生肽已知用于降低哺乳动物体内的胆固醇(Adams等人，2004，Lovati等人，2000，Cho等人，2008)。
本发明的另一方面涵盖用于制备蛋白质水解产物组合物的方法。所述方法包括使蛋白材料与肽链内切酶接触，所述肽链内切酶将蛋白材料切割成富集47kDa片段的多肽的混合物。另一方面公开了制备蛋白级份的方法。
本发明的一个方面包括制备富集的疏水性β-伴球蛋白核心区域的蛋白产物的方法，其中所述β-伴球蛋白的α’和α亚基的亲水性延伸区域被从β-伴球蛋白水解，所述水解通过使用酶在谷氨酸和天冬氨酸的C末端上切割蛋白，从而产生富集的疏水性β-伴球蛋白核心区域的蛋白产物，其中按重量计至少约10％至约66％的多肽是47kDa片段。
本发明的另一方面提供包含蛋白质水解产物的食品。蛋白质水解产物组合物包含富集47kDa片段的多肽的混合物，其中按重量计至少约10％至约66％的多肽是47kDa片段。
本发明的其他方面将在下文中部分显现和部分指出。
彩色图的参考
该专利申请包含至少一张彩色像片。具有彩色像片的该专利申请公布的复印件应请求并在支付必要费用后可由政府机关提供。
附图描述
图1是使用GE水解的大豆分离蛋白的SDS-PAGE。泳道1是标准大豆分离蛋白SUPRO
500E，泳道2-对照的未水解分离蛋白，泳道3-用来自地衣芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶(也称为谷氨酰基肽链内切酶(GE))水解的分离蛋白(12mg GE/kg分离蛋白)，泳道4-用24mg GE/kg分离蛋白水解的分离蛋白，泳道5-用48mg GE/kg分离蛋白水解的分离蛋白，而泳道6是分子量标准。
图2是商品大豆蛋白粉经过和未经过GE处理的考马斯蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)图像。泳道1包含未经过GE处理的商品大豆蛋白对照物。泳道2包含用2.4mg GE/Kg蛋白处理的商品大豆蛋白。泳道3包含用4.8mg GE/Kg蛋白处理的商品大豆蛋白。β-伴球蛋白的α’和α亚基指示在左边，并且47kDa区域指示在左边。
图3是用GE水解的酸沉淀大豆蛋白凝乳的SDS-PAGE。泳道1示出分子量标准，泳道2是未水解的对照凝乳浆液，泳道3、4、和5包含分别用GE浓度24、48和96mg GE/kg凝乳浆液固体水解30分钟的样品，泳道6、7、和8分别包含用GE浓度24、48和96mg GE/kg凝乳浆液固体水解60分钟的样品，泳道9、10、和11分别包含用GE浓度24、48和96mg GE/kg凝乳浆液固体水解120分钟的样品，泳道12包含标准大豆分离蛋白SUPRO
500E。
图4示出GE处理的大豆分离蛋白水解产物对另一种丝氨酸蛋白酶处理的大豆分离蛋白水解产物的白度指数的比较，所述丝氨酸蛋白酶(SP)来自葱绿拟诺卡氏菌。
图5示出来自NaCl处理的GE水解产物的47kDa多肽的富集程度。I：指示用4.8mg GE/Kg蛋白处理的初始样品；II：描述在2％氯化钠中溶解蛋白并在75℃混合30分钟的过程；III：描述在3,000×G将NaCl处理的样品离心10分钟的过程；IV：指示主要富集11S和7S的β亚基片段组成的上清液片段；V：描述主要由富集47kDa多肽片段组成的沉淀片段；VI：指示完整的大豆蛋白。
图6示出用阴离子交换色谱法从GE处理的大豆蛋白的其他蛋白组分中分离47kDa片段，以及用SDS-PAGE分析从色谱法分离物中收集的每个片段(1-10)。Gel A来自对照蛋白，Gel B来自用4.8mg GE/Kg蛋白水解的样品。片段1示出色谱法中未结合片段中的蛋白。Gel B的片段1中的主要蛋白质谱带是47kDa的多肽。
图7示出对照物、2.4mg GE/Kg蛋白、和4.8mg GE/Kg蛋白(即本发明的样品1-3)的热水合比率(THR)值。
图8示出GE处理的大豆蛋白的快速粘度分析仪(RVA)测试结果。
图9示出β-伴球蛋白的α亚基的潜在GE切割位点(有下划线的残基)，47kDa部分用粗体显示。
图10是GE处理的来自大规模制备水解产物的SDS-PAGE。泳道1包含标准大豆分离蛋白SUPRC
500E。泳道2是无酶的对照分离蛋白，泳道3是用基于干物质的6mg GE/kg样品蛋白水解的样品，泳道4是用6mg GE/kg蛋白水解样品并离心得到的沉淀，泳道5是用6mg GE/kg蛋白水解样品并离心得到的上清液。泳道6是用基于干物质的12mg GE/kg样品蛋白水解的样品，泳道7是用12mg GE/kg蛋白水解样品并离心得到的沉淀，泳道8是用12mg GE/kg蛋白水解样品并离心得到的上清液。泳道9是分子量标准。
图11是由6和12mg GE/kg蛋白酶剂量处理的大豆蛋白水解产物制成凝胶的彩色照片。凝胶由水解产物和水解产物UF制成，其中水解产物在pH4.5经过沉淀以除去较短的片段。
图12示出GE处理过的样品与对照物的SQS感官数据比较。
图13示出GE处理过的酸性凝乳与SP处理过的酸性凝乳的白度指数比较。
发明详述
本发明提供蛋白质水解产物组合物、用于生产蛋白质水解产物组合物的方法、以及包括蛋白质水解产物组合物的食品。已经发现用肽链内切酶消化大豆蛋白产生包含约47kDa的多肽片段的组合物，所述肽链内切酶特异性地切割谷氨酸或天冬氨酸的羧基末端(C末端)一侧上的大豆蛋白材料。所述47kDa蛋白级份包括β-伴球蛋白的疏水性β-伴球蛋白核心区域。β-伴球蛋白的疏水性β-伴球蛋白核心区域包括通常为47kDa的α和α’亚基。β-伴球蛋白的β亚基为约47-50kDa。本发明的组合物包括约10％至约66％47kDa片段。这些蛋白质水解产物组合物与大豆蛋白材料相比具有改善的白度指数和独特的粘弹特性，使得它们理想地用于酸奶、干酪、布丁、和搅打食品。
丝氨酸蛋白酶也称为谷氨酰基肽链内切酶(称为“GE”)，它来自地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenformis)(UNIPROT：P80057，其公开并表征于美国专利4,266,031、5,874,278、和5,459,064以及国际专利申请WO 01/16285、WO 92/13964、WO 91/13553、和WO 91/13554，所述文献均全文以引用方式并入本文)，该酶在谷氨酸和天冬氨酸残基的C末端上切割蛋白。通过改变底物，在相同酶和底物浓度下酶反应取得不同的水解结果。当喷雾干燥的大豆分离蛋白进行GE反应时，所述反应较为随机，生成不同分子量的肽片段，这一点从SDS-PAGE(图1)上能明显地看出来，然而当由大豆薄片制成的蛋白混悬液通过等电点沉淀所述蛋白进行反应时，所述蛋白为较天然的形式并且所述水解模式差别很大。水解导致较有选择性的切割以及47kDa蛋白级份的积聚，根据SDS-PAGE的数据(图2和3)，看起来GE水解也似乎对切割β-伴球蛋白非常具有特异性，并且属于大豆球蛋白的条带似乎未发生改变。这项技术允许大规模生成具有富集β-伴球蛋白核心区域片段的材料。
I.制备蛋白质水解产物组合物的方法
本发明的一个方面提供制备包含富集47kDa片段的多肽的混合物的蛋白质水解产物组合物的方法。该方法包括使蛋白材料与肽链内切酶接触，所述肽链内切酶特异性地切割谷氨酸或天冬氨酸的羧基末端一侧上的蛋白材料，从而生成富集47kDa片段的多肽的混合物。
a.水解切割
所述方法包括将所述蛋白材料切割成较小多肽的混合物。一般来讲，使蛋白材料与肽链内切酶接触以形成水解产物。所述水解产物可进一步使用外肽酶进行切割。
i.蛋白材料
合适蛋白材料的非限制性实例包括大豆、苋属植物、竹芋、荞麦、卡诺拉、木薯、桃豆(鹰嘴豆)、玉米、豆类、兵豆、羽扇豆、小米、燕麦、豌豆、裸麦、高粱、向日葵、木薯粉、黑小麦、乳品、以及它们的组合。在一个实施方案中，所述蛋白质材料可为大豆蛋白材料。可在本发明方法中使用多种大豆蛋白以生成大豆蛋白水解产物。一般来讲，大豆蛋白材料可根据本领域已知的方法源自于全大豆。全大豆可为商品大豆(即，非转基因大豆)、转基因大豆、以及它们的组合。转基因大豆包括具有经修饰的蛋白、油、或碳水化合物组合物的大豆，如高β-伴球蛋白大豆和高油酸大豆。大豆蛋白材料的合适的实例包括大豆提取物、豆腐、大豆粉、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、豆浆、豆浆粉、以及它们的混合物。
在一个实施方案中，该方法中使用的大豆蛋白材料可以是大豆分离蛋白(也称为分离大豆蛋白或ISP)。一般来讲，大豆分离蛋白具有按无水基计至少约90％大豆蛋白的蛋白质含量。大豆分离蛋白可包括完整的大豆蛋白或部分水解的大豆蛋白。大豆分离蛋白可具有高含量的贮藏蛋白亚基如7S、11S、2S、和15S的亚基。可用于本发明的大豆分离蛋白的非限制性实例可商购获得，例如购自Solae，LLC(St.Louis，MO)，并且包括SUPRO
500E、SUPRO620、SUPRO710、和SUPROEX 33大豆分离蛋白。
在另一个实施方案中，大豆蛋白材料可为大豆浓缩蛋白(SPC)，其具有按无水基计约65％至小于约90％的蛋白质含量。用于本发明中的合适的大豆浓缩蛋白的实例包括ALPHA
DSP-C、ProconTM、ALPHA
12和ALPHA5800，它们可从Solae，LLC(St.Louis，MO)商购获得。作为另外一种选择，大豆浓缩蛋白可与大豆分离蛋白共混，以取代部分大豆分离蛋白，作为大豆蛋白材料的来源。
在另一个实施方案中，所述大豆蛋白质材料可以是大豆粉，其具有按无水基计约49％至约65％的蛋白质含量。大豆粉可为脱脂大豆粉、部分脱脂大豆粉、或全脂大豆粉。作为另外一种选择，大豆粉可与大豆分离蛋白或大豆浓缩蛋白共混。大豆粉、大豆分离蛋白、或大豆浓缩蛋白的任何组合将是有效的。本领域的技术人员能够根据终端使用产品的期望属性组合这些成分。
当使用大豆粉时，原料通常为脱脂大豆粉或大豆片。全脂大豆包含按重量计约40％的蛋白质和按重量计约20％的油。当脱脂大豆粉或大豆片构成起始蛋白质材料时，所有这些全脂大豆可经由常规方法脱脂。例如，可将大豆弄干净、脱壳、破碎、通过一系列压片辊，然后使用己烷或其他适宜溶剂使其经受溶剂萃取，以提取油并且制得脱脂薄片。所述脱脂薄片可被碾磨以制得大豆粉。虽然所述方法目前还没有用于全脂大豆粉，但是据信全脂大豆粉也可用作蛋白质源。然而，在处理全脂大豆粉时，很可能需要采用分离步骤，诸如三级离心以移除油。
在另一个实施方案中，大豆蛋白材料可为豆浆。作为另外一种选择，豆浆可与大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、或大豆粉共混。大豆粉、大豆分离蛋白、或大豆浓缩蛋白的任何组合将是有效的。本领域的技术人员能够根据终端使用产品的期望属性组合这些成分。
在另一个实施方案中，大豆蛋白材料可为豆浆粉。作为另外一种选择，豆浆粉可与大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、或大豆粉共混。大豆粉、大豆分离蛋白、或大豆浓缩蛋白的任何组合将是有效的。本领域的技术人员能够根据终端使用产品的期望属性组合这些成分。
在另一个实施方案中，大豆蛋白材料可以是基于离心机中的沉淀已被分成四种主要贮藏蛋白级份或亚基(7S、11S、2S和15S)的材料。一般来讲，11S片段高度富集了大豆球蛋白，而7S片段高度富集了β-大豆伴球蛋白。
一般来讲，大豆蛋白材料通常包含具有一定范围大小的蛋白的混合物。在一个实施方案中，大豆材料中的蛋白可在约1000道尔顿至约500,000道尔顿的范围内。在另一个实施方案中，大豆材料中的蛋白可在约3000道尔顿至约100,000道尔顿的范围内。
在另一个实施方案中，蛋白材料可来自非大豆的植物。作为非限制性实例，合适的植物包括苋属植物、竹芋、大麦、荞麦、卡诺拉、木薯、桃豆(鹰嘴豆)、豆类、兵豆、羽扇豆、玉米、小米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、裸麦、高粱、向日葵、木薯粉、黑小麦、小麦、以及它们的混合物。尤其优选植物蛋白包括大麦、卡诺拉、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、以及它们的组合。在一个实施方案中，植物蛋白材料可以是卡诺拉粗粉、卡诺拉分离蛋白、卡诺拉浓缩蛋白、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可以是玉米或谷物蛋白粉、玉米或谷物浓缩蛋白、玉米或谷物分离蛋白、玉米或谷物胚芽、玉米或谷物谷蛋白、玉米或谷物谷蛋白粗粉、玉米或谷物面粉、玉米蛋白、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可以是大麦粉、大麦浓缩蛋白、大麦分离蛋白、大麦粗粉、大麦面粉、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可以是羽扇豆粉、羽扇豆分离蛋白、羽扇豆浓缩蛋白、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可为燕麦片、燕麦粉、燕麦蛋白粉、燕麦分离蛋白、燕麦浓缩蛋白、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可以是豌豆粉、豌豆分离蛋白、豌豆浓缩蛋白、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可以是马铃薯蛋白粉、马铃薯分离蛋白、马铃薯浓缩蛋白、马铃薯粉、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可为米粉、大米粗粉、大米蛋白粉、大米分离蛋白、大米浓缩蛋白、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可以是小麦蛋白粉、小麦谷朊粉、麦芽精、面粉、小麦分离蛋白、小麦浓缩蛋白、可溶性小麦蛋白、以及它们的组合。
在另一个实施方案中，蛋白材料可来自乳品。合适的乳品蛋白的非限制性实例包括脱脂奶粉、分离乳蛋白、浓缩乳蛋白、酸酪蛋白、酪蛋白酸盐(例如酪蛋白酸钠和酪蛋白酸钙)、酪蛋白分离蛋白、酪蛋白浓缩蛋白、乳清浓缩蛋白、乳清分离蛋白、以及它们的组合。乳蛋白材料可以来源于牛、山羊、绵羊、驴、骆驼、羊驼、牦牛、和水牛。
在本发明的方法中设想使用大豆蛋白材料和至少一种其他蛋白材料的组合。即，可由大豆蛋白材料和至少一种其他蛋白材料的组合来制备蛋白质水解产物组合物。在一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可以由大豆蛋白材料和一种其他蛋白材料的组合制备，其他蛋白材料选自大麦、卡诺拉、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、和乳品。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可以由大豆蛋白材料和两种其他蛋白材料的组合制备，其他蛋白材料选自大麦、卡诺拉、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、和乳品。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可以由大豆蛋白材料和三种或更多种其他蛋白材料的组合制备，其他蛋白材料选自大麦、卡诺拉、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、和乳品。非限制性组合包括大豆蛋白和乳品蛋白、大豆蛋白和卡诺拉蛋白、大豆蛋白和小麦蛋白、大豆蛋白和玉米蛋白、大豆蛋白和大米蛋白、大豆蛋白和豌豆蛋白、大豆蛋白和羽扇豆蛋白。
此外，除大豆蛋白之外的多种蛋白材料的组合和包括大豆蛋白在内的多种蛋白材料的组合是可能的。
b.蛋白浆液
所用的大豆蛋白材料和其他蛋白材料的浓度可能并且将会不同。组合中使用的大豆蛋白材料的量可在约1％至约99％总蛋白的范围内。在一个实施方案中，组合中使用的大豆蛋白材料的量可在约1％至约20％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使用的大豆蛋白材料的量可在约20％至约40％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使用的大豆蛋白材料的量可在约40％至约80％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使用的大豆蛋白材料的量可在约80％至约99％总蛋白的范围内。同样的，组合中使用的其他蛋白材料(至少一种)的量可在约1％至约99％总蛋白的范围内。在一个实施方案中，组合中使用的其他蛋白材料的量可在约1％至约20％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使用的其他蛋白材料的量可在约20％至约40％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使用的其他蛋白材料的量可在约40％至约80％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使用的其他蛋白材料的量可在约80％至约99％总蛋白的范围内。
在本发明的方法中，通常将蛋白材料混合或分散在水中以形成按重量计包括约1％至约25％蛋白(按原样)的浆液。在一个实施方案中，所述浆液可包括按重量计约1％至约5％的蛋白(按原样)。在另一个实施方案中，所述浆液可包括按重量计约6％至约10％的蛋白(按原样)。在另一个实施方案中，所述浆液可包括按重量计约11％至约15％的蛋白(按原样)。在另一个实施方案中，所述浆液可包括按重量计约16％至约25％的蛋白(按原样)。
在将蛋白材料分散到水中后，可将蛋白材料的浆液加热至约70℃至约90℃约2分钟至约20分钟以失活推定的内源蛋白酶抑制剂。对蛋白浆液的pH和温度可进行调节以优化水解反应，确保水解反应中使用的肽链内切酶的功能接近其最佳活性水平。蛋白浆液的pH可根据本领域一般已知的方法进行调节及监控。可将蛋白浆液的pH调节至并保持在约5.0至约11.0。然而在一个实施方案中，不调节蛋白浆液的pH。将pH保持在约6.3至约6.8。然后将酶处理的蛋白浆液在约6.3至约6.8的pH下孵育30分钟，随后将pH调节至7.0。在一个实施方案中，可将蛋白浆液的pH调节至并保持在约7.0至约8.0。在另一个实施方案中，可将蛋白浆液的pH调节至并保持在约8.0至约9.0。在另一个实施方案中，可将蛋白浆液的pH调节至并保持在约9.0至约10.0。在一个优选的实施方案中，可将蛋白浆液的pH调节至并保持在8.0。在水解反应期间，根据本领域已知的方法将蛋白浆液的温度优选地调节至并保持在约30℃至约70℃。一般来讲，高于或低于该范围的温度可灭活肽链内切酶。在一个实施方案中，根据本领域已知的方法，在水解反应期间可将蛋白浆液的温度调节至并保持在约40℃至约60℃。
i.肽链内切酶
水解反应一般由将肽链内切酶加入到蛋白材料浆液中以形成反应混合物而引发。肽链内切酶与蛋白材料的反应导致蛋白材料水解成较小的多肽。这种肽链内切酶将选择性地切割谷氨酸或天冬氨酸的羧基末端一侧上的蛋白。肽链内切酶是丝氨酸蛋白酶，具体地讲是GE。GE在约6.0至约11.0的pH和约30℃至约70℃的温度下具有最佳活性，在pH 9.0时的最佳温度为约50℃。
肽链内切酶可为微生物来源的酶。使用微生物酶而不是动物或植物酶是有利的，因为微生物酶表现出广谱特征(最适pH、温度等)并且可以相对大的数量持续获取。合适的肽链内切酶的非限制性实例包括GE，一种如前文所述来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(UNIPROT：P80057)的丝氨酸蛋白酶。GE切割谷氨酸或天冬氨酸的羧基末端一侧上的肽键。
在一个实施方案中，肽链内切酶可为丝氨酸蛋白酶，该酶的氨基酸序列具有与表1中所示的SEQ ID NO：1至少80％的同一性并具有蛋白酶活性。在另一个实施方案中，肽链内切酶可为丝氨酸蛋白酶，该酶的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：1至少85％的同一性并具有蛋白酶活性。在另一个实施方案中，肽链内切酶可为丝氨酸蛋白酶，该酶的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：1至少90％的同一性并具有蛋白酶活性。在另一个实施方案中，肽链内切酶可为丝氨酸蛋白酶，该酶的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：1至少95％的同一性并具有蛋白酶活性。在另一个实施方案中，肽链内切酶可为丝氨酸蛋白酶，该酶的氨基酸序列具有与SEQ IDNO：1至少97％的同一性并具有蛋白酶活性。在另一个实施方案中，肽链内切酶可为丝氨酸蛋白酶，该酶的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：1至少99％的同一性并具有蛋白酶活性。
表1
两个氨基酸序列间的序列同一性程度可使用Karlin和Altschul的BLASTp算法进行测定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990)。通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列来测定序列同一性百分比，其中比较窗口中的氨基酸序列部分与参比序列(不包括添加或删除)相比可包括添加或删除(例如间隙)以达到最佳的两序列比对效果。百分比通过以下方法进行计算：确定两序列中具有相同氨基酸的位置的数目以得到匹配位置的数目，将该匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数，并且所得结果乘以100来获得序列同一性的百分比。
技术人员将理解一个氨基酸残基可被另一个具有相似侧链、不影响多肽功能的氨基酸残基取代。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有包含酰胺的侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸、和组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的几组保守氨基酸取代包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。因此肽链内切酶可具有至少一个针对SEQ ID NO：1的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，肽链内切酶可具有约35个针对SEQ ID NO：1的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约25个针对SEQ ID NO：1的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约15个针对SEQID NO：1的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约10个针对SEQ ID NO：1的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约5个针对SEQ ID NO：1的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约一个针对SEQ ID NO：1的保守氨基酸取代。
这些具有蛋白酶活性的序列中的任何一个序列的片段可以是活性酶的氨基酸序列，例如在加工后，例如在任何信号肽和/或肽原已经被切割后。
肽链内切酶也可为源于哺乳动物的酶，例如源于牛或猪的酶。
表2中给出了蛋白材料和肽链内切酶的多种组合。
表2
| 蛋白材料 | 肽链内切酶 |
| 大豆 | GE |
| 卡诺拉 | GE |
| 鹰嘴豆 | GE |
| 玉米(Maize) | GE |
| 蚕豆 | GE |
| 豆类 | GE |
| 小麦 | GE |
表2
| 大米 | GE |
| 豌豆 | GE |
| 羽扇豆 | GE |
| 乳品 | GE |
取决于蛋白材料的来源、所需的水解度和水解反应的持续时间，加入到蛋白浆液中的肽链内切酶的量可以并且将会不同。酶量可以在每千克蛋白材料约1mg至约5000mg肽链内切酶的范围内。在一个实施方案中，它的量可以在每千克蛋白材料1mg至约20mg肽链内切酶的范围内。在另一个实施方案中，它的量可以在每千克蛋白材料20mg至约1000mg肽链内切酶的范围内。在另一个实施方案中，它的量可以在每千克蛋白材料约1000mg至约5000mg肽链内切酶的范围内。
技术人员将会认识到，取决于例如肽链内切酶的浓度和期望的水解度，水解反应的持续时间可以并且将会不同。一般来讲，水解反应的持续时间可以在几分钟至多个小时的范围内，例如约5分钟至约5小时。在一个优选的实施方案中，反应的持续时间可为约30分钟。
为了终止水解反应，可将反应混合物加热至足以灭活肽链内切酶的温度。例如把反应混合物加热至大约90℃将基本上热灭活大多数蛋白酶。
ii.任选的外肽酶
所述方法可进一步包括使蛋白质水解产物接触外肽酶。一般来讲，外肽酶仅仅作用于接近多肽链末端的部位。在游离氨基末端的这些作用释放单氨基酸残基(即氨基肽酶；AP)、二肽(即二肽肽酶)或三肽(即三肽肽酶)。外肽酶作用于游离羧基末端，释放单氨基酸(即羧肽酶；CP)或二肽(即肽基二肽酶)。一些外肽酶是二肽特异性的(即二肽酶)或除去异肽键取代的、环化的或连接的末端残基。异肽键为除去羧基基团与α-氨基那些连接的肽键，并且酶的这种基团特征在于Ω肽酶。
外肽酶通常将为食品级酶，在约6.0至约8.0的pH和约50℃至约60℃下具有最佳活性。外肽酶可为微生物起源的酶。适用于本发明方法的外肽酶的实例包括来自米曲霉(Aspergillus oryzae)(国际专利申请WO 96/28542中的SEQ ID NO：2，全文以引用方式并入本文的氨基肽酶、来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(UNIPROTE：Q65DH7)的氨基肽酶、来自米曲霉(Aspergillus oryzae)(UNIPROT：Q2TZ11)的羧肽酶D、来自米曲霉(Aspergillus oryzae)(UNIPROT：Q2TYA1)的羧肽酶Y、它们的组合。
取决于多种因素，加入到蛋白质水解产物中的外肽酶的量可以并且将会不同。外肽酶的量可在每千克蛋白材料约1mg至约5,000mg外肽酶的范围内。在一个实施方案中，酶量可在每千克蛋白材料1mg至约20mg外肽酶的范围内。在另一个实施方案中，酶量可在每千克蛋白材料20mg至约1,000mg外肽酶的范围内。在另一个实施方案中，酶量可在每千克蛋白材料约1,000mg至约5,000mg外肽酶的范围内。
可调节蛋白质水解产物的pH以使溶液pH达到最适于外肽酶的水平。可通过加入酸溶液或碱溶液调节水解产物的pH。外肽酶反应的持续时间可以并且将会不同。一般来讲，水解反应的持续时间可以在几分钟至多个小时的范围内，例如约5分钟至约5小时。在一个优选的实施方案中，反应的持续时间可为约30至约60分钟。可通过类似于上文讨论的用于肽链内切酶反应的那些方式终止反应。
c.实施方案
在一个示例性实施方案中，蛋白材料可来源于大豆，并且大豆材料可为大豆分离蛋白。肽链内切酶是GE并且反应可在约40℃至约70℃以及约6.0至约8.5的pH下进行。
在另一个示例性实施方案中，蛋白材料可来源于大豆，并且大豆材料可为大豆浓缩蛋白。肽链内切酶是GE并且反应可在约40℃至约70℃以及约6.0至约8.5的pH下进行。大豆浓缩蛋白可以与大豆分离蛋白联合使用。
在另一个示例性实施方案中，蛋白材料可来源于大豆，并且大豆材料可为大豆粉。肽链内切酶是GE并且反应可在约40℃至约70℃以及约6.0至约8.5的pH下进行。大豆粉可以与大豆浓缩蛋白和/或大豆分离蛋白联合使用。
在一个示例性实施方案中，蛋白材料可来源于大豆，并且大豆材料可为豆浆。肽链内切酶是GE并且反应可在约40℃至约70℃以及约6.0至约8.5的pH下进行。豆浆可以与大豆粉、大豆浓缩蛋白和/或大豆分离蛋白联合使用。
在另一个示例性实施方案中，蛋白材料可来源于大豆，并且大豆材料可为豆浆粉。肽链内切酶是GE并且反应可在约40℃至约70℃以及约6.0至约8.5的pH下进行。豆浆粉可以与豆浆、大豆粉、大豆浓缩蛋白和/或大豆分离蛋白联合使用。
II.蛋白质水解产物组合物
本发明的另一方面涵盖蛋白质水解产物组合物。蛋白质水解产物组合物包含富集47kDa片段的多肽的混合物。蛋白质水解产物组合物的多肽为介于约10％至约66％的47kDa片段。蛋白质水解产物组合物中的多肽可来源于不同蛋白质来源，包括大豆、苋属植物、竹芋、荞麦、卡诺拉、木薯、桃豆(鹰嘴豆)、玉米、豆类、小扁豆、羽扇豆、小米、燕麦、豌豆、裸麦、高粱、向日葵、木薯粉、黑小麦、乳品、以及它们的组合。在一个实施方案中，所述蛋白质材料可为大豆蛋白材料。可在本发明方法中使用多种大豆蛋白以生成大豆蛋白水解产物。一般来讲，大豆蛋白材料可根据本领域已知的方法源自于全大豆。全大豆可为商品大豆(即，非转基因大豆)、转基因大豆、以及它们的组合。转基因大豆包括具有经修饰的蛋白、油、或碳水化合物组合物的大豆，如高β-伴球蛋白大豆和高油酸大豆。大豆蛋白材料的合适的实例包括大豆提取物、豆腐、大豆粉、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、豆浆、豆浆粉、以及它们的混合物。
一般来讲，蛋白质水解产物组合物与蛋白质原料相比将包含不同长度和分子量的多肽的混合物。在一个示例性实施方案中，多肽的分子大小将富集47kDa片段。
决于蛋白材料的来源和反应完成度，蛋白质水解产物组合物的水解度可以并且将会不同。
蛋白质水解产物组合物具有增强的白度，所述白度使用本文所述的白度指数进行测量(图4)。在0.5％至1％的水解度下，所得产物当制成凝胶或浆液时其白度有明显效应。酶浓度对产物白度指数的效应以剂量依赖型方式增强。期望白度较强的水解产物用于多种食品例如饮料、凝胶和肉类体系。本发明的大豆蛋白水解产物颜色比未水解的大豆蛋白浅得多。所述酶GE在谷氨酸和天冬氨酸残基的C-末端上切割蛋白。使用下文所述的白色指数测量白度。
白度指数
大豆蛋白产物的“白度指数”指包含大豆蛋白的组合物的颜色。许多包含大豆蛋白的组合物将具有不同程度的微黄色或褐色。一般来讲，能够“改善”这些组合物的颜色，即能够通过本发明的方法提高所述产品的“白度指数”。白度指数通常使用色度计进行测定，色度计提供组合物的L、a、和b颜色值，由此可使用白度指数(WI)的标准表达式WI＝L-3b计算白度指数。L组分一般指示样品的白度或“亮度”；L值接近0指示黑色样品，而L值接近100指示白色样品。b值指示样品中存在的黄色和蓝色；正的b值指示黄色的存在，而负的b值指示蓝色的存在。a值可用于其他颜色的测量，它指示红色和绿色；正值指示红色的存在，而负值指示绿色的存在。就b值和a值而言，测量的绝对值随着相应的颜色增加的强度而提高。色度计通常使用与色度计一起提供的白度标准卡进行标准化。然后将样品放入玻璃单元，再将玻璃单元导入色度计。样品单元用不透明盖覆盖以最小化环境光透过样品到达检测器的可能性，并且在样品测量期间一直使用。因为通常测量相同材料的多个样品，在读数后将样品单元倒空并通常再充满，并且材料的白度指数用测量平均值表示。合适的色度计一般包括那些由HunterLab(Reston，VA)制造的色度计，包括例如配有光学传感器D 25的Model#DP-9000。
使用包括光学传感器D-25的HunterLab DP-9000色度计测量处理前和经处理后包含按重量计5％固体的悬浮液样品的白度指数，色度计和光学传感器均由Hunter Associates Laboratory(HunterLab)(Reston，VA)制造。就大规模生产平台中的白度指数测量而言，将蛋白质样品基于5％w/w分散：(5g)加入到去离子水(100mL)中。使用Hunter色度计获得的结果以L、a、和b单位报告。使用下式从L和b标度值中计算白度指数：白度指数＝L-3b。
大豆蛋白水解产物
在其中蛋白材料是大豆的实施方案中，蛋白质水解产物组合物可包含选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQID NO：26以及它们的组合的至少一种多肽(参见表6)。本发明也包括可从本发明的大豆蛋白水解产物组合物中纯化得到的任何多肽。寡肽可通过色谱方法进行纯化，例如尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、快速蛋白质液相色谱法(FPLC)、高效液相色谱法(HPLC)等等。例如多肽片段可选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、或SEQ ID NO：26。此外本发明还包括序列基本上类似于SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、或SEQ IDNO：26的多肽。寡肽通常与具有SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、或SEQ ID NO：26的寡肽有至少70、75、80、85、90、95、或99％的序列同一性。
食品
本发明的另一方面是提供包含本文所述的任何蛋白质水解产物组合物的食品。作为另外一种选择，食品可包括任何本文所述的分离的多肽片段。
选择特定蛋白质水解产物组合物或分离的多肽片段可以并且将会取决于形成的食品。本发明的食品可包括饮料、酸奶、块状蛋白质产品、搅打食品、干酪、和其他乳品制品、以及挤出食品。它也可用于肉制凝胶和全肉制品。食品希望最小化苦味或涩味感官特性，通常选择水解度更接近1％而不是6％的大豆蛋白水解产物组合物。此外，在期望最小化其谷物和大豆/豆类感官特性的食品中，通常选择具有更接近6％而不是1％水解度的大豆蛋白质水解产物组合物。
如上所述，蛋白质水解产物组合物可用于多种食物和/或饮料产品。饮料的非限制性实例包括冰沙、营养饮料、能量饮料、运动饮料、豆浆饮料、风味大豆饮料、米乳饮料、婴儿代乳品、茶饮料、咖啡饮料、或它们的组合。
在另一个实施方案中，蛋白质水解产物可用于乳产品。乳产品包括但不限于干酪、冰淇淋、冰淇淋产品、奶昔、酸奶、搅打奶油、酸奶油、松软干酪、或乳品饮料。乳品饮料包括牛奶、风味乳饮料、羊奶、液体酸奶、冰沙、或酪乳。
在另一个实施方案中，蛋白质水解产物可用于营养补充剂。营养补充剂可以是液体或固体。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物可用于块状蛋白质产品，例如格兰诺拉棒、谷类食物棒、营养棒、或能量棒。
在另一个实施方案中，蛋白质水解产物可用于挤出食品。挤出食品包括但不限于谷类食物来源的产品如早餐谷类食物、意大利面食、面包、焙烤产品(即，粉饼、馅饼、卷状食品、饼干、薄脆饼干)、膨化小吃品、营养棒(nugget)、或墨西哥面饼。
在另一个实施方案中，蛋白质水解产物可用于肉类产品或仿肉产品。肉类产品的实例包括但不限于加工肉制品、碎肉制品、全肉制品、和鱼肉酱产品。肉类可以是动物肉或海产品肉。肉类类似物可以是组织化植物蛋白或组织化乳品蛋白，它们的质地模仿动物或海产品的肉。在食品中肉类类似物可以是部分或全部肉类。
可使用这些蛋白水解产物制成的搅打食品包括蛋糕和玉黍蜀饼的糖粉和浇头、酥点的填料、馅饼、和炸面圈、冷甜点和奶油甜点、以及调合蛋白。
定义
为了更好地理解本发明，下文定义了几个术语。
表3.SQS专门词汇
术语“水解度”(DH)是指被水解的特定肽键的百分比(即，切割肽键的数目占完整蛋白中存在的总肽键数目的百分比)。％DH使用简化三硝基苯磺酸(S-TNBS)方法进行评估。该方法是一种用于测定食物蛋白质水解产物水解度的精确的、可重复的和一般适用的方法。
术语“肽链内切酶”是指水解在寡肽或多肽链中的内部肽键的酶。肽链内切酶类包括酶亚类EC 3.4.21至25(国际生物化学与分子生物学联盟酶分类体系)。
术语“外肽酶”指水解氨基-或羧基末端或者靠近氨基-或羧基的部位处的蛋白质和/或肽的酶。外肽酶类包括酶亚类EC 3.4.11-18(国际生物化学与分子生物学联盟酶分类体系)。
“食品级酶”是公认安全(GRAS)认可的并且当被生物体如人消耗时是安全的酶。通常，酶和可从其中得到酶的产品可根据适用的法律法规进行制备。
“水解产物”是当化合物通过水的效应切割时获得的反应产物。在热降解、化学降解或酶降解后产生蛋白质水解产物。在反应期间，将蛋白质分解成多肽和游离的氨基酸。这些产物可为可溶解的或不溶于水的或水基缓冲液。
“肽”是氨基酸的短聚合物，一般为20个或更少的氨基酸。“多肽”是大于20个氨基酸的聚合物。这两种聚合物都仅仅包含初级结构。多肽最初在蛋白质合成期间形成，并且在“折叠”时形成它们的天然状态(即形成二级、三级、和四级结构)，变成蛋白质。在该专利申请中，所述多肽是指蛋白的水解生成长链聚合物。
“蛋白质”是氨基酸的聚合物，所述氨基酸形成天然(即未变性的)状态的活性分子。蛋白质的天然状态可具有初级、二级、三级、和或四级结构蛋白质的初级结构是它的氨基酸序列。蛋白质通常具有二级结构，它由链内氨基酸的相互作用形成。这些结构经由氢键形成，并且是α螺旋或相互作用的氨基酸“片层”，已知是β片层。蛋白质通常也具有三级结构。三级结构通过氨基酸残基的链内相互作用形成，并且通过离子相互作用、疏水性作用、或其他化学相互作用形成。一些蛋白质包含一个或多个“亚基”，其分子相互作用以形成四级结构。蛋白质亚基由单个多肽链组成并包含二级和(通常)三级结构。
如那些用于描述术语如“谷物”、“大豆/豆类”、或“苦味”的术语“感官特性”，根据如实施例11中详述的SQS评分体系进行测定。
如本文所用，术语“分离的大豆蛋白”或“大豆分离蛋白”是指具有基于不含水分至少约90％的大豆蛋白的蛋白含量的大豆材料。大豆分离蛋白如下形成于大豆：将大豆的皮和胚芽从子叶上去除，将子叶压成片或碾碎并将片状或碾碎的子叶去油，将子叶的大豆蛋白和碳水化合物与子叶纤维分离，并随后将大豆蛋白与碳水化合物分离。
如本文所用，术语“大豆浓缩蛋白”是指具有基于不含水分约65％至小于约90％的大豆蛋白的蛋白含量的大豆材料。大豆浓缩蛋白也可包含大豆子叶纤维，通常基于不含水分按重量计约3.5％至最多约20％的大豆子叶纤维。大豆浓缩蛋白由大豆形成，其形成方式为：去除大豆的皮和胚芽，将子叶压成片或碾碎并将片状或碾碎的子叶去油，然后将大豆蛋白和大豆子叶纤维与子叶的可溶碳水化合物分离。
如本文所用，术语“大豆粉”是指全脂大豆粉、酶活性大豆粉、脱脂大豆粉、部分脱脂大豆粉、以及它们的混合物。脱脂大豆粉是指脱脂大豆材料的粉碎形式，优选包含小于约1％的油，由尺寸使得颗粒可通过100目(美国标准)筛网的颗粒形成。利用常规的大豆研磨方法将大豆饼、碎片、薄片、粗粉、或这些材料的混合物粉碎成大豆粉。大豆粉具有按无水计约49％至约65％的大豆蛋白含量。优选将所述大豆粉研磨地非常细，最优选使得有小于约1％的大豆粉保留在300目(美国标准)筛网上。全脂大豆粉是指被磨碎的包含所有原油(通常为18％至20％)的全大豆。所述粉末可以是酶活性的，或者它可被热处理或被烘烤以使酶活性最小化。酶活性大豆粉是指被最小程度热处理以不会使其天然酶无效的全脂大豆粉。
如本文所用，术语“豆浆”指下列的任意一种或多种含水混合物：细磨大豆、大豆粉、大豆薄片、大豆浓缩物、大豆分离蛋白、大豆乳清蛋白、以及下列的任意一种或多种含水提取物：大豆、大豆薄片和大豆粉，其中已经除去了不溶解材料。豆浆可包含附加组分，包括但不限于脂肪、碳水化合物、甜味剂、着色剂、稳定剂、增稠剂、调味剂、酸、和碱。
如本文所用，术语“豆浆粉”指脱水的豆浆。豆浆可通过多种方法脱水，包括但不限于喷雾干燥、盘式干燥、洞道式干燥、和冷冻干燥。
如本文所用，术语“简化三硝基苯磺酸(S-TNBS)方法”指一种精确的、可再现的以及一般可实施的方法，用于测定食物蛋白质水解产物的水解度。就该方法而言，将0.1g大豆蛋白质水解产物溶解在100mL的0.025N NaOH中。将水解产物溶液的等分试样(2.0mL)与8mL的0.05M硼酸钠缓冲液(pH 9.5)混合。用0.20mL 10％三硝基苯磺酸处理两mL经缓冲的水解产物溶液，然后室温暗处培养15分钟。加入4mL0.1M亚硫酸钠-0.1M磷酸钠溶液(1∶99比率)终止反应，在420nm处读取吸光度。使用0.1mM的甘氨酸溶液作为标准品。使用以下计算方法测定甘氨酸标准品溶液的回收率百分比：[(甘氨酸在420nM的吸光度-空白对照在420nM的吸光度)×(100/0.710)]。认为94％或更高的值是可接受的。(Jens Adler-Nissen(1979)“Determination of the Degree ofHydrolysis of Food Protein Hydrolysates by Trinitrobenzenesulfonic Acid，”J.Agric Food Chem.1 27(6)：1256-1262。
当介绍本发明或其优选实施方案的要素时，冠词“一个”和“所述”旨在表示一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在表示包容性并且表示除列出要素外还可以有其他要素。
在不脱离本发明范围的条件下，可对以上化合物、产品和方法进行各种更改，这意味着可将上文描述和下文实施例中包含的所有内容理解为例证性的而非限定性的。
实施例
下列实施例示出了本发明的多种实施方案。
实施例1：从脱脂大豆粉中制备大豆蛋白产物
将约30磅的脱脂大豆粉加入到250磅水中，制备pH6.5、10％固体含量的浆液。将所述浆液加热至54℃(130℉)并搅拌30分钟，不进行pH调节。然后用80ml NaOH(基于固体0.6％)将浆液pH调节至pH 7.0，形成中性浆液。将中性浆液加热至160.5℃(321℉)并保持27秒。将热中性浆液冷却至53℃(128℉)，然后在喷雾烘干机中干燥以形成大豆蛋白产物。烘干机固体为9.9％，pH6.84。
实施例2：从用2.4mg GE处理过的脱脂大豆粉中制备大豆蛋白产物
将约30磅脱脂大豆粉加入到250磅中以制备pH 6.5、10％固体含量的浆液。将所述浆液加热至54℃(130℉)并加入2.4mg GE酶蛋白/kg蛋白固体，搅拌30分钟。在30分钟后，用70ml NaOH(基于固体0.6％)将pH调节至7.0以形成酶处理的中性浆液。在酶处理期间pH下降至6.23。将酶处理的中性浆液加热至160.5℃(321℉)并保持27秒。将热中性酶处理的浆液冷却至53℃(128℉)，然后在喷雾烘干机中干燥。烘干机固体为9.6％，pH 6.82。
实施例3：从用4.8mg GE处理过的脱脂大豆粉中制备大豆蛋白产物
将30磅脱脂大豆粉加入到250磅水中以制备pH 6.5、10％固体含量的浆液。将所述浆液加热至54℃(130℉)并加入4.8mg GE酶蛋白/kg蛋白固体，搅拌30分钟。在30分钟后，用100ml NaOH(基于固体0.8％)将pH调节至7.0以形成酶处理的中性浆液。在酶处理期间pH下降至6.32。将酶处理的中性浆液加热至160.5℃(321℉)并保持27秒。将热中性酶处理的浆液冷却至53℃(128℉)，然后在喷雾烘干机中干燥。烘干机固体为9.6％，pH 6.84。
通过SDS-PAGE使用标准方法分析实施例1至3的蛋白组合物，图2提供了凝胶图像。该分析揭示GE选择性地切割β-伴球蛋白的α和α’亚基的延伸区域，从而将它(47kDa片段)从疏水性核心区域中释放出来。
实施例4：通过盐处理富集47kDa多肽
来自实施例2的大豆蛋白产物进一步用2％的盐(NaCl)处理。程序如下：2％的盐溶液通过将2g氯化钠溶解在100ml水中进行制备。实施例2中制备的2g各种大豆蛋白产物与50g盐溶液组合并在75℃混合30分钟以获得分散体。分散体在3000×G离心10分钟以从上清液中分离沉淀。上清液经鉴定包含大豆球蛋白(11S)和β-伴球蛋白的β亚基(7S)，并且沉淀经鉴定包含47kDa的多肽，如图5所示。
实施例5：通过阴离子色谱法富集47kDa的多肽
使用阴离子交换柱Q Sepharose XL(GE Healthcare)从GE处理的蛋白的其他蛋白组分中分离47kDa的多肽。一毫升1％的蛋白溶液以1ml/min流量的通过1-ml柱，然后用另1ml去离子水洗脱所述柱。水洗脱的样品经鉴定主要是47kDa的多肽，如图6所示，是GE水解产物色谱柱的片段1和SDS-PAGE凝胶B中的样品1。结果指示47kDa的多肽或者是非常疏水的或者是阳离子的。
实施例6：通过热水合比率测量水结合能力
热水合比率(THR)测试是一种用于测定大豆蛋白在2％盐溶液中加热发生的水合比率的测试方法。THR值指示不同产品中的大豆蛋白的水结合能力，例如肉类、酸奶、布丁。在THR测试方法中，制备2％的盐溶液，并且50克该溶液与按无水计2克大豆蛋白产物组合并混合以获得分散体。分散体离心以从上清液中分离固体。通过325目的不锈钢织物过滤上清液以获得滤液。然后给滤液称重。通过下式测定THR：
A是盐溶液重量。B是大豆蛋白产物的样品重量，经调整以包括水分。如果大豆蛋白产物的含水量是4.22％，无水含量是95.78％。然后当包括水分时，2克大豆蛋白产物按无水计重2.09克(2/0.9578＝2.09)。
C是滤液重量。
D是按无水计2克重量的大豆蛋白产物。
GE改性蛋白和对照物的THR测试结果如图7所示。GE水解的蛋白具有比对照物显著更大的THR。这指示GE改性蛋白在存在盐的情况下能保持更多的水。这个结果表明GE改性蛋白可具有应用于肉类、酸奶和布丁的潜力。
实施例7：快速粘度分析仪(RVA)分析
快速粘度分析仪(RVA)是一种加热和冷却粘度计，它能够提供随控制时间精确控制温度和剪切力的粘度方法。
大豆浓缩蛋白和蛋白粉主要包含对热处理敏感的蛋白质和纤维。对应于加热过程的RVA粘度特征可反映大豆蛋白产物的热敏感度。因此比较样品间的RVA加热特征能够成为预测它们对在一些食品中的大豆蛋白产物加热响应的有用工具。
涉及该程序以记录在加热期间10％蛋白浆液的粘度，所述加热期间为从25℃加热至75℃(保持5分钟)，然后冷却至25℃。
如图8所示，GE水解改变大豆蛋白的热敏感度，GE处理剂剂量越高，粘度变化越显著。结果指示GE改性的大豆蛋白可在低温下增稠或凝胶化食品如干酪、酸奶、布丁等。
实施例8：使用GE在工作台上水解大豆分离蛋白对照水解获取自大豆
薄片的酸沉淀大豆蛋白
如图9所示的延伸区域中的大量潜在切割位置使得该区域易于受GE水解。当蛋白为天然状态时，延伸区域优先发生水解，而在变性状态较高时，整个分子发生水解。
使用本领域已知的标准分离方法制备的大豆分离蛋白被用作底物，所述方法涉及蛋白质提取、等电点沉淀、再浆液化蛋白、UHT巴氏灭菌、然后喷雾干燥。具有10％固体含量的大豆分离蛋白浆液通过混合10克大豆分离蛋白和90克水进行制备。使用0.1N NaOH将pH调节至8.0，用GE进行的酶水解在50℃下进行30分钟，使用基于干燥物质12、24、和48mg酶蛋白/1kg大豆分离蛋白的酶浓度，水解通过在85℃加热浆液5分钟终止。冷却样品并进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示。
上文公开的水解过程使用酸沉淀的大豆蛋白凝乳浆液作为底物继续进行。浆液获取自标准分离程序，该程序涉及蛋白质提取、等电点沉淀、再浆液化蛋白、UHT巴氏灭菌、然后喷雾干燥。浆液样品在UHT巴氏灭菌前的再浆液化步骤中收集。浆液为10％的固体含量，使用0.1NNaOH将pH调节至8.0，用GE进行的酶水解在50℃下进行。水解进行30、60、和120分钟。使用基于干燥物质24、48、和96mg酶蛋白/1kg大豆分离蛋白的酶浓度。通过在85℃下加热浆液5分钟终止水解。冷却样品并进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示。当图1与图3进行比较时，基于底物状态(即变性的对天然的)水解模式明显差异很大。还能注意到在天然状态下，甚至在高酶浓度下并且经过长时间的水解，47kDa片段对水解相对稳定，使得通过高效制造过程收获这种片段是可能的。
实施例9：从大豆粉中制备47kDa的富含片段。
在32℃下混合500磅脱脂大豆粉与5000磅水以制备10％固体含量的浆液。离心分离浆液并且收集第一上清液和第一沉淀物。第一沉淀物用3000磅水再次制成浆液，并且离心分离所述浆液。弃去第二沉淀物并收集第二上清液，并且加入第一上清液以形成组合的上清液。用HCl将组合上清液的pH调节至4.53以形成凝乳。在32℃下离心分离凝乳并用水再次形成10％固体含量的浆液。
除去三分之一的凝乳浆液并用NaOH/KOH共混物将pH调节至7.2以形成中性凝乳。将中性凝乳加热至157℃9秒钟并冷却至61℃进行巴氏灭菌。喷雾干燥冷却的中性凝乳以获取对照大豆分离蛋白。
除去三分之二的凝乳浆液并使用NaOH/KOH共混物将pH调节至8.0。将pH 8.0的凝乳浆液加热至55℃并用GE处理。
搅拌包含浆液的酶30分钟以完成酶处理。然后将酶处理的浆液分成两部分。
将第一酶处理的部分用NaOH/KOH共混物将pH调节至7.2，加热至161℃，保持9秒，冷却至55℃并喷雾干燥以形成酶处理的大豆分离蛋白。
将第二酶处理的部分用HCl将pH调节至4.5以形成酶处理的凝乳，然后在60℃下离心分离。酶处理的凝乳用水形成10％固体含量的浆液，用NaOH/KOH共混物中和至pH 7.2，加热至160℃保持9秒，冷却至56℃，并且喷雾干燥以形成酶处理的大豆分离蛋白。
有两种酶处理：第一种接受6mg GE每kg固体的剂量，第二种接受12mg GE酶蛋白每kg固体的剂量。
图10示出该实施例中生成的水解产物的SDS-PAGE。
实施例10：使用新型酶GE制备白度较高的大豆蛋白水解产物
实施例9中制备的蛋白产物用于制备凝胶。为了制备所述凝胶，用水以1∶6的比率分散样品、混合并置于6盎斯(oz.)的罐中，并且在沸水浴中加热30分钟以形成凝胶。这些凝胶的图片如图11所示。图11明显示出GE处理的产品生成白度高得多的凝胶。
由实施例9中制备的蛋白产物制成的浆液在5％浓度下测量白度指数并在表4中显示。
表4：GE处理的样品的白度指数，Hunter测量
| 样品 | 白度指数 |
| 对照物 | 23.2 |
| 6mg GE/kg浆液固体的样品 | 29.5 |
| 12mg GE/kg浆液固体的样品 | 35.4 |
用较高GE浓度处理的蛋白产物的白度指数比未经GE处理的蛋白产物高12.2个单位。
实施例11：GE水解产物的感官分析
专有的感官筛选方法，舒莱定性筛选(Solae Qualitative Screening，SQS)方法，被用于评价实施例9中制备的GE水解产物的感官特性。该方法基于试验样品与对照样品之间的直接比较，它既提供定性的也提供定向定量的差异。向一组十名评估员提供每个样品(稀释至5％浆液)的等分试样和对照样品，对照样品是未处理的大豆分离蛋白的5％浆液。
评估规程包括涡旋样品杯三次，保持杯底部在桌上。样品静置2秒钟后，每个评估员呷入约10mL(2茶匙)样品，在口中漱约10秒钟后吐出。评估员然后根据表5给出的量表评估试验样品和对照样品间的差异。
表5：SQS评分体系
如果试验样品被评价为与参考的不同(即，SQS评分为2、3、或4)，然后还可对试验样品进行进一步评估以提供关于试验样品如何不同于对照样品的诊断信息。因此，如果试验样品具有比对照样品微多、中度多、或极多的某项特性(参见表5)，则赋予它们的评分分别是+1、+2、+3。同样的，如果试验样品具有比对照样品微少、中度少、或极少的某项特性，则赋予它们的评分分别是-1、-2、-3。该分析提供了对试验样品和对照样品之间的定向定量差异的评估。
图12提供了每个GE水解产物的诊断评分(不同于参考)。GE水解产物相对于对照物(未处理的大豆分离蛋白)具有轻度减弱的灰色和大豆/豆类风味特征。
实施例12：使用GE对比SP酶在工作台上水解的大豆分离蛋白的白度 指数。
a)GE水解：如实施例8所述生成样品
b)SP水解：样品规程与实施例8中所述的规程相同，然后进行SP水解，不同的是SP的酶剂量。用于SP的酶剂量为3.3mg酶/1kg分离蛋白和6.6mg酶/1kg分离蛋白。通过在85℃下加热浆液5分钟终止水解。冷却并分析样品。
测量用GE和SP酶制备的样品水解产物浆液的白度指数，它们在图13中显示。使用S-TNBS方法获得每种水解产物的％DH。
虽然商品水解样品的白度指数当用GE水解时随着％DH提高，相同％DH范围内SP导致的水解对白度指数无影响。
实施例13：使用较小剂量的GE和SP酶在工作台上水解中试车间中制 备的酸性凝乳。
使用如实施例9所述在中试车间中制备的商品酸性凝乳。凝乳的固体含量是10％，将pH调节至8.0，并且将样品等分成若干个200g批量。在50℃下用GE酶水解基于干物质0、1、2、3、4、5、和6mg GE/kg凝乳固体30分钟，使用200g的凝乳批量。在50℃下用SP酶水解基于干物质0、0.5、1、2和3.36mg SP/kg凝乳固体30分钟，使用200g的凝乳批量。通过在85℃下加热浆液5分钟终止水解。冷却样品并测试其白度指数。尽管使用的酶剂量非常小，在GE处理样品中发现白度指数有剂量依赖型的提高，此类效应在SP处理的样品中未被发现(图4)。
实施例14：用GE水解大豆蛋白
水解反应。原料为悬浮在pH 8.5的0.1M磷酸钠中的10％大豆分离蛋白(例如SUPRO500E)。用HCl将蛋白浆液的pH调节至8.0。将蛋白浆液加热至约70℃并用来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的丝氨酸蛋白酶(GE)水解混合物。GE的使用浓度为19.5mg、39.0mg、78.1mg、156.3mg、或312.5mg蛋白酶蛋白每千克大豆分离蛋白。水解反应在70℃下进行120分钟。加入pH 3.7的1M甲酸钠终止反应，使得混合物的pH为约4.0并且水解产物中的大豆蛋白终浓度为5％。
实施例15：鉴定GE水解产物中的肽
通过液相色谱质谱(LC-MS)鉴定实施例14制备的GE水解产物中的肽段。表6提供来源于大豆球蛋白亚基G2和前体大豆球蛋白链A的肽片段。
表6.
实验实施例1：包含大豆蛋白水解产物的酸性饮料。
根据本发明制备酸性饮料。将130.0份大豆蛋白成分和8,539份去离子水加入到器皿中。在高剪切下混合内容物直至分散均匀。然后加热分散体至74℃到79℃(165℉到175℉)，并且再混合10分钟。然后混合加入1,180份高果糖玉米糖浆、131份苹果汁浓缩物(68Brix)和20.0份无水柠檬酸。用85％的柠檬酸将pH调节至3.8-4.0。第一阶段在2500磅每平方英寸，第二阶段在500磅每平方英寸下匀化内容物，随后在107℃下巴氏灭菌7秒钟。瓶用饮料在高温下填充，然后置于冰浴中以使饮料温度达到室温并置于冰箱中。
实验实施例2：包含大豆蛋白水解产物的干混物。
以下实验实施例示出制备包含本发明蛋白和下表7列出组分的干混物。
表7
| 组分 | 重量份 | 每份克数 |
| 大豆蛋白水解产物 | 56.85 | 16.89 |
| 果糖 | 20.23 | 6.01 |
| 蔗糖 | 20.22 | 6.01 |
| 干奶油提取物 | 1.01 | 0.30 |
| 冰淇淋香草风味剂 | 1.35 | 0.40 |
| 氯化钠 | 0.34 | 0.10 |
| 总计 | 100.00 | 29.71 |
将各成分加入到器皿中并混合形成干混物。
实验实施例3：包含如实验实施例2所述制备的干混物的饮料
将如实验实施例2所述制备的干混物加入到液体中制备即饮型饮料。加入顺序不重要。
在即饮型饮料内，存在的液体按总组合物重量计为约85％至约95％，并且即饮型饮料的pH为约6.8至约7.4。
实验实施例3是具有创造性的即饮型饮料，通过将实验实施例2的29.71克产品加入到240mL脱脂乳中进行制备。混合内容物30秒。
实验实施例4：包含如实验实施例2所述制备的干混物的饮料
将如实验实施例2所述制备的干混物加入到液体中制备即饮型饮料。加入顺序不重要。
在即饮型饮料内，存在的液体按总组合物重量计为约85％至约95％，并且即饮型饮料的pH为约6.8至约7.4。
实验实施例4是具有创造性的即饮型饮料，通过将实验实施例2的29.71克产品加入到240mL水中进行制备。混合内容物30秒。
实验实施例5：包含大豆蛋白水解产物的未调味低脂豆浆
份重量：8.5g蛋白质/250g。
表8：未调味低脂豆浆的配方
| 成分 | ％配方 |
| 蒸馏水 | 89.4 |
| 柠檬酸钾 | 0.25 |
| 大豆蛋白水解产物* | 3.8-4.2 |
| 麦芽糖糊精 | 4-4.4 |
| 糖 | 1.4 |
| 高油酸向日葵油 | 0.72 |
| 角叉菜胶 | 0.03 |
*根据蛋白质含量按原样调节配方中使用的大豆蛋白水解产物的百分比
在60℃(140℉)水中分散柠檬酸盐。提高混合速度并将蛋白分散到水中。在蛋白质完全分散后提高浆液温度至75℃(167℉)，降低混合速度并继续混合10分钟。预混麦芽糖糊精、糖和角叉菜胶，加入到蛋白浆液中并在低速继续混合5分钟。将向日葵油加入到浆液中并在低速继续混合大约3分钟直至均匀。使用45％氢氧化钾将浆液pH调节至介于7.0和7.2之间。方法如下：均化、巴氏灭菌并冷却。将产品加热至72℃(162℉)并在第二阶段750psi；第一阶段2250psi下匀化。将浆液预热至100℃(212℉)并在141℃(286℉)和UHT下保持6秒。将产品冷却至31℃(88℉)并包装在灭菌瓶中。贮存在冰箱中。
实验实施例6：包含50％大豆蛋白水解产物和50％脱脂乳的未调味饮料。
份重量：8g蛋白质/260g
表9：未调味饮料配方
| 成分 | ％配方 |
| 蒸馏水 | 43.9 |
| 大豆蛋白水解产物* | 1.71-1.9 |
| 脱脂乳 | 50 |
| 麦芽糖糊精 | 1.95-2.12 |
| 糖 | 1.0 |
| 高油酸向日葵油 | 0.84 |
| 无水柠檬酸钠 | 0.05 |
| 磷酸氢镁 | 0.038 |
| 纤维素凝胶 | 0.25 |
| 角叉菜胶 | 0.02 |
| 维生素/矿物质预混物 | 0.006 |
*根据蛋白质含量按原样调节配方中使用的大豆蛋白水解产物的百分比
使用中速混合在15℃(59℉)下将柠檬酸盐全分散在去离子水中。在水中分散SUPROPlus。在分散所有小块后，将浆液加热至77℃(170℉)并在低速继续混合10分钟。干混麦芽糖糊精、糖、维生素预混物、磷酸镁、纤维素和角叉菜胶。将干混物加入到蛋白浆液中并继续混合5分钟。加入向日葵油并继续混合3分钟。测量浆液pH，如需要的话用50％柠檬酸溶液或1N NaOH将pH调节至pH 6.9到7.1。将脱脂乳缓慢加热至72℃(162℉)并加入蛋白浆液以加热脱脂乳。加入调味剂并混合直至完全掺入浆液。缓慢共混3分钟并记录最终浆液pH。方法如下：将产品加热至72℃(162℉)并在第二阶段750psi、第一阶段2250psi下匀化。预热浆液至104℃(220℉)并在141℃(286℉)下UHT 6秒。将产品冷却至31℃(88℉)并包装。贮存在冰箱中。
实验实施例7：包含酪蛋白酸钙、脱脂干乳(NFDM)以及大豆蛋白水
解产物作为蛋白质来源的香草风味体重控制饮料
份重量：10g蛋白质/11oz
表10：香草风味配方
如下制备预混物：混合角叉菜胶和纤维素与小部分代乳品蔗糖。混合阿拉伯树胶和剩余的蔗糖。混合卡诺拉油。
然后共混：使用高剪切混合将柠檬酸钾和柠檬酸钠加入到水中。然后分散预混的角叉菜胶和纤维素。混合5分钟。分散大豆蛋白、酪蛋白酸钙和NFDM并开始加热至65℃(150℉)。水化15分钟，在达到65℃(150℉)后降低混合速度。将卡诺拉油/乳化剂共混物加热至约70℃(158℉)以溶解乳化剂，这可能需要一些混合。然后将热油混合加入到分批罐中，共混5分钟，泡沫将分散。加入蔗糖/阿拉伯树胶共混物、碳酸钙、磷酸镁、碳酸镁和维生素预混物，混合10分钟。加入香草风味剂并用45％KOH将pH调节至7.0-7.2。UHT 286F/6秒，2500/500psi
实验实施例8：包含大豆蛋白水解产物的干混饮料功能饮料模型。
表11：功能饮料配方
| 成分 | ％配方 |
| 大豆蛋白水解产物 | 16.2-16.9 |
| 乳清分离蛋白(WPI)(按原样92.7％蛋白质) | 15.81 |
| 糖 | 3.25 |
| 果糖 | 3.25 |
| 可可 | 3.00 |
| 脂肪粉末 | 1.40 |
| 黄原胶 | 0.40 |
| 维生素预混物 | 0.06 |
| 三氯蔗糖 | 0.04 |
| 增甜剂 | 0.30 |
| 巧克力风味剂 | 0.65 |
| 奶油 | 0.20 |
| 总计 | 44.8-45.3 |
清洁消毒搅拌器。筛滤大豆蛋白和可可粉。中速混合所有成分15分钟。在清洁容器中贮存干粉。
实验实施例9：包含大豆蛋白水解产物的挤出产品。
所述方法以制剂开始；更换成分以获得一定水平的蛋白；实例：10％-90％的干燥基蛋白。为了达到合适的％蛋白，蛋白可为不同来源的蛋白组合，例如：大豆浓缩蛋白(ISP)、大豆浓缩蛋白、大豆粉、其他植物蛋白、乳蛋白等。本发明的大豆蛋白水解产物也用作蛋白组分部分。为了使制剂中的其他部分达到100％，其他组分可包括水分、灰分、脂肪、碳水化合物和本领域技术人员已知的其他组分。可使用多个来源的这些成分，例如淀粉、谷物粉或来自谷物、纤维、树胶、糖浆、脂肪、盐、糖、风味剂的衍生物。
在限定最终产品的组合物后，通常使用干混以匀化干燥成分，将所述干燥成分投料于挤出料斗中。然后将制剂投料于预处理器(如果使用的话)或者直接投料于挤出机中。将水和/或蒸汽注入到预处理器中以预水合和/或预热共混物。基于干燥投料约0％-30％的水和0％-15％的蒸汽将被注入到预处理器中。来自预处理器的材料流量(干料、液体和蒸汽)可为0.2-150(磅/分钟)或更高，这取决于挤出机的圆筒直径和螺杆通道开口面积，圆筒直径和螺杆开口决定进料速率。
挤出机充分“烹煮”干料或预处理投料的能力将取决于L/D，即长度与直径的比率。就高蛋白产物而言，通常使用大于20％的干燥基总蛋白、具有大于15∶1的L/D的挤出机。将成分投料于通常以200rpm-1000rpm的螺杆转速运行的挤出机中。将附加的水、蒸汽、糖浆和/或其他成分加入到挤出机圆筒中；用于获得不同挤出产品的合适产品特性的典型范围(0％-40％)，所述挤出产品：
直接膨胀的“早餐谷类食物、肉块(nugget)、小吃等”。
组织化产品。组织化植物蛋白(TVP)等。
水分含量大于50％的高水分含量挤出物“肉型组织，意大利面食等”
这些成分可在圆筒的不同点加入到挤出机中，并且它们通过预设计螺杆构型进行剪切以获得合适的最终产品特性。在挤出机端部使用模头产生后部压力并挤出填充物以进行合适的烹煮，当材料存在于模头时，挤出温度和压力获得合适的膨胀。模头必须对称以获得最好结果，并且可具有任何几何形状或可用的形状。
挤出机产生连续的长条状物，可使用附属装置如面切割、外部切割、和其他装置将其分切成小段。面切割器用于直接膨胀的产品如谷类食物、小吃、肉块(nugget)等。面切割也用于意大利面食或立体小吃“粒状食品”。
外部切割器用于小吃“正方形、波状、直棒等”，高水分含量挤出物等。其他装置可为切割器装置和粒度缩减器的组合，如“Fitz粉碎机、滚筒磨碎机、commitrol磨碎机等，“TVP、TC等”
在将产品缩减至合适粒度后；将其干燥至合适规格；通常2％-10％以使其在标准仓库条件下架藏稳定；大于12％应冷冻或冷藏。
需考虑的一个附加的典型属性是：
密度：(0.12-0.35g/cc)。
在干燥和筛滤步骤之后包装产品。
Claims (15)
1.大豆蛋白水解产物组合物，所述组合物包含富集47kDa片段的多肽的混合物，其中按重量计约10％-约66％的所述多肽是所述47kDa片段。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：8的至少一种寡肽。
3.蛋白级份，所述蛋白级份包含富集的疏水性β-伴球蛋白核心区域。
4.食品，所述食品包含权利要求1的大豆蛋白水解产物组合物。
5.权利要求4的食品，所述食品选自干酪、乳化肉类、搅打食品、块状食品、鱼肉酱产品、挤出食品、饮料、全肌食品、酸奶、布丁以及它们的组合。
6.用于制备蛋白级份的方法，所述方法包括：
a.使用来源于在pH 4.5等电点沉淀的大豆粉或大豆浓缩物制备大豆蛋白浆液，以及
b.用酶水解所述大豆蛋白浆液，所述酶在谷氨酸和天冬氨酸的C末端上切割蛋白以获得蛋白级份。
7.制备富集的疏水性β-伴球蛋白核心区域的蛋白产物的方法，其中所述β-伴球蛋白的α’和α亚基的亲水性延伸区域通过用酶水解β-伴球蛋白被选择性地从β-伴球蛋白水解，所述酶在谷氨酸和天冬氨酸的C末端上切割蛋白，从而产生富集的疏水性β-伴球蛋白核心区域的蛋白产物。
8.权利要求7的方法，其中所述酶是蛋白酶。
9.权利要求8的方法，其中所述酶是丝氨酸蛋白酶。
10.权利要求9的方法，其中所述酶是来自地衣芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶。
11.用于制备蛋白质水解产物组合物的方法，所述方法包括：
a.使蛋白材料与肽链内切酶接触，所述肽链内切酶将所述蛋白材料切割成富集47kDa片段的多肽的混合物，所述多肽的混合物包含所述蛋白质水解产物组合物，其中按重量计约10％-约66％的所述多肽是所述47kDa片段。
12.权利要求11的方法，其中所述肽链内切酶是丝氨酸蛋白酶。
13.权利要求12的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶来自地衣芽孢杆菌。
14.食品，所述食品包含蛋白质水解产物组合物，所述组合物包括富集47kDa片段的多肽的混合物，其中按重量计约10％-约66％的所述多肽是所述47kDa片段。
15.权利要求14的食品，所述食品选自干酪、鱼肉酱产品、乳化肉类、搅打食品、块状食品、挤出食品、饮料、全肌食品、酸奶、布丁以及它们的组合。
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