DE69632630T2 - Enzym mit aminopeptidaseactivität - Google Patents

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Claus Dambmann
Torben Halkier
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Anant Shamkant PATKAR
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Aminopeptidaseaktivität zeigendes Enzym, ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms, eine Enzymzubereitung, die das Aminopeptidaseaktivität zeigende Enzym enthält, und die Verwendung des Enzyms für verschiedene industrielle Zwecke.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Proteinhydrolysate werden in zahlreichen Nahrungsmittelprodukten verwendet. Traditionell wurden Proteinhydrolysate durch Säurehydrolyse hergestellt, jedoch wird heute enzymatische Hydrolyse als attraktive Alternative betrachtet.
  • Eines der Hauptprobleme der Proteinhydrolysate ist, dass sie oft bitter schmecken. Unter Verwendung z. B. von an hydrophoben L-Aminosäuren reichem Sojaprotein oder Casein als die Proteinquelle, neigt das Proteinhydrolysat dazu, einen bitteren Geschmack aufzuweisen. Im Allgemeinen wird angenommen, dass das, ob der Geschmack von Proteinen bitter ist oder nicht, von der mittleren Hydrophobizität der L-Aminosäurereste wie Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan abhängt.
  • Eine gewaltige Anzahl an Peptidaseaktivität zeigenden Enzymen können enzymatische Hydrolyse bei pflanzlichen, hefeartigen und/oder tierischen Proteinen verrichten, was zu hoch nahrhaften Hydrolysaten führt, die als Nahrungsmittelzu sätze in Produkten wie Suppen, Soßen, Bratensoßen, Pasten, Tofu, Bouillon, Gemüse, Babynahrung, Snacks, Fertiggerichte usw. nützlich sind.
  • Peptidasen
  • Alle Peptidasen oder Proteasen sind Hydrolasen, die so auf Proteine oder ihre Teilhydrolysate wirken, dass die Peptidbindung gespalten wird.
  • EP 427,385 (The Japanese R & D Association) offenbart ein genomisches Gen, das eine alkalische Protease kodiert, die von Gelbschimmelpilzen wie Aspergillus oryzae abgeleitet ist.
  • JP-0-2002374 und JP-0-2002375 (Shokuhin) beschreiben eine alkalische Protease, die von Aspergillus oryzae abgeleitet sind, zur Verwendung in Medizin, Nahrungsmitteln und Detergentien.
  • SU-891777 (Khark) betrifft eine Mikrobenprotease von Aspergillus oryzae, die in Nahrungsmitteln, Medizin usw. verwendet werden kann.
  • JP-5-4035283 (Ajinomoto KK) offenbart eine Zubereitung von Endopeptidaseaktivität zeigenden Enzymen z. B. von Aspergillus oryzae, die Proteine fast vollständig hydrolysieren können.
  • WO 94/25580 (Novo Nordisk A/S) beschreibt ein Verfahren zum Hydrolysieren von pflanzlichem oder tierischem Protein durch Inkubieren mit einer proteolytischen Enzymzubereitung, die von einem Stamm von Aspergillus oryzae abgeleitet ist.
  • Aminopeptidasen
  • Eine Untergruppe von Peptidasen (Proteasen) wird Aminopeptidasen genannt und ist unter der Enzymklassifizierungsnummer E. C. 3.4.11 (Aminopeptidasen) gemäß den Recommendations (1992) of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) klassifiziert.
  • Aminopeptidasen können einen oder mehrere Amino-terminale Reste von Polypeptiden entfernen.
  • JP-7-5034631 (Noda) offenbart eine Leucinaminopeptidase, die von einem Aspergillus oryzae einschließenden Koji-Gelbschimmelpilz abgeleitet ist.
  • JP-7-4021798 (Zaidan Hojin Noda Sangyo) beschreibt die Herstellung von Miso durch Zugabe einer Leucinaminopeptidase-II-Zubereitung durch Züchten einer Anzahl von den Stamm 460 und den Stamm IAM 2616 von Aspergillus oryzae einschließenden Schimmelpilzen.
  • Van Heeke et al., Bioch. Biophys. Acta, (1992), 1131, 337–340, offenbarten das Klonen einer Aminopeptidase mit 30 kDa aus dem Bakterium Vibrio proteolyticus, das bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Nr. 15338 hinterlegt ist.
  • Vom Aspergillus oryzae 460 ist bekannt, dass er eine Anzahl an Leucinaminopeptidasen erzeugt. Das Molekulargewicht von dreien davon wurde durch Gelfiltration als 26.500, 56.000 bzw. 61.000 bestimmt (Nakada et al., Agr. Biol. Chem, (1972), 37(4), 757–765; Nakada et al., Agr. Biol. Chem, (1972), 37(4), 767–774; Nakada et al., Agr. Biol. Chem, (1972), 37(4), 775–782). Der Stamm 460 von Aspergillus oryzae ist bei der American Type Culture Collection als A. oryzae (ATTC Nr. 20386) hinterlegt.
  • Reduzierung von bitterem Geschmack von Proteinhydrolysaten
  • EP 65,663 und EP 325,986 (Miles Inc.) betreffen die enzymatische Hydrolyse von Proteinen unter Verwendung eines Gemischs aus Enzymen, das von Aspergillus oryzae abgeleitete Proteasen enthält. Das erhaltene Proteinhydrolysat weist einen faden, nicht bitteren Geschmack auf.
  • JP-4-7029577 (Asahi Electro-chemical Co.) betrifft eine von Aspergillus oryzae abgeleitete Protease, die bei Zersetzung des Proteins keinen bitteren Bestandteil erzeugt.
  • Matsuoka, H. et al., Agr. Food. Chem., 39(8), 1991, 1392–1395 offenbaren die Reinigung einer extrazellulären Aminopeptidase aus Penicillium caseicolum.
  • WO-A-9426882 beschreibt die Reinigung einer Aminopeptidase aus Propionibacterium shermani.
  • Das Fachgebiet offenbart eine Unmenge an Peptidase, Aminopeptidase und andere Enzymaktivitäten zeigenden Enzymen. Die Enzyme können von einer Anzahl an Mikroorganismen, einschließlich der Pilzspezies Aspergillus oryzae abgeleitet werden.
  • Im Allgemeinen umfassen zur Herstellung von Proteasehydrolysaten ohne einen bitteren Geschmack nützliche Produkte ein Gemisch aus Peptidase- und Aminopeptidaseaktivitäten.
  • Es wäre deshalb wünschenswert, ein Einkomponenten-Enzym (d. h. im Wesentlichen ohne jegliche Nebenaktivität) bereitstellen zu können, das nur eine Aktivität zeigt, die zur Reduzierung der Bitterkeit von in Nahrungsmittelprodukten verwendeten Proteinhydrolysaten nützlich ist.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
  • 1 zeigt das Ergebnis einer SDS-PAGE-Analyse eines Überstands aus dem Transformanten, der Aminopeptidase mit 35 kDA von Aspergillus oryzae A01568 erzeugt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Aktivität zeigendes Einkomponenten-Enzym bereitzustellen, das insbesondere zur Herstellung von verbesserten Brotprodukten und zur Herstellung von Proteinen und/oder Proteinhydrolysaten ohne bitteren Geschmack für Nahrungsmittel nützlich ist.
  • Die Erfinder hatten überraschenden Erfolg beim Isolieren einer DNA-Sequenz, die ein Aminopeptidaseaktivität zeigendes Enzym kodiert, das vorteilhaft zum Verbessern des Geschmacks, der Krustenfarbe, der Krümelstruktur und der Teigklebrigkeit von gebackenen Produkten verwendet werden kann. Ferner ist das neue Enzym zur Herstellung eines Proteins oder von Proteinhydrolysaten ohne bitteren Geschmack nützlich.
  • Die Aminopeptidase kodierende vollständige DNA-Sequenz ermöglicht es, Einkomponenten-Aminopeptidasen herzustellen.
  • Die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte vollständige DNA-Sequenz, welche die Aminopeptidase der Erfindung kodiert, wurde, eingeschlossen in einem Plasmid, zu dem Bakterienstamm Escheria coli DSM Nr. 9965 transformiert. Dies wird weiter nachstehend beschrieben.
  • Durch eine Datenbank-Abgleichssuche wurde gefunden, dass die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte DNA-Sequenz neu ist. Der höchste Grad an Ähnlichkeit und Identität mit der vorstehend erwähnten Aminopeptidase mit 30 kDa von dem Bakterium Vibrio proteolyticus (ATCC Nr. 15338) wurde als 53% bzw. 32% befunden.
  • Die Erfinder charakterisierten die Vorstufenform der aus einem Sekretionssignal bestehenden Aminopeptidase und der Aminopeptidase mit 35 kDa. Das Molekulargewicht (MW) der Vorstufenform wurde als 41 kDa berechnet und der isoelektrische Punkt (pI) wurde als etwa 4,9 geschätzt. Ferner wurde die Aminosäurezusammensetzung der Aminopeptidase wie in Tabelle 1 dargestellt geschätzt.
  • Tabelle 1
    Figure 00060001
  • Figure 00070001
  • Die abgeleitete vollständige Vorstufenform der Aminosäuresequenz des Enzyms mit 35 kDa ist in SEQ ID Nr. 2 dargestellt.
  • Demzufolge betrifft der erste Aspekt der Erfindung ein Aminopeptidaseaktivität zeigendes Enzym, das von einem pilzartigen Mikroorganismus abgeleitet ist, wobei das Enzym eine oder mehrere der in SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 11 dargestellten Teilaminosäuresequenzen umfasst.
  • Eine Massenspektrometrie zeigte, dass die mittlere Masse der rekombinanten Aminopeptidase im Bereich von 33 kDa bis 35 kDa liegt. Der isoelektrische Punkt (pI) des Enzyms wurde als etwa 4,9 bestimmt.
  • Der isoelektrische Punkt, pI, ist als der pH-Wert definiert, bei welchem der Enzymmolekülkomplex (gegebenenfalls mit gebundenen Metall- oder anderen Ionen) neutral, d. h. die Summe von elektrostatischen Ladungen (elektrostatische Netzladung, NEC) am Komplex gleich Null ist. In dieser Summe muss natürlich eine Erwägung der positiven oder negativen Natur der elektrostatischen Ladung berücksichtigt werden.
  • Im Folgenden werden die Begriffe „Aminopeptidase mit 35 kDa" und „das Aminopeptidaseaktivität zeigende Enzym" abwechselnd für das Einkomponenten-Enzym der vorliegenden Erfindung verwendet.
  • Das Aminopeptidaseaktivität zeigende Enzym der Erfindung kann von einer Anzahl von Mikroorganismen abgeleitet werden. Die Erfinder isolierten die Ami nopeptidase der Erfindung von dem Fadenpilz Aspergillus oryzae A01568, der ein bei der American Type Culture Collection als Aspergillus oryzae 460 hinterlegter (FERM-P Nr. 1149, ATCC Nr. 20386) und ferner in US-Patent Nr. 3,914,436 beschriebener Stamm ist.
  • Das Aminopeptidaseaktivität zeigende Enzym der Erfindung umfasst mindestens eine der in SEQ ID Nr. 6, 7, 8, 9 bzw. 10 dargestellten Teilaminosäuresequenzen. SEQ ID Nr. 11 ist ein Peptid (5), das die N-terminale Sequenz überdeckt und erweitert.
  • Im zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfasst, die ein Aminopeptidaseaktivität zeigende Enzym kodiert, wobei die DNA-Sequenz
    • a) den Aminopeptidase kodierenden Teil der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten DNA-Sequenz oder die eine Aminopeptidase kodierende DNA-Sequenz, die von E. coli DSM9965 erhältlich ist, oder
    • b) ein Analogon der in a) definierten DNA-Sequenz, die
    • i) über die gesamte Länge zu 70% identisch ist mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten DNA-Sequenz oder der eine Aminopeptidase kodierenden DNA-Sequenz, die von Escheria coli DSM 9965 erhältlich ist, oder
    • ii) ein Polypeptid kodiert, das zu 70% identisch ist mit dem Peptid, das durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, die die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte DNA-Sequenz oder die eine Aminopeptidase kodierende DNA-Sequenz, die von E. coli DSM9965 erhältlich ist, umfasst, umfasst.
  • Im vorliegenden Kontext soll das „Analogon" der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten DNA-Sequenz und/oder der eine Aminopeptidase kodierende DNA-Sequenz, die von E. coli DSM9965 erhältlich ist, eine beliebige DNA-Sequenz anzeigen, die ein Aminopeptidaseaktivität zeigendes Enzym kodiert, das mindestens eine der Eigenschaften i)–iv) aufweist.
  • Das DNA-Sequenz Analogon
    • – kann von einem anderen oder verwandten (z. B. demselben) Organismus isoliert werden, der das Aminopeptidaseaktivität zeigende Enzym auf der Basis einer beliebigen in SEQ ID Nr. 3–5 dargestellten DNA-Sequenzen, z. B. unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren erzeugt, und folglich eine Allel- oder Spezies-Variante der die hier dargestellten DNA-Sequenzen umfassenden DNA-Sequenz sein,
    • – kann auf der Basis einer beliebigen der in SEQ ID Nr. 3–5 dargestellten DNA-Sequenzen z. B. durch Einbringen von Nukleotidsubstitutionen, die sich zu keiner anderen Aminosäuresequenz der durch die DNA-Sequenz kodierte Aminopeptidase erweitert, jedoch dem Kodongebrauch des für die Erzeugung des Enzyms beabsichtigten Wirtsorganismus entspricht, oder durch Einbringen von Nukleotidsubstitutionen, die sich zu einer anderen Aminosäuresequenz erweitern können, konstruiert sein. Jedoch sind die Aminosäureänderungen des letzteren Falls vorzugsweise von minderer Natur, d. h. bewahrende Aminosäuresubstitutionen, welche die Faltung oder Aktivität des Polypeptids nicht bemerkenswert beeinflussen, kleine Deletionen, die typischerweise aus einer bis 30 Aminosäuren bestehen; kleine Amino- oder Carboxyl-terminale Erweiterungen wie ein Amino-terminaler Methioninrest, ein kleines Linker-Peptid mit etwa 20–25 Resten, oder eine kleine Erweiterung, welche die Reinigung erleichtert, wie ein Polyhistidinteil, ein antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne. Siehe im Allgemeinen Ford et al., (1991), Protein Expression and Purification 2, 95–107. Beispiele für bewahrende Substitutionen liegen innerhalb der Gruppe von basischen Aminosäuren (wie Arginin, Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren (wie Glutaminsäure und Aspartamsäure), polaren Aminosäuren (wie Glutamin und Asparagin), hydropho ben Aminosäuren (wie Leucin, Isoleucin, Valin), aromatischen Aminosäuren (wie Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (wie Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin).
  • Es ist dem Fachmann klar, dass solche Substitutionen außerhalb den Bereichen durchgeführt werden können, die für die Funktion des Moleküls entscheidend sind und noch zu einem aktiven Enzym führen. Aminosäuren, die für die Aktivität des durch das DNA-Konstrukt der Erfindung kodierte Polypeptid wichtig sind und sich deshalb vorzugsweise keiner Substitution unterziehen, können gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren wie stellengerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham and Wells, (1989), Science 244, 1081–1085) identifiziert werden. In letzterer Technik werden in jeden Rest im Molekül Mutationen eingebracht und die erhaltenen Mutant-Moleküle auf biologische (d. h. aminopeptidolytische) Aktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls entscheidend sind. Stellen von Substrat-Enzym-Wechselwirkung können auch durch Kristallstrukturanalyse, wie bestimmt durch solche Techniken wie Kernresonanz, Kristallographie oder Photoaffinitäts-Markieren bestimmt werden. Siehe zum Beispiel de Vos et al. (1992), Science 255, 306–312; Smith et al., (1992), J. Mol. Biol., 224, 899–904; Wlodaver et al., (1992), FEBS Lett., 309, 59–64.
  • Es ist klar, dass die in SEQ ID Nr. 3–5 dargestellten DNA-Sequenzen Sequenzen sind, die zum Isolieren der gesamten die Aminopeptidase kodierenden DNA-Sequenz, z. B. der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten DNA-Sequenz und/oder der DNA-Sequenz, die in den hinterlegten Stamm Escheria coli DSM 9965 transformiert wurde, verwendet werden. Der Begriff „Analogon" soll die gesamte DNA-Sequenz einschließen, die eine oder mehrere der in SEQ ID Nr. 3–5 dargestellten Teilsequenzen oder Teile davon umfasst. Die Aminosäuresequenz (wie aus der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten DNA-Sequenz abgeleitet) ist in SEQ ID Nr. 2 dargestellt.
  • Die vorstehend in i) besprochene Homologie wird als der Identitätsgrad zwischen den beiden Sequenzen bestimmt, die eine Ableitung der ersten Sequenz von der zweiten anzeigen. Die Homologie kann geeigneterweise mittels auf dem Fachgebiet bekannten Computerprogrammen wie GAP, das im GCG-Programmpaket (Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, Seite 443–453) bereitgestellt ist, geeignet bestimmt werden. Unter Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen zum DNA-Sequenzvergleich: GAP-Bildungsnachteil 5,0 und GAP-Erweiterungsnachteil 0,3 zeigt der kodierende Bereich der DNA-Sequenz einen Identitätsgrad von vorzugsweise mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, speziell mindestens 90%, mit dem Kodierungsbereich der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten DNA-Sequenz oder der von dem Plasmid in E. coli DSM 9965 erhältlichen DNA-Sequenz.
  • Eine Hybridisierung soll anzeigen, dass die analoge DNA-Sequenz unter bestimmten spezifizierten Bedingungen, die nachstehend im Detail im Abschnitt „Materialien und Verfahren" beschrieben sind, zu derselben Sonde wie die Aminopeptidase kodierende DNA-Sequenz hybridisiert.
  • Gewöhnlich ist die analoge DNA-Sequenz mit der DNA-Sequenz hoch analog wie mindestens zu 70% homolog zu der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten DNA-Sequenz oder der eine Aminopeptidase kodierenden DNA-Sequenz, die von E. coli DSM9965 erhältlich ist, wie mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder sogar mindestens 95% homolog zu der DNA-Sequenz.
  • Die vorstehend in ii) besprochene Homologie wird als der Identitätsgrad zwischen den beiden Sequenzen bestimmt, die eine Ableitung der ersten Sequenz von der zweiten Sequenz anzeigen. Die Homologie kann geeigneterweise mittels auf dem Fachgebiet bekannten Computerprogrammen wie GAP, das im GCG-Programmpaket (Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, Seite 443–453) bereitgestellt ist, geeignet bestimmt werden.
  • Unter Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für DNA-Sequenzvergleich: GAP-Bildungsnachteil 5,0 und GAP-Erweiterungsnachteil 0,3 zeigt der kodierende Bereich der DNA-Sequenz einen Identitätsgrad von mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, speziell mindestens 90%, mit dem Kodierungsbereich der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten DNA-Sequenz oder der von dem Plasmid in E. coli DSM 9965 erhältlichen DNA-Sequenz.
  • Der Begriff „abgeleitet von" soll nicht nur eine durch den Stamm A01568 erzeugte Aminopeptidase, sondern auch eine Aminopeptidase, die durch eine DNA-Sequenz kodiert wurde, die von dem Stamm A01568 isoliert und in einem mit der DNA-Sequenz transformierten Wirtsorganismus erzeugt wurde, anzeigen. Die immunologische Reaktivität kann durch das nachstehend in im Abschnitt „Materialien und Verfahren" beschriebene Verfahren bestimmt werden.
  • In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung einen Expressionsvektor, der ein DNA-Konstrukt der Erfindung beinhaltet, eine Zelle, die das DNA-Konstrukt oder den Expressionsvektor umfasst, und ein Verfahren zur Herstellung eines Aminopeptidaseaktivität zeigenden Enzyms, wobei das Verfahren das Züchten der Zelle unter die Herstellung des Enzyms gewährenden Bedingungen und Gewinnen des Enzyms aus der Kultur umfasst.
  • Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, eine Enzymzubereitung bereitzustellen, die mit der Aminopeptidase mit 35 kDa der Erfindung angereichert ist.
  • Ferner stellt die Erfindung eine Brot verbessernde oder Teig verbessernde Zusammensetzung bereit, die ein Aminopeptidaseaktivität der Erfindung zeigendes Enzym umfasst. Die Zusammensetzung kann mit anderen Enzymen wie amylolytischen und herkömmlichen Brot-Verbesserungsmitteln kombiniert werden.
  • In noch einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines die Aminopeptidase mit 35 kDa der Erfindung umfassenden gebackenen Produkts oder gefrorenen Teigs.
  • Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung der Aminopeptidase mit 35 kDa der Erfindung. Das Enzym der Erfindung oder eine ein solches Enzym umfassende Zusammensetzung der Erfindung kann zum Verbessern des Geschmacks, der Krustenfarbe und der Krümelstruktur von gebackenen Produkten und zum Verbessern der Klebrigkeit von gefrorenem Teig verwendet werden. Die Aminopeptidase der Erfindung kann weiterhin vorteilhaft in Verbindung mit der Herstellung von Proteinen und Proteinhydrolysaten ohne bitteren Geschmack und für eine Anzahl von Zwecken einschließlich Zersetzung oder Modifikation von proteinhaltigen Substanzen; Reinigen von Kontaktlinsen, Herstellung von Nahrungsmitteln und Tierfutter usw. verwendet werden.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die DNA-Sequenz der Erfindung, die ein Aminopeptidaseaktivität zeigendes Enzym kodiert, kann durch ein allgemeines Verfahren isoliert werden, das beinhaltet:
    • – Klonen in geeigneten Vektoren einer DNA-Genbank von Aspergillus oryzae
    • – Transformieren von geeigneten Hefewirtszellen mit den Vektoren
    • – Züchten der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen zum Exprimieren eines beliebigen Enzyms von Interesse, das durch ein Klon in der DNA-Genbank kodiert wurde,
    • – Screenen auf positive Klone durch Bestimmen von beliebiger Aminopeptidaseaktivität des durch solche Klone hergestellten Enzyms und
    • – Isolieren der DNA, die ein Enzym aus solchen Klonen kodiert.
  • Das allgemeine Verfahren ist ferner in WO 93/11249 offenbart, wobei die Inhalte davon hier unter Bezugnahme eingebracht sind. Eine detailliertere Beschreibung des Screening-Verfahrens ist nachstehend in Beispiel 3 angegeben.
  • Mikrobenquellen
  • Die für die Aminopeptidase der Erfindung kodierende DNA-Sequenz kann zum Beispiel durch Screenen einer cDNA-Genbank des Donor-Organismus und Selektieren auf die geeignete Enzymaktivität (d. h. Aminopeptidaseaktivität wie durch die Fähigkeit des Enzyms zum Hydrolysieren von Leucin-7-amido-4-methylcoumarin) exprimierende Klone isoliert werden. Die geeignete DNA-Sequenz kann dann aus dem Klon durch Standardverfahren, z. B. wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert werden.
  • Der Donor-Organismus kann ein Pilz des in US-Patent Nr. 3,914,436 beschriebenen Aspergillus oryzae (ATCC Nr. 20386) sein.
  • Die vollständige DNA-Sequenz mit voller Länge, welche die Aminopeptidase der Erfindung kodiert, wurde in einen im Expressionsplasmid pYES 2,0 (Invitrogen) enthaltenen Stamm des Bakteriums E. coli transformiert. Das Bakterium wurde von den Erfindern gemäß dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung zur Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentverfahrenszwecke bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, (DSM) hinterlegt.
    Hinterlegungsdatum: 11.05.95
    Hinterlegungsnummer: NN49001
    DSM-Bezeichnung: E. coli DSM Nr. 9965
  • Als eine Internationale Hinterlegungsbehörde unter dem Budapester Vertrag, bietet die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Beständigkeit der Hinterlegung gemäß den Regeln und Verordnungen des Vertrags, siehe insbesondere Regel 9. Ein Zugang zu den beiden Hinterlegungen wird während des Schwebens dieser Patentanmeldung für jemanden, der von dem Commisioner of the United States Patent and Trademark Office bestimmt wurde unter der Bezeichnung 37 C. F. R. Par. 1.14 und 35 U. S. C. Par. 122 verfügbar. Auch erfüllen die vorstehend erwähnten Hinterlegungen die Mikroorganismen betreffenden Erfordernisse der Europäischen Patentanmeldungen gemäß Regel 28 EPC.
  • Die vorstehend erwähnte Hinterlegung stellt eine im Wesentlichen reine Kultur der isolierten Bakterien dar. Die Hinterlegung ist wie für ausländische Patentgesetze in Ländern verfügbar, in welchen Duplikate der betreffenden Anmeldung oder ihre Nachkommenschaft erteilt ist. Jedoch sollte klar sein, dass die Verfügbarkeit des hinterlegten Stamms keine Erlaubnis zum Durchführen der betreffenden Erfindung in Beeinträchtigung der Patentrechte, die durch die Wirkung der Regierung bewilligt sind, bilden.
  • Die DNA-Sequenz, die das Aminopeptidase zeigende Enzym kodiert, kann z. B. aus dem vorstehend erwähnten hinterlegten Stamm durch Standardverfahren isoliert werden.
  • Es ist zu erwarten, dass eine homologe das Enzym kodierende DNA-Sequenz, d. h. ein analoge DNA-Sequenz von anderen Mikroorganismen erhältlich ist. Zum Beispiel kann die DNA-Sequenz durch ähnliches Screenen einer cDNA-Genbank von anderen Mikroorganismen, insbesondere eines Pilzes wie eines Stamms von Aspergillus sp., insbesondere eines Stamms von A. aculeatus oder A. niger oder eines Stamms von einem anderen Trichoderma sp., insbesondere eines Stamms von T. reesei, T. viride, T. longibrachiatum oder T. koningii oder eines Stamms von einem Fusarium sp., insbesondere eines Stamms von F. oxysporum oder eines Stamms von Humicola sp. abgeleitet sein.
  • In einer anderen Ausführungsform kann die DNA-Sequenz, die ein Aminopeptidaseakitvität zeigendes Enzym kodiert, gemäß weithin bekannten Verfahren günstigerweise aus einer DNA von einer geeigneten Quelle wie eine beliebige der vorstehend erwähnten Organismen durch Verwendung von synthetischen Oligonukleotidsonden, die auf der Basis einer hier offenbarten DNA-Sequenz hergestellt sind, isoliert werden. Zum Beispiel kann eine geeignete Oligonukleotidsonde auf der Basis einer beliebigen der in SEQ ID Nr. 3–5 dargestellten Nukleotidsequenzen oder der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenzen oder einer beliebigen geeigneten Sequenz davon hergestellt werden.
  • Die DNA-Sequenz kann anschließend in einen rekombinanten Expressionsvektor eingefügt werden. Dies kann ein beliebiger Vektor sein, der günstigerweise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen wurde, und die Wahl des Vektors hängt oftmals von der Wirtszelle ab, in welche er eingefügt wurde. Folglich kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor, d. h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit vorliegt, wobei die Replikation davon von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z. B. ein Plasmid sein. In einer anderen Ausführungsform kann der Vektor einer sein, der beim Einfügen in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom integriert und zusammen mit dem Chromosom oder den Chromosomen, in welche er integriert wurde, repliziert ist.
  • Im Vektor sollte die die Aminopeptidase kodierende DNA-Sequenz funktionsfähig mit einer geeigneten Promoter- und Terminator-Sequenz verbunden sein. Der Promoter kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die in der Wirtszelle der Wahl transkriptionale Aktivität zeigt, und kann von Genen abgeleitet sein, die Proteine entweder homolog oder heterolog für die Wirtszelle kodieren. Die Verfahren, die zum Binden der Aminopeptidase kodierenden DNA-Sequenzen verwendet werden, der Promoter bzw. der Terminator und das Einfügen dieser in geeignete Vektoren sind dem Fachmann weithin bekannt (vgl. z. B. Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY).
  • Die Wirtszelle, die mit der das Enzym der Erfindung kodierenden DNA-Sequenz transformiert wird, ist vorzugsweise eine eukaryotische Zelle, insbesondere eine Pilzzelle wie eine Hefe- oder Fadenpilzzelle. Insbesondere kann die Zelle zu einer Spezies von Aspergillus, insbesondere Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger gehören. Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, das Protoplastbildung und Transformation der Protoplasten, gefolgt von Regenerierung der Zellwand in einer an sich bekannten Weise beinhaltet. Die Verwendung von Aspergillus in einem Mikroorganismus ist in EP 238 023 (Novo Nordisk A/S) beschrieben, wobei die Inhalte davon hier unter Bezugnahme eingebracht sind. Die Wirtszelle kann auch eine Hefezelle, z. B. ein Stamm von Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri oder Saccharomyces uvarum, ein Stamm von Schizosaccharomyces sp. wie Schizosaccharomyces pombe, ein Stamm von Hansenula sp. Pichia sp., Yarrowia sp. wie Yarrowia lipolytica oder Kluyveromyces sp. wie Kluyveromyces lactis sein.
  • Ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms der Erfindung
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Enzyms, wobei eine geeignete Wirtszelle mit einer das Enzym kodierenden DNA-Sequenz unter die Herstellung des Enzyms gewährenden Bedingungen gezüchtet werden und das erhaltene Enzym aus der Kultur gewonnen wird.
  • Das zum Züchten der transformierten Wirtszellen verwendete Medium kann jedes beliebige herkömmliche Medium sein, das zum Wachsen der fraglichen Wirtszellen geeignet ist. Die exprimierte Aminopeptidase kann günstigerweise im Kulturmedium sekretiert werden und daraus durch weithin bekannte Verfahren, einschließlich Abtrennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Ausfällen von proteinhaltigen Bestandteilen des Mediums mittels eines Salzes wie Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen Verfahren wie Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen gewonnen werden.
  • Enzymzubereitung
  • In noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Enzymzubereitung, die zum Reduzieren der Bitterkeit von Proteinen und/oder Proteinhydrolysaten für Nahrungsmittel geeignet ist.
  • Die mit einem Enzym der Erfindung angereicherte Enzymzubereitung kann z. B. eine mehrere enzymatische Aktivitäten umfassende Enzymzubereitung wie eine mehrere Enzyme zum Herstellen von Proteinhydrolysaten umfassende Enzymzubereitung sein. Die anzureichernde Zubereitung kann Flavourzyme® (erhältlich von Novo Nordisk A/S) sein. Flavourzyme® ist ein von zur Hydrolyse von Proteinen entwickelter Protease/Peptidase-Komplex sein, der von Aspergillus oryzae abgeleitet ist.
  • Abhängig von der Verwendung, für welche die Enzymzubereitung verwendet werden soll, kann die Aminopeptidase der Erfindung mit einem anderen wie nachstehend erwähnten Enzym kombiniert werden.
  • Im vorliegenden Kontext soll der Begriff „angereichert" anzeigen, dass die Aminopeptidaseaktivität der Enzymzubereitung z. B. um einen Anreicherungsfaktor von mindestens 1,1, vorzugsweise zwischen 1,1 und 10, stärker bevorzugt zwischen 2 und 8, insbesondere zwischen 4 und 6, günstigerweise durch die Zugabe eines durch das vorstehend beschriebene Verfahren angereicherten Enzyms der Erfindung erhöht wurde.
  • In einer anderen Ausführungsform kann die mit einem Aminopeptidaseaktivität zeigenden Enzym angereicherte Enzymzubereitung eine, die ein Enzym der Er findung als enzymatischen Hauptbestandteil umfasst, z. B. eine Einkomponenten-Enzymzubereitung sein.
  • Die Enzymzubereitung kann gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden und in Form einer flüssigen oder trockenen Zubereitung vorliegen. Zum Beispiel kann die Enzymzubereitung in Form eines Granulats oder eines Mikrogranulats vorliegen. Das in die Zubereitung einzuschließende Enzym kann gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren stabilisiert werden.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine Brot verbessernde oder eine Teig verbessernde Zusammensetzung, die eine Aminopeptidase der Erfindung umfasst. Die Zusammensetzung kann ferner Enzyme umfassen, die aus amylolytischen Enzymen wie α-Amylase, β-Amylase, maltogener α-Amylase, Amyloglucosidase, säurestabiler Amylase und 1,6-Pullulanase ausgewählt sind.
  • Solche Enzyme sind von Novo Nordisk A/S als AMGTM (Amyloglucosidase), erhältlich von einem Stamm von Aspergillus niger, FungamylTM (Pilzamylase), erhältlich von einem Stamm von Aspergillus oryzae, NovamylTM (maltogene Amylase), erhältlich von einem Stamm von Bacillus stearothermophilus, erhältlich.
  • Die Zusammensetzung der Erfindung kann auch eine oder mehrere zusätzliche Enzyme umfassen. Beispiele für solche Enzyme schließen eine Zellulase, ein Hemizellulase, eine Pentosanase (die für die Teilhydrolyse von die Ausdehnungsfähigkeit des Teigs erhöhenden Pentosanen nützlich ist), eine Lipase (die zur Modifikation von im Teig oder in Teigbestandteilen vorliegenden Lipiden zum Erweichen des Teiges nützlich ist), eine Peroxidase (die zum Verbessern der Teigkonsistenz nützlich ist), eine Oxidase, z. B. eine Glucoseoxidase, eine Laccase, eine Xylanase, eine Protease (die zur Glutenabschwächung, insbesondere bei Verwendung von Hartweizenteig nützlich ist) ein.
  • Die anderen Enzymbestandteile sind vorzugsweise mikrobiellen Ursprungs und können durch herkömmliche wie vorstehend beschriebene auf dem Fachgebiet verwandte Techniken erhalten werden.
  • Das (die) in der vorliegenden Erfindung zu verwendende(n) Enzym(e) kann (können) in jeder beliebigen zur fraglichen Verwendung geeigneten Form z. B. in Form eines Trockenpulvers oder Granulats, insbesondere eines nicht staubenden Granulats, einer Flüssigkeit, insbesondere einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms vorliegen. Granulate können z. B. wie in US 4,106,991 und US 4,661,452 (beide an Novo Industri A/S) offenbart hergestellt werden und zusätzlich durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren beschichtet sein. Flüssige Enzymzubereitungen können z. B durch Zugabe von nährstoffverträglichen Stabilisatoren wie Zucker, eines Zuckeralkohols oder eines anderen Polyols, von Milchsäure oder einer anderen organischen Säure gemäß etablierten Verfahren stabilisiert werden. Geschützte Enzyme können gemäß dem in EP 238,216 offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Normalerweise ist es für den Einschluss in Vorgemischen oder Mehl vorteilhaft, dass das (die) Enzym(e) in Form eines Trockenprodukts, z. B. eines nichtstaubenden Granulats vorliegt (vorliegen), wohingegen es (sie) für den Einschluss zusammen mit einer Flüssigkeit vorteilhaft in einer flüssigen Form vorliegt (vorliegen).
  • Zusätzlich oder alternativ zu anderen Enzymbestandteilen kann die Teig verbessernde und/oder Brot verbessernde Zusammensetzung ein herkömmlich verwendetes Backmittel, z. B. ein oder mehrere der folgenden Bestandteile umfassen:
    Ein Milchpulver (das die Krustenfarbe liefert), Gluten (zum Verbessern der Gasretentionsleistung von schwachen Mehlen), einen Emulgator (zum Verbessern von Teigausdehnungsfähigkeit und bis zu einem gewissen Grad der Konsistenz des erhaltenen Brots), granuliertes Fett (zur Teigerweichung und für die Konsistenz von Brot), ein Oxidationsmittel (zugegeben zum Verstärken der Glutenstruktur; z. B. Ascorbinsäure, Kaliumbromat, Kaliumiodat oder Ammoniumpersulfat), eine Aminosäure (z. B. Cystein), ein Zucker und Salz (z. B. Natriumchlorid, Calciumacetat, Natriumsulfat oder Calciumsulfat, die zum Verfestigen des Teigs dienen), Mehl oder Stärke. Solche Bestandteile können dem Teig gemäß einem Verfahren der Erfindung direkt zugesetzt werden.
  • Beispiele für geeignete Emulgatoren sind Mono- oder Diglyceride, Diacetylweinsäureester von Mono- oder Diglyceriden, Zuckerester von Fettsäuren, Polyglycerolester von Fettsäuren, Milchsäureester von Monoglyceriden, Essigsäureester von Monoglyceriden, Polyoxyethylenstearate, Phospholipide und Lecithin.
  • Die Brot verbessernde und/oder Teig verbessernde Zusammensetzung der Erfindung ist im Teig typischerweise in einer 0,01–5%, insbesondere 0,1–3% entsprechenden Menge eingeschlossen.
  • Gemäß dem Verfahren der Erfindung, in welchem ein Enzym mit Aminopeptidaseaktivität der Erfindung gegebenenfalls in Kombination mit wie vorstehend beschriebenen anderen Enzymen für die Herstellung von Teig und/oder gebackenen Produkten verwendet wird, kann (können) das (die) Enzym(e) als solches dem Gemisch, aus welchem der Teig hergestellt werden soll, oder einem beliebigen Zusatz, z. B. Mehl, aus welchem der Teig hergestellt werden soll, zugesetzt werden. In einer anderen Ausführungsform kann (können) das (die) Enzym(e) als Bestandteil einer wie vorstehend beschriebenen Teig verbessernden und/oder Brot verbessernden Zusammensetzung entweder dem Mehl oder anderen Teigzusätzen oder direkt dem Gemisch, aus welchem der Teig hergestellt werden soll, zugesetzt werden.
  • Die Dosierung des (der) im Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Enzyms (Enzyme) sollte auf die Natur und Zusammensetzung des fraglichen Teils sowie auf die Natur des (der) zu verwendenden Enzyms (Enzyme) angepasst sein. Gewöhnlich wird die Enzymzubereitung in einer 0,01–1000 mg Enzym protein pro kg Mehl, vorzugsweise 0,1–100 mg Enzymprotein pro kg Mehl, stärker bevorzugt 0,1–10 mg Enzymprotein pro kg Mehl entsprechenden Menge zugesetzt.
  • In Bezug auf Enzymaktivität hängt die geeignete Dosierung eines vorgegebenen Einkomponenten-Enzyms mit Aminopeptidaseaktivität gegebenenfalls in Kombination mit (einem) anderen Enzym(en) zum Ausüben einer gewünschten Verbesserung der Mehl- oder Krustenfarbe eines gebackenen Produkts von dem (den) Enzym(en) und dem (den) fraglichen Enzymsubstrat(en) ab. Die optimale Dosierung kann abhängig von den Mehl- oder Hefearten und den Backverfahren variieren. Der Fachmann kann eine geeignete Enzymdosierungseinheit auf der Basis von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren bestimmen.
  • Jedoch wird erfindungsgemäß das Aminopeptidaseaktivität zeigende Enzym in einer 30 bis 1000 LAPU, vorzugsweise 50 bis 500 LAPU, insbesondere 80 bis 300 LAPU wie etwa 100 LAPU pro kg Mehl entsprechenden Menge zugesetzt. LAPU ist nachstehend definiert.
  • Amylolytische Enzyme werden gewöhnlich mit 1 bis 50 FAU pro kg Mehl zugesetzt. Ein FAU (Fungal α-Amylase Unit; Pilz-α-Amylaseeinheit) ist die Menge, die 5,26 g Stärke (Merck, Amylum solubile Erg. B.6, BAch 9947275) pro Stunde unter Verwendung eines Standardverfahrens zur Bestimmung von α-Amylase-Aktivität von Novo Nordisk spaltet. Eine detaillierte Beschreibung des Analyseverfahrens von Novo Nordisk (AF 216) ist auf Anfrage erhältlich.
  • Maltogene Amylase wird gewöhnlich mit 1 bis 1000 MANU pro kg Mehl (Maltogenic Amylase Novo Units) zugesetzt. Ein MANU ist als die Enzymmenge definiert, die unter Standardbedingungen in mikromol Maltotriose pro Minute hydrolysiert. Das analytische Verfahren (AF 203) ist auf Anfrage erhältlich.
  • Sollen ein oder mehrere zusätzliche Enzymaktivitäten gemäß dem Verfahren der Erfindung zugesetzt werden, können diese Aktivitäten getrennt oder zusammen mit dem Einkomponenten-Enzym mit Exopeptidaseaktivität gegebenenfalls als Bestandteil(e) der Brot verbessernden und/oder Teig verbessernden Zusammensetzung der Erfindung zugesetzt werden. Die anderen Enzymaktivitäten können beliebige der vorstehend beschriebenen Enzyme sein und gemäß etablierter Backpraxis dosiert werden.
  • Wie vorstehend erwähnt wird das Aminopeptidaseaktivität zeigende Enzym gegebenenfalls in Kombination mit (einem) wie vorstehend beschriebenen anderen Enzym(en) zu einem beliebigen Gemisch aus Teigzusätzen, dem Teig oder beliebigen der im Teig einzuschließenden Zusätzen zugesetzt, mit anderen Worten kann (können) das (die) Enzym(e) in einem beliebigen Schritt der Teigherstellung und wie geeignet in einem, zwei oder mehreren Schritten zugesetzt werden.
  • Die Handhabung des Teigs und/oder Backens wird in beliebiger für den Teig und/oder die fragliche Backprodukte geeigneten Weise durchgeführt, was typischerweise die Schritte des Knetens des Teigs, Unterziehen des Teigs einer oder mehreren Gärbehandlungen und Backen des Produkts unter geeigneten Bedingungen, d. h. bei einer geeigneten Temperatur und für eine ausreichende Zeitdauer einschließt. Zum Beispiel kann der Teig unter Verwendung eines Direktteigverfahrens oder eines Sauerteigverfahrens, eines Teigverfahrens über Nacht, eines Niedertemperatur- und Langzeitgärverfahrens, eines Gefrierteigverfahrens, des Chorleywood-Bread-Verfahrens oder des Sponge-and-Dough-Verfahrens hergestellt werden.
  • Der durch das Verfahren der Erfindung hergestellte Teig und/oder das durch das Verfahren der Erfindung hergestellte gebackene Produkt basieren gewöhnlich auf Weizenkleie oder -mehl, gegebenenfalls in Kombination mit anderen Kleie- oder Mehlarten wie Maismehl, Roggenkleie, Roggenmehl, Hafermehl oder -kleie, Sojamehl, Hirsekleie oder -mehl oder Kartoffelkleie oder -mehl.
  • Im vorliegenden Kontext soll der Begriff „gebackenes Produkt" ein beliebiges Produkt einschließen, das aus Teig entweder weichen oder knusprigen Charakters hergestellt ist. Beispiele von gebackenen Produkten entweder weißen, hellen oder dunklen Typs, die vorteilhafterweise durch die vorliegende Erfindung hergestellt werden, sind Brot (insbesondere Weißmehl-, Schrot- oder Roggenbrot), typischerweise in Form von Laiben oder Rollen, französisches Baguette, Pita-Brot, Taccos, Kuchen, Pfannkuchen, Biscuits, Knäckebrot und dergleichen.
  • Der Teig der Erfindung kann ein beliebiger der vorstehend erörterten Typen und frisch oder gefroren sein.
  • Die Zubereitung von gefrorenem Teig ist von K. Kulp und K. Lorenz in „Frozen and Refridgerated Doughs and Batters" beschrieben. Unter Verwendung der Aminopeptidase der Erfindung für gefrorenen Teig sind der Geschmack, die Krustenfarbe und die Knusprigkeit verbessert.
  • Aus der vorstehenden Offenbarung ist klar, dass der Teig der Erfindung gewöhnlich ein Sauerteig oder dem Ansäuern zu unterziehender Teig ist. Der Teig kann auf verschiedene Weise, wie durch Zugabe von Natriumbicarbonat oder dergleichen oder durch Zugabe eines Sauerteigs (Gärteig) angesäuert werden, jedoch ist es bevorzugt, dass der Teig durch Zugabe einer geeigneten Hefekultur wie einer Kultur von Saccharomyces cerevisiae (Backhefe) angesäuert wird. Jede beliebige der im Handel erhältlichen Stämme von S. cerevisiae kann eingesetzt werden.
  • Wie vorstehend erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein Vorgemisch, z. B. in Form einer Mehlzusammensetzung für Teig und/oder aus Teig hergestellte, gebackene Produkte, wobei das Vorgemisch ein Aminopeptidaseaktivität zeigendes Enzym der vorliegenden Erfindung und gegebenenfalls andere wie vorstehend spezifizierte Enzyme umfasst. Das Vorgemisch kann durch Mischen des (der) maßgeblichen Enzyms (Enzyme) oder einer Brot verbessernden und/oder Teig verbessernden Zusammensetzung der Erfindung, die das (die) Enzym(e) mit einem geeigneten Träger wie Mehl, Stärke, einem Zucker oder einem Salz umfasst, hergestellt werden. Das Vorgemisch kann andere Teig verbessernde und/oder Brot verbessernde Zusätze, z. B. einen beliebigen der vorstehend erwähnten, Enzyme einschließenden Zusätze enthalten.
  • Verwendung der Aminopeptidase mit 35 kDa der Erfindung
  • Verwendung des Enzyms der Erfindung zur Herstellung von gebackenen Produkten
  • Das Enzym oder eine Enzymzubereitung der Erfindung kann beim Backen, z. B. zum Abschwächen der Glutenbestandteile von Mehl zum Erweichen von so genanntem harten Mehl verwendet werden.
  • Jedoch wurde überraschend gefunden, dass die Aminopeptidase der Erfindung das Netzwerk des Glutens nicht zersetzt, was normalerweise bei Verwendung von Proteasen zum Herstellen von gebackenen Produkten beobachtet wird. Demzufolge werden die Teigeigenschaften und die Krümelstruktur nicht beeinflusst.
  • Ferner werden bei Zugabe der Aminopeptidase mit 35 kDa der Erfindung zu dem Teig oder den Teigzusätzen beim Herstellen von gebackenen Produkten wie in Beispiel 13 dargestellt der Geschmack, die Krustenfarbe und/oder die Krümelstruktur und/oder die Krustenfarbe eines gebackenen Produkts wesentlich verbessert.
  • Ferner verbessert das Enzym der Erfindung die Teigklebrigkeit.
  • Die Zugabe des Enzyms der Erfindung führt zu gebackenen Produkten mit einem hefeartigen Geschmack, wodurch ein „frisch gebackener" Brotgeruch bereitgestellt wird. Dies macht die Erfindung für das Sponge-Dough-System, in welchem eine Zugabe des Enzyms die Vorteig-Gärungszeit ohne begleitenden Verlust von hefeartigem Geschmack reduzieren kann, und dem Nullzeit-Teigverfahren (dem häufigsten europäischen Verfahren), in welchem das Enzym einen hefeartigen Geschmack bereitstellen kann, der sonst normalerweise bei durch solche Verfahren hergestellten Produkten fehlt, besonders interessant.
  • Ohne auf eine Theorie beschränkt zu sein, wird gegenwärtig angenommen, dass ein weiter verbesserter Geschmack und/oder eine weiter verbesserte Krustenfarbe eines gebackenen Produkts erhalten werden kann, wenn ein Einkomponenten-Enzym mit Exopeptidaseaktivität in Kombination mit einem amylolytischen Enzym, insbesondere einem amylolytischen Enzym, das reduzierende Zuckermoleküle von Mehl oder anderen Bestandteilen des Teils freisetzen kann, verwendet wird. Die erhöhte Menge an reduzierenden Zuckern im Teig stellt eine Erhöhung hinsichtlich während des Backens stattfindenden Maillard-Reaktionen bereit, wodurch der Geschmack und die Krustenfarbe des gebackenen Produkts weiter verbessert werden.
  • Verwendung des Enzyms der Erfindung zum Reduzieren von bitterem Geschmack
  • Das Enzym oder die Enzymzubereitung der Erfindung kann zum Reduzieren der Bitterkeit von Proteinen und/oder Proteinhydrolysaten für Nahrungsmittel verwendet werden.
  • Erfindungsgemäß auch berücksichtigt wird die Herstellung von freien Aminosäuren aus Proteinen und/oder Proteinhydrolysaten. Im Falle der freien Aminosäure wie Glutaminsäure wird der Geschmack des Nahrungsmittelprodukts erhöht.
  • Das Protein oder Proteinhydrolysat kann tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist das zu hydrolysierende Protein Casein oder Sojaprotein.
  • Das Protein kann zum Herstellen von Nahrungsmitteln wie Käse und kakaohaltigen Nahrungsmitteln verwendet werden.
  • Obwohl die Aminopeptidase und die mit einem Enzym der Erfindung angereicherten Enzymzubereitungen in Verbindung mit der Herstellung von Proteinen oder Proteinhydrolysate ohne bitteren Geschmack besonders vorteilhaft verwendet werden können, kann die Aminopeptidase der Erfindung für eine Anzahl von industriellen Anwendungen, einschließlich Zersetzung oder Modifikation von proteinhaltigen Substanzen wie Zellwänden verwendet werden. Einige Proteine, wie Extensine sind Bestandteile von Pflanzenzellwänden. Aminopeptidasen erleichtern deshalb die Zersetzung oder Modifikation von Pflanzenzellwänden.
  • Die Dosierung der Enzymzubereitung der Erfindung und andere Bedingungen, unter welchen die Zubereitung verwendet wird, können auf der Basis von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren bestimmt werden.
  • Ölextraktion von Pflanzen
  • Die erfindungsgemäße Enzymzubereitung kann zur Extraktion von Öl aus Pflanzenquellen wie Oliven und Raps oder zur Herstellung von Saft aus verschiedenen Früchten wie Äpfeln, Birnen und Zitrusfrüchten verwendet werden. Sie kann auch in der Weinindustrie, insbesondere der Weißweinindustrie zum Verhindern von Trübungsbildung nützlich sein. Weiterhin kann sie zum Modifizieren und Zersetzen von Proteinen, z. B. zum Reduzieren der von Proteinen verursachten oder teilweise verursachten Viskosität oder zum Erleichtern von Gärverfahren, bei welchen Proteine beteiligt sind, oder zum Verbessern der Verdauungsfähigkeit von Proteinen und anderen Nährstoffen verwendet werden.
  • Die Verwendung zur Herstellung von Nahrungsmitteln und Futter
  • Die Aminopeptidasezubereitung kann auch in der Nahrungsmittel- und Futterindustrie zum Verbessern der Verdauungsfähigkeit von Proteinen verwendet werden. Zum Beispiel kann das Enzym oder die Enzymzubereitung Tierfutter zugesetzt werden oder zum Verarbeiten von Tierfutter, insbesondere Futter für Schweine oder Gänse verwendet werden.
  • Ferner kann das Enzym oder die Enzymzubereitung der Erfindung zum Herstellen von Proteinhydrolysaten z. B. aus Pflanzenproteinen wie Soja-, Erbsen-, Lupinen- oder Rapssamenprotein, milchähnlichem Casein, Fleischproteinen oder Fischproteinen nützlich sein. Die Aminopeptidase kann für Proteinhydrolysate zum Verbessern der Löslichkeit, Konsistenz oder Gärfähigkeit, zum Reduzieren von Antigenizität oder für andere Zwecke zum Herstellen von Nahrungsmitteln, Futter oder medizinischen Produkten verwendet werden. Die Aminopeptidase kann allein oder zusammen mit anderen Aminopeptidasen oder zusammen mit andern Enzymen wie Exopeptidasen verwendet werden. Die Verwendung der Aminopeptidase der Erfindung zusammen mit Exopeptidase-reichen Enzymzubereitungen verbessert den Geschmack der Proteinhydrolysate.
  • Weiterhin kann das Enzym oder die Enzymzubereitung bei der Verarbeitung von Fisch oder Fleisch, z. B. zum Ändern der Textur und/oder Viskosität verwendet werden.
  • Verwendung in Brauverfahren
  • Die Enzymzubereitung kann auch zum Erleichtern der Gärverfahren wie Hefegärung von Gerste, Malz und anderen Rohstoffen zur Herstellung z. B. von Bier verwendet werden.
  • Verwendung zur Protoplastherstellung
  • Die Enzymzubereitung kann zur Protoplastherstellung aus Pilzen nützlich sein.
  • Verwendung zur Peptidherstellung
  • Die Enzymzubereitung kann zur Herstellung von Peptiden aus Proteinen nützlich sein, wo es vorteilhaft ist, ein geklontes Enzym zu verwenden, das im Wesentlichen frei von anderen proteolytischen Aktivitäten ist.
  • Verwendung zur Zersetzung von Proteinen
  • Ferner kann die Aminopeptidasezubereitung zum Zersetzen von Protein zur Erleichterung der Reinigung oder Verbessern von verschiedenen Produkten wie bei der Reinigung oder Verbessern von Gummis wie Guarkernmehl, Xanthangummi, Entbasten von Seide oder Verbessern der Qualität von Wolle verwendet werden.
  • Verwendung zur Reinigung von Kontaktlinsen
  • Ferner kann das Enzym oder die Enzymzubereitung zum Reinigen von Kontaktlinsen verwendet werden.
  • Die Erfindung ist in weiterem Detail in den folgenden Beispielen beschrieben, die den beanspruchten Umfang der Erfindung in keiner Weise beschränken sollen.
  • VERFAHREN UND MATERIALIEN
  • Materialien
  • Donor-Organismus
    • Aspergillus oryzae A01568 (beschrieben in US Patent Nr. 3,914,436)
  • Wirtsorganismus
    • Escherichia coli MC1061 (Meissner et al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 4171–4176: cDNA Genbank-Stamm
    • Saccharomyces cerevisiae W3124 (van den Hazel et al., (1992), Eur. J. Biochem., 207, 277–283): Aktivitätsscreening-Stamm
    • Schizosaccharomyces pombe: Bröker et al., (1989), FEES Letters, 248, 105–110.
  • Andere Organismen
    • Aspergillus oryzae A1560 (Christensen et al. (1988), Bio/technology 6, 1419–1422).
  • Plasmide
    • pYES 2,0: Transformationsvektor (Invitrogen).
    • PHD 414: Aspergillus Expressionsvektor ist ein Derivat des Plasmids p775 (beschrieben in EP 238,023 ). Die Konstruktion des pHD414 ist ferner in WO 93/11249 beschrieben. pHD414 enthält den Glucoamylaseterminator von A. niger und den TAKA-Amylasepromoter von A. oryzae.
    • pHD423 ist ein Derivat von pHD414 (beschrieben in WO 94/20611) mit einem neuen Polylinker.
    • pUC18: Expressionsvektor (Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).
    • pC1EXP3: Plasmid, umfassend die cDNA-Einfügung mit 1,4 kb, welche die Aminopeptidase mit 35 kDa der Erfindung kodiert. (Siehe Beispiel 3 und SEQ ID Nr. 1).
    • pC1EXP4: Plasmid, umfassend eine cDNA-Sequenz, die um 120 bp kürzer ist als die cDNA-Einfügung pC1EXP3 mit 1,4 kb. (siehe Beispiel 10 und SEQ ID Nr. 12).
    • p3SR2: Das amdS+-Gen von A. nidulans tragendes Plasmid (Christensen et al., (1988), Bio/Technology 6, 1419–1422).
    • PP1: Hefeexpressionsvektor, der ein Pendelvektor von E. coli/S. pombe, enthaltend den ADH-Promoter und URA 3 als selektive Markierung, ist (Broker et al., (1989), FEBS Letters, 248, 105–110).
  • Primer
    • Universale pUC-Primer (Sambrook et al., (1989), vorstehend).
  • Abgeleitete Primersequenzen, verwendet in PCR-Reaktionen
  • s2
    • 5'- GAR ACI GTI CAR AAY CTI AT -3'
  • s3
    • 5'- GAY AAR AAR AAY TTY GAW ACI GT -3'
  • as1
    • 5'- TCI ACR TTR TCI GTI ATI ATY TCI AT -3'
    • (s = sense, as = Anti-Sense)
    • A = Adenin
    • G = Guanin
    • C = Cytosin
    • T = Thymin
    • I = Deoxyinosin
    • Y = C oder T
    • R = A oder G
    • W = A oder T
  • Vorwärts- und Rückwärts-pYES-Primer (Invitrogen)
  • Enzyme
    • Lysin-specifische Protease
    • Novozym® 234 (Novo Nordisk A/S)
    • Alcalase® (Novo Nordisk A/S)
    • Neutrase® (Novo Nordisk A/S)
  • Peptide der Aminopeptidase mit 35 kDa
    • (siehe SEQ ID Nr. 6–11)
  • N-terminal
  • Direktes N-terminales Sequenzieren von authentischen und rekombinanten Aminopeptidasen zeigte dieselbe N-terminale Aminosäuresequenz für die beiden Enzyme, was zeigte, dass das rekombinante Enzym proteolytisch mit dem authentischen Enzym identisch verarbeitet ist. Die gefundene N-terminale Sequenz war
    Figure 00320001
    (Xaa ist ein glycosylierter Asn-Rest)
  • Die folgende Peptidsequenz wurde aus Peptiden erhalten, die von einer S-carboxymethylierten Probe der Aminopeptidase durch Spaltung mit einer Lysyl-spezifischen Protease erhalten wurde. Peptid 1
    Figure 00330001
    Peptid 2
    Figure 00330002
    Peptid 3
    Figure 00330003
    Peptid 4
    Figure 00330004
    Peptid 5
    Figure 00330005
    (überdeckt und Erweitert die N-terminale Sequenz).
  • Medien und andere Materialien
    • STC: 1,2 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM CaCl2
    • BSA (Sigma, Typ H25)
    • Leucin-7-amido-4-methylcumarin (Sigma)
    • PEG 4000 (Polyethylenglycol, Molekulargewicht = 4000)
    • (BDH, England)
    • Sequenase®-Bausatz (United Stated Biochemical, USA)
    • Hybond-N-Nylon-Membran (Amersham, USA)
    • Q-Sepharose (Pharmacia Tm)
    • Superdex 200 Tm
    • Amicon-Membran
    • VG Analytical TofSpec
    • α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (Aldrich, Steinheim, Germany).
    • YPD: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H2O auf 810 ml. 90 ml, im Autoklaven behandelte, 20%ige Glucose (steril filtriert) wurde zugesetzt.
    • 10 × Basalsalz: 66,8 g Hefestickstoffbase, 100 g Bernsteinsäure, 60 g NaOH, H2O auf 1000 ml, steril filtriert.
    • SC-URA: 90 ml 10 × Basaltsalz, 22,5 ml 20%ige Casaminosäuren, 9 ml 1%iges Tryptophan, H2O auf 806 ml, im Autoklaven behandelt, 3,6 ml 5%iges Threonin und 90 ml 20%ige Glukose oder 20%ige Galaktose wurden zugesetzt.
    • SC-H Brühe: 7,5 g/l Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 11,3 g/l Bernsteinsäure, 6,8 g/l NaOH, 5,6 g/l Casaminosäuren ohne Vitamine, 0,1 g/l Tryptophan. Im Autoklaven für eine Dauer von 20 Minuten bei 121°C behandelt. Nach der Behandlung im Autoklaven wurden 10 ml einer 30%igen Galaktoselösung, 5 ml einer 30%igen Glucoselösung und 0,4 ml einer 5%igen Threoninlösung pro 100 ml Medium zugesetzt.
    • SC-H Agar: 7,5 g/l Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 11,3 g/l Bernsteinsäure, 6,8 g/l NaOH, 5,6 g/l Casaminosären ohne Vitamine, 0,1 g/l Tryptophan und 20 g/l Agar (Bacto). Im Autoklaven für eine Dauer von 20 Minuten bei 121°C behandelt. Nach dem Behandeln im Autoklaven wurden 55 ml einer 22%igen Galaktoselösung und 1,8 ml einer 5%igen Threoninlösung pro 450 ml Agar zugesetzt.
    • YNB-1 Agar: 3,3 g/l KH2PO4, 16,7 g/l Agar, pH-Wert eingestellt auf 7. Im Autoklaven für eine Dauer von 20 Minuten bei 121°C behandelt. Nach dem Behandeln im Autoklaven wurden 25 ml einer 13,6%igen Hefestickstoffbase ohne Ami nosäuren, 25 ml einer 40%igen Glukoselösung, 1,5 ml einer 1%igen L-Leucinlösung und 1,5 ml einer 1%igen Histidinlösung pro 450 ml Agar zugesetzt.
    • YNB-1 Brühe: Zusammensetzung wie YNB-1-Agar, jedoch ohne den Agar.
    • Minimalplatten: (Cove Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51–56), enthaltend 1,0 M Saccharose, pH 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl.
    • Weizenproteinhydrolysat: Weizen, hydrolysiert mit Alcalase® und Neutrase® wurde mit Wasser verdünnt, bis der Proteingehalt 8 Gew.-% der Gesamtlösung betrug.
  • Verfahren
  • RNA-Isolierung
  • Die gesamte RNA wurde aus gefrorenem, gepulvertem Mycelium von A. oryzae A01568, durch Extraktion mit Guanidiniumthiocyanat, gefolgt von Ultrazentrifugation durch einen 5,6 M CsCl-Puffer (Chirgwin et al., (1979), Biochemistry 18, 5294–5299) hergestellt. Die Poly(A)+-RNA wurde durch Oligo(DT)-Zelluloseaffinitätschromatographie (Aviv, H, und Leder, P., (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 1408–1412) durchgeführt.
  • cDNA-Synthese
  • Doppelstrang-cDNA wurde aus 5 μg Aspergillus oryzae Poly(A)+RNA wie von Kofod et al., J. of Biol. Chem., (1994), 269, 29182–29189 beschrieben synthetisiert, außer das 25 ng statistischer Hexanukleotid-Primer (Pharmacia, Sweden) in der Synthese des ersten Strangs eingeschlossen wurden.
  • Konstruktion von cDNA-Genbank
  • Die cDNA-Genbank wurde wie von Kofod et al., J. of Biol. Chem., (1994), 269, 29182–29189 beschrieben konstruiert.
  • Transformation von Saccharomyces cerevisiae
  • Zur Sicherstellung, das alle Bakterienklone in Hefe getestet wurden, wurde eine Anzahl von Hefe-Transformanten 5 Mal größer als die Anzahl an Bakterienklone in den ursprünglichen Pools als die Grenze eingestellt.
  • Ein μl Aliquote von gereinigter Plasmid-DNA (100 ng/μl) von einzelnen Pools wurden in 40 μl kompetentem S. cerevisiae-Zellen (OD600 = 1,5 in 500 ml YPD) elektrophoriert (200 Ω, 1,5 kV, 24 μF), zweimal in kaltem destilliertem Wasser, einmal in kaltem 1 M Sorbit gewaschen, in 0,5 ml 1 M Sorbit, Becker & Guarante, 1991) resuspendiert. Nach Zugabe von 1 ml 1 M kaltem Sorbit wurden unter Erhalt von 250–400 c. f. u./Platte 80 μl Aliquote auf SC + Glucose-Uracil aufgetragen und bei 30°C für eine Dauer von 3–5 Tagen inkubiert.
  • Transformation von Schizosaccharomyces pombe
  • Schizosaccharomyces pombe wurde wie von Bröker, (1987) BioTechniques, 5, 51–517 beschrieben transformiert.
  • Reinigung von Aminopeptidase mit 35 kDa von Aspergillus oryzae
  • Ein Gramm gefriergetrocknetes Pulver des Gärüberstands von Aspergillus oryzae A015068 wurde in 100 ml Trisacetatpuffer (25 mM, pH 8) gelöst. Die Ionenstärke betrug 2 mSi. Die Suspension wurde durch einen Milliporenfilter mit 45 μm filtriert. Die filtrierte Lösung wurde auf eine Anionenaustauschchromatographiesäule mit 200 ml, die mit mit dem Trisacetatpuffer äquilibrierter Q-Sepharose bepackt war, aufgebracht. Alkalische Protease, die eine Hauptendoprotease mit einem isoelektrischen Punkt von 8 ist, wurde im Ausfluss aufgefangen. Die Säule wurde mit dem Trisacetatpuffer gewaschen, bis kein UV-Absorptionsmaterial mehr im Ausfluss vorlag.
  • Die gebundenen Proteine wurden mit einem linearen Salzgradienten unter Verwendung von 0 bis 0,5 M NaCl im Trisacetatpuffer (pH 8) unter Verwendung von 10 Säulenvolumen mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/Minute eluiert. Aminopeptidaseaktivität enthaltende Fraktionen (siehe nachstehend) wurden in Pools aufgefangen und gegen Trisacetatpuffer (25 mM, pH 6) dialysiert.
  • Der Aktivität enthaltende dialysierte Pool wurde auf einen pH-Wert von 6 und eine Ionenstärke von 2 mSi eingestellt und auf eine mit 25 mM Trisacetatpuffer (pH 6) für Anionenaustauschchromatographie äquilibrierte Hochleistungs-Q-Sepharosesäule aufgebracht. Die Säule wurde dann gewaschen, bis das UV-absorbierende Material im Ausfluss unter 0,05 bei 280 nm lag. Die gebundene Aktivität wurde dann mit 20 Säulenvolumen linearem Salzgradienten von 0 bis 0,5 M NaCl mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Minute eluiert. Aminopeptidaseaktivität enthaltende Fraktionen wurden in Pools aufgefangen und durch Ultrafiltration unter Verwendung von 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 6) eingeengt.
  • Zwei Milliliter des Aminopeptidaseaktivität enthaltenden eingeengten Pools wurden auf eine mit 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 6), enthaltend 0,1 M NaCl, äquilibrierten Superdex-200-Tm-Säule aufgebracht. Die Gelfiltration wurde unter Verwendung einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute durchgeführt. Aminopeptidaseaktivität enthaltende Proben wurden in Pools aufgefangen und durch Ultrafiltration unter Verwendung von Amicon-Membran mit einem Abschnittswert von 10 kDa eingeengt.
  • Aminosäuresequenzbestimmung von N-terminalen und inneren Peptiden der Aminopeptidase von Aspergillus oryzae
  • S-carboxymethylierte Proben der gereinigten ursprünglichen Aminopeptidase werden mit Lysyl-spezifischer Protease aufgeschlossen und die erhaltenen Peptide durch Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) abgetrennt und wie von Matsudaira, A Practical Guide to Protein and Peptide Purification für Microsequencing, 3–88, Academic Press Inc, San Diego, CA, in einem Sequenzierer von Applied Biosystems 473A gemäß den Anweisungen des Herstellers (Applied Biosystems) sequenziert.
  • Die Reagenzien und die Lösungsmittel für das Sequenzieren von Aminosäuren sind von Applied Biosystems (Foster City, CA).
  • Bezeichnen von PCR-Primern
  • Die PCR-Primer wurden wie von Kofod et al., J. of Biol. Chem., (1994), 269, 29182–29189 beschrieben bezeichnet.
  • Bildung einer cDNA-Sonde für eine Aminopeptidase unter Verwendung von PCR
  • Ein μg Doppelstrangplasmid-DNA von einem cDNA-Genbankpool wurde unter Verwendung von 500 pmol von jedem der aufgeschlossenen Primer in Kombination mit 500 pmol pYES 2,0 Polylinkerprimer (vorwärts und rückwärts), eines DNA-Wärmeumläufers (Landgraf, Deutschland) und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin-Elmer) amplifiziert.
  • Dreißig PCR-Zyklen wurden unter Verwendung eines Denaturierungs-Zyklusprofils bei 94°C für eine Dauer von 1 Minute, Abkühlen auf 55°C für eine Dauer von 2 Minuten und Erwärmen auf 72°C für eine Dauer von 3 Minuten durchgeführt.
  • Dideoxyketten-Terminierungsverfahren
  • Das Verfahren wurde wie von Anger et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463–5467 unter Verwendung des Sequenase®-Bausatzes und von universellen pUC-Primern durchgeführt.
  • Charakterisierung von positiven cDNA-Klonen durch Southern-Blot-Analyse
  • Die positiven Klone wurden durch die Verwendung von Southern-Blot-Hybridisierung unter Verwendung des statistisch-primierten, 32P-markierten PCR-Produkts mit 0,5 kb oder der Aminopeptidase mit 35 kDa als Sonde charakteri siert. Die Hybridisierungen wurden in 2 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5% (g/v) SDS, 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA für eine Dauer von 48 Stunden bei 65°C durchgeführt, gefolgt von hoch strengem Waschen mit hoher Strenge in 2 × SSC (2 × 15 Minuten), 2 × SCC, 0,5% SDS (30 Minuten), 0,2 × SSC, 0,5% SDS (30 Minuten) und schließlich in 2 × SSC (15 Minuten) bei 65°C (Sambrook et al. (1989), vorstehend).
  • Elektrophorese
  • Die Elektrophorese wurde auf einem 0,7%igen Agarosegel von SeaKem, FMC durchgeführt.
  • Kapillarblotten
  • Das Kapillarblott-Verfahren ist von Sambrook et al., (1989), vorstehend, unter Verwendung von SSC als Transferpuffer beschrieben.
  • Höchstgründliche Waschungen von hybridisierten Klonen
  • Das Waschen wurde in 2 × 15 Minuten in 2 × SSC, 2 × 30 Minuten in 0,1 × SSC, 0,5% SDS und 15 Minuten in 2 × SSC bei 65°C durchgeführt.
  • Transformation von Aspergillus oryzae
  • Die Transformation von Aspergillus oryzae wurde wie von Christensen et al., (1988), Biotechnology 6, 1419–1422 beschrieben durchgeführt.
  • Konstruktion der Aminopeptidase-Expressionskassette für Aspergillus
  • Plasmid DNA wurde aus den positiven Klonen von E. coli unter Verwendung von Standardverfahren isoliert und durch Restriktionsenzymanalyse analysiert. Die cDNA-Einfügung wurde unter Verwendung von geeigneten Restriktionsanalysen exzidiert und in einen Aspergillus-Expressionsvektor gebunden.
  • Transformation von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger
  • Allgemeines Verfahren
  • 100 ml YPD (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) werden mit Sporen von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger geimpft und unter Schütteln bei 37°C für eine Dauer von etwa 2 Tagen inkubiert. Das Myzelium wird durch Filtration durch Miracloth geerntet und mit 200 ml 0,6 M MgSO4 gewaschen. Das Myzelium wird in 15 ml 1,2 M MgSO4, 10 mM NaH2PO4, pH = 5,8 suspendiert. Die Suspension wird auf Eis gekühlt und 1 ml Puffer, enthaltend 120 mg Novozym® 234, wird zugesetzt. Nach 5 Minuten wird 1 ml 12 mg/ml BSA zugesetzt und die Inkubation unter sanftem Rühren für eine Dauer von 1,5–2,5 Stunden bei 37°C fortgeführt, bis eine große Anzahl an Protoplasten in einer unter dem Mikroskop betrachteten Probe sichtbar ist.
  • Die Suspension wird durch Miracloth filtriert, das Filtrat in ein steriles Röhrchen überführt und mit 5 ml 0,6 M Sorbit, 100 mM Tris-HCl, pH = 7,0 überschichtet. Die Zentrifugation wird für eine Dauer von 15 Minuten bei 100 g durchgeführt und die Protoplaste vom oberen Teil des MgSO4-Puffers aufgefangen. 2 Volumen STC werden der Protoplastsuspension zugesetzt, und das Gemisch wird für eine Dauer von 5 Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Das Protoplastpellet wird in 3 ml STC resuspendiert und davon wieder ein Pellet gebildet. Dies wird wiederholt.
  • Schließlich werden die Protoplaste in 0,2–1 ml STC resuspendiert.
  • 100 μl Protoplastsuspension wird mit 5–25 μg der geeigneten DNA in 10 μl STC gemischt. Die Protoplaste werden mit p3SR2 (ein amdS-Gen von A. nidulans tragendes Plasmid) gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für eine Dauer von 25 Minuten stehen gelassen. 0,2 ml 60%iges PEG 4000, 10 mM CaCl2 und 10 MM Tris-HCl, pH 7,5 werden zugesetzt und vorsichtig gemischt (zweimal), und schließlich werden 0,85 ml derselben Lösung zugesetzt und vorsichtig gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für eine Dauer von 25 Minuten stehen gelassen, bei 2500 g für eine Dauer von 15 Minuten gedreht und das Pellet in 2 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert. Nach nochmaliger Abscheidung werden die Protoplaste auf die geeigneten Platten gesprüht. Die Protoplaste werden auf Minimalplatten gesprüht, um Hintergrundwachstum zu hemmen. Nach Inkubation für eine Dauer von 4–7 Tagen bei 37°C werden die Sporen aufgesammelt und für Einzelkolonien ausgestreut. Dieses Verfahren wird wiederholt und die Sporen einer Einzelkolonie nach der zweiten Reisolierung als definierter Transformant aufbewahrt.
  • Reinigung der Transformanten von Aspergillus oryzae
  • Kolonien von Aspergillus oryzae werden durch Konidial-Sporen auf AmdS+-Platten (+0,01% Triton X-100) gereinigt, und man lässt sie in YPM für eine Dauer von 3 Tagen bei 30°C wachsen.
  • Identifizierung von Aminopeptidase-positiven Transformanten von Aspergillus oryzae
  • Die Überstände der Transformanten von Aspergillus oryzae wurden auf Aminopeptidase auf Agarplatten, die mit 60 μg/ml Leucin-7-amido-4-methylcumarin überschichtet waren, geprüft. Positive Transformanten wurden durch Analysieren der Platten durch Fluoreszenz unter UV-Licht nach 5-minütiger bis 2-stündiger Inkubation bei 30°C identifiziert.
  • SDS-PAGE-Analyse
  • SDS-PAGE-Analyse des Überstands eines Aminopeptidase von Aspergillus oryzae erzeugenden Transfomanten.
  • Man ließ den Transformanten in 5 ml YPM für eine Dauer von 3 Tagen wachsen. 10 μl Überstand wurden auf 12%igem SDS-Polyacrylamidgel aufgebracht, was anschließend mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt wurde.
  • Massenspektrometrie
  • Die Massenspektrometrie wird unter Verwendung von Matrix-unterstützter Laserdesorptionionisierungs-Time-of-Flugmassenspektrometrie in einem VG- Analytischen TofSpec durchgeführt. Für die Massenspektrometrie werden 2 μl Probe mit 2 μl gesättigter Matrixlösung (α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure in 0,1% TFA : Acetonitril (70 : 30)) und 2 μl des auf den Zielplatte platzierten Gemischs gemischt. Vor dem Einbringen in das Massenspektrometer wurde das Lösungsmittel durch Abdampfen entfernt. Die Proben werden desorbiert und durch 4 ns Laserpulse (337 nm) mit einer Grenzwert-Laserleistung ionisiert und in das feldfreie Flugröhrchen mit einer Beschleunigungsspannung von 25 kV beschleunigt. Ionen wurden durch Mikrokanalplatten-Einstellung bei 1850 V nachgewiesen. Das Spektrum wird extern mit Proteinen von bekannter Masse kalibriert.
  • Immunologische Kreuzungsreaktivität
  • Bei der Bestimmung von immunologischer Kreuzungsreaktivität zu verwendende Antikörper können unter Verwendung einer gereinigten Aminopeptidase hergestellt werden. Spezieller kann Antiserum gegen die Aminopeptidase der Erfindung durch Immunisieren von Kaninchen (oder anderen Nagern) gemäß dem von N. Axelsen et al. in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23, oder A. Johnstone und R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (Spezieller Seiten 27–31) beschriebenen Verfahren erhoben werden. Gereinigte Immunglobuline können von den Antiseren z. B. durch Salzausfälllung ((NH4)2SO4) gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie, z. B. auf DEAE-Sephadex erhalten werden. Die immunchemische Charakterisierung von Proteinen kann entweder durch Outcherlony-Doppeldiffusionsanalyse (O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, Seiten 655–706), durch Kreuzungsimmunelektrophorese (N. Axelsen et al., vorstehend, Kapitel 3 und 4) oder durch Rocket-Immunelektrophorese (N. Axelsen et al., Kapitel 2) durchgeführt werden.
  • Southern-Blot-Analyse
  • Genomische DNA von A. oryzae wird gemäß Yelton et al., (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81., Seite 1470–1474, isoliert und zur Vollendung mit BamHI, BglII, EcoRI und HindIII (10 μg/Probe) aufgeschlossen, auf einem 0,7%igen Agarosegel fraktioniert, denaturiert und auf einen Nylonfilter (Hybond-N) unter Verwendung von 10 × SSC als Transferpuffer (Southern, E. M., (1975), J. Mol. Biol. 98, Seite 503–517) geblottet. Die Aminopeptidase cDNA wird durch statistisches Primieren 32P-markiert (> 1 × 109 cpm/μg) und als Sonde in der Southern-Analyse verwendet. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind in der RNA-Gel-Blot-Analyse beschrieben. Der Filter wird bei –80°C für eine Dauer von 12 Stunden autoradiographiert.
  • RNA-Gel-Blot-Analyse
  • Poly(A)+-RNA (1 μg) von A. oryzae wird in 1,2%igen Agarose- 2,2 M Formaldehydgelen (Thomas, P. S., (1983) Methods Enzymol. 100, Seiten 255–2663) elektrophoresiert und auf eine Nylonmembran (Hybond-N) mit 10 × SSC als Transferpuffer geplottet. Die Aminopeptidase-cDNA wird durch statistisches Primieren 32P-markiert (> 1 × 109 cpm/μg ) und auf der Membran für eine Dauer von 18–20 Stunden bei 65°C in 5 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5% SDS (g/v) und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA hybridisiert. Der Filter wird in 5 × SSC bei 65°C (2 × 15 Minuten), 2 × SSC, 0,5% SDS (1 × 30 Minuten), 0,2 × SSC, 0,5% SDS (1 × 30 Minuten) und 5 × SSC (2 × 15 Minuten) gewaschen. Der Filter wird bei –80°C für eine Dauer von 12 Stunden autoradiographiert.
  • Bestimmung von Aminopeptidaseaktivität (LAPU)
  • Ein LAPU ist als die Enzymmenge definiert, die 1 μmol L-Leucin-p-nitroanilid pro Minute unter Verwendung des in AF 298/1-GB (erhältlich auf Anfrage von Novo Nordisk A/S) beschriebenen Verfahrens hydrolysiert.
  • Prozentuale DH-Bestimmung auf der Basis von THBS-Analyse
  • Der Proteinhydrolysegrad kann durch den erzielten Hydrolysegrad bestimmt werden. Im Kontext dieser Erfindung ist der Hydrolysegrad (DH) durch die folgende Formel definiert:
    Figure 00440001
    h ist die Anzahl der hydrolysierten Peptidbindungen und hgesamt ist die Gesamtzahl an Peptidbindungen im Protein. hgesamt ist abhängig von der Rohmaterialart, wohingegen h als Funktion von meqv-Leucin NH2, gemessen z. B. durch TNBS-Analyse, ausgedrückt werden kann.
  • Die Bestimmung von %ualem DH ist in EF-9415317 (erhältlich auf Anfrage von Novo Nordisk A/S) beschrieben.
  • Test von Teigen und Broten
  • Erfindungsgemäß kann die Wirkung der Zugabe eines Einkomponenten-Enzyms mit Aminopeptidaseaktivität in Teigen und Broten unter Verwendung des folgenden Verfahrens getestet werden:
  • Herstellung von Broten
  • Verfahren
    • 1. Mischen des Teiges (Spiralmischer) 3 Min. bei 700 UpM 5 Min. bei 1400 UpM wobei die Mischzeit vorherbestimmt ist und von einem sachkundigen Bäcker auf der Basis des verwendeten Mehls so eingestellt ist, dass eine optimale Teigkonsistenz unter den verwendeten Testbedingungen erhalten wird.
    • 2. 1. Nachweis: 30°C–80% RH, 15 Min.
    • 3. Abmessen und Formen;
    • 4. Ruhen lassen für eine Dauer von 5 Minuten bei Umgebungstemperatur;
    • 5. Endgärung: 32°C–80% RH, 45 Minuten für Rollen, 55 Minuten für Brot;
    • 6. Backen: 225°C, 22 Minuten für Rollen und 30 Minuten für Laibe.
  • Bewertung von Teig und gebackenen Produkten
  • Teig und gebackene Produkte können wie folgt bewertet werden:
  • Laib-spezifisches Volumen
  • Der Mittelwert der Volumina von 4 Laiben wird unter Verwendung des traditionellen Rapssamenverfahrens gemessen. Das spezifische Volumen wird als Volumen ml pro g Brot berechnet. Das spezifische Volumen der Kontrolle (ohne Enzym) wird als 100 definiert. Der relative spezifische Volumenindex wird berechnet als:
  • Figure 00450001
  • Die Teigklebrigkeit und Krümelstruktur kann visuell gemäß der folgenden Tabelle bewertet werden: Teigklebrigkeit
    fast flüssig 1
    zu klebrig 2
    klebrig 3
    annehmbar 3,5
    normal 4
    trocken 5
    Krümelstruktur
    sehr schlecht 1
    schlecht 2
    ungleichmäßig 3
    gleichmäßig/gut 4
    sehr gut 5
  • Schlagtest
  • Nach dem zweiten Gären wird eine den Teig enthaltende Pfanne von einer Höhe von 20 cm fallen gelassen. Der Teig wird gebacken und das Volumen des erhaltenen Brotes bestimmt. Hefeartiger Geschmack
    wie Kontrolle 3
    leicht verbessert 3,5
    verbessert 4
  • Krümelfarbe
  • Die Krümelfarbe wird visuell bestimmt.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Konstruktion einer cDNA-Genbank
  • Die gesamte RNA wurde von Aspergillus oryzae A01568 extrahiert. Poly(A)+-RNA wurde durch Oligo(dT)-Zelluloseaffinitätschromatographie isoliert und eine Doppelstrang-cDNA (ds cDNA) synthetisiert.
  • Eine cDNA-Genbank von Aspergillus oryzae A01568, bestehend aus 3,5 × 106 Klonen, wurde in den Hefeexpressionsvektor pYES 2,0 konstruiert.
  • Beispiel 2
  • Amplifikation und Charakterisierung von cDNA-Klonen
  • Die Aminopeptidase wurde aus Aspergillus oryzae A01568 wie vorstehend im Abschnitt „Materialien und Verfahren" beschrieben gereinigt.
  • Eine lange NH2-terminale Sequenz und vier interne Sequenzen (einschließend Peptid 1 bis 5) der Aminopeptidase wurden durch Aufschluss von S-carboxymethyliertem gereinigtem Protein mit einer Lysyl-spezifischen Protease erhalten.
  • Auf der Basis dieser Sequenzen wurden drei Primer (as1, s2 beziehungsweise s3) synthetisiert. Doppelstrang-cDNA (ds cDNA) wurde als Templat im PCR-Amplifikationsexperiment wie vorstehend im Abschnitt „Materialien und Verfahren" beschrieben verwendet.
  • Eine Analyse der erhaltenen PCR-Produkte zeigte ein Fragment mit 0,5 kb mit einem Primerpaar (Primer s3 und Primer as1).
  • Das PCR-Fragment wurde zu SmaI-geschnittenem, dephosporyliertem pUC18-Vektor subgeklont und von beiden Enden unter Verwendung des Dideoxyketten-Terminierungsverfahren wie vorstehend im Abschnitt „Materialien und Verfahren" beschrieben sequenziert.
  • Zusätzlich zu den Primer-kodierten Resten bestätigte die Sequenz von aus der gereinigten Aminopeptidase erhaltenem Peptid 2, das auf die abgeleitete Aminosäuresequenz angepasst ist, dass die gewünschte cDNA-Spezies spezifisch PCR-amplifiziert wurde.
  • Beispiel 3
  • Screenen der cDNA-Genbank auf Klone, die Aminopeptidase von Aspergillus oryzae kodieren
  • Etwa 10.000 Kolonien aus der cDNA-Genbank von Aspergillus oryzae A01568 wurden durch Kolonie-Hybridisierung wie vorstehend beschrieben gescreent. Dadurch wurden positive Klone mit Einfügungen im Bereich von 650 bp bis 1,5 kb erhalten.
  • Die positiven Klone wurden durch Southern-Blot-Analyse wie vorstehend im Abschnitt „Materialien und Verfahren" beschrieben analysiert.
  • Gereinigte Plasmid-DNA (etwa 1 μg) von den Aminopeptidase-cDNA-Klonen wurde vollständig durch HindII und XbaI zum Freisetzen der cDNA-Einfügungen vom pYES-Vektor aufgeschlossen. Die Proben wurden elektrophoresiert und auf eine Hybond-N-Nylon-Membran durch das Kapillar-Blot-Verfahren überführt. Die Filter wurden mit hoher Strenge gewaschen, was zu positiven Klonen mit Einfügungen im Bereich von 900 bp bis 1700 bp führte.
  • Die stark hybridisierten Klone wurden durch Sequenzieren der Enden der cDNA's mit Vorwärts- und Rückwärts-pYES-Primern analysiert.
  • Eine Analyse der Sequenzdaten zeigte, dass einige dieser Klone abgeschnittene cDNA's waren, wohingegen andere als Klone mit voller Länge erschienen. Die Nukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von einem der erhaltenen Klone mit voller Länge (pC1EXP3) (in 1 dargestellt) enthält eine cDNA-Einfügung von 1,4 kb.
  • Beispiel 4
  • Expression der Aminopeptidase in Aspergillus oryzae
  • Zum Erhalt einer hochgradigen Herstellung von Aminopeptidase in Aspergillus oryzae wurde die cDNA-Einfügung des pC1EXP3-Klons zu pHD423 subgeklont und mit dem AmdS+-Plasmid in Aspergillus oryzae wie vorstehend beschrieben cotransformiert.
  • Die cDNA-Einfügung mit 1,4 kb von pC1EXP3 wurde von pYES 2,0 durch HindIII- und NotI-Aufschluß isoliert, an einen NotI/HindIII-gespaltenen pHD423-Vektor gebunden und in E. coli transformiert.
  • Die erhaltenen Transformanten wurden zweimal gereinigt (siehe vorstehend) und auf Aminopeptidaseaktivität wie vorstehend beschrieben überprüft. Transformant pA3EXP3/1 zeigte nachweisbare Aminopeptidaseaktivität.
  • Beispiel 5
  • Expressionsgrad von Aminopeptidase erzeugenden Transformanten (pA3EXP3/1)
  • Die Menge und Reinheit (Expressionsgrad) von sekretierter Aminopeptidase des Transformants (pA3EXP3/1) wurde semiquantitativ durch SDS-PAGE unter Verwendung des nicht transformierten Stamms A01560 von A. oryzae als Negativ-Kontrolle und des Stamms A01568 von A. oryzae als Positiv-Kontrolle (siehe 1) bestimmt.
  • Ein Polypeptid mit 36–37 kDa war in pA3EXP3/1 ersichtlich, lag jedoch nicht in der Negativ-Kontrolle vor. Die Größe der rekombinanten Aminopeptidase ist möglicherweise aufgrund zusätzlicher Glykosylierung oder anderen Arten von posttranslationalen Modifikationen um etwa 2 kDa höher als diejenige der ursprünglichen Aminopeptidase (eine Doppelbande von etwa 35 kDa).
  • Beispiel 6
  • Eine Massenspektrometrie zeigte, dass die rekombinante Aminopeptidase glykosyliert ist, da die bestimmte Masse die Masse des aus der cDNA-Sequenz als 32,4 kDa berechneten Polypeptids überstieg.
  • Die mittlere Masse der rekombinanten Aminopeptidase beträgt 34,1 kDa, wobei die Massen im Bereich von 33 kDa bis 35 kDa liegen.
  • Das scheinbare Molekulargewicht (Mw), bestimmt durch SDS-PAGE (wie in „Materialien und Verfahren" beschrieben), wurde als etwa 35 kDa befunden.
  • Beispiel 7
  • Gärung von eine Aminopeptidase mit 35 kDa erzeugendem Transformanten
  • Man ließ den Transformanten von Aspergillus oryzae pA3EXP3/1 im Schüttelkolben mit einem Volumen von 1 Liter, enthaltend 150 ml DAP 2C (pH = 5,9), für eine Dauer von 3 Tagen bei 30°C wachsen.
  • Die Menge an sequenzierter Aminopeptidase wurde durch SDS-PAGE-Analyse auf etwa 0,5 g/Liter Überstand bestimmt.
  • Beispiel 8
  • Expression von Aminopeptidase-Klonen mit 35 kDa in S. pombe
  • Der Aminopeptidase-cDNA-Klon mit voller Länge und 35 kDa wurde in Schizosaccharomyces pombe durch Elektroporation retransformiert. Die cDNA-Einführung mit 1,4 kb wurde von dem pYES 2,0-Vektor durch SpeI- und NotI-Aufschluß freigesetzt und in den SpeI/NotI-gespaltenen Hefeexpressionsvektor pP1, der ein Pendelvektor von E. coli/S. pombe, enthaltend den ADH-Promoter ist, subgeklont und auf Aminopeptidaseaktivität überprüft.
  • Es wurde gezeigt, dass ein Transformant von S. pombe starke Aminopeptidaseaktivität aufwies, was anzeigte, dass S. pombe eine funktionell aktive Aminopeptidase mit 35 kDa von Aspergillus oryzae A01568 synthetisieren und sekretieren kann.
  • Beispiel 9
  • Organisation und Expression des Aminopeptidase-Gens
  • Die Kopienanzahl des Aminopeptidase-Gens im Genom von A. oryzae A01568 wurde durch Southern-Blot-Hybridisierung, beschrieben im Abschnitt „Materiali en und Verfahren", bestimmt. Die gesamte von A. oryzae isolierte DNA wurde zur Vollständigkeit mit BamHI, BglII, EcoRI oder HindIII aufgeschlossen und mit der Aminopeptidase-cDNA hybridisiert. Die Aminopeptidase-Sonde weist nur einzelne stark hybridisierende Fragmente in jedem Fall außer in BamHI-Aufschluß nach, wodurch zwei hybridisierende Fragmente aufgrund einer BamHI-Stelle an der Nukleotid-Position 640 erhalten werden. Dies zeigt, dass das Aminopeptidase-Gen als einzelne Kopie in dem Genom von A. oryzae A01568 vorliegt.
  • Beispiel 10
  • Zur Untersuchung der Expression des Aminopeptidase-Gens mit 35 kDa wurde eine von dem Myzelium von von A. oryzae A01568 extrahierte Poly(A)+-RNA der Northern-Blot-Analyse unterzogen. Ein Sondieren der geblotteten RNA mit der Aminopeptidase-cDNA zeigte zwei Spezien von mRNA von etwa 1,45 und 1,55 Kilobasen. Diese zwei mRNA's schienen keine Transskripte von zwei bestimmten Genen darzustellen, da dasselbe Hybridisierungsmuster beobachtet wurde, als die Filter mit hoher Strenge gewaschen wurden. Der Unterschied in der Größe der beiden mRNA's konnte aufgrund der verschiedenen Längen des 3'-untranslatierten Bereichs aufgrund von zwei Polyadenylierungsstellen gemäß den beiden cDNA-Spezien, die aus der cDNA-Genbank von Aspergillus oryzae isoliert wurden, vorliegen, wobei einer den Klonen pC1EXP3 und der andere pC1EXP4 entsprach, der um 120 bp kürzer ist. Beide mRNA's kodieren die selbe Aminopeptidase.
  • Beispiel 11
  • Entfernen von bitterem Geschmack aus Weizen-Protein-Hydrolysat
  • Die Gärbrühe des Transformanten von Aspergillus oryzae pA3EXP3/1 wurde auf die Fähigkeit zum Entbittern einer Lösung, enthaltend 8% (g/g) Proteasehydrolysiertes Weizen-Protein, getestet.
  • Die Aminopeptidaseaktivität der Gärbrühe betrug 5,58 LAPU/g.
  • Die Substrat-Proteinlösung wurde in einem Kolben, enthaltend 100 g des 8%igen Protein-Hydrolysats, getestet. Die Aminopeptidaseaktivität zeigende Gärbrühe wurde zugesetzt, bis das Verhältnis zwischen Enzym und Substrat (E/S) 0,25%, berechnet auf der Basis eines Produkts mit 5000 LAPU/g (äquivalent zu 12,5 LAPU/g Protein), betrug, und wurde dann für eine Dauer von 6 Stunden bei 50°C, pH 7,0 rehydrolysiert.
  • Der pH-Wert und die Osmolarität wurden (unter Verwendung von Standardverfahren) nach 1 Minute beziehungsweise 6 Stunden bestimmt. Die %uale DH wurde unter Verwendung des TVSB-Verfahrens (vorstehend bestimmt), und die %uale FAA (% freie Aminosäuren) wurde unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt
  • Figure 00520001
  • Eine Probe von entbittertem Hydrolysat, enthaltend 13% FFA, wurde auf den Gehalt an Leucin analysiert. Es wurde gefunden, dass Leucin etwa 2,7% bildete, während Leucin etwa 0,3% der Blindprobe bildete.
  • Beispiel 12
  • Geschmackstest
  • Der Geschmack von entbittertem Protein-Hydrolysat wurde durch eine Testgruppe von 5 Personen unter Verwendung eines Bitterkeitsindexes (BI) zwischen 0 (nicht bitter) und 10 (Blindprobe) geprüft.
  • Die Bitterkeit einer Probe von bitter schmeckendem 3,5%igen Proteinhydrolysat (Blindprobe) und einer ähnlichen Probe, die dem Transformanten unterzogen wurde, wurde überprüft.
  • Der Bitterkeitsindex (BI) für die Protein-Hydrolysat-Probe, die dem Transformanten unterzogen wurde, wurde im Bereich von etwa 6,2 gefunden.
  • Dieses Ergebnis zeigt, dass die Aminopeptidase mit 35 kDa die Proteinhydrolysat-Proben entbitterte.
  • Beispiel 13
  • Brotgeschmack, Teigklebrigkeit und Krümelstruktur
  • Der Geschmack, die Teigklebrigkeit und die Krümelstruktur von Brot, das unter Verwendung von 0 bis 300 LAPU pro kg Mehl hergestellt wurde, wurden mit Brot, das unter Verwendung des im Handel erhältlichen Produkts Flavourzyme® hergestellt wurde, verglichen. Das Brot wurde hergestellt und wie vorstehend im Abschnitt „Materialien und Verfahren" beschrieben geprüft.
  • Das folgende Ergebnis (Mittel von zweifacher Ausführung) wurde gefunden:
  • Figure 00540001
  • Wie aus der vorstehenden Tabelle ersichtlich liefert die Aminopeptidase mit 35 kDa der Erfindung eine deutliche Geschmackverbesserung in Form eines „frisch-gebackenen" Brotgeruchs, wenn sie in Mengen von 30 bis 300 LAPU pro kg Mehl zugesetzt wurde. Die Krümelstruktur wird durch die Aminopeptidase der Erfindung nicht beeinflusst. Die Teigklebrigkeit ist verglichen mit dem im Handel erhältlichen Protease/Peptidase-Komplex Flavourzyme® verbessert.
  • Wie dem Fachmann im Lichte der vorhergehenden Offenbarung ersichtlich, sind viele Abweichungen und Modifikationen bei der Durchführung dieser Erfindung ohne Verlassen des Geists oder Umfangs davon möglich. Demzufolge soll der Rahmen der Erfindung gemäß dem durch die nachstehenden Ansprüche definierten Stoff erstellt werden.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001

Claims (39)

  1. Aminopeptidaseaktivität zeigendes Enzym, das von einem pilzartigen Mikroorganismus abgeleitet ist, wobei das Enzym eine oder mehrere Teilaminosäuresequenzen umfasst, die in SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 11 dargestellt sind.
  2. Enzym nach Anspruch 1, wobei das Enzym ein ersichtliches Molekulargewicht (Mw) von 35 kDa, bestimmt durch SDS-Page, aufweist.
  3. Enzym nach Anspruch 1 mit einem geschätzten isoelektrischen Punkt (pI) im Bereich von etwa 4,9.
  4. Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das von einem Fadenpilz oder einer Hefe ableitbar ist.
  5. Enzym nach Anspruch 4, das von einem Fadenpilz wie Aspergillus, insbesondere A. oryzae, speziell A. oryzaeA01568, oder Trichoderma, Penicillium, Fusarium oder Humicola ableitbar ist.
  6. Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Enzym die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst oder von dieser umfasst ist.
  7. DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Aminopeptidaseaktivität zeigendes Enzym kodiert, wobei die DNA-Sequenz a) den Aminopeptidase kodierenden Teil der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten DNA-Sequenz oder die eine Aminopeptidase kodierende DNA-Sequenz, die von E. coli DSM 9965 erhältlich ist, oder b) ein Analogon der in a) definierten DNA-Sequenz, die i) über ihre gesamte Länge zu 70% identisch mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten DNA-Sequenz oder der eine Aminopeptidase kodierenden DNA-Sequenz, die von E. coli DSM 9965 erhältlich ist, oder ii) ein Polypeptid kodiert, das zu 70% identisch ist mit dem Polypeptid, das durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, die die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte DNA-Sequenz oder die eine Aminopeptidase kodierende DNA-Sequenz, die von E. coli DSM 9965 erhältlich ist, umfasst, umfasst.
  8. DNA-Konstrukt nach Anspruch 7, umfassend die in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Teil-DNA-Sequenzen und/oder die in SEQ ID Nr. 4 dargestellten Teil-DNA-Sequenzen und/oder die in SEQ ID Nr. 5 dargestellten Teil-DNA-Sequenzen.
  9. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei die DNA-Sequenz von einem pilzartigen Mikroorganismus, wie einem fadenförmigen Pilz oder einer Hefe, erhältlich ist.
  10. DNA-Konstrukt nach Anspruch 9, wobei die DNA-Sequenz von einem Stamm von Aspergillus, wie Aspergillus oryzae, insbesondere von dem hinterlegten Aspergillus oryzae ATCC 20386 oder Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Humicola oder E. coli DMS 9965, erhältlich ist.
  11. DNA-Konstrukt nach Anspruch 10, wobei die DNA-Sequenz auf der Basis einer Nukleinsäure-Bibliothek von Aspergillus oryzae A01568 isoliert oder hergestellt wird.
  12. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend das DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 11.
  13. Pilzartige Wirtszelle, umfassend ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 11 oder einen rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 12.
  14. Zelle nach Anspruch 13, die eine Hefezelle oder eine Fadenpilzzelle ist.
  15. Zelle nach Anspruch 14, wobei die Zelle zu einem Stamm von Aspergillus, insbesondere einem Stamm von Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae, einem Stamm von Saccharomyces, insbesondere von Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri oder Saccharomyces uvarum, einem Stamm von Schizosaccharomyces sp., wie Schizosaccharomyces pombe, einem Stamm von Hansenula sp., Pichia sp., Yarrowia sp wie Yarrowia lipolytica oder Kluyveromyces sp., wie Kluyveromyces lactis, gehört.
  16. Zelle nach Anspruch 15, wobei die Zelle zu einem Stamm von Aspergillus, insbesondere einem Stamm von Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae, gehört.
  17. Verfahren zur Herstellung eines Aminopeptidaseaktivität zeigenden Enzyms, wobei das Verfahren das Züchten einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 16 in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression des DNA-Konstrukts nach einem der Ansprüche 7 bis 11 oder des Expressionsvektors nach Anspruch 12 gewähren, und das Gewinnen des Enzyms aus der Kultur umfasst.
  18. Enzymzubereitung, die zur Verminderung von bitterem Geschmack von Proteinen oder Proteinhydrolysaten für Nahrungsmittel nützlich ist, wobei die Zubereitung mit einem Aminopeptidaseaktivität zeigenden Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 6 angereichert ist.
  19. Enzymzubereitung nach Anspruch 18, die zusätzlich mindestens eine andere Enzymaktivität, einschließlich einer Zellulase, einer Hemizellulase, einer Pentosanase, einer Lipase, einer Peroxidase, einer Oxidase, einer Laccase, einer Xylanase, einer Peptidase und einer Endo-Protease umfasst.
  20. Zusammensetzung, umfassend ein Aminopeptidaseaktivität zeigendes Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ferner umfassend Brot- oder Teig-verbessernde Mittel.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, die ferner ein amylolytisches Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend α-Amylase, beta-Amylase, maltogene α-Amylase, säurestabile Amylase, 1,6-Pullulanase und Amyloglukosidase, umfasst.
  22. Zusammensetzung nach Anspruch 20 oder 21, die ferner ein anderes Enzym, wie eine Zellulase, eine Hemizellulase, eine Pentosanase, eine Lipase, eine Peroxidase, eine Oxidase, eine Laccase und eine Xylanase, umfasst.
  23. Verfahren zur Herstellung eines gebackenen Produkts aus einem Mehlteig, wobei das Verfahren in dem Teigherstellungsverfahren die Zugabe eines Aminopeptidaseaktivität zeigenden Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zu dem Teig oder den Teigzusätzen und Backen des erhaltenen Teigs unter geeigneten Bedingungen umfasst.
  24. Verfahren zur Herstellung eines gebackenen Produkts aus einem Mehlteig nach Anspruch 23, wobei das Verfahren im Teigherstellungsverfahren ferner die Zugabe eines amylolytischen Enzyms zu dem Teig oder den Teigzusätzen und Backen des erhaltenen Teigs unter geeigneten Bedingungen umfasst.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das amylolytische Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus α-Amylase, beta-Amylase, maltogener α-Amylase, säurestabiler Amylase, 1,6-Pullulanase und Amyloglukosidase.
  26. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei ein anders Enzym, wie eine Zellulase, eine Hemizellulase, eine Pentosanase, eine Lipase, eine Peroxidase, eine Oxidase, eine Laccase, Amylase und eine Xylanase, dem Teig oder den Teigzusätzen zugesetzt wird.
  27. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, wobei das Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in einer Menge, entsprechend 30 bis 1000 LAPU, vorzugsweise 50 bis 500 LAPU, insbesondere 80 bis 300 LAPU, wie etwa 100 LAPU, pro kg Mehl zugesetzt wird.
  28. Verfahren zur Herstellung eines gefrorenen Teigs, wobei das Verfahren im Teigherstellungsverfahren die Zugabe eines Aminopeptidaseaktivität zeigenden Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zu dem Teig oder den Teigzusätzen und Einfrieren des erhaltenen Teigs unter geeigneten Bedingungen umfasst.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei ein amylolytisches Enzym zusammen mit dem Aminopeptidaseaktivität zeigenden Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zugesetzt wird.
  30. Verwendung des Aminopeptidaseaktivität zeigenden Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 22 zur Verbesserung des Geschmacks eines gebackenen Produkts.
  31. Verwendung des Aminopeptidaseaktivität zeigenden Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 22 zur Verbesserung der Teigklebrigkeit eines gebackenen Produkts.
  32. Verwendung des Aminopeptidaseaktivität zeigenden Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 22 zur Verbesserung der Krümelstruktur eines gebackenen Produkts.
  33. Verwendung des Aminopeptidaseaktivität zeigenden Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 22 zur Verbesserung der Krustenfarbe eines gebackenen Produkts.
  34. Verwendung des Aminopeptidaseaktivität zeigenden Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer Enzymzubereitung nach einem der Ansprüche 18 oder 19 für Proteine oder Proteinhydrolysaten für Nahrungsmittel.
  35. Verwendung nach Anspruch 34 zum Entbittern von Proteinen oder Proteinhydrolysaten für Nahrungsmittel.
  36. Verwendung nach Anspruch 34 oder 35, wobei das zu hydrolysierende Protein oder Proteinhydrolysat tierischen Ursprungs, wie Casein oder Molkeprotein, ist.
  37. Verwendung nach Anspruch 36, wobei das Nahrungsmittel Käse ist.
  38. Verwendung nach Anspruch 34 oder 35, wobei das zu hydrolysierende Protein oder Proteinhydrolysat pflanzlichen Ursprungs, wie Sojaprotein, ist.
  39. Verwendung nach Anspruch 38, wobei das Nahrungsmittel Kakao umfasst.
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