CN1159436C - 一种有氨肽酶活性的酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表现氨肽酶活性、衍生自真菌微生物的35 kDa的酶，一种含编码该酶的DNA序列的DNA构建体，一种含该DNA构建体的重组表达载体以及一种含该DNA序列的细胞。本发明的另一个目的是提供表现氨肽酶活性的该酶的生产方法，以及含该酶的酶制剂，含本发明氨肽酶的改善面包和面团的组合物。最后，本发明还涉及对表现氨肽酶活性的该酶、或其酶制剂及其组合物的利用。

Description

一种有氨肽酶活性的酶

本发明涉及一种表现出氨肽酶活性的酶，一种生产该酶的方法，含表现出氨肽酶活性的该酶的一种酶制剂，以及将该酶用于多种工业用途。

蛋白质水解产物被用于许多食品中。蛋白质水解产物传统上是由酸水解所产生的，然而今天酶水解已被视为一种引人注意的替代方法。

蛋白质水解产物的主要问题之一是其尝起来常常有苦味。当使用诸如大豆蛋白质或酪蛋白(它们都富含疏水L-氨基酸)作为蛋白质来源时，蛋白质水解产物就会具有苦味。总的来说，人们相信蛋白质是否具有苦味取决于L-氨基酸残基的平均疏水性，如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

大多数能表现出肽酶活性的酶都可实施对植物、酵母及/或动物蛋白质的酶水解，可引出用作食品添加物的具高营养值的蛋白质水解产物，如在汤类、酱油、肉汁、糊酱、豆腐、牛肉清汤、调味品、婴儿食品、快餐、成品肉等产品中。

                          肽酶

所有的肽酶或蛋白酶都是水解酶，它们作用于蛋白质或其部分水解产物而分解肽键。

欧洲专利427,385(日本研究与发展协会)披露了一种可编码衍生自黄色霉菌(如米曲霉(Aspergillus oryzae))的碱性蛋白酶的染色体组基因。

日本专利0-2002374和0-2002375(Shokuhin)描述了衍生自米曲霉、可用于医药、食品和清洁剂之中的一种碱性蛋白酶。

SU-89177(Khark)讨论了来自米曲霉的一种微生物蛋白酶，它也可用于食品、医药等。

日本专利5-4035283(Ajinomoto KK)披露了来自如米曲霉、可表现出内肽酶活性的多种酶制剂，它们可以将蛋白质几乎完全水解。

WO 94/25580(Novo Nordisk A/S)描述了的一种水解植物或动物蛋白质的方法，是通过用衍生自米曲霉菌株的一种解蛋白酶制剂进行温育而实施的。

                         氨肽酶

肽酶(蛋白酶)的一个亚组叫做氨肽酶，根据国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)的推荐文件(1992)，被划分在酶分类号码E.C.3.4.11之下(氨肽酶)。

氨肽酶能够从多肽中去除一个或多个氨基末端残基。

日本专利7-5034631(Noda)披露了一种衍生自黄色霉菌(其中包括米曲霉)的亮氨酸氨肽酶。

日本专利7-4021798(Zaidan Hojin Noda Sangyo)描述了通过添加由培养多种霉菌(包括米曲霉菌株460和IAM 2616)而制备的亮氨酸氨肽酶II来生产味噌酱。

Van Heeke等人[生物化学和生物物理记述，(1992)，1131，337-340]描述了来自解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)的一种30kDa氨肽酶的克隆，该菌株保藏于美国典型培养物保藏所，号码ATCC No.15338。

米曲霉460被认为能生产多种亮氨酸氨肽酶。通过凝胶过滤，经计算可确定其中3种的分子量分别为26,500、56,000和61,000[Nakada等人，农业生物化学，(1972)，37(4)，757-765；Nakada等人，农业生物化学，(1972)，37(4)，767-774；Nakada等人，农业生物化学，(1972)，37(4)，775-782]。米曲霉460菌株保藏于美国典型培养物保藏所，其为米曲霉(ATCC No.20386)。

              蛋白质水解产物苦味的降低

欧洲专利65,663和325,986(Miles公司)讨论了利用含米曲霉衍生的蛋白酶的酶混合物对蛋白质进行酶水解。所得到的蛋白质水解产物味道温和，无苦味。

日本专利4-7029577(Asahi电子一化学公司)探讨了衍生自米曲霉的一种蛋白酶，其分解蛋白质时不产生任何苦成分。

现有技术披露了许多表现出肽酶、氨肽酶和其它酶活性的酶。所述的酶可衍生自多种微生物，包括真菌种类米曲霉。

一般来说，用于生产无苦味的蛋白质水解产物的产品包括肽酶和氨肽酶活性的混合物。

因此，极需要提供一种单成分酶(即基本上没有任何副活性)，其只表现出用于减少食品中蛋白质水解产物的苦味的活性。

图1显示对来自米曲霉A01568 35 kDa氨肽酶生产用的转化体上清液的SDS-PAGE分析结果。

本发明的目的是提供一种表现出活性的单成分酶，其尤其可用于制备改进性面包产品和生产食料中无苦味的蛋白质及/或蛋白质水解产物。

在分离可编码表现出氨肽酶活性的DNA序列的方面，本发明人的成功是十分惊人的，其可优先用于改进烘烤产品的味道、外皮色泽、面心结构和面团粘性。另外，所述新型酶可用于生产无苦味的蛋白质或蛋白质水解产物。

编码所述氨肽酶的整体DNA序列使得制备单成分氨肽酶成为可能。

编码本发明氨肽酶的整体DNA序列(如SEQ ID No.1所示)包含在一个质粒中，其被转化到细菌菌株大肠杆菌DSM No.9965中。将在下面进行描述。

通过数据库编排检索，我们发现，如SEQ ID No.1所示的DNA序列是新的。我们发现，对于上述来自解蛋白弧菌(ATCC No.15338)的30 kDa氨肽酶来说，相似性和同一性最高分别可达53％和2％。

本发明人对由分泌信号组成的氨肽酶前体形式和35kDa氨肽酶进行了分析。经过计算，前体形式的分子量(M_w)达41kDa，估计等电点(pI)约为4.9。另外，氨肽酶的氨基酸组成估计如表1所示。

                       表1

非极性：          No.           百分比

        丙氨酸    37             9.79

缬氨酸            23            6.08

亮氨酸            29            7.67

异亮氨酸          20            5.29

脯氨酸            14            3.70

甲硫氨酸          3             0.79

苯丙氨酸          19            5.03

色氨酸            2             0.53

极性：            No.           百分比

甘氨酸            28            7.41

丝氨酸            32            8.47

苏氨酸            25            6.61

半胱氨酸          4             1.06

酪氨酸            13            3.44

天冬酰胺          11            2.91

谷氨酰胺          16            4.23

酸性：            No.           百分比

天冬氨酸          29            7.67

谷氨酸            25            6.61

碱性：            No.           百分比

赖氨酸            28            7.41

精氨酸            9             2.38

组氨酸            10            2.65

35kDa酶的氨基酸序列的推论性完整前体形式如SEQ ID No.2所示。

因此，本发明的第一方面涉及一种表现氨肽酶活性的酶，用SDS-PAGE法测得其表观分子量(Mw)约为35kDa。

质谱法显示，该重组氨肽酶的平均质量在33kDa-35kDa范围内。测得该酶的等电点(pI)约为4.9。

等电点pI被定义为酶分子复合体(与金属或其它离子选择性相联)为中性时即复合体上的静电荷总量(净电荷，NEC)等于0时的pH值。在这个量化过程中，必须考虑到静电荷的正或负性。

在下列术语中，“35kDa氨肽酶”和“表现氨肽酶活性的-可交替用于本发明的单成分酶。

本发明表现氨肽酶活性的酶可衍生自多种微生物。本发明人已经从丝状真菌米曲霉A01568中分离出了本发明的氨肽酶，其以米曲霉460(FERM-P No.1149，ATCC No.20386)被保藏于美国典型培养物保藏所，进一步描述见美国专利No.3,914,436。

本发明的表现氨肽酶活性的酶至少包括分别如SEQ ID Nos.6，7，8，9和10所述的部分氨基酸序列之一。SEQ ID No.11是一种重叠和延伸N-末端序列的肽(5)。

第二方面，本发明涉及一种DNA构建体，其含有编码所述氨肽酶的DNA序列，该DNA序列包括

a)如SEQ ID No.1所示的DNA序列的氨肽酶编码部分，和/或得自大肠杆菌DSM 9965的DNA序列，

b)如a)定义所示DNA序列的类似物，其

i)与如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大肠杆菌DSM 9965的DNA序列同源，或

ii)与SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大肠杆菌DSM 9965的DNA序列的相同寡核苷酸探针杂交，

iii)编码一种多肽，该多肽与由含如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大肠杆菌DSM 9965的DNA序列的DNA序列所编码的多肽同源，

iv)编码一种多肽，该多肽与由衍生自米曲霉A01568或得自大肠杆菌DSM 9965的SEQ ID No.1所示的DNA序列所编码的纯化氨肽酶所针对的抗体有免疫反应性，

在本说明书中，如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大肠杆菌DSM 9965的DNA序列的“类似物”意指编码表现氨肽酶活性的酶的任何DNA序列，其至少具有属性i)-iv)中的一种。

类似的DNA序列

—可分离自能产生表现氨肽酶活性的酶的另一种或相关(如相同)的生物，这要根据SEQ ID Nos.3-5所示的任意DNA序列，例如可使用此处的方法；因此可以是含此处所示的DNA序列的DNA序列的等位或种类变异体，

—依据如SEQ ID Nos.3-5所示的任何DNA序列进行构建，例如可通过引入核苷酸的置换，即不会发生该DNA序列所编码氨肽酶的另外的氨基酸序列，但其需符合产生该酶的宿主生物的密码子利用；或者可通过引入能发生不同氨基酸序列的核苷酸置换。然而，在后一情况中，氨基酸变化最好是微小性的，是对多肽折叠或活性无显著影响的保守性氨基酸置换，是一般为1-30个氨基酸的小型缺失；小型氨基或羧基末端的延展，如氨基末端甲硫氨酸残基，一个约达20-25个残基的小型衔接性肽，可促进纯化作用的小型延展，如聚组氨酸束，即抗原表位或连接区域。一般参见Ford等人，(1991)，蛋白质表达与纯化2，95-107。保守性置换的实例限于碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小型氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)。

本领域技术人员显然知道，这种置换可以在对分子功能十分关键的区域之外进行，而且仍旧导致一种活性酶。这些氨基酸对于由本发明DNA构建体所编码的多肽活性是最基本的，因而最好不进行置换，它们可依据本技术领域熟知的程序进行鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变

[Cunningham和Wells，(1989)，科学244，1081-1085]。在后者中，在分子的每一个残基处都引入了技术性突变，对所生成的突变分子进行生物活性检测(即解氨肽特性)，以鉴定对于分子活性十分关键的氨基酸残基。还可通过对晶体结构的分析来确定底物—酶相互作用的位点，例如可通过诸如核磁共振、结晶分析或光亲和性标记等技术。例如可参见de Vos等人，(1992)，科学255，306-312；Smith等人，(1992)，分子生物学杂志，224，899-904；Wlodaver等人，(1992)，欧洲生物化学学会联合会通讯，309，59-64。

可以理解，如SEQ ID Nos.3-5所示的DNA序列就是可用于分离编码氨肽酶的整体DNA序列的序列，所述整体DNA序列例如是SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或转化入保藏的菌种大肠杆菌DSM 9965中的DNA序列。术语“类似物”意指包括所述的完整DNA序列，其包含如SEQ ID Nos.3-5所示的一种或多种部分序列或其部分。氨基酸序列(从如SEQ ID No.1所示的DNA序列所推论)如SEQ ID No.2所示。

上述i)中所述的同源性可通过两个序列间同一性程度(标志第一个序列由第二个序列衍生)来确定。可通过技术领域所熟知的计算机程序来适宜地确定该同源性，如GCG程序包中所提供的GAP[Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)，分子生物学杂志，48，443-453]。使用GAP在下列条件下进行DNA序列的比较：GAP创造罚值为5.0，GAP延展罚值为0.3，与如SEQ ID No.1所示的DNA序列或得自大肠杆菌DSM 9965中质粒的DNA序列的编码区域相比，DNA序列的编码区域所表现出的同一性程度最好至少为70％，优选至少为80％，尤其至少为90％。

上述ii)中所述的杂交意指，在某些特殊条件下类似的DNA序列与编码氨肽酶的DNA序列的相同探针进行杂交，详细描述见以下“材料与方法”章节。

一般而言，类似的DNA序列与DNA序列是高度同源的，例如同如SEQ IDNo.1所示的DNA序列或得自大肠杆菌DSM 9965中质粒、编码本发明中氨肽酶的DNA序列至少有60％的同源性，如与所述DNA序列比较至少为65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或甚至至少95％的同源性。

上述iii)中所述的同源性可通过两个序列间同一性程度(标志第一个序列由第二个序列衍生)来确定。可通过技术领域所熟知的计算机程序来适宜地确定该同源性，如GCG程序包中所提供的GAP[Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)，分子生物学杂志，48，443-453]。使用GAP在下列条件下进行DNA序列的比较：GAP创造罚值为5.0，GAP延展罚值为0.3，与如SEQ ID No.1所示的DNA序列或得自大肠杆菌DSM 9965中质粒的DNA序列的编码区域相比，DNA序列的编码区域所表现出的同一性程度最好至少为70％，优选至少为80％，尤其至少为90％。

与上述特性iv)相联系的术语“衍生自”不仅指由菌种A01568所产生的氨肽酶，而且指由分离自菌种A01568的DNA序列所编码并在用该DNA序列转化的宿主生物中产生的氨肽酶。可通过如以下“材料与方法”章节中所述的方法来确定免疫反应性。

本发明的进一个方面涉及携带本发明DNA构建体的表达载体，含该DNA构建体或表达载体的细胞，和表现氨肽酶活性的酶的生产方法，该方法包括在允许该酶生成的条件下培养所述细胞，并从培养物中回收酶。

本发明还有一个目的是提供富含本发明35kDa氨肽酶的酶制剂。

另外，本发明提供了一种改进面包或面团的组合物，它含有本发明表现氨肽酶活性的酶。该组合物可以和其它酶组合，例如与解淀粉酶和常规性面包改进剂组合。

本发明还涉及含有本发明35kDa氨肽酶的烘烤产品和冷冻面团的制备方法。

最后，本发明涉及对本发明35kDa氨肽酶的利用。本发明的酶或含这种酶的本发明组合物可用于改进烘烤产品的味道、外皮色泽和面心结构，以及改进冷冻面团的粘性。本发明的氨肽酶还可优先用于生产无苦味的蛋白质和蛋白质水解产物，还可用于很多用途，包括含多种物质的蛋白质的降解或修饰；对接触透镜的清洗、制备食物和动物饲料等。

可通过通常方法来分离本发明中编码表现氨肽酶活性的酶的DNA序列，包括

—在适宜的载体中从米曲霉中克隆出DNA文库，

—用所述载体转化适宜的酵母宿主细胞，

—在适宜的条件下培养宿主细胞，以表达由文库中克隆所编码的令人感兴趣的任何酶，

—通过测定该克隆所产生的酶的任何氨肽酶活性来筛选阳性克隆，

—从该克隆中分离编码酶的DNA。

通常方法进一步参见WO 93/11249，其内容附此作为参考。对筛选方法的更详细描述见以下实施例3。

                          微生物来源

例如，通过筛选供体生物的cDNA文库和选择表达适当酶活性(即由酶水解亮氨酸-7酰胺基-4-甲基香豆素的能力所定义的氨肽酶活性)的克隆，来分离出编码本发明中氨肽酶的DNA序列。而后可通过标准程序从克隆中分离适当的DNA序列，例如在实施例1中所述。

供体生物可以是米曲霉(ATCC No.20386)的真菌，如美国专利No.3,914,436所述。

把编码本发明中氨肽酶的完整全长DNA序列转化入大肠杆菌菌株中，其包括在表达质粒pYES 2.0(Invitrogen)中。该菌种由本发明人根据有关“用于专利程序用途的国际微生物保藏认可的布达佩斯条约”保藏于theDeutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Branschweig，德国(DSM)。

保藏日期：    11.05.95

保藏者文献：  NN49001

DSM名称：     大肠杆菌DSM No.9965

作为布达佩斯条约下的国际保藏机构，Deutshe Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH根据上述条约的条例和规章来实施永久性的保藏，特别参见条例9。在本专利申请尚未授权期间，被美国专利及商标局的专员授权的人员，可以得到两种保藏菌种，按照37 C.F.R.Par.1.14和35 U.S.C.Par.122。另外，根据EPC的条例28，上述保藏菌种满足了欧洲有关微生物专利申请的要求。

上述保藏菌种代表了所分离菌种基本纯化的培养物。在某些国家中，按该外国专利法可得到保藏物，所述国家中本申请的对应申请或其派生申请已提交。不过，应该理解，得到所保藏的菌种并不是对实施本标题发明的许可，政府行为所授权的专利权并没有废止。

可通过标准方法从上述保藏菌种中分离出表现氨肽酶活性的酶的编码DNA序列。

我们预期，编码同源酶的DNA序列(即类似的DNA序列)可得自其它微生物。例如，可通过类似筛选另一种微生物的cDNA文库来衍生出该DNA序列，特别是真菌，如曲霉属的菌种，尤其是刺孢曲霉(A.aculeatus)或黑曲霉，木霉属的菌种，尤其是T.reesei、绿色木霉(T.viride)、T.longibrachiatum或康宁木霉(T.koningii)，或镰孢属的菌种，尤其是尖镰孢(F.oxysporum)，或腐殖霉属的菌种。

另外，依据人们熟知的程序，通过根据此处披露的DNA序列所制备的合成性寡核苷酸探针，可以从适宜来源(例如上述任何生物)的DNA中方便地分离出编码表现本发明氨肽酶活性的酶的DNA序列。比如，依据如SEQ IDNos.3-5所示的任何寡核苷酸序列或如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其任何适宜的亚序列，可制备出适宜的寡核苷酸针。

随后可将该DNA序列插入重组表达载体中。其可以是能方便进行重组DNA程序处理的任何载体，而载体的选择常常取决于其所要引入的宿主细胞。于是，该载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体而存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制(如质粒)。另外，该载体可以是这样的载体，当引入宿主细胞中时，其可整合入宿主细胞基因组中并同其整合入的染色体一起进行复制。

在载体中，编码氨肽酶的DNA序列可操作性连接到适宜的启动子和终止子序列上。启动子可以是在所选择的宿主细胞中表现出转录活性的任意DNA序列，可以衍生自编码蛋白质(对宿主细胞既可是同源的也可是异源的)的基因。用于将编码氨肽酶的DNA序列、启动子和终止子分别连接起来及将其插入适宜载体中的程序是本领域技术人员所熟知的[例如可参见Sambrook等人，(1989)，分子克隆，实验室手册，冷泉港，纽约]。

用编码本发明中酶的DNA序列进行转化的宿主细胞优选为真核细胞，特别是真菌细胞，如酵母或丝状真菌细胞。该细胞尤其可以是曲霉属的菌种，最好为米曲霉或黑曲霉。可以通过涉及原生质体形成及其转化、随后通过熟悉的方式进行细胞壁再生，这样来进行真菌细胞的转化。使用曲霉属作为宿主微生物如欧洲专利238 023所述(Novo Nordisk A/S)，其内容附录于此作参考。该宿主细胞也可以是酵母细胞，如酵母菌属的菌种，特别是酿酒酵母、克鲁弗酵母(S.kluyveri)或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)；裂殖酵母属的菌种，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；汉逊酵母属的菌种；毕赤酵母属的菌种；Yarrowia的菌种，如Y.lipolytica；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的菌种，如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)。

                       生产本发明酶的方法

本发明的另一方面涉及本发明的酶的生产方法，其中将用酶的DNA编码序列所转化的适宜的宿主细胞在准许酶生成的条件下进行培养，然后从培养物中回收所生成的酶。

用于培养转化过的宿主细胞的培养基可以是任意适于所述宿主细胞生长的常规培养基。所表达的氨肽酶可方便地分泌入培养基中，并通过熟知的程序进行回收，其中包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，通过盐法(如硫酸铵)、随后通过色谱程序(如离子交换色谱、亲合色谱等)沉淀出培养基中的蛋白质类成分。

                         酶制剂

本发明还有一个方面涉及可用于降低食料中蛋白质及/或蛋白质水解产物苦味的酶制剂。

富集本发明酶的酶制剂例如可以是含有多种酶活性的酶制剂，例如含多种生成蛋白质水解产物之酶的酶制剂。富集的制剂可以是Flavourzyme^_(购自Novo Nordisk A/S)。Flavourzyme^_是一种衍生自米曲霉中的蛋白酶/肽酶复合体，开发来进行蛋白质的水解。

根据该酶制剂待应用的用途，本发明的氨肽酶可结合下述其它酶类。

在本说明书中，术语“富集”意指该酶制剂的氨肽酶活性已经增长了，例如富集因子至少为1.1，优选在1.1及10之间，更优选在2及8之间，特别是4及6之间，原因在于添加了通过上述方法所制备的本发明的酶。

另外，用表现出氨肽酶活性的酶所富集的酶制剂是这样的制剂，其包括作为主要酶成分的本发明的酶，如单成分酶制剂。

可依据本技术领域熟知的方法来制备该酶制剂，形式可以是液体或是干制剂。例如，酶制剂的形式可以是颗粒或微颗粒状的。可依据本技术领域熟知的方法来稳定包含在该制剂中的酶。

本发明的另一个方面涉及含有本发明氨肽酶的改进面包或面团的组合物。所述组合物可进一步含有选自.解淀粉酶在内的酶类，例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、生麦α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、酸稳定性淀粉酶和1，6-支链淀粉酶。

这类酶可购于Novo Nordisk A/S，如得自黑曲霉菌种的AMG^TM(淀粉葡糖苷酶)，得自米曲霉菌种的Fungamyl^TM(真菌淀粉酶)，得自嗜热脂肪芽孢杆菌的Novamyl^TM(生麦淀粉酶)。

本发明的组合物还可含有一种或多种附加酶。这类酶的实例包括纤维素酶、半纤维素酶、戊聚糖酶(用于戊聚糖的部分水解，这能增加面团的延展性)、脂肪酶(用于改变面团或面团构成中存在的脂质以软化面团)、过氧化物酶(用于改善面团的稠度)、氧化酶(如葡糖氧化酶)、漆酶、木聚糖酶、蛋白酶(用于面筋弱化，特别是当使用硬度小麦面粉时)。

其它酶组分优选为微生物来源的，可通过上述使用的常规技术得到。

本发明中所使用的酶类可以是适宜的任何形式，例如干粉或颗粒形式(特别是无尘颗粒)、液体形式(特别是稳定性液体)或被护性酶形式。可如US 4,106,991和US 4,661,452(均为Novo Industri A/S)所披露的来生成颗粒，用本技术领域所熟知的方法来有选择地进行涂敷。例如，可依据既成方法，通过加入营养上可接受的稳定剂来稳定酶制剂，如糖、糖醇或另外的多羟基化合物、乳酸或另外的有机酸。可依据欧洲专利238,216所披露的方法来制备被护性酶。

一般来说，为了在预混物或面粉中进行添加，酶最好是干产品的形式，如无尘颗粒，而为了与液体一同添加，最好是液态形式的。

除此之外或作为其它酶组分的替代品，改善面团及/或面包的组合物可含有常规使用的烘烤剂，例如一种或多种下列组成：

奶粉(提供外皮色泽)、面筋(以改善弱度面粉中的气体滞留)、乳化剂(以改善面团的延展性并在某种程度上改善做出的面包的稠度)、颗粒性脂肪(用于面团的软化和面包的稠度)、氧化剂(添加以加强面筋的结构；如抗坏血酸、溴酸钾、碘化钾或过硫酸铵)、氨基酸(如半胱氨酸)、糖、盐类(如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙，用来使面团更加坚固)、面粉或淀粉。还可以依据本发明的方法将这些组分直接加入到面团之中。

适当的乳化剂实例有甘油一酯或甘油二酯、甘油一酯或甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的聚甘油酯、甘油一酯的乳酸酯、甘油一酯的乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸盐、磷脂和卵磷脂。

本发明的面包和/或面团改善组合物通常含在面团中，其含量0.01-5％，尤其是0.1-3％。

依据本发明的方法，其中将本发明具有氨肽酶活性的酶与上述其它酶类有选择地组合起来，可用于面团和/或烘烤产品的制备，可将酶类原样加入面团制备于其中的混合物或待制备面团用的任何组分(如面粉)中。另外，可将酶类作为上述面团和/或面包改善组合物的组分进行添加，既可以加入面粉中也可加入其它面团组分之中，或直接加入到制备面团用的混合物中。

在本发明方法中所使用的酶剂量应适用于所述面团的特性和组成以及所用酶类的特性。一般来说，酶制剂的添加量为每kg面粉中0.01-1000mg酶蛋白质，优选为每kg面粉中0.1-100mg酶蛋白质，更优选为每kg面粉中0.1-10mg酶蛋白质。

至于酶的活性，具有氨肽酶活性的已知单成分酶有选择地同其它酶相组合使用，用于对面粉或烘烤产品的外皮色泽进行有益的改善，其适当的剂量取决于所涉及的酶和酶底物。最佳剂量依面粉或酵母类型和烘烤过程的不同而有所变化。有经验的人士可根据本技术领域的方法来确定适宜的酶单位剂量。

然而，依据本发明，本发明表现出氨肽酶活性的酶的添加剂量为每kg面粉30-1000LAPU，优选为50-500LAPU，尤其为80-300LAPU，如约为100LAPU。LAPU定义如下。

解淀粉酶的添加量一般为每kg面粉1-50FAU。一个FAU(真菌α-淀粉酶单位)是指每小时分解5.26g淀粉所用的酶量(Merk，Amylumsolubile Erg.B.6，BAch 9947275)，使用的是Novo Nordisk标准方法来测定α-淀粉酶的活性。对Novo Nordisk分析方法(AF216)的详细描述可索取得到。

生麦淀粉酶一般添加量为每kg面粉1-1000MANU(生麦淀粉酶Novo单位)。一个MANU被定义为：标准条件下，每分钟水解i微摩尔麦芽三糖所用的酶量。该分析方法(AF 203)可索取得到。

当依据本发明的方法添加一种或多种附加的酶活性时，这些活性可以分别加入或者同具有外肽酶活性的烧烤组分酶一起加入，可选择性作为本发明面包和/或面团改善组合物的组成。其它酶活性可以是上述任意的酶，可依据既成的烘烤做法来确定添加剂量。

如上所述，表现出氨肽酶活性的酶与上述其它酶选择性组合使用，可添加至任何面团组分的混合物中，加入面团，或加入面团中所包括的任何组分中，换句话说，酶可以在面团制备的任意步骤加入，在适宜之处可分一步、两步或多步进行添加。

对于拟议中的面团和/或烘烤产品来说，可通过任何适当的方法来实施对面团和/或烘烤物的处理，一般包括以下步骤：揉捏面团，对面团进行一次或多次试验处理，在适宜的条件下烘烤产品，即适宜的温度和足够的烘烤时间。例如，可通过常规的直接面团过程、酸面团过程、面团过夜方法、低温和长期发酵方法、面团冷冻方法、Chorleywood面包过程或发面及面团过程来制备面团。

通过本发明方法所制备的面团和/或烘烤产品一般使用的是小麦粉或面粉，可有选择地同其它类型的粉组合使用，如玉米粉、黑麦粉、燕麦粉、大豆粉、高粱粉或土豆粉。

在本说明书中，术语“烘烤产品”意指任何制备于面粉的产品，既可以是柔软的也可以是松脆特性的。由本发明优先制作的烘烤产品的实例可以是白色、淡色或深色类型的，包括面包(尤其是白色、全粉或黑麦面包)、典型形式为条形或卷形、法国小圆形面包、皮塔面包、油炸三明治、蛋糕、薄煎饼、饼干、松脆面包等等。

本发明的面团可以是上述任意类型的，可以是新鲜或冷冻的。

冷冻面团的制备如K.Kulp和K.Lorenz所述，见“冷冻和冷藏面团及稀面糊”。当使用本发明中的氨肽酶用于冷冻面包时，其味道、外皮色泽和松软性都得到了改善。

如上所述，显然，本发明中的面团一般是发酵的面团或要进行发酵处理的面团。可以以多种方式使面团发酵，例如加入小苏打等或曲子(发酵的面团)，但优选是通过加入适当的酵母培养物来发酵面团，如酿酒酵母培养物(即面包师傅所使用的酵母)。可以使用任何商用性酿酒酵母菌种。

如上所述，本发明还涉及一种预混物，形式例如可为面粉组合物，用于面团和/或由面团制备的烘烤产品，该预混物含有本发明表现氨肽酶活性的酶以及上述其它选择性酶。可通过将相关的酶或含有酶的本发明面包和/或面团改进用组合物同适宜的载体(如面粉、淀粉、糖或盐)进行掺混来制备出预混物。该预混物可含有其它面团和/或面包改进用添加剂，如任意的添加剂，包括上述的酶。

               对本发明35kDa氨肽酶的利用

              利用本发明的酶来制备烘烤产品

本发明中的酶或酶制剂可用于烘烤业，例如用来减弱面粉的面筋成分以获得所谓硬麦面粉的软化。

不过，我们惊奇地发现，本发明中的氨肽酶并不能降解面筋的网络，而这是在将蛋白酶用于制备烘烤产品时所观察到现象。于是，面团的特性和面心结构并没有受到影响。

另外，当制备烘烤产品时在面团或面团成分中加入本发明的35kDa氨肽酶，烘烤产品的味道、外皮色泽和/或面心结构和/或外皮色泽将得到显著改善，如实施例13所示。

再者，本发明中的酶可改善面团的粘性。

添加本发明中的酶可使得烘烤产品具有酵母类型的味道，提供一种“新烘烤性”面包的香味。这使得本发明着重研究了发面团系统，其中添加酶可以减少发面团发酵的时间而无酵母味道降低的副作用，在速制面团法(大多数欧洲用的过程)中酶可以提供酵母味道，而一般以该过程制备的产品会缺少这种味道。

在不局限于任何理论的情况下，我们坚信，当具有外肽酶活性的单成分酶与解淀粉酶组合使用时，就可以进一步改善烘烤产品的味道和/或外皮色泽，尤其是与能够从面粉或面团其它组成中释放还原糖分子的解淀粉酶组合使用时。还原糖在面团中的数量增长可以增强烘烤过程中发生的Maillard反应，因此可进一步改善烘烤产品的味道和外皮色泽。

                 利用本发明的酶来降低苦味

本发明的酶或酶制剂可用于降低食料中蛋白质和/或蛋白质水解产物的苦味。

依据本发明还可以推测在从蛋白质和/或蛋白质水解产物中产生出游离氨基酸。在这方面，谷氨酸可以提高食品的味道。

所述蛋白质或蛋白质水解产物可以是动物或植物来源的。

在本发明的实施方案中，所水解的蛋白质是酪蛋白或大豆蛋白。

蛋白质可用来生成如奶酪的食料和含可可的食料。

尽管用本发明的酶所富集的氨肽酶和酶制剂可与特别优先用于生成无苦味的蛋白质或蛋白质水解产物，本发明的氨肽酶还可以用于多种的工业用途，包括降解或修饰含蛋白质的多种物质(如细胞壁)。诸如伸展蛋白的某些蛋白质是植物细胞壁的组成成分。因而氨肽酶可以促进植物细胞壁的降解或修饰。

可依据本技术领域熟知的方法来确定本发明的酶制剂剂量和使用该制剂的其它条件。

                       从植物中提取油

依据本发明的酶制剂可以用来从植物源(如橄榄和油菜)中提取油，或者从不同的水果(如苹果、梨和柑橘)中榨取汁液。它还可以用于酒行业来防止混浊的形成，特别是在白酒行业。再者，它还可用来修饰和降解蛋白质，例如用来降低蛋白质引起或部分引起的粘度，或者用来促进涉及蛋白质的发酵过程，或者用来改善蛋白质和其它营养物的可消化性。

                 在制备食品和饲料中的应用

氨肽酶制剂还可以用于食品和饲料业中以改善蛋白质的可消化性。例如，可在动物饲料中加入该酶或酶制剂，或者用来处理动物饲料，尤其是小猪或家禽的饲料。

另外，本发明的酶或酶制剂可用于从诸如植物蛋白质(如大豆、豌豆、羽扇豆或油菜籽蛋白质)、乳(如酪蛋白)、肉类蛋白质或鱼类蛋白质中制造蛋白质水解产物。氨肽酶可以用于蛋白质水解产物以改善溶解能力、稠度或发酵能力，用来降低抗原性或用于其它用途来制造食品、饲料或医药产品。氨肽酶可以单独使用或同其它氨肽酶或其它酶类(如外肽酶)一起使用。将本发明的氨肽酶同富含外肽酶的酶一起使用可改善蛋白质水解产物的味道。

再者，该酶或酶制剂可用于鱼或肉类的加工中，例如可用来改变组织结构和/或粘性。

                      在酿造过程中应用

该酶制剂还可以用来促进发酵过程，譬如对大麦、麦芽和其它原材料的酵母发酵过程以制造诸如啤酒的产品。

                      用来制造原生质体

该酶制剂可用来从真菌中制造原生质体。

                         用来生产肽

该酶制剂可用来从蛋白质中生产肽，其优势在于它使用了基本不含其它解蛋白活性的克隆化酶。

                       用来降解蛋白质

另外，该氨肽酶制剂可用来降解蛋白质以促进不同产品的纯化或浓集，例如用来纯化或浓集树胶(如瓜耳胶、黄原胶)，用来进行丝的脱胶，或者改善绒毛的质量。

                      用来清洗接触透镜

该酶或酶制剂还可用来清洗接触透镜。

本发明将在如下的实施例中进行详细的描述，这些实施例绝不是限制本发明所要求的范围。

                       方法和材料

                          材料

供体生物：米曲霉A01568(如美国专利No.3,914,436所述)

宿主生物：

大肠杆菌MC1061[Meissner等人，(1987)，美国自然科学学术汇编，84，4171-4176：cDNA文库菌种]

酿酒酵母W3124[van den Hazel等人，(1992)，欧洲生物化学杂志，207，277-283]：活性筛选菌种

粟酒裂殖酵母：Broker等人，(1989)，欧洲生物化学学会联合会通讯，248，105-110

其它生物：米曲霉A1560[Christensen等人，(1988)，生物/技术6，1419-1422]。

质粒：

pYES 2.0：转化载体(Invitrogen)

pHD414：曲霉表达载体是质粒p775的衍生物(如欧洲专利238,023所述)。pHD414的构建进一步描述于WO 93/11249中。pHD414含有黑曲霉葡糖淀粉酶终止子和米曲霉TAKA淀粉酶启动子。

pHD423是带有新的多接头的pHD414的微生物(如WO 94/20611所述)。

pUC18：表达载体[Sambrook等人，(1989)，分子克隆：实验室手册，第2版；冷泉港实验室，冷泉港，纽约]。

pC1EXP3：含有编码本发明35kDa氨肽酶的1.4kb cDNA插入子的质粒(见实施例3和SEQ ID No.1)。

pC1EXP4：含有cDNA序列的质粒，其比pC1EXP3 1.4kb cDNA插入子短120bp(见实施例10和SEQ ID No.12)。

p3SR2：冠构曲霉amdS+基因携带质粒[Christensen等人，(1988)，生物/技术，6，1419-1422]。

pP1：酵母表达载体，其为含有ADH启动子和URA3(选择性标记物)的大肠杆菌/粟酒裂殖酵母穿梭载体[Broker等人，(1989)，欧洲生物化学学会联合会通讯，248，105-110]。

引物：通用pUC引物[Sambrook等人，(1989)，如上]

              在PCR反应中所使用引物的推断序列

s2：

5’-GAR  ACI  GTI  CAR  AAY  CTI  AT-3’

s3：

5’- GAY  AAR  AAR  AAY  TTY  GAW  ACI  GT -3’

as1：

5’- TCI  ACR  TTR  TCI  GTI  ATI  ATY  TCI  AT -3’

(s＝意义，a s＝反义)

A＝腺嘌呤

G＝鸟嘌呤

C＝胞嘧啶

T＝胸腺嘧啶

I＝脱氧肌苷

Y＝C或T

R＝A或G

W＝A或T

正向和反向pYES引物(Invitrogen)

酶：

赖氨酸特异性蛋白酶

Novozym_234(Novo Nordisk A/S)

Alcalase_(Novo Nordisk A/S)

Neutrase(Novo Nordisk A/S)

35kDa氨肽酶的肽(见SEQ ID No.6-11)

N-末端：

对真实和重组氨肽酶N-末端的直接序列测定表明，两种酶具有相同的N-末端氨基酸序列，这表明对重组酶进行了与真实酶相同的解蛋白处理。

Tyr-Pro-Asp-Ser-Val-Gln-His-Xaa- Glu-Thr-Val-Gln-Asn-Leu-Ile-

                                s2------>

Lys-Ser-Leu- Asp-Lys-Lys-Asn-Phe-Glu-Thr-Val-Leu-Gln-Pro-

              s3------>

(Xaa是糖基化的Asn残基)

通过用赖氨酰特异性蛋白酶进行裂解，从衍生自氨肽酶S-羧甲化样品的肽中得到了下列肽序列。

肽1：

Tyr-Pro-Asp-Ser-Val-Gln-His-Xaa-Glu-Thr-Val-Gln-Asn-Leu-Ile-Lys

肽2：

Gly-Val-Thr-Val-Glu-Pro-Phe-Lys

肽3：

Val-Ile-Val-Asp-Ala-Tyr-cys-Thr-Ile-Pro-Thr-val-Asp-Ser-Lys

肽4：

Gly-Thr-Thr-Asp-Ala-Gly-Lys-Pro-Glu-Ser- Ile-Glu-Ile-Ile-Thr-

                                        <-------asl

Asp-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Leu-Thr-Lys

肽5：

Asn-Phe-Glu-Thr-Val-Leu-Gln-Pro-Phe-Ser-Glu-Phe-His-Asn-Arg-

Tyr-Tyr-Lys

(重叠和扩展N-末端序列)

培养基和其它材料：

STC：1.2M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH＝7.5，10mM CaCl₂ BSA(Sigma，H25型)

亮氨酸-7酰胺-4-甲基香豆素(Sigma)

PEG 4000(聚乙二醇，分子量＝4,000)(BDH，英国)

Sequenase^_Kit(美国生物化学公司)

Hybond-N尼龙膜(Amersham，美国)

Q-琼脂糖(Pharmacia Tm)

Superdex 200 Tm

Amicon膜

VG Analytical Tofspec

α-氰4-羟基肉桂酸(Aldrich，Steinheim，德国)

YPD：10g酵母膏，20g胨，加水至810ml。高压灭菌，加入90ml20％的葡萄糖(无菌过滤)。

10×基础盐：66.8g酵母氮碱，100g琥珀酸，60g NaOH，加水到1000ml，无菌过滤。

SC-URA：90ml 10×基础盐，22.5ml的20％酪蛋白氨基酸，9ml 1％的色氨酸，加水至806ml，高压灭菌，加入3.6ml 5％的苏氨酸和90ml20％的葡萄糖或20％的半乳糖。

SC-H培养液：7.5g/l无氨基酸的酵母氮碱。11.3g/l的琥珀酸，6.8g/l的NaOH，5.6g/l无维生素的酪蛋白氨基酸，0.1g/l的色氨酸。121℃下高压灭菌20分钟。之后，在每100ml培养液中加入10ml 30％的半乳糖液，5ml 30％的葡萄糖液和0.4ml 5％的苏氨酸液。

SC-H琼脂：7.5g/l无氨基酸的酵母氮碱，11.3g/l的琥珀酸，6.8g/l的NaOH，5.6g/l的无维生素的酪蛋白氨基酸，0.1g/l的色氨酸和20g/l琼脂(Bacto)。121℃下高压灭菌20分钟。之后，在每450ml琼脂中加入55ml 22％的半乳糖液，1.8ml 5％的苏氨酸液。

YNB-1琼脂：3.3g/l的KH₂PO₄，16.7g/l的琼脂，pH调至7。121℃下高压灭菌20分钟。之后，在每450ml琼脂中加入25ml 13.6％的无氨基酸的酵母氮碱，25ml 40％的葡萄糖液，1.5ml 1％的L-亮氨酸液和1.5ml 1％的组氨酸液。

YNB-1培养液：组成同YNB-1琼脂一样，但无琼脂。

基本平皿[Cove生物化学及生物物理记述113(1996)51-56]含有1.0M蔗糖，pH7.0，10mM乙酰胺(作为氮源)和20mM的CsCl。

乳清蛋白质水解产物：用Alcalase_和Neutrase_水解乳清，再用水稀释，直到蛋白质的含量为整体溶液的8％(w/w)。

                           方法

RNA分离：通过用硫氰酸胍提取随后通过5.7M CsCl垫[Chirgwin等人，(1979)，生物化学，18，5294-5299]进行超离心，从冷冻、粉状的米曲霉A01568菌丝体中制备出整体RNA。通过寡(dT)-纤维素亲和色谱方法来实施聚(A)⁺RNA[Aviv，H，和Leder P，(1972)，美国自然科学学术汇编，69，1408-1412]。

cDNA的合成：从5μg米曲霉聚(A)⁺RNA中合成双链cDNA，如Kofod等人所述，生物化学杂志，(1994)，269，29182-29189，不同点在于在第一次链合成中加入25ng的随机六核苷酸引物(Pharmacia，瑞典)。

                     cDNA文库的构建

进行cDNA文库的构建，如Kofod等人所述，生物化学杂志，(1994)，269，29182-29189。

                     酿酒酵母的转化

为了确保所有的细菌克隆都能在酵母中得到检测，将比源库池中的细菌克隆数量高出5倍的酵母转化体数目作为一种限制。

将来自各个库池的1μl等分试样的纯化质粒DNA(100ng/μl)电穿孔(200Ω，1.5kV，24μF)至40μl的感受态酿酒酵母细胞中(在500ml YPD中OD600＝1.5，在冷蒸馏水中冲洗2次，在1M的冷山梨醇中冲洗1次，在0.5ml 1M的山梨醇中重悬浮，Becker和Guarante，1991)。添加1ml 1M的冷山梨醇之后，将80μl等分试样涂敷在SC+葡萄糖-尿嘧啶的平皿上而达到250-400c.f.u./平皿，在30℃下温育3-5天。

                  粟酒裂殖酵母的转化

对粟酒裂殖酵母进行转化，如Broker(1987)所述，生物技术，5，51-517。

从米曲霉中提纯35kDa氨肽酶

将1g米曲霉A01568发酵上清液的冷冻、干燥粉末溶解于100ml的Tris-乙酸缓冲液中(25mM，pH8)。离子强度为2mSi。将悬浮液通过45μ微孔过滤器进行过滤。过滤后的溶液上200ml的阴离子交换色谱柱(填充有Q-琼脂糖)，其用Tris-乙酸缓冲液进行过平衡。从流出液中收集碱性蛋白酶—即主要的内蛋白酶(等电点为8)。用Tris-乙酸缓冲液来冲洗色谱柱，直到流出液中再无紫外线吸附物质出现。

用线性盐梯度来洗脱所束缚的蛋白质，即在Tris-乙酸缓冲液(pH为8)中使用0-0.5M的NaCl，10柱体积，流速为4ml/分钟。汇集含有氨肽酶活性(见下)的级分，用Tris-乙酸缓冲液进行透析(25mM，pH为6)。

将透析后含有活性的库池pH值调至6，离子强度至2mSi，上50ml的高性能Q-琼脂糖柱(用25mM的Tris-乙酸缓冲液平衡，pH为8)进行阴离子交换色谱分析。冲洗该柱直到流出液中的紫外线吸附物质在280nm处低于0.05。用20柱体积的线性盐梯度(从0-0.5M NaCl)来洗脱所束缚的活性，流速为2ml/分钟。汇集含有氨肽酶活性的级分，用50mM乙酸钠缓冲液(pH为6)，超过滤进行浓缩。

将含有氨肽酶活性的2ml浓缩库池上Superdex 200 Tm柱，该柱用含0.1M的NaCl的50mM乙酸钠缓冲液平衡(pH为6)。进行凝胶过滤，流速为0.5ml/分钟。汇集含有氨肽酶活性的样品，利用Amicon膜进行超过滤浓缩，截断值为10kDa。

测定米曲霉氨肽酶的N-末端和内部肽的氨基酸序列：

用赖氨酰-特异性蛋白酶来消化纯化的天然氨肽酶的S-羧甲基化样品，通过反相高压液体色谱法(HPLC)来分离所得到的肽，并如Matsudaria所示进行序列测定，见“用于微序列测定的蛋白质和肽提纯的实用指南”，3-88，学术出版公司，圣迭哥，加利福尼亚，根据生产商说明书参见应用生物系统公司的473A序列测定仪(应用生物系统公司)。

用于氨基酸序列测定的试剂和溶剂均来自应用生物系统公司(Foster城，加利福尼亚)。

PCR引物的设计：

PCR引物的设计如Kofod等人所述，生物化学杂志，(1994)，269，29182-29189。

使用PCR进行的氨肽酶cDNA探针的产生：

利用每份500pmol所设计的引物，配合500pmol pYES 2.0多接头引物(正向和反向)、DNA热循环器(Landgraf，德国)和2.5单位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer)，对来自cDNA文库池的1μg双链质粒DNA进行PCR扩增。

实施30轮PCR反应，每轮在94℃下变性反应1分钟，在55℃下退火2分钟，在72℃下延伸3分钟。

双脱氧链终止法：

该方法实施如Sanger等人所述，(1977)，美国自然科学学术汇编，74，5463-5467，使用Sequenase^_Kit和通用pUC引物。

利用Southern印迹分析来鉴定阳性cDNA克隆:

通过Southern印迹杂交来鉴定阳性克隆，使用的是0.5kb无规引物³²P标记性PCR产物或作为探针的35kDa氨肽酶。杂交实施的条件为2×SSC，5×Denhardt溶液，0.5％(w/v)SDS，100μg/ml变性鲑精DNA，时间48小时，温度65℃，随后严格冲洗，2×SSC(2×15分钟)，2×SSC，0.5％SDS(30分钟)，0.2×SSC，0.5％SDS(30分钟)，最好2×SSC(15分钟)，温度65℃[Sambrook等人，(1989)，如上述]。

电泳

在0.7％琼脂糖凝胶(来自SeaKem，FMC)上进行电泳。

毛细管印迹法

毛细管印迹法如Sambrook等人所述(1989，如上)，使用10×SSC转移缓冲液。

对杂交克隆进行严格冲洗：

在2×SSC中实施2×15分钟的冲洗，在0.1×SSC、0.5％SDS中实施2×30分钟的冲洗，在2×SSC中实施15分钟的冲洗，温度65℃。

米曲霉的转化

米曲霉的转化如Christensen等人所述，(1988)，生物技术6，1419-1422。

曲霉属的氨肽酶表达盒构建

使用标准程序从阳性大肠杆菌克隆中分离出质粒DNA，并通过限制性内切酶进行分析。利用适宜的限制性内切酶来剪切cDNA插入子，并连接到曲霉属表达载体上。

米曲霉或黑曲霉的转化(通用程序)

将100ml YPD(Sherman等人，酵母遗传学方法，冷泉港实验室，1981)用米曲霉或黑曲霉的孢子接种，在37℃下震荡温育约2天。通过miracloth过滤来收获菌丝体，用200ml 0.6M的MgSO₄冲洗。将菌丝体悬浮在15ml1.2M的MgSO₄·10mM NaH₂PO₄，pH＝5.8。将悬浮液在冰上冷却，加入含120mg Novozym^_234的缓冲液1ml。5分钟后，加入12mg/ml的BSA 1ml，在37℃下轻微搅拌，持续温育1.5-2.5小时，直到在显微镜下检测样品可看到大量的原生质体。

将悬浮液通过miracloth进行过滤，把滤液转移至无菌试管中，用5ml0.6M的山梨醇、100mM Tris-HCl、pH＝7.0重叠。在100g下离心15分钟，从MgSO₄垫的顶端收集原生质体。在原生质体悬浮液中加入2体积的STC，在1000g下将混合物离心5分钟。将原生质体丸粒重悬浮在3ml的STC中并再次制成丸粒。重复这一过程。

最后将原生质体重悬浮在0.2-1ml的STC中。

将100μl的原生质体悬浮液和5-25μg的适宜DNA在10μl的STC中进行混合。将原生质体和p3SR2(一种携带冠构曲霉amdS基因的质粒)。把混合液在室温下放置25分钟。加入0.2ml 60％的PEG 4000，10mM的CaCl₂和10mM的Tris-HCl，pH7.5，仔细混合(两次)，最后加入0.85ml的相同溶液并仔细混合。将混合液在室温下放置25分钟，在2500g下旋转15分钟，并在2ml 1.2M的山梨醇中重悬浮丸粒。再经过一次沉淀之后，将原生质体涂抹到适当的平皿上。把原生质体涂抹到基本平皿上以抑制背景的生长。在37℃下温育4-7天之后挑选出孢子，涂抹为单菌落。重复该过程，在两次重分离之后，将单菌落的孢子储存为所定义的转化体。

米曲霉转化体的提纯：

通过分生孢子在AmdS⁺-平皿(+0.01％Triton X-100)上并于30℃下在YPM中生长3天来提纯米曲霉菌落。

对氨肽酶阳性米曲霉转化体的鉴定：

在琼脂平皿(重叠有60μg/ml的亮氨酸-7酰胺-4甲基香豆素)上对得自米曲霉转化体的上清液进行氨肽酶的检测。通过在30℃下温育5分钟-2小时后在紫外线荧光下分析平皿来鉴定阳性转化体。

SDS-PAGE分析：

对来自米曲霉氨肽酶生产用转化体的上清液进行SDS-PAGE分析。将该转化体在5ml的YPM中生长3天。将10μl的上清液上12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶，而后用考马斯亮蓝进行染色。

质谱分析

在 VG Analytical TofSpec中使用基质辅助性激光解吸电离飞行时间质谱法进行质谱分析。对质谱分析来说，将2μl的样品同2μl饱和基质液[0.1％TFA：乙腈(70∶30)中的α-氰基-4-羟基肉桂酸]和2μl点在靶平皿上的混合物相混合。在引入质谱分析仪之前，蒸发去除溶剂。在阈值激光强度下通过4ns激光脉冲(337nm)来解吸和电离样品，通过25kV的加速电压而加速加入无场飞行试管中。通过设置在1850V下的微槽平皿对离子进行检测。用已知质量的蛋白质从外部对光谱进行校准。

免疫交叉反应性：

通过使用纯化氨肽酶来制备用于测定免疫交叉反应性的抗体。特别是通过使兔子(或其它啮齿动物)免疫来培养出抗本发明氨肽酶的抗血清，依据的程序见N.Axelsen等人，定量免疫电泳手册，Blackwell科学出版社，1973，第23章；或见A.Johnstone和R.Thorpe，实用免疫化学，Blackwell科学出版社，1982(尤其是27-31页)。从该抗血清中可得到纯化的免疫球蛋白，例如可通过盐沉淀法[(NH₄)₂SO₄]，而后进行渗析和离子交换色谱分析，如在DEAE-Sephadex上。可进行蛋白质的免疫化学分析，既可通过Outcherlony双扩散分析[0.Ouchterlony，见：实验免疫学手册(D.M.Weir编辑)，Blackwell科学出版社，1967，655-706页]，通过交叉免疫电泳法(N.Axelsen等人，如上，第3和第4章)，也可以通过火箭免疫电泳法(N.Axelsen等人，第2章)。

Southern印迹分析：

根据Yelton等人(1984)从米曲霉中分离出基因组DNA(美国自然科学学术汇编，81，1470-1474页)，用BamHI、BglII、EcoRI和HindIII(10μg/样品)进行完全消化，在0.7％的琼脂糖凝胶上分级，利用10×SSC作为转移缓冲液将其变性并印迹在尼龙滤膜(Hybond-N)上，见Southern，E.M.(1975)，分子生物学杂志，503-517页。通过随机引物法对氨肽酶cDNA进行³²P标记(＞1×10⁹cpm/μg)，并用作Southern分析中的探针。杂交和冲洗条件如RNA凝胶印迹分析中所述。将滤膜在-80℃下放射性自显影12小时。

RNA凝胶印迹分析：

将 来自米曲霉的聚(A)⁺RNA(1μg)上电泳(1.2％琼脂糖-2.2M甲醛凝胶)，见Thomas，P.S.(1983)，酶学方法，100，255-2663页，然后印迹在具10×SSC(作为转移缓冲液)的尼龙膜(Nybond-N)中。通过随机引物法对氨肽酶cDNA进行³²P标记(＞1×10⁹cpm/μg)，然后在65℃下在膜上杂交18-20小时，溶液为5×SSC，5×Denhardt溶液，0.5％SDS(w/v)和100μg/ml的变性鲑精DNA。冲洗滤膜，溶液为65℃下的5×SSC(2×15分钟)，2×SSC，0.5％SDS(1×30分钟)，0.2×SSC，0.5％SDS(1×30分钟)及5×SSC(2×15分钟)。将滤膜在-80℃下放射性自显影12小时。

测定氨肽酶的活性(LAPU)

将一个LAPU定义为每分钟水解1μmol L-亮氨酸-p-硝基酰苯胺所用的酶量，方法如AF 298/1-GB所述(从Novo Nodisk A/S可索取得到)。

根据TMBS分析来确定％DH

可通过水解作用达到的程度来测定蛋白质水解的程度。在本发明的说明书中，水解作用的程度(DH)可据如下公式所定义：

$\mathrm{DH}=\frac{h}{h_{\mathrm{total}}}\&times;100\%$

h是所水解的肽键的数目，h_total是蛋白质中肽键的总数。h_total取决于原材料的类型，而h可表示为meqv亮氨酸NH₂的函数，例如可通过TNBS分析来量度。

％DH的确定如EF-9415317所述(可从Novo Nordisk A/S索取得到)。

                    对面团和面包的检测

依据本发明，可通过以下方法在面团和面包中检测添加具有氨肽酶活性的单成分酶后的效果：

面包的制作：

程序：

1.面团的调制(螺旋调制器)

700RPM下3分钟

1400RPM下5分钟

调制时间事先由有经验的面包师根据所用面粉进行确定并调整，以便能在本检测条件下达到最佳的面团稠度。

2.第一次实验：30℃-80％RH，15分钟

3.标度和定型；

4.在周围环境下搁置5分钟；

5.最终实验：32℃-80％RH，面包卷45分钟，面包55分钟；

6.烘烤：225℃，面包卷22分钟，枕形面包30分钟。

               对面团和烘烤产品的评估

如下对面团和烘烤产品进行评估：

枕形面包的比容：使用传统油菜籽方法来衡量4个枕形面包体积的平均值。按每g面包的体积ml来计算比容。将对照组(无酶)的比容定义为100。如下计算出相对比容指数：

可依据以下尺度从视觉上来评估面团粘性和面心结构：

面团粘性：    近乎液体      1

              过于粘着      2

              粘着          3

              可接受        3.5

              正常          4

              干燥          5

面心结构：    很差          1

              差                 2

              非均匀             3

              均匀/良好          4

              优秀               5

震动测试：第二次实验之后，将盛有面团的一个平锅从20cm高度处扔下。将面团进行烘烤，确定所制作面包的体积。

酵母味道

    对照组        3

    略有改善      3.5

    改善          4

面心色泽

可从视觉上来确定面心色泽

                          实施例

实施例1 cDNA文库的构建

从米曲霉A01568中提取全部RNA。利用寡(dT)-纤维素亲和色谱来分离聚(A)+RNA，并合成双链cDNA(ds cDNA)。

将来自米曲霉A01568的cDNA文库(由3.5×10⁶个克隆组成)构建入酵母表达载体pYES 2.0中。

实施例2  cDNA克隆的扩增和特性分析

如“材料和方法”章节中所述，从米曲霉A01568中提纯氨肽酶。

用赖氨酰-特异性蛋白酶对S-羧甲基化纯蛋白质进行消化，得到氨肽酶的1个长NH₂-末端序列和4个内序列(包括肽1-5)。

根据这些序列合成出3个引物(分别是as1、s2和s3)。如“材料和方法”章节中所述，将双链cDNA(ds cDNA)用作PCR扩增试验中的模板。

对所生成PCR产物的分析揭示出带有一引物对(引物s3和引物as1)的0.5kb片段。

将PCR片段亚克隆到SmaI酶切的脱磷酸化pUC18载体中，利用如“材料和方法”章节中所述的双脱氧链终止方法从两端来进行序列测定。

除了引物所编码的残基之外，由得自纯化氨肽酶的肽2序列(与所推论的氨基酸序列线匹配)可以确定：所需的cDNA种类已经被PCR特异性地扩增了。

实施例3对编码来自米曲霉的氨肽酶的克隆之cDNA文库的筛选

通过上述菌落杂交筛选出来自米曲霉A01568的cDNA文库的约10,000个菌落。其产生出带有插入子(范围650bp-1.5kb)的阳性克隆。

按上述“材料和方法”章节中所述，用Southern印迹分析法分析这些阳性克隆。

将来自氨肽酶cDNA克隆的纯化质粒DNA(约1μg)用HindIII和XbaI进行完全消化，以从pYES载体中释放出cDNA插入子。将样品进行电泳分析，通过毛细管印迹方法将其转移至Hybond-N尼龙膜。严格冲洗滤膜，可得到带有插入子(范围900bp-1700bp)的阳性克隆。

通过对带有正向和反向pYES引物的cDNAs末端进行序列测定，可分析强烈杂交的克隆。

对序列数据的分析表明，其中一些克隆是截断的cDNAs，而另外一些似乎是完整的克隆。所得到的完整克隆之一(pC1EXP3，如表1所述)的核苷酸序列和推论性氨基酸序列含有1.4kb的cDNA插入子。

实施例4  氨肽酶米曲霉中的表达

为了能在米曲霉中大量生成氨肽酶，将来自pC1EXP3克隆的cDNA插入子亚克隆到pHD423中，并同AmdS⁺质粒共转化到米曲霉中，如上所述。

通过Hind III和Not I消化，从pYES 2.0中分离出来自pC1EXP3的1.4kb的cDNA插入子，连接到Not I/Hind III裂解的pHD 423载体上，然后转化入大肠杆菌。

将所生成的转化体提纯两次(如上)并如上述进行氨肽酶活性的检测。转化体pA3EXP3/1表现出可检测到的氨肽酶活性。

实施例5  氨肽酶生成用转化体(pA3EXP3/1)的表达水平

利用非转化性米曲霉A01560菌种作为负对照及米曲霉A01568菌种作为正对照，通过DSD-PAGE来半定量测定来自转化体(pA3EXP3/1)的分泌性氨肽酶的数量和纯度(表达水平)，参见表1。

在pA3EXP3/1中可以看到一个36-37kDa的多肽，但在负对照中没有。重组氨肽酶的大小比天然氨肽酶(约35kDa的双条带)高出约2kDa，可能是由于附加的糖基化或其它类型的转译后修饰作用。

实施例6

质谱法显示，由于所测定的质量超过了由cDNA序列计算出的多肽质量32.4kDa，重组氨肽酶被糖基化了。

重组氨肽酶的平均质量为34.1kDa，其质量范围为33kDa-35kDa。

通过SDS-PAGE(如“材料和方法”中所述)所测定的表观分子量(M_w)约为35kDa。

实施例7 35kDa氨肽酶生成用转化体的发酵

米曲霉转化体pA3EXP3/1在含有150ml DAP 2C(pH＝5.9)的1升摇瓶中生长3天，温度30℃。

通过SDS-PAGE分析所估测的分泌性氨肽酶数量约为0.5g/l上清液。

实施例8 35kDa氨肽酶克隆在粟酒裂殖酵母中的表达

通过电穿孔法将完整的35kDa氨肽酶cDNA克隆pC1EXP3重转化到粟酒裂殖酵母中。通过SpeI和NotI消化从pYES 2.0载体中释放出1.4kb的cDNA插入子，并亚克隆至SpeI/NotI剪切性酵母表达载体pP1(一种含有ADH启动子的大肠杆菌/粟酒裂殖酵母穿梭载体)上，而后检测氨肽酶的活性。

结果表明，粟酒裂殖酵母转化体具有很强的氨肽酶活性，这说明粟酒裂殖酵母能够从米曲霉A01568中合成及分泌具功能活性的35kDa氨肽酶。

实施例9  氨肽酶基因的组织和表达

通过Southern印迹杂交(如“材料和方法”章节所述)来确定米曲霉A01568基因组中氨肽酶基因的拷贝数。用BamHI、BalII、EcoRI或HindIII来完全消化从米曲霉中分离的完整DNA，并与氨肽酶cDNA进行杂交。氨肽酶探针只能在每一情况中检测出单个强杂交片段(BamHI消化除外)，由于BamHI位点在核苷酸640处，因此可给出2个杂交片段。这意味着氨肽酶基因在米曲霉A01568基因组中是以单拷贝存在的。

实施例10

为了研究35kDa氨肽酶基因的表达，对提取自米曲霉A01568菌丝体的聚(A)⁺RNA进行Northern印迹分析。用氨肽酶cDNA来探测RNA印迹揭示了mRNA的两个种类，约1.45和1.55千碱基。这两个mRNAs似乎并不代表两个不同基因的转录物，因为当严格冲洗滤膜时会观察到相同模式的杂交。两个mRNAs大小的差异可能是由于3′-非翻译区的不同长度，因为存在有两个聚腺苷酸化位点，而依据分离自米曲霉cDNA文库的两个cDNA种类，一个对应着克隆pC1EXP3，而另一个则对应着pC1EXP4(其短120bp)。两个mRNAs都能编码同样的氨肽酶。

实施例11  去除乳清蛋白质水解产物的苦味

检测米曲霉转化体pA3EXP3/1的发酵培养液去除含8％(w/w)蛋白酶水解乳清蛋白质的溶液苦味的能力。

发酵培养液的氨肽酶活性为5.58 LAPU/g。

在含100g 8％的蛋白质水解产物的烧瓶中检测底物蛋白质溶液。加入表现出氨肽酶活性的发酵培养液，直到根据5000 LAPU/g的产品(等于12.5LAPU/g蛋白质)进行计算，酶和底物(E/S)之间的关系为0.25％，而后在50℃下重新水解6小时，pH7.0。

(利用标准方法)分别在1分钟和6小时之后来测定pH和渗析作用。使用TNSB方法(如上述)来测定％DH，使用标准方法来测定％FAA(％自由氨基酸)。

氨肽酶	1分钟后的pH	6小时后的pH	mOsm增加	通过TNBS法测得的％DH	全部％FAA
						转化体	6.47	6.65	59	7.01*	13
盲试(blind)	6.61	6.81	1		3

*通过氨肽酶对底物的水解所引起的DH增加。

盲试DH为28％

对去掉苦味的水解产物(含13％FFA)样品分析其亮氨酸含量。我们发现亮氨酸组成约为2.7％，而盲试的亮氨酸为约0.3％。

实施例12品尝测试

利用苦指数(BI)为0(不苦)和10(盲试)之间，通过5个人的品尝小组来评估去苦味蛋白质水解产物的口味。

对属于转化体的苦味3.5％蛋白质水解产物(盲试)的样品和相似样品的苦味进行评估。

我们发现属于转化体的蛋白质水解产物样品的苦指数(BI)范围约为6.2。

这个结果表明，35kDa氨肽酶去除了蛋白质水解产物样品的苦味。

实施例13  面包味道、面团粘性和面心结构

将使用每kg面粉0-300LAPU所制作的面包的味道、面团粘性和面心结构同使用商用产品Flavourzyme_制作的面包进行比较。制作面包并如上述“材料和方法”章节中所述进行评估。

我们发现下列结果(两重复的平均量)：

酶	LAPU/kg面粉	平均体积指数	味道	面团粘性	面心结构
						Flavourzyme_本发明的酶	80	112	4	3	松软及开放
0	100	3	4	作为对照
					10		100	3	4	作为对照
30	100	3	4	作为对照
					50		100	3.25	4	作为对照
80	98	3.5	4	作为对照
					100		102	3.5	4	作为对照
150	97	4	4	作为对照
					200		99	4	4	作为对照
300	100	4	4	作为对照

从上表可以看出，当每kg面粉加入量为30-300LAPU时，本发明的35kDa氨肽酶以“新烘烤性”面包的形式显著地改善了味道。本发明的氨肽酶对面心结构并无影响。与商用性蛋白酶/肽酶复合物Flavourzyme_相比，面团的粘性得到了改善。

本领域技术人员从上述说明中显然可以看出，在实施本发明而不背离其精神或其范围的前提下可以进行许多变化和改进。因此，本发明的范围要依据下列权利要求所定义的内容。

                     序列表

(1)一般情况：

(i)申请人：

(A)姓名：Novo Nordisk A/S

(B)街道：Novo Alle

(C)城市：Bagsvaerd

(E)国家：丹麦

(F)邮政编码(ZIP)：DK-2880

(G)电话：+45 4444 8888

(H)电传：+45 4449 3256

(ii)发明标题：一种有氨肽酶活性的酶

(iii)序列数目：12

(iv)计算机可读形式：

(A)媒介形式：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patent In Release#1.0，Version#1.30B(EPO)

(2)SEQ ID No.1：

(i)序列性质：

(A)长度：1409个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链况：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(vi)来源：

(B)菌种：米曲霉A01568

(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：52..1183

(xi)序列描述：SEQ ID No.1：

CGAGCATTCC GTTCGTATCG ACTTGGTGGT ACACGCTTTC GTTCTCTCAA G ATG CGT    57

                                                         Met Arg

                                                           1

TTC CTC CCC TGC ATC GCG ACT TTG GCA GCC AGG GCC TCT GCC CTT GCT     105

Phe Leu Pro Cys Ile Ala Thr Leu Ala Ala Thr Ala Ser Ala Leu Ala

          5                  10                  15

ATT GGA GAC CAT GTA CGC TCG GAC GAT CAG TAT GTC CTA GAA CTC GCC     153

Ile Gly Asp His Val Arg Ser Asp Asp Gln Tyr Val Leu Glu Leu Ala

     20                  25                  30

CCG GGA CAA ACG AAA GTG GTG ACG GAA GCA GAG AAA TGG GCT GTG AGA     201

Pro Gly Gln Thr Lys Val Val Thr Glu Ala Glu Lys Trp Ala Leu Arg

 35                  40                  45                  50

GCT GAG GGC AAG GGT TTC TTC CAT ATA ACC GAA CGG GCC AGT AGC CTG     249

Ala Glu Gly Lys Arg Phe Phe Asp Ile Thr Glu Arg Ala Ser Ser Leu

                 55                  60                  65

GAA CTC GCA TCG AAC AAG AAA CAA AAG CTC GCG GTT ACC TAC CCC GAT     297

Glu Leu Ala Ser Asn Lys Lys Gln Lys Leu Ala Val Thr Tyr Pro Asp

             70                  75                  80

TCC GTG CAA CAC AAC GAG ACC GTG CAA AAT CTG ATC AAG TCG CTC GAC     345

Ser Val Gln His Asn Glu Thr Val Gln Asn Leu Ile Lys Ser Leu Asp

         85                  90                  95

AAA AAG AAC TTC GAA ACC GTT CTC CAG CCG TTC TCG GAG TTC CAC AAT     393

Lys Lys Asn Phe Glu Thr Val Leu Gln Pro Phe Ser Glu Phe His Asn

    100                 105                 110

CGC TAT TAC AAG AGC GAC AAT GGC AAG AAA TCA TCC GAG TGG CTG CAA     441

Arg Tyr Tyr Lys Ser Asp Asn Gly Lys Lys Ser Ser Glu Trp Leu Gln

115                 120                 125                 130

GGC AAG ATT CAG GAA ATC ATC TCC GCC AGT GGA GCA AAG GGA GTC ACT     489

Gly Lys Ile Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ser Gly Ala Lys Gly Val Thr

                135                 140                 145

GTG GAG CCT TTC AAA CAC TCC TTC CCG CAG TCG AGT CTG ATT GCG AAA     537

Val Glu Pro Phe Lys His Ser Phe Pro Gln Ser Ser Leu Ile Ala Lys

            150                 155                 160

ATC CCC GGC AAG AGT GAC AAG ACC ATC GTG CTT GGA GCG PAT GAG GAC     585

Ile Pro Gly Lys Ser Asp Lys Thr Ile Val Leu Gly Ala His Gln Asp

        165                 170                 175

TCC ATC AAC CTT GAT TCA CCC TCA GAG GGC CGT GCA CCG GGA GCT GAT     633

Ser Ile Asn Leu Asp Ser Pro Ser Glu Gly Arg Ala Pro Gly Ala Asp

    180                 185                 190

GAC GAT GGA TCC GGC GTT GTT ACC ATT CTC GAA GCC TTC CGC GTT CTC     681

Asp Asp Gly Ser Gly Val Val Thr Ile Leu Glu Ala Phe Arg Val Leu

195                 200                 205                 210

GTG ACG GAC GAG AAG GTC GCA GCC GGT GAG GCT CCG AAC ACC GTT GAG    729

Leu Thr Asp Glu Lys Val Ala Ala Gly Glu Ala Pro Asn Thr Val Glu

                215                 220                 225

TTC CAC TTC TAT GCC GGA GAG GAG GGT GGT CTG CTG GGA AGT CAG GAC    777

Phe His Phe Tyr Ala Gly Glu Glu Gly Gly Leu Leu Gly Ser Glu Asp

            230                 235                 240

ATC TTC GAG CAG TAC TCG CAG AAA AGC CGA GAC GTG AAA GCC ATG CTT    825

Ile Phe Glu Gln Tyr Ser Gln Lys Ser Arg Asp Val Lys Ala Met Leu

        245                 250                 255

CAA CAG GAT ATG ACG GGT TAT ACT AAA GGC ACA ACC GAT GCT GGA AAG    873

Gln Gln Asp Met Thr Gly Tys Thr Lys Gly Thr Thr Asp Ala Gly Lys

    260                 265                 270

CCG GAG TCG ATC GGT ATC ATC ACT GAC GIC GIC GAT GAG AAC CTG ACC    921

Pro Glu Ser Ile Gly Ile Ile Thr Asp Asn Val Asp Glu Asn Leu Thr

275                 280                 285                 290

AAG TTC CTG AAG GTC ATT GTC GAT GCT TAT TGC ACT ACT CCG ACC GTC    969

Lys Phe Leu Lys Val Ile Val Asp Ala Tyr Cys Thr Ile Pro Thr Val

                295                 300                 305

GAT TCG AAA TGC GGA TAC GGA TGC TCT GAC CAT GCT TCT GCC ACG AAG    1017

Asp Ser Lys Cys Gly Tyr Gly Cys Ser Asp His Ala Ala Ala Thr Lys

            310                 315                 320

TAT GGT TAT CCC GCC GCA TTC GCA TTC GAG TCA GCC TTT GGC GAC GAC    1065

Tyr Gly Tyr Pro Ala Ala Phe Ala Phe Glu Ser Ala Phe Gly Asp Asp

        325                 330                 335

AGC CCT TAC ATT CAC TCG GCT GAT GAT ACG ATT GAG ACC GTC AAC TTT    1113

Ser Pro Tyr Ile His Ser Ala Asp Asp Thr Ile Glu Thr Val Asn Phe

340                 345                 350

GAC CAT GTG GTG CAA CAC GGC AAA CTG ACT CTT GGA TTT GCA TAT GAG    1161

Asp His Val Leu Gln His Gly Lys Leu Gly Leu Gly Phe Ala Tyr Glu

355                 360                 365                 370

CTT GCC TTC GCA GAT TCG CTG T AAGGCTTATG ACGACGGTTG TATGAGCGAG     1213

Leu Ala Phe Ala Asp Ser Leu

                375

AGATCCAGTC CAACAGTGTG TATAATATGT GGGCCCGTGT TCAAATAGCA CTTTGATTTA  1273

GCCAGTGAGT AGCTTTGGTG GCGAAAATGG AGGCCGAATT CTAGGCAACA TCGAACTGGA  1333

GGCTGTCAGG GGCGCATCAC AAGAAGTTTT GAGCTACATA AGCGAGATAA AAGTCAGAAA  1393

AAAAAAAAAA AAAAAA                                                  1409

(2)SEQ ID No.2的情况：

(i)序列性质：

(A)长度：377个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID No.2：

Met Arg Phe Leu Pro Cys Ile Ala Thr Leu Ala Ala Thr Ala Ser Ala

  1               5                  10                  15

Leu Ala Ile Gly Asp His Val Arg Ser Asp Asp Gln Tyr Val Leu Glu

             20                  25                  30

Leu Ala Pro Gly Gln Thr Lys Val Val Thr Glu Ala Glu Lys Trp Ala

         35                  40                  45

Leu Arg Ala Glu Gly Lys Arg Phe Phe Asp Ile Thr Glu Arg Ala Ser

     50                  55                  60

Ser Leu Glu Leu Ala Ser Asn Lys Lys Gln Lys Lai Ala Val Thr Tyr

 65                  70                  75                  80

Pro Asp Ser Val Gln His Asn Glu Thr Val Gln Asn Leu Ile Lys Ser

                 85                  90                  95

Leu Asp Lys Lys Asn Phe Glu Thr Val Leu Gln Pro Phe Ser Glu Phe

            100                 105                 110

His Asn Arg Tyr Tyr Lyr Ser Asp Asn Gly Lys Lys Ser Ser Glu Trp

        115                 120                 125

Leu Gln Gly Lys Ile Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ser Gly Ala Lys Gly

    130                 135                 140

Val Thr Val Glu Pro Phe Lys His Ser Phe Pro Gln Ser Ser Leu Ile

145                 150                 155                 160

Ala Lys Ile Pro Gly Lys Ser Asp Lys Thr Ile Val Leu Gly Ala His

                165                 170                 175

Gln Asp Ser Ile Asn Leu Asp Ser Pro Ser Glu Gly Arg Ala Pro Gly

            180                 185                 190

Ala Asp Asp Asp Gly Ser Gly Val Val Thr Ile Leu Glu Ala Phe Arg

        195                 200                 205

Val Leu Leu Thr Asp Glu Lys Val Ala Ala Gly Glu Ala Pro Asn Thr

    210                 215                 220

Val Glu Phe His Phe Tyr Ala Gly Glu Glu Gly Gly Leu Leu Gly Ser

225                 230                 235                 240

Gln Asp Ile Phe Glu Gln Tyr Ser Gln Lys Ser Arg Asp Val Lys Ala

                245                 250                 255

Met Leu Gln Gln Asp Met Thr Gly Tyr Thr Lys Gly Thr Thr Asp Ala

            260                 265                 270

Gly Lys Pro Glu Ser Ile Gly Ile Ile Thr Asn Asn Val Asp Glu Asn

        275                 280                 285

Leu Thr Lys Phe Leu Lys Val Ile Val Asp Ala Tyr Cys Thr Ile Pro

    290                 295                 300

Thr Val Asp Ser Lys Cys Gly Tyr Gly Cyr Ser Asp His Ala Ser Ala

305                 310                 315                 320

Thr Lys Tyr Gly Tyr Pro Ala Ala Phe Ala Phe Glu Ser Ala Phe Gly

                325                 330                 335

Asp Asp Ser Pro Tyr Ile Ile His Ala Asp Asp Thr Ile Glu Thr Val

            340                 345                 350

Asn Phe Asp His Val Leu Gln His Gly Lys Leu Thr Leu Gly Phe Ala

        355                 360                 365

Tyr Glu Leu Ala Phe Ala Asp Ser Leu

    370                 375

(2)SEQ ID No.3的情况：

(i)序列性质：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链况：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：引物

(iii)假说：无

(iv)反义：是

(xi)序列描述：SEQ ID No.3

TCTACRTTRT CTGTTATIAT YTCIAT                               26

(2)SEQ ID No.4的情况：

(i)序列性质：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链况：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：引物

(iii)假说：无

(iv)反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID No.4

GAPACIGTIC ARAAYTIAT                                       20

(2)SEQ ID No.5的情况：

(i)序列性质：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链况：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：引物

(iii)假说：无

(iv)反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID No.5

GAYAARAARA AYTTYGAWAC IGT                                  23

(2)SEQ ID No.6的情况：

(i)序列性质：

(A)长度：16个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链况：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假说：无

(v)片段类型：内部

(xi)序列描述：SEQ ID No.6

Tyr Pro Asp Ser Val Gln His Xaa Glu Thr Val Gln Asn Leu Ile Lys

1               5                   10                  15

(2)SEQ ID No.7的情况：

(i)序列性质：

(A)长度：8个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链况：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假说：无

(v)片段类型：内部

(xi)序列描述：SEQ ID No.7

Gly Val  Thr Val Glu Pro Phe Lys

1                5

(2)SEQ ID No.8的情况：

(i)序列性质：

(A)长度：15个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链况：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假说：无

(v)片段类型：内部

(xi)序列描述：SEQ ID No.8

Val Ile Val Asp Ala Tyr Cys Thr Ile Pro Thr Val Asp Ser Lys

1               5                   10                  15

(2)SEQ ID No.9的情况：

(i)序列性质：

(A)长度：24个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链况：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假说：无

(v)片段类型：内部

(xi)序列描述：SEQ ID No.9

Gly Thr Thr Asp Ala Gly Lys Pro Glu Ser Ile Glu Ile Ile Thr Asp

1               5                   10                  15

Asn Val Asp Glu Asn Leu Thr Lys

        20

(2)SEQ ID No.10的情况：

(i)序列性质：

(A)长度：29个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链况：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假说：无

(v)片段类型：N-末端

(xi)序列描述：SEQ ID No.10

Tyr Pro Asp Ser Val Gln His Xaa Glu Thr Val Gln Asn Leu Ile Lys

1               5                   10                  15

Ser Leu Asp Lys Lys Asn Phe Glu Thr Val Leu Gln Pro

            20                  25

(2)SEQ ID No.11的情况：

(i)序列性质：

(A)长度：18个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链况：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假说：无

(v)片段类型：N-末端

(xi)序列描述：SEQ ID No.11

Asn Phe Glu Thr Val Leu Gln Rro Phe Ser Glu Phe His Asn Arg Tyr Tyr Lys

1               5                   10                  15

(2)SEQ ID No.12的情况：

(i)序列性质：

(A)长度：1272个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链况：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：cDNA

(vi)来源：

(B)菌种：米曲霉A01568

(xi)序列描述：SEQ ID No.12

CTCGAGCATT CCGTTCGTAT CGACTTGGTG GTACACGCTT TCGTTCTCTC AAGATGCGTT   60

TCCTCCCCTG CATCGCGACT TTGGCAGCCA CGGCCTCTGC CCTTGCTATT GGAGACCATG  120

TACGCTCGGA CGATCAGTAT GTCCTAGAAC TCGCCCCGGG ACAAACGAAA GTTGTGACGG  180

AAGCAGAGAA ATGGGCTCTG AGAGCTGAGG GCAAGCGTTT CTTCGATATA ACCGAACGGG  240

CCAGTAGCCT GGAACTCGCA TCGAACAAGA AACAAAAGCT CGCGGTTACC TACCCCGATT  300

CCGTGCAACA CAACGAGACC GTGCAAAATC TGATCAAGTC GCTCGACAAA AAGAACTTCG  360

AAACCGTTCT CCAGCCGTTC TCGGAGTTCC ACAATCGCTA TTACAAGAGC GACAATGGCA  420

AGAAATCATC CGAGTGGTG  CAAGGCAAGA TTCAGGAAAT CATCTCCGCC AGTGGAGCAA  480

AGGGAGTCAC TGTGGAGCCT TTCAAACACT CCTTCCCGCA GTCGAGTCTG ATTGCGAAAA  540

TCCCCGGCAA CAGTGACAAG ACCATCGTGC TTGGAGCGCA TCAGGACTCC ATCAACCTTG  600

ATTCACCCTC AGAGGGCCGT GCACCGGGAG CTGATGACGA TGGATCCGGC GTTGTTACCA  660

TTCTCGAAGC CTTCCGCGTT CTCCTGACGG ACGAGAAGGT CGCAGCCGGT GAGGCTCCGA  720

AAACCGTTGA GTTCCACTTC TATGCCGGAG AGGAGGGTGG TCTGCTGGGA AGTCAGGACA  780

TCTTCGAGCA GTACTCGCAG AAAAGCCGAG ACGTGAAAGC CATGCTTCAA CAGGATATGA  840

CGGGTTATAC TAAAGGCACA ACCGATGCTG GAAAGCCGGA GTCGATCGGT ATCATCACTG  900

ACAATGTCGA TGAGAACCTG ACCAAGTTCC TGAAGGTCAT TGTCGATGCT TATTGCACTA  960

TOOOGAOOGT CGATTCGAAA TGOGGATAOG GATGCTCTGA CCATGCTTCT GCCACGAAGT  1020

ATGGTTATCC CGCCGCATTC GCATTCGAGT CAGCCTTTGG CGACGACAGC CCTTACATTC  1080

ACTCGGCTGA TGATACGATT GAGACCGTCA ACTTTGACCA TGTGCTGCAA CACGGCAAAC  1140

TGACTCTTGG ATTTGCATAT GAGCTTGCCT TCGCAGATTC GCTGIAAGGC TTATGACGAC  1200

GGTTGTATGA GCGAGAGATC CAGTCCAACA GTGIGTATAA TATGTGGGCC CGTGTTCAAA  1260

TAGCACTTAA AA                                                      1272

INDICATIONS RELATiNG TO A DEPOSITED MICROORGANISM

(PCT Rule 13bis)

Form PCT/RO/134(July 1992)

Claims (27)

1.含有编码表现氨肽酶活性的酶的DNA序列的DNA构建体，该DNA序列包括

a)SEQ ID No.1所示的DNA序列的氨肽酶编码部分，或得自大肠杆菌DSM 9965的编码氨肽酶的DNA序列，或

b)如a)定义所示DNA序列的类似物，其

i)与SEQ ID No.1所示的DNA序列同源性至少为80％，或

ii)编码一种多肽，该多肽与由含SEQ ID No.1所示的DNA序列的DNA序列所编码的多肽同源性至少为80％。

2.依据权利要求1的DNA构建体，含有如SEQ ID No.3所示的DNA序列，和/或如SEQ ID No.4所示的DNA序列，和/或如SEQ ID No.5所示的DNA序列。

3.依据权利要求1或2的DNA构建体，其中DNA序列得自真菌微生物。

4.依据权利要求3的DNA构建体，其中所述真菌微生物是丝状真菌或酵母。

5.依据权利要求4的DNA构建体，其中所述丝状真菌是曲霉属，或木霉属、青霉属、镰孢霉属、腐殖霉属或大肠杆菌DMS 9965菌株。

6.依据权利要求5的DNA构建体，其中所述曲霉属是米曲霉。

7.依据权利要求6的DNA构建体，其中所述米曲霉是保藏的米曲霉ATCC 20386。

8.依据权利要求5的DNA构建体，其中DNA序列分离自米曲霉A01568的核酸文库或依据其而产生。

9.含有依据权利要求1-8任一项的DNA构建体的重组表达载体。

10.含有依据权利要求1-8任一项的DNA构建体或依据权利要求9的重组表达载体的真菌宿主细胞。

11.依据权利要求10的细胞，该细胞是酵母细胞或丝状真菌细胞。

12.依据权利要求11的细胞，其中细胞属于曲霉属的菌株；酵母菌属的菌株；裂殖酵母属的菌株；汉逊酵母属的菌株；毕赤酵母属的菌株；Yarrowia的菌株；或克鲁维酵母属的菌株。

13.依据权利要求12的细胞，其中所述曲霉属是米曲霉或黑曲霉。

14.依据权利要求12的细胞，其中所述酵母菌属是酿酒酵母、克鲁弗酵母或葡萄汁酵母。

15.依据权利要求12的细胞，其中所述裂殖酵母属是粟酒裂殖酵母。

16.依据权利要求12的细胞，其中所述Yarrowia是Yarrowia.lipolytica。

17.依据权利要求12的细胞，其中所述克鲁维酵母属是乳酸克鲁维酵母。

18.生产表现氨肽酶活性的酶的方法，该方法包括，在适宜培养基中培养依据权利要求10-17任一项的宿主细胞，培养条件使依据权利要求1-8任一项的DNA构建体或依据权利要求9的表达载体得以表达，并从培养物中回收酶。

19.一种用于降低食料中蛋白质或蛋白质水解产物苦味的酶制剂，该制剂用依据权利要求18的方法生产的表现氨肽酶活性的酶进行富集。

20.依据权利要求19的酶制剂，其另外含有至少一种其它酶活性，包括纤维素酶、半纤维素酶、戊聚糖酶、脂肪酶、过氧化物酶、氧化酶、漆酶、木聚糖酶、肽酶和内蛋白酶。

21.将用权利要求18的方法生产的表现氨肽酶活性的酶或权利要求19或20的酶制剂用于制备食料的蛋白质水解产物。

22.依据权利要求21的应用，用于去除食料中蛋白质或蛋白质水解产物的苦味。

23.依据权利要求21或22的应用，其中待水解的蛋白质或蛋白质水解产物为动物来源的。

24.依据权利要求23的应用，其中待水解的蛋白质或蛋白质水解产物为酪蛋白或乳清蛋白。

25.依据权利要求21或22的应用，其中待水解的蛋白质或蛋白质水解产物为植物来源的。

26.依据权利要求25的应用，其中待水解的蛋白质或蛋白质水解产物为大豆蛋白。

27.一种得自真菌微生物、表现氨肽酶活性的酶，该酶包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

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