ES2081442T5 - Proteasa de bacillus licheniformis. - Google Patents

Proteasa de bacillus licheniformis.

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ES2081442T5 ES91309737T ES91309737T ES2081442T5 ES 2081442 T5 ES2081442 T5 ES 2081442T5 ES 91309737 T ES91309737 T ES 91309737T ES 91309737 T ES91309737 T ES 91309737T ES 2081442 T5 ES2081442 T5 ES 2081442T5
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Abstract

SE PRESENTA UNA NUEVA PROTEASA DERIVADA DEL BACILLUS LICHENIFORMIS. LA PROTEASA PARTE LOS ENLACES PEPTIDOS EN LOS TERMINOS CARBOXILOS DE RESIDUOS DE ACIDO PLUTAMICO ES POLIPEPTIDOS. LA PROTEASA CONTIENE UNA SECUENCIA AMINOACIDA DE SERINA EN LA POSICION +1 A GLUTAMINA EN LA POSICION +222 DE N C: 1

Description

Proteasa de Bacillus lichenimorfis.
Fundamento de la invención 1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a una nueva secuencia de DNA que codifica una proteasa que, específicamente, segmenta el enlace peptídico en los términos carboxilo de los restos del ácido glutámico en las secuencias de aminoácidos de polipéptidos, a métodos para producir la proteasa a partir de bacterias del género Bacillus, a un vector de expresión que contiene la secuencia de DNA, a un transformante obtenido introduciendo este vector de expresión en un hospedador, y a un método para producir la proteasa usando el transformante.
2. Descripción de la técnica anterior
La proteasa V8 derivada de la cepa V8 de Streptococcus aureus es ya conocida como enzima que actúa sobre proteínas (es decir, polipéptidos) y específicamente segmenta el enlace peptídico en el terminal carboxilo de los restos de ácido glutámico (Glu) (Gabriel R. Drapeau et al., J. Biol. Chem. 247, 20, 6720-6726, 1972). Esta enzima está clasificada como una proteasa de serina. C. Carmona et al. han clonado la secuencia de DNA que codifica esta enzima (Nucl. Acids. Res., 15, 6757, 1987).
También se conoce una enzima similar, una endopeptidasa que es específica para restos de aminoácidos de carácter ácido y que deriva de una bacteria actinomiceto Streptomyces griseus (Norio Yoshida et al., J. Biochem. 104, 3, 451-456, 1988). Además, también es conocida una endoproteasa que es específica para el resto de ácido glutámico, derivada de Bacillus subtilis (Takuro Niidome, Norio Yoshida, Fusahiro Ogata, Aki Ito y Kosaku Noda, J. Biochem. 108, 965-970, 1990; Abstracts of 62nd General Conference of the Japan Bio-chemical Society).
Las enzimas antes mencionadas son útiles cuando se desea la segmentación específica de proteínas en los sitios antes mencionados con la finalidad de realizar análisis estructural de proteínas, etc., o cuando se han empleado técnicas de DNA recombinante para producir una proteína deseada en forma de una determinada proteína de fusión, de la cual se ha de obtener la proteína deseada por segmentación. En este último caso, por ejemplo, cuando la proteína deseada ha sido producida en forma de una proteína de fusión en la que la proteína deseada está unida con otra proteína mediante un resto de ácido glutámico, la proteína deseada puede ser separada mediante segmentación con tal enzima. Por estas razones sería muy deseable la disponibilidad de otras proteasas que poseyesen este tipo de actividad enzimática, además de las mencionadas antes.
Los documentos WO 91/13553 y WO 91/13554 describen cada uno de ellos una proteasa que contiene una secuencia de aminoácidos desde serina en la posición +1 a glutamina en la posición +222 de la SEQ ID No: 1.
Sumario de la invención
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia de DNA que codifica una molécula de proteasa que contiene una secuencia de aminoácidos desde la serina en la posición +1 a la glutamina en la posición +222 de la SEQ ID No: 1, y segmenta las uniones peptídicas en los términos carboxilo de los restos de ácido glutámico en los polipéptidos, la cual secuencia de DNA contiene una secuencia de bases desde el resto de timina en la posición 605 hasta el resto de adenina en la posición 1270 de la SEQ ID No: 1.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir una proteasa que contiene una secuencia de aminoácidos desde la serina en la posición +1 a la glutamina en la posición +222 de la SEQ ID No: 1, el cual método comprende:
(i) aislar del Bacillus licheniformis cepa ATCC 14580, una secuencia de DNA que codifica dicha proteasa;
(ii) construir un vector de expresión que contiene dicha secuencia de DNA;
(iii) transformar un hospedador con dicho vector de expresión para producir un transformante, y
(iv) cultivar el transformante en un medio de cultivo, y recuperar la proteasa producida del medio de cultivo.
La proteasa mencionada anteriormente, que supera los inconvenientes y deficiencias antes discutidos, y otros muchos, de la técnica anterior, deriva de Bacillus licheniformis. La proteasa segmenta los enlaces peptídicos en los términos carboxi de los restos de ácido glutámico en los polipéptidos, y contiene una secuencia de aminoácidos desde la serina en la posición +1 a la glutamina en la posición +222 de la SEQ ID No: 1.
En una realización preferida, la proteasa es derivada de Bacillus licheniformis ATCC N4 14580.
En una realización preferida, la proteasa tiene las propiedades siguientes:
(1) pH óptimo: aproximadamente 8,0; y
(2) Intervalo de pH estable: pH 6,5-8,5 a 25ºC.
En una realización preferida, la proteasa contiene una secuencia de aminoácidos desde la serina en la posición +1 a la glutamina en la posición +222 de la SEQ ID No: 1, y segmenta los enlaces peptídicos en los términos carboxilo de los restos de ácido glutámico en los polipéptidos.
La secuencia de DNA de esta invención codifica la proteasa antes mencionada.
En una realización preferida, la secuencia de DNA con-tiene una secuencia de bases desde el resto de timina en la posición 605 hasta el resto de adenosina en la posición 1270 de la SEQ ID No: 1.
En una realización preferida, la secuencia de DNA codifica una proteasa que contiene una secuencia de aminoácidos desde la N-formilmetionina en la posición -94 hasta la glutamina en la posición +222 de la SEQ ID No: 1.
En una realización preferida, la secuencia de DNA con-tiene una secuencia de bases desde el resto de timina en la posición 323 hasta el resto de adenosina en la posición 1270 de la SEQ ID No: 1.
El vector de expresión de esta invención contiene la secuencia de DNA antes mencionada.
En una realización preferida, el vector de expresión es expresable en bacterias del género Bacillus.
El transformante de esta invención puede obtenerse introduciendo el vector de expresión antes mencionado en un hospedador.
En una realización preferida, el hospedador es una cepa perteneciente al género Bacillus.
Se entiende que resultarán evidentes otras diversas modificaciones y podrán ser realizadas fácilmente por los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y el espíritu de esta invención. En consecuencia, se entiende que el alcance de las reivindicaciones anexas al presente texto no está limitado a la descripción que se expone en el mismo, sino que más bien se considera que las reivindicaciones abarquen todas las características de novedad patentable que residen en la presente invención, incluyendo todas las características que serían tratadas como equivalentes de las mismas por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención.
Así pues, la invención descrita en el presente texto hace posibles los objetivos de:
(1) proporcionar una proteasa con una actividad enzimática de segmentar específicamente polipéptidos en los términos carboxilo de los restos de ácido glutámico; y
(2) proporcionar una secuencia de DNA que codifica la proteasa, un vector de expresión que contiene la secuencia de DNA, un transformante obtenido mediante la introducción del vector de expresión en un hospedador, y métodos para la producción de la proteasa usando el transformante.
Breve descripción de los dibujos
Esta invención puede ser entendida mejor, y sus numerosos objetivos y ventajas se harán evidentes a los expertos en la técnica, haciendo referencia a los dibujos anexos, de la forma siguiente:
Las Figuras 1-1 a 1-3 muestran la secuencia de DNA de la proteasa de la presente invención y la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de DNA.
La Figura 2 es un diagrama esquemático que ilustra la construcción del vector de expresión pHY300BLtt de la presente invención.
La Figura 3 es un diagrama esquemático que ilustra la construcción del vector lanzadera pHY300PLKtt usado en la construcción del vector de expresión pHY300BLtt de la presente invención.
La Figura 4 muestra gráficos que indican la elución de la enzima de la presente invención desde una columna de afinidad, en el procedimiento de extracción y purificación de la enzima a partir del medio en el que se ha cultivado el Bacillus licheniformis ATCC Ns 14580.
Descripción de las realizaciones preferidas
Los presentes inventores han realizado diversos estudios con miras a la obtención de proteasas que poseen la acción enzimática de segmentar péptidos en los términos carboxilo de restos de ácido glutámico, a partir de microorganismos distintos de los Staphylococcus aureus, etc., antes mencionados. Como resultado de estas investigaciones, los presentes inventores han descubierto una proteasa que posee la propiedad antes mencionada, derivada de Bacillus licheniformis ATCC N2 14580. Además, los presentes inventores han encontrado también una secuencia de DNA que codifica esta proteasa, y han creado un vector de expresión que contiene la secuencia de DNA, así como un transformante obtenido por introducción del vector de expresión en un hospedador, y han descubierto un método para la producción de esta proteasa usando el transformante, completando así la presente invención.
La proteasa (denominada en lo sucesivo BL-asa) es producida por bacterias del género Bacillus, en concreto por Bacillus licheniformis ATCC No. 14580. Esta cepa está disponible en la American Type Culture Collection (ATCC).
I. Condiciones de cultivo
No se requiere un medio especial para cultivar la cepa bacteriana antes mencionada, y cualquiera de los diversos tipos convencionales de medio de cultivo resulta adecuado para este fin. Por ejemplo, puede usarse un medio que contiene glucosa, polvo de soja, extracto de carne, licor "corn step", y las diversas sales inorgánicas, etc. El pH apropiado del medio es 5-9, preferentemente aproximadamente 7,0, la temperatura apropiada del medio es 15-50ºC, preferentemente aproximadamente 28ºC, y las bacterias son cultivadas, por ejemplo, aeróbicamente agitando o sacudiendo durante aproximadamente 36 horas. La enzima BL-asa fue principalmente segregada extracelular-
mente.
II. Recolección de la enzima
Pueden usarse procedimientos conocidos para la recolección y purificación de enzimas, tanto solos como en combinación, para la recolección y purificación de la presente enzima del caldo de cultivo antes citado. Por ejemplo, el caldo de cultivo puede ser sometido a filtración por presión, ultrafiltración y separación centrífuga, obteniéndose así un concentrado líquido libre de células. La enzima puede ser obtenida entonces a partir de este concentrado mediante un método de purificación apropiado. Por ejemplo, el concentrado antes mencionado puede ser sometido primero a una purificación preliminar mediante cromatografía de intercambio iónico, y después a cromatografía con S-Sepharosa, y finalmente a cromatografía de afinidad, obteniéndose así la presente enzima. En el Ejemplo 1 que se expone más adelante, la muestra de enzima con una actividad de 1,9 x 10^{3} a 2,4 x 10^{3} U/mg (analizada por el método para la medida de la actividad enzimática descrito más adelante) fue obtenida por este tipo de procedimiento. Esta muestra de enzima fue usada para la determinación de las propiedades enzimáticas descrita más adelante.
III. Método para la medida de la actividad enzimática
Z-Phe Leu Glu-pNA (en donde Z es un grupo carbobenzoxi y pNA es un grupo p-nitroanilina), usado como sustrato, se disuelve en Tris-HCl 50 mM (pH 7,5, que contiene cloruro cálcico 2 mM y DMF al 2%) de forma que se consiga una concentración final de sustrato de 0,2 mM. Se añade a esta mezcla una solución de enzima y se lleva a cabo una reacción a 37ºC durante 10 minutos, y después se mide la absorbancia a 410 nm de la p-nitroanilina liberada en el líquido por la reacción enzimática. La actividad enzimática presente cuando la absorbancia es 1,0 se define como 1 unidad (U).
IV. Propiedades de la enzima
Las propiedades enzimáticas y las propiedades químicas proteicas de la BL-asa son como sigue.
(1) Acción enzimática y especificidad por el sustrato
(i) Se prepararon los sustratos sintéticos que se indican en la Tabla 1, y cada uno de ellos fue disuelto en 50 mL de Tris-HCl (pH 7,5, que contiene cloruro cálcico 2 mM y dimetilformamida (DMF) o dimetilsulfóxido (DMSO) en las pro-porciones indicadas en la Tabla 1) de forma que se consiguiese la concentración indicada en la Tabla 1. Después se añadió la presente enzima a esta solución y se llevó a cabo una reacción a 25ºC. Se midió la absorbancia a 410 nm de la p-nitroanilina liberada en el líquido por la reacción enzimática, y se calculó la cantidad (nmoles) de p-nitroanilina liberada a partir de 1 mg de sustrato por minuto; los resultados obtenidos de esta manera se muestran en la Ta-
bla 1.
TABLA 1
50
(ii) Se eligió la cadena B de insulina oxidada como sustrato proteico, y las acciones de la presente enzima y la proteasa V8 derivada de Staphylococcus aureus sobre este sustrato fueron comparadas por el procedimiento siguiente. Primero, la cadena B de insulina oxidada fue disuelta en bicarbonato amónico 50 mM (pH 7,8), se añadió la presente enzima o la proteasa V8 antes mencionada para conseguir una relación enzima/sustrato de 1/100 (p/p), y se llevó a cabo una reacción a lo largo de un periodo de tiempo prescrito. La mezcla de reacción fue después sometida a HPLC usando una columna de 4,6 x 250 mm rellena con Vydac Protein C_{4} (300 Angstroms), que fue eluida bajo un gradiente lineal de acetonitrilo 0-50% en TFA al 0,1%, aumentando la concentración de acetonitrilo en 1,67%/min. El cartografiado del péptido reveló que, cuando se usó una cualquiera de las enzimas, los enlaces peptídicos de los términos carboxilo de los restos de ácido glutámico se segmentaron y los productos de la hidrólisis enzimática inducida por las dos enzimas eran idénticos entre sí.
Así, los resultados de los análisis (i) y (ii) antes mencionados demostraron que la presente enzima segmenta los enlaces peptídicos en los términos carboxilo de los restos de ácido glutámico, y es realmente una endopeptidasa específica para el ácido glutámico.
(2) pH óptimo e intervalo de pH estable
Se disolvió Z-Phe Leu Glu-pNA como sustrato en Tris-HCl 50 mM que contiene DMF al 10% y cloruro cálcico 2 mM. Después, se añadió a la mezcla la presente enzima, se llevó a cabo una reacción durante 15 minutos a 37ºC, y se midió la absorbancia a 410 nm de la p-nitroanilina liberada en el líquido por la reacción enzimática. La reacción antes citada fue realizada a diversos valores de pH, y los resultados revelaron que el pH óptimo para la actividad enzimática es 8,0.
A continuación, la presente enzima fue mantenida a 25ºC durante 24 horas a varios valores de pH, y en cada caso se dejó que la enzima después de este tratamiento reaccionase con un sustrato de acuerdo con los procedimientos descritos en el método para la medida de la actividad enzimática mencionado antes. Los resultados indican que el intervalo de pH estable de la presente enzima es aproximadamente 4,0-10,0. En un intervalo de pH de 6,5-8,5, la actividad enzimática se mantiene a 100%, y en intervalos de pH por encima de 4,0 hasta menos de 6,5, y por encima de 8,5 hasta 10,0, la actividad enzimática se mantiene en 80-100%.
(3) Estabilidad térmica
La presente enzima fue mantenida durante 15 minutos a diversas temperaturas en una solución tampón que contiene cloruro cálcico 2 mM a pH 7,8. En cada caso, se dejó que la enzima, después de este tratamiento, reaccionase con un sus-trato de acuerdo con los procedimientos descritos en el método para la medida de la actividad enzimática mencionado anteriormente. Los resultados indicaron que, bajo las condiciones citadas antes, la presente enzima es estable a temperaturas hasta 60ºC. Cuando la presente enzima se mantuvo de la misma forma en soluciones que no contenían cloruro cálcico, fue estable a temperaturas de hasta 50ºC.
(4) Efecto de inhibidores
La presente enzima es completamente inhibida por el fluorofosfato de diisopropilo (DFP). Este hecho indica que la presente enzima se clasifica como una proteasa de serina.
La presente enzima es también inhibida completamente por Z-Phe Leu Glu CH_{2}Cl. Este hecho indica que la presente enzima es una endopeptidasa específica para el ácido glutámico.
La presente enzima es parcialmente inhibida por EDTA, con una relación de inhibición máxima de aproximadamente 72%. Este efecto inhibidor del EDTA es anulado completamente por la adición de iones metálicos a concentraciones bajas (10^{-4} a 10^{-3} M de iones calcio o magnesio, etc.).
Los hechos anteriores indican que la presente enzima es una proteasa de serina típica, cuya estabilidad está relacionada con la presencia de iones metálicos.
(5) Peso molecular
El peso molecular de la presente enzima fue determinado mediante SDS-PAGE usando gel al 15% (1,0 mm) y marcador de peso molecular de proteínas Rainbow™ (Amersham), y se calculó que era 26.000. El peso molecular fue también calculado a partir de la secuencia de aminoácidos determinada basándose en el análisis de secuenciación de genes que se describirá más adelante, y el valor así obtenido fue 23.567, que es algo diferente del valor antes mencionado obtenido por SDS-PAGE. Sin embargo, los resultados de los diversos análisis químicos de proteínas que se describirán más adelante (composición de aminoácidos, secuencias terminales amino, composición en aminoácidos en las proximidades del término carboxilo) concordaron bien con la estructura deducida a partir de la secuencia de DNA. Esto indica que el peso molecular obtenido por SDS-PAGE era, de hecho, ligeramente superior al valor verdadero.
(6) Punto isoeléctrico
La investigación del punto isoeléctrico de la presente enzima usando el sistema FAST de Pharmacia (Pharmalite, pH 3,0-10,0) dio valores por encima de pH 9,0, y no pudo obtenerse un valor normal.
(7) Composición en aminoácidos
Usando ácido metanosulfónico 4 M (que contiene 0,2% de 3-(2-aminoetil)indol), se hidrolizó la presente enzima a 110ºC durante intervalos de tiempo preestablecidos (24, 48 o 72 horas). Los correspondientes materiales hidrolizados fue-ron después sometidos a análisis de aminoácidos usando un analizador de aminoácidos Hitachi Modelo 835. Los resultados de este análisis, corregidos para la descomposición de aminoácidos en el proceso de hidrólisis, se muestran en la Tabla 2. La composición en aminoácidos calculada a partir de la secuencia de DNA de la presente enzima (descrita más adelante) se muestra también en la Tabla 2 con fines comparativos. Los dos conjuntos de resultados mostraron claramente una buena concordancia.
TABLA 2 Composición en aminoácidos
Aminoácido Valor medido (%) Valor calculado (%)
Asp 8,38 8,10
Thr 11,68 12,61
Ser 13,49 14,41
Glu 5,48 4,95
Pro 4,79 4,50
Gly 13,61 13,06
Ala 5,24 5,41
Cys/2 1,69 1,80
Val 6,08 5,86
Met 0,93 0,90
TABLA 2 (continuación)
Aminoácido Valor medido (%) Valor calculado (%)
Ile 6,04 5,86
Leu 2,34 2,25
Tyr 7,97 7,66
Phe 2,38 2,25
Lys 2,70 2,70
His 1,73 1,80
Arg 4,11 4,05
Trp 1,37 1,80
Total 100,01 99,97
(8) Secuencias parciales de aminoácidos (i) Secuencia de aminoácidos cerca del término N
Se usó un secuenciador de proteínas Modelo 477A (Applied Biosystems) para analizar la secuencia de aminoácidos de la presente enzima en las proximidades del término amino. Las muestras de enzima usadas fueron inhibidas de antemano con DFP. La secuencia de aminoácidos desde el término amino hasta el resto 23º se muestra en la Tabla 3.
TABLA 3
Etapa de Aminoácido Recuperación Etapa de Aminoácido Recuperación
degradación (%) degradación (%)
1 Ser 24,1 13 Asn 53,2
2 Val 85,6 14 Thr 30,3
3 Ile 81,6 15 Thr 31,9
4 Gly 90,2 16 Ala 51,5
5 Ser 22,8 17 Tyr 62,3
6 Asp 51,7 18 Pro 42,7
7 Asp 73,1 19 Tyr 45,1
8 Arg 61,3 20 Arg 12,9
9 Thr 39,8 21 Ala 33,4
10 Arg 55,6 22 Ile 24,6
11 Val 65,3 23 Val 22,7
12 12Thr 36,4
(ii) Secuencia de aminoácidos cerca del término C
Se dejó actuar carboxipeptidasa A (CP-asa A) o carboxipeptidasa Y (CP-asa Y) sobre muestras de la presente enzima previamente inhibida con DFP, y las cantidades de aminoácidos liberados por estas reacciones fueron medidas con un analizador de aminoácidos Hitachi Modelo 835. Sin embargo, la secuencia de aminoácidos en las proximidades del término carboxilo de la presente enzima no pudo ser determinada con precisión usando ninguna de las carboxipeptidasas antes mencionadas. No obstante, se comprobó la presencia de glutamina, serina, alanina y asparagina en las proximidades del término carboxilo.
V. Determinación de la secuencia de DNA que codifica BL-asa
Cierta terminología empleada en la memoria de la presente invención se define de la forma que sigue.
"Oligonucleótido" se refiere a una molécula corta de DNA monocatenario. Los oligonucleótidos pueden ser sintetizados químicamente de acuerdo con métodos conocidos. A menos que se indique otra cosa, los oligonucleótidos usados en los procedimientos de la presente invención son sintetizados químicamente, y se purifican mediante cromatografía en gel usando Sephadex G50 y cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) con una columna de gel de sílice de fase inversa.
"PCR" es el acrónimo de "polymerase chain reaction" (reacción en cadena de polimerasa) y se refiere a un método de multiplicación enzimática de una región de DNA definida (Saiki et al., Science, 239, 487-497, 1988). Primero, el DNA que se ha de multiplicar se convierte en la forma monocatenaria por desnaturalización térmica, y cebadores de oligonucleótido (dos tipos, es decir, cordones con sentido y antisentido, cada uno de los cuales tiene una secuencia complementaria de la región 3'-terminal de dicho DNA de cordón único) son reasociados a las regiones en los correspondientes términos 3' del DNA monocatenario (es decir, el DNA molde). A continuación, se realiza la extensión de los cordones de DNA de los correspondientes cebadores mediante una reacción que usa DNA polimerasa. Repitiendo esta secuencia de reacciones, el DNA diana puede ser multiplicado en un factor de 100.000 a 1.000.000.
"Transferencia Southern" es un método para determinar si un gen concreto está o no contenido en un fragmento de DNA obtenido por segmentación con una determinada enzima de restricción. La transferencia Southern se realiza digiriendo primero la muestra de DNA que se está estudiando con una enzima de restricción que reconoce específicamente a una de-terminada secuencia de bases en DNA dúplex, y segmenta este DNA en sitios específicos. El material digerido así obtenido es sometido a electroforesis en gel de agarosa al 1%, y después es desnaturalizado para dar DNA monocatenario mediante tratamiento alcalino, y transferido a un filtro de nylon. Separadamente, se prepara un oligonucleótido o fragmento de DNA que constituye una porción del gen en cuestión, y se marca para obtener una sonda. Después se usa la hibridación del DNA monocatenario en el filtro de nylón con esta sonda, para detectar la presencia del gen en cuestión.
"Ligación" se refiere a la creación de un enlace fosfodiéster entre dos fragmentos de DNA dúplex. En esta técnica, para evitar la auto-ligación de los fragmentos de DNA dúplex, uno de los fragmentos es sometido a tratamiento de desfosforilación previa por el método convencional (T. Maniatis et al., "Molecular Cloning", 133-134, 1982). La ligación puede realizarse con DNA ligasa T4, usando un tipo bien conocido de solución tampón y de condiciones de reacción.
"Transformación" se refiere al fenómeno en el que el genotipo de una célula (es decir, una célula hospedadora) es transformado por la introducción de genes exógenos (DNA) en dicha célula. Una célula que ha experimentado tal transformación es conocida como un "transformante", y se caracteriza por la capacidad de replicación del DNA exógeno, bien como componente extracelular o en forma integrada en los cromosomas de dicha célula.
A continuación, el método empleado para la determinación de la secuencia de DNA de la BL-asa de la presente invención será descrito por el orden de procesos implicados. Esta secuencia de DNA fue determinada mediante el análisis del DNA del genoma del Bacillus licheniformis ATCC N4 14580 usando una combinación de análisis de PCR, transferencia Southern, técnicas de secuenciación directa, etc.
(1) Análisis de PCR de la secuencia de DNA del genoma
Puede obtenerse una secuencia del DNA que codifica a la BL-asa, por ejemplo, a partir del DNA del genoma. Para obtener el DNA, primero, el DNA del genoma de Bacillus licheniformis ATCC No. 14580 es aislado a partir de células cultivadas de dicha cepa por la técnica convencional (M. Stahl et al., J. Bacteriology, 154, 406-412, 1983). Este DNA del genoma se usa como DNA molde para análisis de PCR. Los cebadores de oligonucleótido usados para la PCR se sintetizan por métodos convencionales basándose en la secuencia de aminoácidos en las proximidades del término amino de la enzima purificada, determinada en la Sección IV Item (8) anterior, y/o las secuencias de aminoácidos de los péptidos obtenidos por hidrólisis parcial de dicha enzima. Por ejemplo, el oligonucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos Thr Asn Thr Thr Ala Tyr Pro Tyr que corresponde a las posiciones 12ª a 19ª contadas desde el término amino de la BL-asa (véase la Tabla 3) se usa como cebador con sentido BL8 (indicado por la SEQ ID No. 2). Este oligonucleótido es un tricosámero que codifica a la secuencia de aminoácidos hasta la segunda base del codón triplete para el resto de tirosina del término C.
1
Separadamente, se sintetiza otro cebador de oligonucleótido basándose en un péptido que se obtiene mediante la descomposición de la enzima purificada con lisil-endopeptidasa seguida de secuenciación, y cuya secuencia es la más fiable. Como se describe en el Ejemplo 2, más adelante, se obtiene la secuencia Gly Tyr Pro Gly Asp Lys (SEQ ID No: 8), y por tanto el octadecámero complementario a un oligonucleótido que codifica esta secuencia de aminoácidos se usa como cebador antisentido BL83 (indicado por la SEQ ID No: 3).
2
Después se lleva a cabo la PCR usando el DNA del genoma antes mencionado, el cebador con sentido BL8 y el cebador antisentido BL83, extendiendo así y multiplicando los cordones de DNA diana en el DNA del genoma. Los productos de la PCR así obtenidos son sometidos a electroforesis en gel de agarosa, obteniéndose así un fragmento de DNA de aproximadamente 370 pb. Este fragmento de DNA es incorporado a un vector adecuado y, después de subclonar, la secuencia de bases del fragmento se determina mediante la técnica de Sanger. La secuencia de aminoácidos antes citada Gly Tyr Pro Gly Asp Lys que constituía la base de la preparación del cebador antisentido BL83 fue indentificada como la situada en las posiciones 131-136 en la secuencia de aminoácidos de la BL-asa.
(2) Análisis de transferencia Southern del DNA del genoma
El DNA del genoma derivado del Bacillus licheniformis ATCC Ns 14580, preparado en el ítem (1) anterior, es digerido con la enzima de restricción SalI y, después de la separación mediante electroforesis en gel de agarosa, los fragmentos de DNA así obtenidos son transferidos sobre un filtro de membrana de nylon y analizados mediante la técnica de Southern. La sonda utilizada para la hibridación es el producto de la PCR BL8-BL83 obtenido en el ítem (1) anterior, marcado con ^{32}P-dCTP por el método convencional. El fragmento de DNA, que muestra hibridación positiva para este producto BL8-BL83, es reconocido como una banda correspondiente a una longitud de aproximadamente 3,1 kb.
(3) Secuenciación del DNA del genoma mediante PCR
El DNA del genoma de Bacillus licheniformis ATCC No. 14580, obtenido en el Item (1) anterior, es digerido con SalI, después este material de digestión es incorporado en un vector adecuado, por ejemplo el vector pUC119, y se lleva a cabo una PCR usando como cebador una porción de la secuencia de DNA conocida. Por ejemplo, una porción de la secuencia de DNA de pUC119 situada aguas arriba del DNA del genoma antes citado es usada como cebador con sentido RV (indicado por la SEQ ID No: 4), y una secuencia de DNA complementaria a una secuencia en las proximidades del término 3' del fragmento de DNA de 375 pb analizado en el ítem (2) anterior, se usa como cebador antisentido B125 (indicado por la SEQ ID No: 5).
RV: 5' - CAGGAAACAGCTATGAC
B125: 5' - TGTCCCAACAAGTGATGA
Un fragmento de DNA de aproximadamente 1050 pb se obtiene mediante la PCR. La secuencia de bases de este fragmento puede ser determinada por el método de secuenciación de DNA directo (Gibbs et al., Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 1919-1923, 1989). De esta manera, puede ser averiguada la secuencia de DNA que codifica la BL-asa desde el término amino hasta la porción media de la secuencia.
A continuación puede determinarse la porción de la secuencia en el lado 3' del DNA del genoma por el procedimiento siguiente. Primero, de la misma manera que se indicó anteriormente, el DNA del genoma del Bacillus licheniformis ATCC Nº 14580 es digerido con SalI y se aísla un fragmento de aproximadamente 3,1 kb. Este es insertado en el M13mp11, y se lleva a cabo una PCR. Los cebadores usados para esta PCR son fragmentos parciales del fragmento de DNA de 375 pb analizado en el Item (2) anterior; uno es el cebador con sentido B40 (indicado por la SEQ ID No: 6) que está situado aguas arriba del cebador antisentido B125 antes mencionado, y el otro es el cebador antisentido M4 (indicado por la SEQ ID N2 7) que tiene una secuencia de DNA complementaria a una porción de la secuencia de DNA de M13mpl1, y está situado aguas abajo del DNA del genoma.
B40: 5' - AAAACCGTCGCAACAGCC
M4: 5' - GTTTTCCCAGTCACGAC
La PCR antes mencionada proporciona un fragmento de DNA de aproximadamente 2,2 kb. La secuencia de bases de este fragmento de DNA puede ser determinada por el método directo de secuenciación de DNA. De esta manera se determina la secuencia de bases desde el término 3' hasta la porción media del DNA del genoma.
La secuencia de DNA completa de la BL-asa determinada de esta manera, así como la secuencia de aminoácidos determinada a partir de esta secuencia de DNA se muestran en la SEQ ID No: 1 y en la Figura 1. De la SEQ ID No: 1 y de la Figura 1 se reconoce que el gen que codifica la proteína madura derivada de Bacillus licheniformis contiene una secuencia de DNA que codifica un péptido señal compuesto por los 94 restos de aminoácidos desde el resto de N-formilmetionina en la posición -94 hasta el resto de lisina en la posición -1, y una secuencia de DNA que codifica la proteína madura compuesta por los 222 restos de aminoácidos desde el resto de serina en la posición +1 hasta el resto de glutamina en la posición +222. Normalmente, ATG codifica la metionina pero en este caso el TTG (fMet) parece ser el codón de inicio de la traducción. En el segmento de 332 pb de la región no traducida 5' que parte del sitio de segmentación SalI, hay una región de promotor que contiene una secuencia -35, una caja de Pribnow, y una secuencia de Shine-Dalgarno que está presente 9 bases aguas arriba desde el cordón de inicio de la traducción TTG anteriormente citado que se ha deducido. En la región no traducida 3', se localiza una repetición complementaria inversa de 13 pares de bases, 8 bases aguas abajo del codón de detención TAA.
VI. Construcción de los vectores de expresión
Como se muestra en la Figura 2, el pHY300BLtt, un ejemplo de los vectores de expresión de la presente invención, se obtiene a partir del vector lanzadera pHY300PLKtt, que contiene un terminador de proteasa alcalina derivada de Bacillus subtilis ATCC Nº 6051, insertando un fragmento de DNA que codifica BL-asa de la presente invención mostrado en la SEQ ID N2 1 (es decir, un fragmento de DNA que contiene un promotor, una secuencia de DNA que codifica un péptido señal, una secuencia de DNA que codifica el péptido maduro de BL-asa y un terminador) en dicho vector pHY300PLKtt. Como se muestra en la Figura 3, el vector pHY300PLKtt antes mencionado se obtiene a partir de un vector pHY300PLK que es un vector lanzadera de E. coli y B. subtilis, insertando un terminador de proteasa alcalina derivado de Bacillus subtilis ATCC Nº 6051 en el vector pHY300PLK.
El procedimiento antes mencionado será ahora explicado con más detalle por el orden de los procesos implicados. Primero, como se muestra en la Figura 3, el DNA del genoma es aislado del Bacillus subtilis ATCC Nº 6051 por el método de M. Stahl et al. (supra), y este se emplea como DNA molde. A continuación, un fragmento compuesto de una secuencia de DNA correspondiente a las proximidades del término 5' de la porción del terminador del gen de la proteasa alcalina derivado del Bacillus subtilis 1-168, con un sitio de segmentación XbaI añadido, y un fragmento complementario a una secuencia de DNA correspondiente a las proximidades del término 3' de la porción del terminador, con un sitio de segmentación HindIII añadido, son sintetizados químicamente, y se lleva a cabo una PCR usando estos fragmentos como cebadores. El fragmento de DNA así obtenido es después segmentado con XbaI y HindIII, obteniéndose así un fragmento (1) mostrado en la Figura 3. A continuación, el pHY300PLK es segmentado con XbaI y HindIII, obteniéndose así el fragmento mayor (2) mostrado en la Figura 3. El vector lanzadera pHY300PLKtt, que contiene el terminador de proteasa alcalina derivado del Bacillus subtilis ATCC Nº 6051, es después construido mediante la ligación de estos fragmentos (1) y (2).
A continuación, es aislado el DNA del genoma de células cultivadas derivadas de Bacillus licheniformis ATCC N4 14580, y usado como DNA molde. Después, un fragmento compuesto de una secuencia de DNA correspondiente a las proximidades del término 5' de este DNA molde con un sitio de segmentación EcoRI añadido y un fragmento complementario respecto de la secuencia de DNA correspondiente al término 3' del DNA molde con un sitio de segmentación XbaI añadido, son sintetizados y usados como cebadores con sentido y anti-sentido, respectivamente. Se lleva a cabo una PCR usando el DNA molde, el cebador con sentido y el cebador antisentido antes mencionados. Después, el fragmento así obtenido es segmentado con EcoRI y XbaI, obteniéndose así un fragmento de DNA (3) que codifica la BL-asa (véase la Figura 2). Este fragmento (3) contiene un promotor, una secuencia de DNA que codifica un péptido señal, una secuencia de DNA que codifica la BL-asa madura y un terminador. A continuación, el vector pHY300PLKtt antes mencionado es segmentado con EcoRI y XbaI, obteniéndose así el fragmento más grande (4). El vector de expresión pHY300BLtt de la presente invención es después obtenido ligando los fragmentos antes mencionados (3) y (4) (véase la Figura 2).
Este vector de expresión pHY300BLtt contiene, bajo el control del promotor de BL-asa, una secuencia de DNA que codifica el péptido señal desde el resto de N-formilmetionina en la posición -94 hasta el resto de lisina en la posición -1; una secuencia de DNA que codifica un péptido maduro que se extiende desde el resto de serina en la posición +1 hasta el resto de glutamina en la posición +222 de la BL-asa; y una región no traducida 3' que comprende un terminador. Todavía más aguas abajo, está presente el terminador de la proteasa alcalina derivado del Bacillus subtilis ATCC N4 6051.
VII. Preparación de transformantes y producción de BL-asa
El vector de expresión obtenido en la Sección VI anterior es introducido en células hospedadoras adecuadas por un método convencional. Por ejemplo, el vector pHY300BLtt antes mencionado puede ser introducido en el Bacillus subtilis ISW1214 (Takara Shuzo) por el método de J. Spiezen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 44, 1072, 1958). El transformante (Bacillus subtilis pHY300BLtt/ISW1214) es cultivado en cualquier medio adecuado para el hospedador, produciéndose así BL-asa de la presente invención. Finalmente, la BL-asa es aislada del caldo de cultivo en el que se ha desarrollado el transformante, y es purificada mediante el procedimiento que se describe en la Sección II anterior.
Ejemplos
La presente invención será ahora explicada con más de-talle con referencia a ejemplos específicos.
Ejemplo 1
Se cultivó Bacillus licheniformis ATCC Nº 14580 a 28ºC durante 36 horas en un medio de pH 7,0 que contiene 2,0% de glucosa, 2,0% de harina de haba de soja, 0,25% de licor "corn steep", 0,5% de sulfato amónico, 0,05% de hidrogéno-fosfato dipotásico, 0,05% de sulfato de magnesio heptahidrato, 0,01% de sulfato ferroso heptahidrato, y 0,3% de carbonato cálcico. Noventa y cinco litros del caldo de cultivo fueron pasados por un filtro prensa y concentrados hasta aproximadamente 14 litros por medio de un módulo de ultrafiltración (Módulo de Ultrafiltración Nitto NTU 2020T P18B (HF); valor de corte Pm 20.000) y una centrífuga (4200 rpm, 30 minutos). Este caldo concentrado libre de células fue diluido a aproximadamente 28 litros (1,90 ms/cm) con cloruro cálcico 2 mM. Después, el pH del caldo diluido libre de células fue ajustado en 6,0 mediante la adición de ácido clorhídrico. A esto se añadieron aproximadamente 4 litros de Amberlite CG-50 que había sido equilibrado con un tampón de acetato 10 mM (pH 6,0) que contiene cloruro cálcico 2 mM, y la muestra fue agitada durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de comprobar que el sobrenadante no tenía actividad de BL-asa, se desechó dicho sobrenadante. Después se empaquetó el Amberlite CG-50 en una columna de vidrio de 14 x 32 cm. Después de lavar con aproximadamente 10 litros de tampón de acetato 10 mM (pH 6,0) que contiene cloruro cálcico 2 mM, se realizó la elución con tampón de acetato sódico 0,5 M (pH 8,5) que contiene también cloruro cálcico 2 mM.
Las fracciones que tienen actividad de BL-asa eluidas del Amberlite CG-50 fueron combinadas (el volumen total de las fracciones era 2,7 litros) y dializadas frente a agua durante 48 horas. El material dializado fue diluido a 8 litros (2,23 ms/cm) con cloruro cálcico 2 mM, y, después de ajustar el pH en 6,0, el fluido fue adsorbido sobre aproximadamente 800 ml de S-Sepharosa, empaquetada en una columna de 5 x 40 cm, que había sido equilibrada de antemano con una solución tampón de acetato 5 mM (pH 6,0) que contenía cloruro cálcico 2 mM. Después de lavar con aproximadamente 5 litros de solución tampón con la misma composición que la usada para el equilibrado mencionado anteriormente, la columna fue sometida a elución con 7 litros de esta solución tampón bajo un gradiente lineal de cloruro sódico 0-0,2M. Las fracciones que tenían actividad de BL-asa fueron combinadas (el volumen total de las fracciones era 900 mL) y dializadas durante la noche frente a una solución acuosa 2 mM de cloruro cálcico, obteniéndose así aproximadamente 950 mL de material dializado (0,86 ms/cm). El pH de este material dializado fue ajustado en 7,5, y después fue inmediatamente sometido a cromatografía de afinidad. El portador usado en este proceso de cromatografía de afinidad fue aproximadamente 340 mL de CH Sepharose 4B (Phe Leu-D-GluOMe) empaquetada en una columna de 3 x 48 cm, y equilibrada con Tris-HCl 5 mM (pH 7,5) que contenía cloruro cálcico 2 mM. Después de adsorber el material dializado antes mencionado en esta columna, la columna fue lavada con aproximadamente 5 litros de solución tampón con la misma composición que la usada para el equilibrado de la columna, y después fue sometida a elución con 3,5 litros de la solución tampón de la misma composición bajo un gradiente lineal de cloruro sódico 0 - 0,7 M.
La actividad de BL-asa de cada fracción así obtenida fue medida por el método empleado para la medida de la actividad enzimática mostrado en la Sección III de Descripción de las Realizaciones Preferidas. Los resultados se muestran en la Figura 4. La absorbancia a 280 nm de cada fracción fue medida como un índice de concentración de proteína, y los resultados así obtenidos se muestran también en la Figura 4. Esta figura indica que la BL-asa fue eluida a una concentración de aproximadamente 0,5 M de cloruro sódico. La BL-asa así obtenida mostró una banda única en SDS-PAGE. De esta manera, se obtuvo una muestra de 833,1 mg de dicha enzima (cuantificada con un estuche de análisis de proteínas Bio Rad) con una actividad específica de 1,9 x 10^{3} - 2 x 10^{3} U/mg, a partir de 95 litros del caldo de cultivo. El rendimiento de la actividad enzimática fue 27,5%.
Ejemplo 2 Determinación de la secuencia de bases del DNA que codifica la BL-asa (1) Análisis de PCR de la secuencia de bases interna del DNA del genoma
Cien microgramos de la BL-asa purificada obtenida en el Ejemplo 1, que había sido tratada con DFP, fueron añadidos a 150 \muL de Tris-HCl 0,05 M (pH 9,0) que contiene urea 1 M, y digeridos con 1 \mug de lisil-endopeptidasa (Wako Pure Chemi-cals Industries, Ltd.) a 37ºC durante 5 horas. El material de digestión de la enzima resultante fue después aislado y purificado mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento usando una columna rellena con TSKgel ODS-120T (4,6 x 250 mm, Tosoh Co. Ltd.). Las secuencias de aminoácidos de los fragmentos digeridos así obtenidos fueron investigadas con un Secuenciador de Proteínas Modelo 477A (Applied Biosystems), determinándose así las secuencias de aminoácidos de cinco tipos de fragmentos. Tres de estas secuencias se indican a continuación, así como en las SEQ ID No: 8, 9 y 10.
Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Lys (I)
Ala-Ile-Val-His-Ile (II)
Ser-Thr-Arg-Tyr-Phe-Ile-Pro-Ser (III)
A continuación se aisló el DNA del genoma del Bacillus licheniformis ATCC No. 14580 por el método de M. Stahl et al. (supra), y el DNA fue usado como molde para el análisis por PCR. Los cebadores de oligonucleótidos usados para la PCR fueron preparados basándose en porciones conocidas de la secuencia de aminoácidos de la BL-asa producida por el Bacillus licheniformis ATCC No. 14580. Primero se sintetizó químicamente un oligonucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos que comienza con la 12ª posición y que termina con la 19ª posición a partir del término amino de la molécula de BL-asa (véase la Tabla 3), es decir, Thr Asn Thr Thr Ala Tyr Pro Tyr (excepto que dicho oligonucleótido se extiende solamente a través de la segunda base del triplete que codifica al resto de tirosina en el terminal carboxi del oligopéptido, es decir, dicho oligonucleótido es un tricosámero). Este fue usado como cebador con sentido BL8 (indicado por la SEQ ID Nº: 2).
3
A continuación se sintetizó químicamente un octadecámero complementario a la secuencia de DNA que codifica un fragmento de aminoácidos que es un producto obtenido en la digestión con lisil-endopeptidasa antes mencionada y que tiene una secuencia de aminoácidos con el más alto grado de fiabilidad [es decir, Gly Tyr Pro Gly Asp Lys (mostrada por la SEQ ID No. 8)]. Esta se usó como cebador antisentido BL83 (mostrada por la SEQ ID No: 3).
4
Usando el DNA molde y los cebadores de oligonucleótidos antes mencionados, el DNA fue multiplicado por el método de la PCR (Saiki et al., Science 239, 487-491, 1989). Una porción de los productos multiplicados fue analizada mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, confirmándose así la presencia de un fragmento de DNA de aproximadamente 370 pb. Este fragmento fue aislado y, después de tratar los extremos para hacerlos romos con fragmento de Klenow, el fragmento fue clonado en M13mpll que había sido digerido con SmaI, y la secuencia de DNA del fragmento fue determinada por el método de Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977). De esta manera, fue determinada la secuencia de bases de un fragmento de 375 pb y se encontró que la secuencia de aminoácidos correspondiente a BL83 estaba localizada en las posiciones 131 a 136. Además, se encontró que las secuencias de aminoácidos antes mencionadas (II) y (III) estaban localizadas en las posiciones 21 a 25 y 79 a 86, respectivamente.
(2) Análisis por transferencia Southern del DNA del genoma
El DNA del genoma derivado de Bacillus licheniformis ATCC N4 14580 obtenido por el procedimiento descrito en el ítem (1) anterior, fue digerido con la enzima de restricción SalI, y, después de separar los productos mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, los fragmentos de DNA fueron transferidos sobre un filtro de membrana de nylon y analizados por la técnica de Southern. La sonda usada para la hibridación fue el producto de la PCR BL8-BL83 obtenido en el ítem (1) anterior, y marcado con ^{32}P-dCTP por el método convencional. El fragmento de DNA que mostró hibridación positiva frente a este producto BL8-BL83 fue reconocido como una banda correspondiente a una longitud de aproximadamente 3,1 kb.
(3) Determinación de la secuencia del DNA del genoma por PCR
El DNA del genoma del Bacillus licheniformis ATCC No. 14580, obtenido en el ítem (1) anterior, fue digerido con SalI, y después los extremos de los fragmentos fueron tratados para hacerlos romos con DNA polimerasa T4. Este fragmento con terminales romos fue ligado con un vector pUC119 digerido con SmaI desfosforilado. Esta reacción de ligación fue realizada con un estuche comercial (Takara Shuzo).
A continuación, el cebador con sentido RV (indicado por la SEQ ID No. 4) y el cebador antisentido B125 (indicado por la SEQ ID No. 5), con las secuencias de bases también indica-da más adelante, fueron sintetizados químicamente y añadidos a una parte alícuota de la mezcla de reacción para la reacción de ligación antes citada, dejándose que tuviese lugar una reacción de PCR.
El cebador con sentido RV es una porción de la secuencia de DNA de pUC119 y está situada aguas arriba del DNA del genoma antes mencionado, mientras que el cebador antisentido B125 es una secuencia de DNA complementaria a una secuencia en las proximidades del término 3' del fragmento de DNA de 375 pb analizado en el Item (2) anterior.
RV: 5' - CAGGAAACAGCTATGAC
B125: 5' - TGTCCCAACAAGTGATGA
Un fragmento de DNA de aproximadamente 1050 pb fue obtenido mediante la PCR antes citada. La secuencia de bases de este fragmento fue determinada por el método de secuenciación de DNA directa (Gibbs et al., Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 1919-1923, 1989). De esta manera fue averiguada la secuencia de DNA que codifica la presente enzima desde el término 5' hasta la porción media de la secuencia.
El DNA del genoma del Bacillus licheniformis ATCC Nº14580, obtenido en el ítem (1) anterior, fue digerido con SalI y sometido a electroforesis en gel de agarosa al 1%, aislándose así un fragmento de aproximadamente 3,1 kb. Este fragmento fue tratado para hacer sus extremos romos con fragmento de Klenow, y fue ligado con fragmentos de M13mp11 digeridos con SmaI desfosforilado. Usando esto como plantilla se llevó a cabo una PCR. Los cebadores usados para esta PCR fueron cebador con sentido B40 (indicado por la SEQ ID No: 6) que es una porción del fragmento de DNA de 375 pb analizado en el Item (2) anterior (aguas arriba del cebador B125 antes mencionado), y cebador antisentido M4 (indicado por la SEQ ID No: 7) que es una secuencia de DNA complementaria a una porción de la secuencia de DNA de M13mp11 localizada aguas abajo del DNA del genoma.
M4: 5' - GTTTTCCCAGTACGAC
B40: 5' - AAAACCGTCGCAACAGCC
La PCR antes citada proporcionó un fragmento de DNA de aproximadamente 2,2 kb. La secuencia de bases de este fragmento de DNA fue determinada por el método de secuenciación de DNA directo. De esta manera se determinó la secuencia de bases desde el extremo 3' hasta la porción media del DNA del genoma.
La secuencia completa de DNA de la BL-asa determinada de esta manera, así como la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de DNA, se muestran en la SEQ ID Nº: 1 y en las Figuras 1-1 a 1-3.
La secuencia de DNA de la BL-asa, así como las secuencias de DNA que se hibridan con dicha secuencia de DNA, son también útiles para producir una proteasa con actividad de BL-asa. La secuencia de DNA que se hibrida con la secuencia de DNA de la BL-asa puede ser obtenida, por ejemplo, por el siguiente procedimiento.
Varios fragmentos de DNA, por ejemplo fragmentos de DNA derivados de varios organismos, son seleccionados usando la totalidad o parte de la secuencia de DNA de la BL-asa, p. ej. un fragmento de DNA de 1124 pb que es de A en la posición 248 a T en la posición 1371 de la SEQ ID No: 1, como sonda. Por ejemplo, se emplea la técnica de hibridación de Southern (Southern, E. M., J. Mol. Biol. 98, 503-517, 1975) usando la sonda marcada con ^{32}P, y un tampón de hibridación que tiene la composición siguiente:
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Después de llevarse a cabo la hibridación a 65ºC duran-te la noche, un filtro en el que la sonda ha sido hibridada es lavado 4 veces a temperatura ambiente con 2 x SSC, 0,1% SDS, realizándose cada lavado cuatro veces durante 10 minutos, a temperatura ambiente, obteniéndose entonces un fragmento de DNA que tiene aproximadamente un 65% de homología con la secuencia de DNA de la BL-asa. Cuando el filtro es lavado una vez durante 20 minutos a 50ºC, puede obtenerse un fragmento de DNA que tiene aproximadamente un 80% de homología con la secuencia de DNA de la BL-asa.
(4) Construcción del vector de expresión (4)-1 Contrucción del vector lanzadera pHY300PLKtt
Se aisló un DNA del genoma de Bacillus subtilis ATCC No. 6051 por el método de Stahl et al. (supra), y fue empleado como DNA molde. A continuación, como cebadores, se sintetizaron químicamente un fragmento compuesto de una secuencia de DNA correspondiente a las proximidades del término 5' de la porción del terminador de un gen de la proteasa alcalina derivado de Bacillus subtilis 1-168 (Journal of Bacteriology, 158, 411-418, 1984), con un sitio de segmentación XbaI añadido (cebador con sentido A, indicado por la SEQ ID No: 11), y un fragmento complementario a una secuencia de DNA correspondiente a las proximidades del término 3' de la porción del terminador, con un sitio de segmentación HindIII añadido (cebador antisentido B, indicado por la SEQ ID No: 12).
Cebador con sentido A:
5' - GAGTCTAGAGCAGCTGCACAATAATAG -3'
Cebador antisentido B:
5' - GAGAAGCTTGACAGAGAACAGAGAAG -3'
Después, se realizó una PCR usando el DNA molde antes mencionado y estos dos cebadores. El fragmento de DNA así obtenido fue después segmentado con XbaI y HindIII, obteniéndose así el fragmento (1) mostrado en la Figura 3. A continuación, el vector lanzadera pHY300PLK (Takara Shuzo) fue segmentado con XbaI y HindIII, obteniéndose así el fragmento más grande (2) (véase la Figura 3). Un vector lanzadera pHY300PLKtt, que contiene el terminador de proteasa alcalina derivado de Bacillus subtilis ATCC Nº 6051, fue construido después mediante la ligación de estos fragmentos (1) y (2).
(4)-2 Construcción del vector de expresión pHY300BLtt
Se aisló un DNA del genoma a partir de células cultivadas de Bacillus licheniformis ATCC No. 14580 por el método de Stahl et al. (supra) y se usó como DNA molde. Después, se sintetizaron un fragmento de DNA monocatenario correspondiente a las proximidades del término 5' de este DNA molde con un sitio de segmentación EcoRI añadido y un fragmento de DNA monocatenario complementario a una secuencia de DNA correspondiente al término 3' del DNA molde con un sitio de segmentación XbaI añadido, y se usaron como cebador con sentido C (indicado por la SEQ ID No: 13) y cebador antisentido D (indicado por la SEQ ID No: 14), respectivamente.
Cebador con sentido C:
5' - CAAGAATTCGGCTTCCCGTGCGCCTCC - 3'
Cebador antisentido D:
5' - TTGTCTAGAATTTGCCGATCAGCGGTC - 3'
Se realizó una PCR usando el DNA molde antes mencionado, el cebador con sentido C y el cebador antisentido D. Después, el fragmento así obtenido fue segmentado con EcoRI y XbaI, obteniéndose así un fragmento de DNA (3) que codifica la BL-asa (véase la Figura 2). A continuación, el vector antes mencionado pHY300PLKtt fue segmentado con EcoRI y XbaI, obteniéndose así el fragmento más grande (4). Los fragmentos antes mencionados (3) y (4) fueron después ligados con DNA ligasa T4. La mezcla de ligación fue usada para transformar E. coli K-12 C600. Los transformantes fueron cultivados sobre un medio de placa de agar que contiene ampicilina, y se seleccionaron las colonias resistentes a la ampicilina. Después se aisló el DNA plasmídico de las células de las colonias seleccionadas, y se comprobó la inserción del fragmento de DNA (3) antes mencionado en la dirección correcta a partir de los patrones de segmentación con enzima de restricción.
(5) Preparación de transformantes y producción de BL-asa
El vector de expresión pHY300BLtt obtenido en el ítem (4) anterior fue introducido en Bacillus subtilis ISW1214 (Takara Shuzo) por el método de J. Spizien et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 44, 1072 (1958)). Las bacterias fue-ron después cultivadas en un medio de agar en placa que con-tiene tetraciclina, y se seleccionaron las colonias resistentes a la tetraciclina obteniéndose así el transformante deseado (Bacillus subtilis pHY300BLtt/ISW1214).
El transformante fue trasplantado a 5 mL de medio LB (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 5 g de cloruro sódico, con adición de agua para dar un volumen total de 1 litro; pH 7,2) y cultivado en sacudidora a 37ºC durante 18 horas. Después se añadió 1 mL de este caldo de cultivo a 10 mL de medio Sc^{+} que había sido esterilizado en un autoclave a 120ºC durante 20 minutos, y se llevó a cabo su cultivo en sacudidora a 28ºC.
Composición del medio Sc'.
6
Se añade agua de forma que el volumen total sea 1 L (pH 7,0).
El caldo de cultivo antes mencionado fue centrifugado a 2500 x g durante 5 minutos y se obtuvo el sobrenadante. Se midió la actividad de BL-asa de este sobrenadante por el método de la actividad enzimática descrito en la Descripción de las Realizaciones Preferidas. Los resultados de estas medidas se muestran en la Tabla 4. La cantidad de proteína por litro de caldo de cultivo fue calculada basándose en una actividad específica de BL-asa supuesta de 2500 U/mg.
TABLA 4
Periodo de cultivo Actividad de BL-asa Contenido de proteína
(días) (unidades/mL) (mg/L)
1 15 6,0
2 56 22,4
3 72 28,8
4 79 31,6
5 69 27,6
Como se describió antes, la presente invención proporciona una secuencia de DNA que codifica una proteasa que segmenta específicamente los enlaces peptídicos en los términos carboxilo de los restos de ácido glutámico en las secuencias de aminoácidos de polipéptidos, un método para la preparación de la proteasa a partir de bacterias del género Bacillus, un vector de expresión que contiene la secuencia de DNA, un transformante obtenido mediante la introducción del vector de expresión en un hospedador, y un método para la producción de la proteasa usando el transformante. Este tipo de proteasa puede ser utilizado para diversos fines, tales como análisis de proteínas y segmentación de las cadenas peptídicas de proteínas de fusión en los sitios deseados, etc.
SEQ ID No: 1
TIPO DE SECUENCIA: nucleótidos con la correspondiente proteína
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1448 PARES DE BASES
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA: doble
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip1.000000\baselineskip
FUENTE ORIGINAL
ORGANISMO: Bacillus licheniformis
CEPA: ATCC No. 14580
\vskip1.000000\baselineskip
CARACTERÍSTICAS:
de 323 a 1270 pb CDS (E)
de 303 a 604 pb péptido señal (E)
de 605 a 1270 pb péptido maduro (E)
\vskip1.000000\baselineskip
OTRA INFORMACIÓN:
X_{aa} en posición -94 de la secuencia de aminoácidos: formil metionina
7
8
9
10 
\newpage
SEQ ID No: 2
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 23 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA: simple
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico, DNA sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACYAACACYA CYGCTTACCC RTA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No: 3
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA: simple
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico, DNA sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
YTTRTCKCCM GGATAKCC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No: 4
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA: simple
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico, DNA sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGGAAACAG CTATGAC 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No: 5
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA: simple
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico, DNA sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTCCCAACA AGTGATGA 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No: 6
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA: simple
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico, DNA sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAACCGTCG CAACAGCC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No: 7
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17 Pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA: simple
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico, DNA sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTTTTCCCAG TCACGAC 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No: 8
TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 6 aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
\vskip1.000000\baselineskip
FUENTE ORIGINAL
ORGANISMO: Bacillus licheniformis
CEPA: ATCC No. 14580
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Pro Gly Asp Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No: 9
TIPO DE SECUENCIA: aminoácido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 5 aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
\vskip1.000000\baselineskip
FUENTE ORIGINAL
ORGANISMO: Bacillus licheniformis
CEPA: ATCC No. 14580
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ile Val His Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No: 10
TIPO DE SECUENCIA: aminoácido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 8 aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
\vskip1.000000\baselineskip
FUENTE ORIGINAL
ORGANISMO: Bacillus licheniformis
CEPA: ATCC No. 14580
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Thr Arg Tyr Phe Ile Pro Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No: 11
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 27 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA: simple
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico, DNA sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGTCTAGAG CAGCTGCACA ATAATAG 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No: 12
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 26 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA: simple
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico, DNA sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGAAGCTTG ACAGAGAACA GAGAAG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No: 13
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 27 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA: simple
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico, DNA sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAAGAATTCG GCTTCCCGTG CGCCTCC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No: 14
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 27 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA: simple
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico, DNA sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGTCTAGAA TTTGCCGATC AGCGGTC 
\hfill
27

Claims (15)

1. Una secuencia de DNA que codifica una molécula de proteasa que contiene una secuencia de aminoácidos desde la serina en la posición +1 hasta la glutamina en la posición +222 de la SEQ ID Nº 1, y segmenta los enlaces peptídicos en los términos carboxilo de restos de ácido glutámico en polipéptidos, la cual secuencia de DNA contiene una secuencia de bases desde el resto timina en la posición 605 hasta el resto adenina en la posición 1270 de la SEQ ID No: 1.
2. Una secuencia de DNA según la reivindicación 1ª en la que dicha secuencia de DNA codifica una proteasa que contiene una secuencia de aminoácidos desde la N-formilmetionina en la posición -94 hasta la glutamina en la posición +222 de la SEQ ID No: 1.
3. Una secuencia de DNA según la reivindicación 2ª, que contiene una secuencia de bases desde el resto de timina en la posición 323 hasta el resto de adenina en la posición 1270 de la SEQ ID No: 1.
4. Un vector de expresión que contienen una secuencia de DNA según las reivindicaciones 1ª, 2ª o 3ª.
5. Un vector de expresión según la reivindicación 4ª, que puede expresarse en bacterias del género Bacillus.
6. Un transformante que puede obtenerse introduciendo el vector de expresión según la reivindicación 4ª o 5ª en un hospedador.
7. Un transformante según la reivindicación 6ª, en el que dicho hospedador es una cepa que pertenece al género Bacillus.
8. Un método para producir una proteasa, que comprende las etapas de cultivar un transformante según las reivindicaciones 6ª o 7ª en un medio de cultivo y recuperar la proteasa producida del medio de cultivo.
9. Un método para producir una proteasa que contiene una secuencia de aminoácidos desde la serina en la posición +1 hasta la glutamina en la posición +222 de la SEQ ID No: 1, el cual método comprende:
(i) aislar del Bacillus licheniformis cepa ATCC 14580, una secuencia de DNA que codifica dicha proteasa;
(ii) construir un vector de expresión que contiene dicha secuencia de DNA;
(iii) transformar un hospedador con dicho vector de expresión para producir un transformante, y
(iv) cultivar el transformante en un medio de cultivo, y recuperar la proteasa producida del medio de cultivo.
10. Un método según la reivindicación 9ª, para producir una proteasa que tiene las propiedades siguientes:
(1) pH óptimo: aproximadamente 8,0; y
(2) Intervalo de pH estable: pH 6,5-8,5 a 25ºC.
11. Un método según la reivindicación 9ª, en el que dicha secuencia de DNA tiene una secuencia de bases desde el resto timina en la posición 605 hasta el resto adenina en la posición 1270 de la SEQ ID No: 1.
12. Un método según la reivindicación 9ª, en el que dicho DNA codifica una proteasa que contiene una secuencia de aminoácidos desde la N-formilmetionina en la posición -94 hasta la glutamina en la posición +222 de la SEQ ID No:1.
13. Un método según la reivindicación 9ª, en el que dicha secuencia de DNA contiene una secuencia de bases desde el resto timina en la posición 323 hasta el resto adenina en la posición 1270 de la SEQ ID No: 1.
14. Un método según la reivindicación 9ª, en el que dicho vector de expresión puede expresarse en bacterias del género Bacillus.
15. Un método según la reivindicación 9ª, en el que dicho hospedador es una cepa perteneciente al género Bacillus.
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