KR19980701848A - 고열안정성 프로테아제 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열목록의 SEQ ID Nos. 1,3 및 5에 의해서 나타내지는 아미노산을 서열을 갖는 고열안정성 프로테아제 또는 그의 기능적 균등물 및 이 고열안정성 프로테아제를 암호화하는 고열안정성 프로테아제 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 유전자를 함유하는 형질전환체를 배양하여 고열안정성 프로테아제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

고열안정성 프로테아제 유전자

[기술분야]

본 발명은 그를 암호화하는 유전자 및 산업적으로 유용한 고열안정성을 갖는 프로테아제를 유전 공학적 방법에 의해 효소를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

[배경기술]

프로테아제는 단백질의 펩티드 결합을 분해하는 효소이며, 많은 프로테아제는 동물, 식물, 미생물에서 발견되고 있다. 이는 연구 작업과 의학적 공급을 위한 시약으로 이용될 뿐만아니라 세제의 첨가제, 식품 가공 과정과 역반응을 이용한 화학적 합성과 같은 산업 분야에서도 시약으로서 이용되고 있다. 그리고, 이는 산업적 관점에서 매우 중요한 효소라 말할 수 있다. 산업 분야에 이용되는 프로테아제의 경우는 매우 높은 물리 화학적 안정성이 요구되기 때문에 특히 고열안정성 효소가 사용하기에 바람직하다. 현재, 산업 분야에서 주로 이용되는 프로테아제는 바실러스(Bacillus)속의 박테리아에서 생산된 것이다. 또 왜냐하면 그들은 비교적 높은 열안정성을 갖기 때문이다.

그러나, 보다 우수한 성질을 가진 효소가 바람직하며 고온에서 자라는 미생물, 예를 들면 바실러스(Bacillus) 속의 고온성균으로 부터 효소를 얻으려고 시도해 오고 있다.

한편, 고온성균으로 불리는 미생물 그룹은 고온의 환경에 스스로 잘 적응하고 따라서 다양한 열에 안정한 효소를 공급하는 공급원으로 기대된다. 고온성균의 하나로 알려진 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)는 프로테아제를 생성한다[문헌 Appl. Microbiol., volume 56, page 1992-1998(1990), FEMS Microbiol. Letters, volume 71, page 17-20(1990), J. Gen. Microbiol., volume 137, page 1193-1199(1991) 참조].

피로코커스(Pyrococcus) 속(genus)에 속하는 고온성균 피로코커스 에스피 종(Pyrococcus sp.) 균주 KOD1은 티올 프로테아제(시스테인 프로테아제)를 생성한다고 보고 되었다[문헌 Appl. Environ. Microbiol., volume 60, page 4559-4566(1994) 참조]. 써모코쿠스(Thermococcus) 스타필로써무스(Staphylothermus)와 써모박테리오이드(Thermobacteroides)속에 속하는 박테리아는 또한 고열성균주이고, 프로테아제를 생성한다고 알려져 있다[문헌 Appl. Microbiol. Biotechnol., volume 34, page 715-719(1991) 참조].

[발명의 목적]

이러한 고열성 균주에서 생성되는 프로테아제는 고온에 안정하고, 어떤 알려진 효소가 이용되지 않는 새로운 적용에 적용할 수 있다고 기대된다. 그러나 문헌은 단지 열안정성 프로테아제 활성은 무세포 추출물 또는 배양상등액(supernatant)에서 얻을 수 있는 조(crude) 효소 용액에 존재한다고 교시하고 있고, 거기에는 단리되고 정제된 효소의 성질에 대한 개시는 없다. 단지 균주 KOD1에 의해 생성된 프로테아제는 정제된 형태로 얻을 수 있다. 그러나, 시스테인 프로테아제는 산화에 의해 쉽게 활성을 잃는 결점을 갖고 있기 때문에 산업적 이용면에서는 불리하다. 게다가 고온에서의 미생물의 배양이 이러한 고열성 균주로부터 효소를 얻기 위해서 요구되기 때문에 효소의 산업적 생산에는 문제점이 있다.

위의 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 산업적 이용면에서 유용한 고열성균의 프로테아제를 제공하고, 고열성균의 프로테아제를 암호화하는 유전자를 단리하고, 유전 공학에 의해 유전자를 이용하여 고열안정성의 프로테아제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

[발명의 개시]

고열안정성 프로테아제를 얻기 위해서, 본 발명가들은 효소의 아미노산 서열의 일부를 결정하기 위해서 미생물 세포와 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) DSM3638의 배양 상등액으로부터 프로테아제를 순수 분리하려고 최초로 시도했다. 그러나, 프로테아제의 순수 분리는 미생물 세포 또는 배양 상등액을 사용한 경우 매우 어렵고, 본 발명가들은 아미노산 서열 일부를 결정하기 위한 충분한 순도의 효소 샘플을 얻는데 실패했다.

효소 단백질의 1차 구조에 대한 정보없이 대상이 되는 효소 유전자를 클로닝하는 방법으로서, 발현 클로닝 방법이 있다. 예로, 피로코커스 오에세이(Pyrococcus woesei)(WO92/02614)에서 기원하는 플루라나아제(pllulanase) 유전자는 이러한 방법에 의해서 얻었다. 그러나, 발현 클로닝 방법에서, 플라스미드 벡터가 일반적으로 사용되고, 그러한 경우에 있어서, 목적 유전자의 내부 부분의 절단없이 DNA 단편을 플라스미드 벡터에 삽입하기 위해서 목적 유전자를 비교적 작은 DNA 단편으로 자를 수 있는 제한 효소를 사용하는 것이 필요하다. 따라서, 발현 클로닝 방법은 모든 종류의 효소 유전자의 클로닝에 항상 적용할 수 있는 것은 아니다. 게다가 많은 클론의 효소 활성에 대한 실험은 필요하며, 이러한 작업은 복잡하다.

본 발명가는 피로코커스 푸리오수스 게놈의 코스미드 라이브러리(cosmid library)를 준비하기 위해서 플라스미드 벡타 대신에 커다란 DNA 단편(30-50kb)을 유지할 수 있는 코스미드 벡터를 사용하고 프로테아제 유전자를 단리하려고 시도하였다. 프로테아제 활성을 발현하는 클론을 찾기 위해서 라이브러리에서 코스미드 클론을 조사하여 코스미드 벡터 사용에 의해서, 선별하려는 형질 전환체의 수는 효소 유전자 내부 일부분의 절단의 가능성의 감소와 더불어 감소될 수 있다. 한편, 숙주 세포에서 코스미드 벡터의 복제수는 플라스미드의 복제의 수보다 더 높지 않기 때문에, 발현되는 효소의 양은 너무나 작아서 감지할 수 없을지도 모른다.

목적 효소의 고열안정성의 관점에서, 처음으로, 본 발명가들은 코스미드 라이브러리에서 각각의 형질전환체를 배양하고, 이 단계를 이렇게 얻어진 미생물 세포로부터 오로지 열안정성의 단백질을 포함한 용해물을 준비하는 단계와 결합하고, 효소 활성을 검출하기 위해 이러한 용해물을 사용했다. 게다가, 프로테아제 활성을 검출하기 위한 젤라틴 함유 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 사용은 미소량의 효소 활성의 검출을 할 수 있게 했다.

그리하여, 본 발명가들은 피로코커스 푸르오수스의 코스미드 라이브러리로부터 프로테아제 활성을 발현하는 수개의 코스미드 클론을 얻었고, 그 클론에 삽입된 DNA 단편으로부터 프로테아제를 암호화하는 유전자를 단리할 수 있었다. 더불어, 본 발명가들은 상기 유전자로 암호화되는 프로테아제가 극단적으로 고열안정성을 갖는 것을 확인했다.

미생물에서 기원한 알려진 프로테아제의 아미노산 서열을 가진 유전자의 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 고열안정성 프로테아제의 아미노산 서열 비교에 의해, 대표적인 것이 서브틸리신(subtilisin)인 알칼리성 세린 프로테아제 그룹과 고열안정성 프로테아제의 앞부분 반의 아미노산 서열의 상동성을 확인했다. 특히 매우 높은 상동성의 효소의 촉매 활성에 중요하다고 알려져 있는 4개의 아미노산 잔기 부근의 각 영역에서 발견되었다. 그리하여, 피로코커스 푸리오수스에 의해 생성된 프로테아제는, 중온성균에서 유도된 프로테아제가 비활성화되는 고온에서 활성을 가지고, 중온성균의 효소 구조와 비슷하기 때문에, 유사한 프로테아제는 피로코커스 푸리오수스외의 다른 고열성균에 의해서 생성될 것이다.

본 발명가들은 수득된 고열안정성 프로테아제 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서, 서브틸리신(subtilisin)과 고도의 상동성을 보여주는 영역을 암호화하는 영역이 서열과 고열안정성 프로테아제 유전자를 검출하는 프로브(probe)로서 사용할 수 있고, 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머(primer)로서 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성한 DNA를 사용하는 폴리머라제 중합 효소 반응(PCR)에 의해서 고열성균주에서 기원한 프로테아제 유전자를 검출하려고 시도해 왔다. 그 결과로, 상기의 유전자와 상동성을 가진 유전자 단편이 고열성균주, 써모코커스(Thermococcus) 셀러(celer) DSM2476에 존재하는 것을 발견했다. 완전한 길이의 유전자를 클로닝하기란 어렵고, 이는 유전자로부터 생긴 생성물은 숙주에 유해함에 기인한다고 생각된다.

본 발명가들은 클로닝에 대한 숙주로써 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 사용하고 전 길이의 유전자의 은신(harboring)은 가능하고 발현된 프로테아제는 세포밖으로 분비됨을 반견하였고, 더 나아가 발현된 프로테아제가 95℃에서 프로테아제 활성을 나타내고 고열안정성을 가짐을 밝혀냈다. 상기 유전자에 의해 암호화되는 프로테아제의 분자량은 언급한 피로코커스 푸리오수스에서 유도된 고분자 프로테아제의 분자량의 반 미만임이 밝혀졌다.

또한, 프로브로써 유전자 단편을 사용한 혼성화에 의해, 우리는 고분자의 프로테아제의 것과는 다른 두번째 프로테아제가 피로코커스 푸리오수스에 존재하는 것을 발견했다. 상기 유전자에 의해 프로테아제는 써모코커스 셀러(Thermococcus celer)로부터 유래한 고열안정성의 프로테아제의 분자량과 비슷하고, 단리된 유전자는 바실러스 서브틸리스로 도입되고, 유전자로부터 발현된 생성물은 세포밖으로 분비된다. 발현된 프로테아제는 95℃에서 효소 활성을 보이고, 고열안정성을 가지고 있다. 게다가 프로테아제의 프로세싱(processing)에 의해 생성된 성숙한 프로테아제의 아미노산 서열은 밝혀졌다.

이러한 두 종의 프로테아제는 어떠한 특별한 과정없이 세포 밖으로 분비되기 때문에, 시그날 펩타이드(signal peptide)는 바실러스 서브틸리스에서 유전자 자체의 기능에 의해 암호화된다고 생각된다. 배양액당 발현된 두 종의 프로테아제의 양은 대장균이나 바실러스 서브틸리스에서 발현된 피로코커스 푸리오수스로부터 유래한 고분자량의 프로테아제의 경우와 비교하여 현저히 높다. 게다가, 그 유전자가 서브틸리신(subtilisin) 유전자의 프로모터와 시그날 서열에 의해 발현될 때, 발현된 프로테아제의 양은 더 증가된다.

더구나, 본 발명자는 두종의 프로테아제로부터 키메라 단백질인 혼성 프로테아제를 암호화하는 유전자를 만들었고, 그 유전자에 의해서 발현된 효소는 상기의 고열안정성의 프로테아제처럼 고온에서 프로테아제 활성을 나타냄을 확인했다. 이는 본 발명의 완성을 가져온다.

[발명의 요약]

본 발명의 첫번째 측면은 서열 목록의 SEQ ID No. 1에 기술된 아미노산 서열을 갖는 고열안정성 프로테아제, 그의 기능적 등가물 및 고열안정성 프로테아제를 암호화하는 고열안정성 프로테아제, 특히 서열 목록의 SEQ ID No. 2에 설명된 뉴클레오타이드 서열을 가진 고열안정성의 프로테아제를 제공한다. 더욱이, 이 고열안정성 프로테아제 유전자와 혼성화하고 유전자와 고열안정성 프로테아제를 암호화하는 유전자를 또한 제공한다.

또한, 본 발명의 두번째 측면은 서열 목록 SEQ ID No. 3에 기술된 아미노산 서열을 가진 고열안정성 프로테아제 또는 그의 기능적 등가물을 제공하거나 고열안정성 프로테아제를 암호화하는 고열안정성 프로테아제 유전자, 특히 서열목록 SEQ ID No. 4에 기술된 뉴클레오타이드 서열을 가진 고열안정성 프로테아제 유전자를 제공하는 것이다. 게다가, 이러한 고열안정성 프로테아제 유전자와 혼성화하고 고열안정성 프로테아제를 암호화한 유전자를 또한 제공하였다.

또한, 본 발명의 세번째 측면은 서열 목록 SEQ ID No. 5에 기술된 아미노산 서열을 갖는 고열안정성 프로테아제 또는 그의 기능적 등가물을 제공하거나 서열 목록 SEQ ID No. 6에 기술된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 고열안정성 프로테아제 유전자를 제공하는 것이다.

더 나아가, 본 발명의 고열안정성 프로테아제 유전자를 포함한 형질 전환체를 배양하고 배양물로부터 고열안정성 프로테아제를 모으는 것을 포함하는 고열안정성 프로테아제의 준비 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 것처럼, 용어 기능적 등가물은 다음을 의미한다. 자연적으로 생성된 단백질 중에서 아미노산의 하나 또는 몇개의 (모든 아미노산의 5%까지) 결손, 첨가, 치환과 같은 돌연 변이는 변형 반응(modification reaction)과 생체에서 생성되는 단백질의 그와 같은 반응 또는 다형화 또는 그들을 암호화하는 유전자의 돌연변이 외에 순수 분리하는 동안에 아미노산 서열에서 일어날수 있다고 알려졌지만, 앞에서 언급한 돌연 변이에도 불구하고 실질적으로 돌연 변이없는 단백질과 동일한 생리적 또는 생물적 활성을 나타내는 단백질이 있다.

단백질이 구조에서 약간의 차이를 가지고 있을때, 기능에서의 큰 차이는 감지되지 않는다. 이것을 기능적 등가물이라고 한다. 상기의 돌연 변이가 단백질의 아미노산 인위적으로 도입되고, 이 경우에, 더 다양한 돌연변이체들이 만들어질 수 있다는 것은 사실이다. 예로, 인간의 인터루킨-2(interleukin-2, IL-2)의 아미노산 서열에서 특 정의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 폴리펩티드는 인터루킨-2의 활성을 보여준다[참조, 문헌 Science, volume 224, page 1431(1984)].

본 발명의 고열안정성 프로테아제 유전자로부터 전사되고 번역된 유전자 생성물은 두 영역을 포함한 예비 효소 전구체(preproenzyme)이며, 그 중 하나는 세포외로 분비하기 위해 필요한 시그날 펩타이드이고, 다른 것은 활성형으로 발현될때 제거되는 프로펩타이드(propeptide)이다. 상기 유전자가 도입된 형질전환체는 이러한 시그날 펩타이드를 절단할 수 있고, 시그날 펩타이드가 제거된 효소 전구체(proenzyme)는 세포외로 분비된다. 더나아가, 프로펩타이드가 제거된 활성형의 효소는 프로 효소(proenzyme) 사이에서 자가 분해 반응에 의해 생성된다.

본 발명의 유전자로부터 이렇게 얻어진 모든 예비프로 효소(preproenzyme), 효소 전구체 및 활성형 전구체는 결국 기능적 등가물을 갖는 단백질이고 기능적 등가물의 범위에 속한다.

그 분야의 기술자에게는 명백하게, 적당한 시그날 펩타이드는 대상 유전자의 발현에 사용된 숙주에 의존하여 선택될지도 모른다. 세로밖으로의 분비가 바람직하지 않을 때 제거될 수 있다. 그러므로, 본 명세서에 개시된 고열안정성 프로테아제 유전자 중에서, 시그날 펩타이드를 암호화하는 부분이 제거된 유전자, 다른 뉴클레오타이드 서열로 대체된 부분이 있는 유전자는 본질적으로 등가물 활성을 보여주는 프로테아제를 암호화하는 내용안에서 본 발명의 범위안에는 든다. 본 명세서에서 사용된 것처럼 고열안정성 프로테아제 유전자에 혼성화한 유전자는 엄격한 조건하에서 즉, 50℃ 0.5% SDS, 0.1% 소혈청 알부빈(BSA), 0.1% 폴리비닐피로리돈(polyvinylpyrrolidone), 0.1% 피콜 400과 0.01% 변성된 연어 정자 DNA를 포함한 6×SSC는(0.15M NaCl, 0.15M 나트륨 시트레이트, pH 7.0) 12시간 동안 인큐베이션되는 조건하에서 고열안정성 프로테아제 유전자와 혼성화시킨 유전자를 언급한다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 플라스미드 pTPR 12와 플라스미드 pUBP 13에 포함된 피로코커스 푸리오수스로 유래된 DNA 단편의 제한 지도를 보여주는 도면이다.

제2도는 올리고뉴클레오타이드 PRO-1F의 디자인을 보여주는 도면이다.

제3도는 올리고뉴클레오타이드 PRO-2F와 PRO-2R의 디자인을 보여주는 도면이다.

제4도는 올리고뉴클레오타이드 PRO-4R의 디자인을 보여주는 도면이다.

제5도는 플라스미드 P2F-4R의 제한 지도이다.

제6도는 플라스미드 pTC3의 제한 지도이다.

제7도는 플라스미드 pTC6의 제한 지도이다.

제8도는 플라스미드 pTC4의 제한 지도이다.

제9도는 플라스미드 pSTC3의 제작에 대한 과정을 보여준다.

제10도는 플라스미드 pSTC3의 제한 지도이다.

제11도는 여러가지 프로테아제의 아미노산서열을 비교하는 도면이다.

제12도는 제11도의 계속이다.

제13도는 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 크로모좀 DNA 상의 프로테아제 PFUS 유전자 주위의 제한 지도이다.

제14도는 플라스미드 pSPT1의 제한 지도이다.

제15도는 플라스미드 pSPT1의 제한 지도이다.

제16도는 플라스미드 pSPT1의 제한 지도이다.

제17도는 플라스미드 pNAPS1의 제한 지도이다.

제18도는 효소 제조물 TC-3에 대한 최적 온도를 나타내는 도면이다.

제19도는 효소 제조물 NAPS-1에 대한 최적 온도를 나타내는 도면이다.

제20도는 효소 제조물 TC-3에 대한 최적 pH를 나타내는 도면이다.

제21도는 효소 제조물 NP-1에 대한 최적 pH를 나타내는 도면이다.

제22도는 효소 제조물 NAPS-1에 대한 최적 pH를 나타내는 도면이다.

제23도는 효소 제조물 TC-3의 열안정성을 보여주는 도면이다.

제24도는 효소 제조물 NP-1의 열안정성을 보여주는 도면이다.

제25도는 활성효소 제조물 NP-1의 열안정성을 보여주는 도면이다.

제26도는 효소 제조물 NPAS-1의 열안정성을 보여주는 도면이다.

제27도는 효소 제조물 NP-1의 pH안정도를 보여주는 도면이다.

제28도는 SDS의 존재하에서 효소 제조물 NP-1의 안정성을 보여주는 도면이다.

제29도는 SDS 존재하에 효소 제조물 NAPS-1의 안정성을 보여주는 도면이다.

제30도는 아세토니트릴(acetonitrile)의 존재하에서 효소 제조물 NAPS-1의 안정성을 보여주는 도면이다.

제31도는 우레아(Urea) 존재하에서 효소 제조물 NAPS-1의 안정성을 보여주는 도면이다.

제32도는 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride)의 존재하에서 효소 제조물 NAPS-1의 안정성을 보여주는 도면이다.

[발명의 바람직한 구체예]

본 발명의 고열안정성 프로테아제 유전자는 고열성균주의 유전자 라이브러리를 스크리닝하여 얻을 수 있다. 고열성균주로서, 피로코커스(Pyrococcus)속에 속하는 박테리아로 사용할 수 있고 목적 유전자는 피로코커스 푸리오수스(pyrococcus furiosus) 게놈의 코스미드 라이브러리를 스크리닝하여 얻을 수 있다.

예로 피로코커스 푸리오수스 DSM3638은 피로코커스 푸리오수스로 사용할 수 있고, 그 균주는 Deutsche Sammlung von Mikroorganism und Zellkulturen GmbH로부터 입수 가능했다.

피로코커스 푸리오수스(pyrococcus furiosus)의 코스미드 라이브러리의 한 예는 3중 나선 코스미드 벡터(스트라타진(stratagene)에 의해 제조)와 함께 제한 효소 Sau3AI(다까라 슈조(주)(Takara shuzo Co. Ltd.)에서 제조)로 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)DSM3638 게놈 DNA의 부분적 분해에 의해 얻은 DNA 단편을 연결시키고, 시험관내의 팩캐징 방법(packaging method)에 따라 람다 파아지(Lamda phage) 입자(particle)에, 연결된 생성물을 팩캐징하며, 그리고나서, 형질 전환체를 얻기 위하여 라이브러리를 적당한 대장균으로, 예를 들면, 대장균 DH5αMCR(BRL에서 제조)에 도입하여, 그들을 배양한 후 미생물 세포들을 수집하고 열처리(예를 들면, 100℃ 10분)한후 초음파 처리하고 다시 열처리(예를 들면, 100℃ 10분)하여 얻을 수 있다. 그 결과로 생긴 용해물(lysate)에 프로테아제 활성이 존재하든 안하든 젤라틴을 포함한 SDS-폴리아크릴아미이드 젤 전기 영동에 의해 스크리닝 할 수 있다.

이러한 방법에서, 상기 열처리에 내성을 갖는 프로테아제를 발현시키는 고열안정성 프로테아제 유전자를 포함한 코스미드 클론을 얻을 수 있다. 더욱이, 이렇게 코스미드 클론으로부터 제조된 코스미드 DNA는 각각의 결합된 단편을 가진 재조합 플라스미드를 얻기 위하여 적당한 제한 효소를 가지고 단편으로 자를 수 있다. 그리고나서, 적당한 미생물을 플라스미드로 형질 전환시키고, 그 결과 생긴 형질 전환체에 의해 발현된 프로테아제 활성은 목적된 고열안정성 프로테아제를 포함한 재조합 플라스미드를 얻기 위해 조사될 수 있다.

즉, 상기 코스미드 클론의 하나로부터 제조된 코스미드는 NorⅠ과 PvuⅡ(둘다 다카라 슈조(주)가 제조)로 잘라 7.5kb DNA를 제공하고, 이를 NotⅠ 린커(linker)(다카라 슈조(주)에서 제조)가 도입된 플라스미드 벡터 pUCIP(Takara shuzo(주)에서 제조)의 Not와 SmaⅠ부위에 삽입한다. 플라스미드 pTPR12라 명명하여 그 플라스미드로 형질 전환된 대장균 JM109를 명명하여 JM109/pTPR 12라 명명하고 부다페스트 조약 아래 기탁 번호 FERM BP-5013으로 1994. 5. 24(최초 기탁일)이래로 일본국 이바라키 쭈쿠바-시 히가시 1-1-3에 소재한 통상산업성공업기술원생명공학공업기술연구소(National Institute of bioscience and human-Technology)에 기탁했다.

대장균 JM 109/pTPR12의 용해물은 젤라틴을 포함한 SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 상의 상기 코스미드 클론의 것과 유사한 프로테아제 활성을 갖는다.

플라스미드 pTPR12에 삽입된 피로코커스 푸리오수스로부터 유래하여 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열은 편리한 종래의 방법 예를 들면, 디데옥시방법(dideoxy method)에 의해 결정될 수 있다. 플라스미드 pTPR12에 삽입된 DNA 단편안에 두개의 DraⅠ 부위에 의한 측면의 4.8kb 부분의 뉴클레오타이드 서열은 서열 목록의 SEQ ID No.7에 나타나 있다. 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 유전자 생성물의 염기 서열은 서열 목록 SEQ ID. No. 8에 있다. 그리하여 피로코커스 푸리오수스로부터 유래한 고열안정성 프로테아제의 뉴클레오타이드 서열과 아미노산 서열을 밝혀졌고, 프로테아제 PFUL로 명명되었다. 서열 목록 SEQ ID No. 8에서 보았듯이, 프로테아제 PFUL은 1398잔기로 구성되고, 1500,000이상의 고분자량을 가지고 있다.

프로테아제 PFUL 유전자는 숙주로서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 이용하여 발현될 수 있다. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) DB104는 사용될 수 있고 그 균주는 문헌[Gene, volume 83, page 215-233(1989)]에 잘 설명되어 알려져 있다. 클로닝 벡터로서, 플라스미드 pUB18-P43은 사용될 수 있고 그 플라스미드는 캘거리 대학에 있는 Sui-Lam Wong 박사로 부터 선물받았다. 그 플라스미드는 선택마커로서 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자를 포함한다.

플라스미드 pUBP13은 약 4.8kb DNA 단편으로, 플라스미드 pTPR13을 DraⅠ으로 잘라 플라스미드 벡터 pUB18-P43의 SmaⅠ 부위에 삽입시켜 얻었다. 그 플라스미드에서는 프로테아제 PFUL 유전자를 바실러스 서브틸리스에서 기능하는 P43 프로모터의 아래쪽에 위치한다[J. Biol. Chem., volume 259, page 8619-8625(1984)] 바실러스 서브틸리스 DB104는 그 플라스미드로 형질 전환되어 바실러스 서브틸리스 DB104/pUBP13으로 명명되었다. 형질 전환체의 용해물(lysate)은 대장균 JM109 /pTPR12의 것과 비슷한 프로테아제 활성을 보여준다.

그러나 단지 미소량의 프로테아제 활성을 형질 전환체의 배양액의 상등액에서 감지할 수 있다. 이것은 프로테아제 PFUL의 분자량이 극단적으로 커서 바실러스 서브틸리스에서는 효과적으로 번역되지 않고, 프로테아제 PFUL 유전자에 의해 암호화된 시그날 서열이 바실러스 서브틸리스에서 잘 기능하지 않는다는 것에 기인한다고 생각된다. 프로테아제 PFUL은 프로테아제 세포막 결합형 프로테아제일 가능성이 있고 프로테아제 PFUL 사슬의 C-말단의 펩타이드 쇄는 세포막에 결합하기 위한 부분일지도 모른다.

제1도는 프로테아제 pTPR12로 삽입된 DNA 단편과 마찬가지로, 피로코커스 푸리오수스 크로모좀상의 프로테아제 PFUL 유전자 주위의 제한 지도를 나타내며 플라스미드 pUBP13으로 삽입된다. 또한, 제1도의 화살표는 프로테아제 PFUL를 암호화하는 오픈리딩프레임(open reading frame)을 나타낸다.

알려진 미생물로부터 유래한 프로테아제의 서열과 서열 목록 SEQ ID No. 8에 나타난 프로테아제 PFUL의 아미노산 서열의 비교에 의해, 프로테아제 PFUL의 앞쪽반의 아미노산 서열은 알칼리성 세린 프로테아제의 대표적인 것이 서브틸리신(subtilisin)의 (Protein Engineering, volume 4, page 719-737(1991)) 그룹과 상동성이 있음을 알 수 있다. 또한, 프로테아제의 촉매 활성에 중요한 것으로 여겨지는 4개의 아미노산 잔기 주위의 높은 상동성이 있음을 알 수 있다.

중온성균에서 유래한 프로테아제에 공통으로 존재하는 영역이 고열성균 피로코커스 푸리오수스에 의해 생성된 프로테아제 PFUL의 아미노산 서열에 보존되어 있음이 밝혀짐에 따라, 이러한 영역의 피로코커스 푸리오수스보다 다른 고열성균에 의해 생성된 같은 종류의 프로테아제에 존재한다고 기대된다.

즉, 적당한 길이의 DNA는 서브틸리신(subtilsin)과 그와 같은 것과 높은 상동성을 가진 영역의 아미노산 서열을 암호화한 부분의 서열에 기초하여 제조될 수 있고, 그 DNA는 혼성화를 위한 프로브나 PCR처럼 유전자 증폭을 위한 프라이머로 사용될 수 있고, 다양한 고열안정성균에 존재하는 본 효소와 비슷한 고열안정성 프로테아제 유전자를 선별할 수 있다.

상기의 방법에서, 목적 유전자의 일부만이 포함한 DNA 단편을 몇 가지 경우에서 얻는다. 그 결과물인 DNA의 단편의 뉴클레오티드 서열이 조사되었고, 그것이 목적유전자의 일부임이 확인되었고 그후 혼성화된 DNA 단편이나 그것으로부터의 일부를 프로브로서 이용하여 수행할 수 있거나 PCR을 목적 유전자 모두를 얻기 위하여 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열에 기초한 프라이머를 합성하여 실시할 수 있다.

상기 혼성화는 아래와 같은 조건에서 수행할 수 있다.

즉, DNA가 고정된 막을 50℃에서 12-20시간 동안 0.5% SDS, 0.1% 소의 혈청알부민(BSA), 0.1% 폴리비닐피노리돈(polyvinylpynolidone), 0.1% 피콜(Ficol)400과 0.01% 변성된 연어정자를 DNA를 포함한 6×SSC(1×SSC는 0.15M 염화나트륨, 0.015M 나트륨 시트레이트, pH 7.0을 나타낸다)에서 적당히 표지된 프로브와 함께 인큐베이션시킨다.

인큐베이션 완성 후에 막을 세척하고, 0.5% SDS를 포함한 2×SSC에서 37℃에서 세척하기 시작해서, SDS 농도를 0.1×까지, 온도는 50℃까지의 범위로 변화시키면서 고정된 DNA에 혼성화된 프로브로부터 시그날이 배경에서 제거될 때까지지 실시한다.

게다가 본 분야의 기술을 가진 자에게는 프로브와 프라이머는 비슷한 방법에 따라 다른 고열안정성 프로테아제 유전자를 얻기위해서 새(new) 고열안정성 유전자에 기초하여 만들 수 있다.

제2,3,4도는 서브틸리신(subtilisin)과 그와 같은 높은 상동성을 가진 프로테아제 PFUL의 아미노산 서열에 있는 영역 아미노산 서열 사이의 관계를 보여준다.

그 영역을 암호화하는 프로테아제 PFUL의 뉴클레오타이드 서열, 그 영역을 암호화하는 프로테아제 PFUL의 뉴클레오타이드 서열 및 이를 근거로 합성된 올리고뉴클레오타이드 PRO-1F, PRO-2F, PRO-2R과 PRO-4R의 관계를 나타내고, 더욱이 서열 목록의 SEQ ID Nos. 9, 10, 11 및 12는 올리고뉴클레오타이드 PRO-1F, PRO-2F, PRO-2R 및 PRO-4R의 뉴클레타이드 서열을 나타낸다. 즉, SEQ ID No. 9-12는 본 발명의 고열안정성 프로테아제 유전자를 선별하기 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드의 한 실시예의 뉴클레오타이드 서열이다.

프라이머로서 올리고뉴클레오타이드의 결합에 의해 프로테아제 유전자는 주형으로서 다양한 고열성균의 크로모좀 DNA를 사용하여 PCR에 의해 검출할 수 있다. 고열성균으로서, 피로코커스 속(genus pyrococcus), 써모코커스 속(genus thermococcus), 스타필로써무스 속(genus staphyothermus), 써모박테리오이드 속(genus thermobacteroides)에 속하는 박테리아와 그와 같은 종류를 사용할 수 있다. 예를 들면, 써모코커스 속에 속하는 박테리아로서, 써모코커스 셀러(Thermococcus celer) DSM2476이 사용될 수 있고 그 균주는 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH로부터 얻을 수 있다.

주형으로서 써모코쿠스 셀러(Thermoccoccus celer) DSM 2476의 크로모좀 DNA를 사용하고, 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 PRO-1F와 PRO-2R의 조합 또는 올리고뉴클레오타이드 PRO-2F와 PRO-4R의 조합을 사용하여 PCR을 수행할 때, 특정 DNA 단편의 증폭이 관찰되어 프로테아제 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 게다가, DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열은 재조합 플라스미드를 만들기 위해 적당한 플라스미드 벡터로 DNA 단편을 삽입한 후 다이데옥시 방법(dideoxy method)에 의해 삽입된 DNA 단편의 염서서열을 결정하여 평가될 수 있다.

올리고뉴클레오타이드 PRO-1F와 PRO-2F를 사용하여 증폭된 약 150bp의 DNA 단편과 올리고뉴클레오타이드 PRO-2F와 PRO-4R사용하여 증폭된 약 550bp의 DNA 단편이 플라스미드벡터 pUC 18(다카라 슈죠(주)에서 플라스미드는 p1F-2R(2)과 p2F-2R로 각각 묘사되었다.

서열목록의 SEO ID No. 13은 플라스미드 p1F-2R(2)에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드와 그로부터 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. 그리고 서열목록은 SEQ ID No. 14는 플라스미드 p2F-4R에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드과 그로부터 추론된 아미노산 서열을 나타낸다.

서열목록의 SEQ ID No. 13에서, 1부터 21번째 까지 염기서열과 113부터 145염기까지 서열목록의 SEQ ID No. 14에서, 1-32염기과 532-564 뉴클레오타이드는 PCR에서 프라이머로서(각각 올리고뉴클레오타이드 PRO-1F, PRO-2R, PRO-2F와 프로테아제 PFUL와의 아미노산서열과 상동성을 가진 아미노산 다양한 미생물로 유래한 서열목록의 SEQ ID No. 9, 13과 14에 나타난 아미노산서열에 존재한다. 상기의 PCR에 의해 증폭된 DNA 단편은 주형으로 프로테아제 유전자를 가지고 증폭되었음을 가리킨다.

플라스미드 p2F-4R의 제한 지도는 도면 5에 나타나 있다. 도면 5에서 굵은 줄은 플라스미드 벡터 pUC18로 삽입된 DNA 단편을 가리킨다.

그리고나서, 예로, 써모코쿠스 셀러에 의해 생성된 고열안정성 프로테아제 유전자는 상기 올리고뉴클레오타이드나 프로브로써 상기 PCR에 의해 얻어진 증폭된 DNA 단편을 이용하여 고열안정성 박테리아의 유전자 라이브러리를 스크리닝하여 얻을 수 있다.

써모코쿠스 셀러의 유전자 라이브러리의 한 예는, 라이브러리는 써모코쿠스 셀러DSM2476의 크로모좀 DNA를 DNA 단편을 얻기위해서 제한 효소 Sau3AⅠ를 가지고 부분적으로 분해하여, 그 단편을 람다 GEM-11 벡터(프로메가에서 제조)에 연결하여 시험관 안에서 팩캐징 방법(in vitro packaging method)에 의해 람다 파아지 입자로 그것을 팩캐징시켰다. 그리고 나서 그 라이브러리를 적당한 대장균, 예를 들면 대장균 LE392(프로메가에서 제조)에 형질도입하여 평판 배지에서 플라크를 형성하게 하고, 목적 유전자를 포함한 파아지 클론을 얻기 위하여 프로브로서 상기 PCR에 의해 얻은 증폭된 DNA 단편을 이용하여 플라크 혼성화를 수행했다.

더 나아가, 그렇게 얻어진 파아지 클론으로부터 제조된 파아지 DNA를 적절한 제한 효소로 자를 수 있고, 프로테아제 유전자를 포함한 DNA 단편을 얻기 위해서 상기 프로브를 사용하여 사우던 혼성화를 수행할 수 있다.

플라크 혼성화에 의해 얻어진 파아지 클론으로부터 제조된 파아지 DNA는 Kpn1과 BamH1(다까라 슈조(주)에서 제조)으로 분해하고, 약 5kb DNA 단편을 프로브으로 혼성화시키고, 약 5kb DNA 단편을 분리하여 플라스미드 벡터 pUC19(다까라 슈조(주)에서 제조)의 Kpn1과 BamH1 부위에 삽입하여 재조합 플라스드를 얻었다. 이 플라스드는 pTC3로 명명되고, 이로 인해 형질 전환된 대장균 JM109를 대장균 JM 109/pTC3로 명명하였다. 플라스드 pTC3의 제한 지도는 제6도에 있다. 제6도에서 굵은 실선은 플라스미드 벡터 pUC119로 삽입된 DNA 단편을 나타낸다.

플라스미드 pTC3로 삽입된 DNA 단편 내에 프로테아제 유전자를 포함하지 않는 DNA 단편을 다음과 같은 과정에 의해 제거될 수 있다. 즉, 플라스미드 pTC3를 SacⅠ(다까라 슈조(주)에서 제조)으로 분해한 후, 사우던 혼성화를 상기 기술된 유사한 과정에 따라서 수행되고 약 1.9kb DNA 단편이 프로브에 혼성화됨에 밝혀졌다. 이어서, 약 1.9kb DNA 단편을 단리하고, 재조합 벡터를 만들기 위해 플라스미드 벡터 pUC118(다까라 슈조(주)에서 제조)의 Sac1 부위로 삽입시켰다. 상기 플라스미드는 pTCS6로 명명되어 이로 인해 형질 전환된 대장균 JMJ109를 대장균 JM109/pTCS6로 명명하였다. 플라스미드 pTCS6의 제한 지도는 제7도에 있다. 제7도에서 굵은 실선은 플라스미드 벡터 pUC118에 삽입된 DNA 단편을 나타낸다. 디데옥시 방법에 의해 플라스미드 pTCS6에 삽입된 DNA 단편외 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 프로테아제 유전자가 DNA 단편안에 있음을 확인할 수 있었다. 서열 목록은 SEQ ID No. 15는 그 단편의 뉴클레오타이드이다. 플라스미드 p1F-2R(2)에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 목록의 SEQ ID No. 13 또는 14에 나타난 p2F-4R의 뉴클레오타이드 서열의 비교에 의해, 플라스미드 pTCS6에 삽입된 DNA 단편이 플라스미드 p2F-4R에 의해 공유된 DNA 단편을 포함하나, 프로테아제 유전자의 5' 영역이 결여된다.

이처럼, 플라스미드 pTCS6에 함유된 써모코쿠스 셀러에서 유래한 고열안정성 프로테아제 유전자는 그의 일부가 결여되어 있다. 그러나 본 분야의 숙련자에게는 명백하게, 전 길이의 고열안정성 프로테아제를 가진 DNA 단편을 (1) 한번 더 유전자 라이브러리를 스크리닝하거나, (2) 크로모좀 DNA를 이용한 사우던 혼성화를 실행하거나, (3) 카세트와 카세트 프라이머(다까라 슈조(주), Genetic Engineering Products Guidance, 1994-1995 edition, 페이지 250-251)를 사용하여 PCR에 의해 5' 상류 영역의 DNA 단편을 얻어 수득할 수 있다.

본 발명가들은 방법(3)을 선택했다. 즉, 써모코쿠스 셀러의 크로모좀 DNA가 몇가지 제한 효소로 완전히 자른 후 사용된 제한 효소에 상응하는 카세트(다까라 슈조(주)에서 제조)로 연결시킨다. PCR은 주형으로써 연결 생성물을 사용하고, 프라이머로써 프라이머 TEC6R(서열 목록 SEQ ID No. 16은 프라이머 TEC6R의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다)와 카세트 프라이머 C1(다까라 슈조(주)에서 제조)를 사용하여 수행했다. 상기 과정을 제한 효소 HindⅢ(다까라 슈조에서 제조)로 수행할 때 약 1.8kb DNA 단편이 증폭할 수 있고, HindⅡⅡ와 Sac1으로 상기 증폭된 단편을 잘라 얻어진 약 1.5kbDNA 단편을 플라스미드 벡터 pUC119의 HindⅢ와 Sac1부위사이에 삽입하여 재조합 플라스미드를 얻었다. 그 플라스미드를 pTC4로 명명하여, 이를 가지고 대장균 JM109를 형질 전환시켜 대장균 JM109/pTC4라 하였다. 플라스미드 pTC4의 제한 지도는 제8도에 있다. 제8도에서, 굵은 줄은 플라스미드 벡터 pUC119로 삽입된 DNA 단편을 나타낸다.

디데옥시 방법에 의해 플라스미드 pTC4에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드를 결정함으로써 프로테아제 유전자가 그 DNA 단편내에 있음을 확인할 수 있었다. 서열 목록 SEQ ID No. 17은 그 단편의 뉴클레오타이드 서열이다. 다양한 프로테아제의 아미노산 서열과 뉴클레오타이드로부터 추론된 아미노산 서열의 비교에 의해, 플라스미드 pTC4로 삽입된 DNA 단편이 플라스미드 pTCS6에는 없는 고열안정성 프로테아제 유전자의 5' 영역을 가지고 있음을 발견했다. 뉴클레오타이드서열을 서열 목록 SEQ ID No. 15에 보여 준 플라스미드 pTCS6로 삽입된 DNA 단편의 서열과 조합하여 써모코쿠스 셀러로부터 유래한 전(FULL) 길이의 거열 안정성 뉴클레오타이드를 동정할 수 있었다. 얻어진 뉴클레오타이드 서열내에 있는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 서열 목록 SEQ ID No. 2에 있고 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 아미노산 서열은 SEQ ID No.1에 있다. 그리하여 써모코쿠스 셀러로부터 유래한 고열안정성 프로테아제는 그를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 그의 아미노산 서열과 함께 프로테아제 TCES로 명명되었다. 프로테아제 TCES 유전자의 전 길이는 플라스미드 pTC4의 삽입된 DNA 단편과 플라스미드 pTCS6에 삽입된 DNA 단편을 조합하여 재구성될 수 있다.

유전자에 의해서 발현된 프로테아제 활성은 pTC4과 pTCS6에 포함된 두단편의 DNA으로부터 전 길이의 프로테아제 TCES 유전자를 재구성하고, 발현시키기 위해 플라스미드의 락(lac) 프로모터 하류에 이것을 삽입하여, 발현 베터를 얻고, 이를 대장균에 도입하여 확인할 수 있었다. 그러나, 이러한 방법은 목적 발현 벡터가 도입된 형질 전환체를 제공하지 않고, 유전자로 발현된 생성물의 생성은 대장균에 해롭거나 치사적임이 예견된다. 이러한 경우에, 예를 들어 활성을 학인하기 위하여 숙주로서 바실러스 서브틸러스를 사용하여 프로테아제 세포밖으로 분비됨이 추론된다.

바실러스 서브틸리스에서 프로테아제 TCES 유전자를 발현하기 위한 숙주로서, 바실러스 서브틸리스 DB104가 사용되고, 클로닝 베터로서, 플라스미드 pUB18-P43이 사용될 수 있다.

그러나, 대장균에 대한 숙주 벡터 시스템이, 다종의 벡터를 가지고 형질전환이 간단하면서 높은 효율로 이루어진다는 이점을 가지고 있기 때문에, 가능한한 많은 발현 베터를 제작하는 과정이 바람직하고, 가능하다면 대장균에서 수행한다. 즉 대장균에서는 종료 코돈을 포함한 최적의 뉴클레오타이드를 플라스미드 pTC4와 플라스미드 pTCS6으로부터 유래한 두 프로테아제 유전자 단편 사이에 삽입하여 전 길이의 프로테아제 TCES 유전자가 재구성되지 않고, 따라서 그 유전자 생성물의 발현을 불가능하게 하여 플라스미드의 제작을 수행할 수 있다. 이어서, 제10도에서 보여준 목적 발현 플라스미드 pSTC3를 만들기 위해 최종 단계에서 이 삽입 서열을 제거할 수 있다. 제9도에서 나타난 플라스미드 pSTC3를 제작 하는 과정은 아래 설명한다.

첫째, 플라스미드 pTCS6에 삽입된 약 1.8kb HindⅢ-SspⅠ 단편을 플라스미드 벡터 pBR322(다까라 슈조(주)에서 제조)의 HindⅢ 부위와 EcoRV 부위 사이에 삽입하여 재조합 플라스미드 pBTC5를 만들고, 이 플라스미드로부터 플라스미드 벡터 pUC118의 다중 클로닝에서 유래한 HindⅢ 부위 및 KpnⅠ과 플라스미드 벡터 pBR322상의 BamHⅠ사이의 DNA 단편이 제거되어 플라스미드 pBTC5HKB를 만든다.

그 후, 프로테아제 TCES 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여, 프로테아제 TCES의 개시 코든 앞에 EcoRⅠ과 BamHⅠ 부위를 도입할 수 있는 프라이머 TCE12 및 ClaⅠ 부위와 뉴클레오타이드 서열에 존재하는 오직 하나의 SacⅠ 부위의 3'쪽에 있는 종료 코돈을 도입할 수 있는 프라이머 TCE20R이 합성되었다. 서열 목록 SEQ ID Nos. 18과 19는 프라이머 TCE12와 프라이머 TCE20R의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.

주형으로서 써모코커스 셀러의 크로모좀 DNA를 사용하고, 이들 두 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭된 약 0.9kb DNA 단편을 EcoRⅠ 및 ClaⅠ(Takaha Shuzo Co., Ltd. 제조)으로 분해하고, 플라스미드 pBTC5HKB의 EcoRⅠ부위와 ClaⅠ 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pBTC6을 수득하고, 이는 종료 코돈을 포함하는 69bp 길이의 뉴클레오타이드 서열이 프로테아제 TECS 유전자의 SacⅠ 부위에 삽입된 돌연변이 유전자를 갖는다.

바실러스 서브틸리스 P43 프로모터로부터 유래된 리보소옴 결합부위[참조:J. Biol. Chem., volume 259, page 8619-8625(1984)]를 플라스미드 벡터 pUC18의 KpnⅠ 부위와 BamHⅠ 부위사이에 도입하여 플라스미드 pUC-P43을 작제한다. 합성 올리고뉴클레오타이드 BS1 및 BS2의 뉴클레오타이드 서열을 서열목록 SEQ ID Nos. 20 및 21에 각각 나타내었다. 그후, 플라스미드 pBTC6을 BamHⅠ 및 SphⅠ(다카라 슈조(주)에서 제조)으로 분해하여 프로테아제 TCES의 돌연변이 유전자를 함유하는 약 3kb DNA 단편을 수득하고, 이를 플라스미드 pUC-P43의 BamHⅠ부위 및 SphⅠ 부위사이에 삽입하여 플라스미드 pTC12를 작제한다.

플라스미드를 제작하기 위한 상기 모든 과정은 숙주로서 대장균을 사용하여 수행할 수 있다.

바실러스 서브틸리스에 클로닝하기 위해 사용된 플라스미드 벡터 pUC 18-P43안에 존재한 SacⅠ 부위가 미리 제거되고, pTC 12로부터 얻은 약 3kb KpnⅠ-SphⅠ DNA 단편이 숙주로서 바실러스 서브틸리스 DB104를 사용하여 플라스미드 pSTC2를 만들기 위해서 KpnⅠ 부위와 SphⅠ 부위사이에 삽입할 수 있다. 상기 플라스미드는 p43 프로모터와 5' 쪽에 리보소옴 결합 부위 서열을 가진 프로테아제 TCES의 돌연변이 유전자를 포함한다.

플라스미드 pSTC2를 SacⅠ 분해한 후, 재조합 플라스미드를 얻기 위해서 분자내 연결(ligation)이 수행되었고, 그로부터 상기 돌연변이 유전자의 SacⅠ 부위에 포함된 삽입된 서열이 제거되었다. 재조합 플라스미드는 플라스미드 pSTC3라고 명명되었고, 상기 플라스미드로 형질전환된 바실러스 서브틸리스 DB104는 바실러스 서브틸리스 DB104/pSTC3으로 명명되고 부다페스트조약에 따라 1995년 12월 1일(최초 기탁일)이래로 승인 번호 FERM BP-5635로 일본국 1-1-3 히가시 쯔쿠바-시 이바라키-켄(Ibaraki-ken, Tsukuba-shi, Higashi 1-1-3)에 있는 일본국 통산 산업성 공업 기술원 생명공학 공업기술 연구소(National institute of bioscience and Human-Technology)에 기탁되어 있다. 형질 전환체는 배양되고, 배양물 상등액과 세포추출물은 프로테아제 활성에 대해 조사되었다. 그 결과로, 고열안정성 프로테아제 활성은 두 샘플에서 발견되었다. 제10도는 플라스미드 pSTC3의 제한 지도이다. 제10도에서, 굵은 실선은 플라스미드 벡터 pUC18-P43에 삽입된 DNA 단편을 나타낸다.

프로테아제 PFUL의 아미노산 서열, 프로테아제 TCES와 서브틸리신(subtilisin)이 상동성을 가진 영역이 제11도와 제12도에서처럼 서로 일치되도록 정렬되면 프로테아제 PFUL은 상동성을 가진 부위 및 C-말단 부위에서 프로테아제 TCES의 서열과 서브틸리신의 서열사이에 상동성이 없는 부분이 있음을 알수 있다. 이것으로부터 프로테아제 PFUL외에 프로테아제 TCES 또는 서브틸리신과 같은 프로테아제 PFUL의 분자량보다 작은 분자량을 가진 프로테아제가 피로코커스 푸리오수스에 존재할지도 모른다고 추측된다.

그런 프로테아제를 암호화하는 유전자를 찾기위해서 타겟(target)으로서 피로코커스 푸리오수스로부터 제조된 크로모좀 DNA를 사용하고, 프로테아제 TCES 유전자안에 뉴클레오타이드 서열을 포함한 DNA 단편을 사용하여 사우던 혼성화를 수행할 수 있고, 상기 프로테아제 TCES는 프로브로서 플라스미드 p1F-2R(2)에 삽입된 약 150bp DNA 단편인 세가지 프로테아제에서 잘 보전된 아미노산서열을 암호화한다.

비록, 프로브로 사용된 DNA 단편이 또한 프로테아제 PFUL 유전자와 상동성을 가지고 있기 때문에, 유전자단편은 혼성화 조건에 의존하여 시그널로서 검출되고, 그 유전자로부터 유래한 시그널 위치는 크로모좀 DNA를 자르기 위해 사용한 각각의 제한 효소 상에서 프로테아제 PFUL 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 제한지도 정보로부터 미리 측정될 수 있다.

어떤 효소가 사용될때, 프로테아제 PFUL 유전자상에 예상된 위치에 더하여, 다른 시그널이 거의 같은 수준으로 검출되는데, 이는 최소한 하나의 프로테아제가 프로테아제 PFUL외에 피로코커스 푸리오수스에 존재할 가능성을 시사한다.

상기의 새로운 시그널에 해당하는 유전자를 단리하기 위해, 첫째 대장균에게는 해롭고 치명적인 유전자 생성물이 발현된 결과로부터 야기된 프로테아제 TCES 경우에서처럼 그 유전자의 분리에 실패하지 않기 위해서 유전자의 일부가 클로닝된다. 예로, 피로코커스 푸리오수스의 크로모좀 DNA가 제한 효소 SacⅠ과 SpeⅠ(둘다 다카라 슈조(주)에서 제조)으로 잘라 그 절단물을 프로브로서 프로테아제 TCES 유전자의 단편을 이용하여 상기 기술된 것처럼 사우던 혼성화를 수행할때, 새로운 유전자로부터 유래한 약 0.6kb에 상응하는 새로운 시그널이 SacⅠ만으로 자른 경우에서 관찰된 약 3kb에 상응하는 시그널을 대체함이 밝혀졌다. 이러한 약 0.6kb SpeⅠ-SacⅠ 단편은 최대 200 잔기의 아미노산 서열을 암호화하고, 이는 활성을 가진 프로테아제를 발현시킨다고 생각할 수 없다. SacⅠ과 SpeⅠ으로 자른 피로코커스 푸리오수스의 크로모좀 DNA는 아가로즈 젤 전기영동을 하여 젤로부터 약 0.6kb에 해당하는 DNA 단편을 회수했다.

그리고 그 단편은 플라스미드 벡터 pBluescript SK(-)(스트라타젠에 의해 제조)의 SpeⅠ 부위와 Sac1I 부위사이에 삽입되고 그 결과물인 재조합 플라스미드는 대장균 JM109를 형질전환시키는데 이용된다. 이 형질전환체로부터 목적되는 단편이 혼입된 클론을 상기 사우던 혼성화에 사용된 것처럼 같은 프로브를 사용하여 콜로니 혼성화에 의해 얻을수 있었다. 결과적인 클론에 포함된 플라스미드가 프로테아제를 암호화한 서열을 가지는지 아닌지는 상기 다양한 프로테아제에 공통인 아미노산 서열에 기초하여 만들어진 프라이머 1FP1, 1FP2, 2PR1과 2RP2(프라이머 1FP1, 1FP2, 2RP1과 2RP2의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 SEQ ID Nos. 22, 23, 24과 25에 나타나있다)를 이용한 PCR을 수행하거나 상기 클론으로부터 제조된 플라스미드로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 수행하여 확인될 수 있다. 프로테아제 유전자의 존재가 이러한 방법으로 확인된 플라스미드는 플라스미드 pSS3로 명명하였다. 플라스미드에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열, 그로부터 추론된 아미노산 서열은 서열목록 SEQ ID No. 26에 나타나 있다.

플라스미드 pSS3에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 아미노산 서열은 서브틸리신, 프로테아제 PFUL, 프로테아제 TCES등의 서열과 상동성을 가진 것으로 나타난다. 일부분이 피로코커스 푸리오수스로부터 새롭게 얻어진 프로테아제 PFUL과 다른 프로테아제 유전자 생성물이 프로테아제 PFUS로 명명되었다. 프로테아제의 N-말단을 암호화하는 영역, 즉, SpeⅠ부위의 5' 영역과 C-말단쪽 부분을 암호화하는 영역, 즉 상기 SacⅠ 부위의 유전자 단편의 3'은 역방향의 PCR 방법에 의해 얻을수 있다. 프로테아제 PFUS 유전자안에 있는 제한 효소 부위와 크로모좀상에서의 인접성이 미리 밝혀져 있다면 역방향 PCR은 적당한 제한 효소를 사용하여 수행할 수 있다. 제한효소부위는 다양한 제한효소로 피로코커스 푸리오수스의 크로모좀 DNA를 절단하고 프로브로서 플라스미드 pSS3에 삽입한 DNA 단편을 이용하여 사우던 혼성화를 수행하여 밝힐 수 있다. 결과적으로 SacⅠ 부위는 SpeⅠ 부위의 5'쪽으로부터 약 3kb 떨어진 곳에 위치하고 XbaⅠ 부위는 SacⅠ 부위의 3'쪽에서 약 5kb 떨어져 위치한다.

역방향 PCR에 사용된 프라이머는 플라스미드 pSS3에 포함된 SpeⅠ-SacⅠ3 단편의 말단 주위에 어닐링하도록 설계될 수 있다. SacⅠ 부위주변에 어닐링하도록 설계된 프라이머는 NPF-1과 NPF-2로 명명되고, SpeⅠ 부위 주위에 어닐링하기 위해 설계된 프라이머는 NPR-3로 명명되었다. 그 뉴클레오타이드 서열이 각각 서열목록 SEQ ID NoS. 27, 28과 29에 나타나있다.

피로코커스 푸리오수스의 크로모좀 DNA는 각각 SacⅠ 또는 XbaⅠ(둘다 다카라 슈조(주)에서 제조)로 잘라 분자내 연결(ligate)시켜, 이 반응혼합물을 역방향 PCR에 대한 주형으로 사용할 수 있다. 크로모좀 DNA를 SacⅠ으로 자를때, 약 3kb 단편이 역 방향 PCR에 의해 증폭되어 플라스미드 pS322로 명명된 재조합 플라스미드를 얻기 위해서 플라스미드 벡터 pT7BlueT(노바겐(Novagen)에서 제조)로 삽입되었다. 한편, XbaⅠ으로 자른 크로모좀 DNA의 경우에 약 9kb 단편이 증폭된다. 증폭된 단편은 약 5kb단편을 얻기 위해 XbaⅠ으로 잘라 회수하여 재조합 플라스미드를 얻기 위해서 플라스미드 벡터 pBluescript SK(-)에 삽입되어 플라스미드 pSKK5로 명명되었다. 프로브로서 플라스미드 pSS3에 포함된 SpeⅠ-Sac1 단편을 사용하여 수행된 사우던 혼성화의 결과와 제한 효소로 플라스미드 pS322와 PSKX5상의 분석결과를 조합하여 프로테아제 PFUS 유전자의 제한 지도와 크로모좀상에서의 인접성을 얻을 수 있다. 제13도는 그 제한 지도이다.

또한, SpeⅠ 부위로부터 출발하여 5' 방향으로 플라스미드 pSS322에 삽입된 5' 단편상의 뉴클레오타이드 서열을 분석하여, 그 영역에 의해 암호화된 효소 단백질의 아미노산 서열을 추론할 수 있다. 결과적인 뉴클레오타이드 서열과 그로부터 추론된 아미노산 서열이 서열목록 SEQ ID No. 30에 나타나있다. 이 영역의 아미노산서열이 서브틸리신과 같은 프로테아제의 아미노산 서열과 상동성이 있으므로, 프로테아제 PFUS의 개시 코돈은 이런 상동성에 기초하여 추정할 수 있고 따라서 프로테아제 PFUS의 개시 코돈앞에 BamHⅠ 부위를 도입할 수 있는 프라이머 NPF-4는 설계될 수 있다. 한편, 플라스미드 XbaⅠ 부위로부터 출발하여 5' 방향으로 플라스미드 pSKX5로 삽입된 프로테아제 PFUS 유전자의 3' 단편의 뉴클레오타이드 서열을 분석하여 결정한 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 SEQ ID No. 31에 나타나있다. 뉴클레오타이드 서열에 기초하여, XbaⅠ 부위의 근처로 SphⅠ 부위를 삽입할 수 있는 프라이머 NPR-4가 설계될 수 있다. 프라이머 NPF-4와 NPR-4의 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열목록 SEQ ID Nos. 32와 33에 있다. 전 길이의 프로테아제 유전자는 이러한 두 프라이머와 피로코커스 푸리오수스의 크로모좀 DNA를 사용하여 증폭될 수 있다.

프로테아제 PFUS는 프로테아제 TCES처럼 바실러스 서브틸리스 시스템에서 발현할 수 있다. 프로테아제 PFUS를 발현하기 위한 플라스미드는 프로테아제 TCES에 대한 발현 플라스미드 pSTC3상에 기초하여 제작될 수 있다. 첫째, PCR에 의해 증폭할 수 있는 전 길이의 프로테아제 PFUS 유전자를 포함한 DNA 단편은 효소의 N-말단의 일부를 암호화하는 약 약 0.8kb단편을 회수하기 위해 BamHⅠ과 SacⅠ으로 잘랐다. 그리고 이 단편을 플라스미드 pSTC3의 프로테아제 TCES의 N-말단을 암호화한 BamHⅠ-SacⅠ 단편으로 대체한다. 프로테아제 TCES와 프로테아제 PFUS 유전자의 혼성 단백질을 암호화하는 결과적인 발현 플라스미드가 pSPT1으로 명명되어 제14도에 그의 제한 지도가 나타나 있다.

이어서, 상기 PCR 증폭된 DNA 단편은 SpeⅠ과 SphⅠ으로 잘라 약 5.7kb 단편을 만들어 이를 단리하고 플라스미드 pSPT1에 있는 프로테아제 TCES의 C-말단을 암호화하는 SpeⅠ-Sph1I 단편으로 대체한다. 이렇게 구성된 발현 플라스미드가 플라스미드 pSNP1으로 명명되어, 이 플라스미드로 형질전환된 바실러스 서브틸리스 DB104를 바실러스 서브틸리스 DB104/pSNP1으로 명명하고 이를 부다페스트조약하에 승인번호 FERM BP-5634로 1995년 12월 1일(최초 기탁일)이래로 일본 Ibaraki-ken, Tsukuba-shi, Higashi, 1-1-3에 있는 National Institute of Bioscience and Human-Technology(N1BH)에 기탁하였다. 제15도는 플라스미드 pSNP1의 제한지도이다.

바실러스 서브틸리스 DB104/pSNP1을 배양하여 배양물 상등액과 세포추출물에 대한 프로테아제 활성이 조사되었고, 두 샘플에서 고열안정성 프로테아제 활성이 있음이 밝혀졌다.

프로테아제 PFUS를 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 제한효소로 플라스미드 pSNP1에 삽입된 DNA 단편을 적당한 크기의 단편으로 잘라 결정할 수 있었고, 적당한 클로닝벡터로 단편에 서브클로닝하며, 주형으로서 서브 클로닝된 단편을 이용하여 디데옥시 방법을 실행하였다. 서열목록 SEQ ID No. 34는 그렇게 얻어진 뉴클레오타이드 서열안에 존재하는 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 또한, 서열목록 SEQ ID No. 35는 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 프로테아제 PFUS의 아미노산 서열을 나타낸다.

또한, 플라스미드 pSPT1으로 형질전환시킨 바실러스 서브틸리스 DB104, 바실러스 서브틸리스 DB104/pSPT1을 배양할 때, 배양물 상등액과 세포추출물 모두에서 프로테아제 활성이 발견되었다. 서열목록 SEQ ID No. 6은 프로테아제 TCES와 프로테아제 PFUS의 혼성 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열이다. 또 서열목록 SEQ ID No. 5는 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 혼성 단백질의 아미노산 서열이다.

본 발명의 발현된 프로테아제의 양은 바실러스 서브틸리스에서 높게 발현되는 유전자, 특히 분비성 단백질 유전자를 이용하여 증가시킬 수 있다. 유전자로 α-아밀라아제와 다양한 세포외 프로테아제 유전자들이 사용될 수 있다. 예로 발현된 프로테아제 PFUS의 양은 서브틸리신의 프로모터와 시그널서열을 사용하여 증가시킬 수 있다. 즉, 전 길이의 프로테아제 PFUS 유전자를 서브틸리신 유전자의 시그널서열을 암호화한 영역의 하류에 연결하여 두 유전자의 번역 프레임이 서로 일치함에 따라서 프로테아제 PFUS는 서브틸리신 유전자 프로모터의 조절하에 융합단백질로 발현될 수 있다.

서브틸리신의 프로모터와 시그널 서열로서 문헌[J. Bacteriol. volume 171, page 2657-2665(1989)]에 기술된 플라스미드 pKWZ에 삽입된 서브틸리신 유전자의 서열이 사용될 수 있다. 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 프로모터 서열을 함유하는 5' 상류 영역에 대해서, 및 문헌[J. Bacteriol., volume 158, page 411-418(1984)]에서 서브틸리신 암호화 영역에 대해 각각 기술되어 있다. 이들 서열을 기초로하여, 유전자의 프로모터 서열의 상류에 EcoRⅠ 부위를 도입하기 위한 프라이머 SUB4 및 서브틸리신의 시그널 서열을 암호화하는 영역뒤에 BamHⅠ 부위를 도입하기 위한 프라이머 BmRⅠ가 각각 합성되었다. 서열목록 SEQ ID Nos. 36과 37에 프라이머 SUB4와 BmR1의 뉴클레오타이드 서열이 있다. 프라이머 SUB4와 BmRⅠ을 이용하여 서브틸리신 유전자의 프로모터부터 시그널 서열까지 암호화한 영역을 포함한 약 3.0kb DNA 단편이 주형으로 플라스미드 pKWZ을 이용하여 PCR에 의해 증폭할 수 있었다.

DNA 단편의 하류에 연결된 프로테아제 PFUS 유전자 PCR 방법에 의해 피로코커스 푸리오수스의 크로모좀 DNA로부터 취할 수 있다. 상기 유전자의 5' 부분과 혼성화한 프라이머로서, 프라이머 NPF-4가 사용될 수 있다. 또한, 3' 부분과 혼성화한 프라이머는 유전자의 종료 코돈의 하류 뉴클레오타이드 서열이 결정된후에 만들 수 있었다. 즉, 플라스미드 pSNP1을 BamHⅠ으로 분해하여 생성된 약 0.6kb 단편을, 플라스미드 벡터 pUC119의 BamHⅠ 부위에 서브클로닝하여 얻은 플라스미드 pSNPD의 뉴클레오타이드 서열의 일부가 결정된다(뉴클레오타이드 서열은 서열목록 SEQ ID No. 38이다). 상기 서열에 기초하여, 프로테아제 PFUS 유전자의 3' 부분과 혼성화하고 SphⅠ 부위를 도입할 수 있는 프라이머 NPM-1을 합성했다. 서열목록 SEQ ID No. 39는 프라이머 NPM-1의 서열이다.

한편, 프로테아제 PFUS 유전자는 BamHⅠ 부위를 이용하여 상기 0.3kb DNA 단편과 연결될때, 유전자에 존재한 단 하나의 BamHⅠ 부위가 그 과정의 장벽이 된다. 이러한 BamHⅠ 부위를 PCR-돌연변이 방법에 의해 제거하기 위해서 프라이머 mutRR과 mutFR이 서열목록 SEQ ID No. 34에서 나타낸 프로테아제 PFUS 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 만들수 있었다. 프라이머 mutRR과 mutRF의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID No. 40과 41에 각각 있다. 또한, 이러한 프라이머를 이용하여 BamHⅠ 부위가 제거될 때, 서열목록 SEQ ID No. 35에 나타난 프로테아제 PFUS 아미노산 서열중 550위치에 있는 글라이신(glycine)이 그 부위로 도입되는 뉴클레오타이드 치환 때문에 발린으로 치환된다.

이러한 프라이머 이용에 의해, 서브틸리신 유전자의 프로모터로부터 시그널 서열까지에 연결되는 프로테아제 pFUS가 얻어질 수 있다. 즉, 두 종류의 PCR은 주형으로서 피로코커스 푸리오수스의 크로모좀 DNA를 사용하고 두 종류의 프라이머 mutRR과 NPF-4, 및 mutFR과 NPM-1을 사용하여 수행되었다. 더욱이, 두번째 PCR은 주형으로 두가지 PCRs에 의해 증폭된 DNA 단편을 혼합하여 형성된 헤테로 듀플렉스를 사용하고, 프라이머로 NPF-4와 NPM-1을 사용하여 수행되었다. 그리하여 BamHⅠ 부위를 포함하지 않는 약 2.4kb 프로테아제 PFUS의 전 길이가 증폭될 수 있다.

상기 PCR-증폭된 DNA 단편을 BamHⅠ 및 SphⅠ으로 분해하여 얻은 약 2.4kb DNA 단편을 단리하고 플라스미드 pSNP1안에 프로테아제 PFUS 유전자를 포함한 BamHⅠ-SphⅠ 단편으로 대체하였다. 그리하여 제작된 발현 플라스미드는 pPS1으로 명명되고, 이 플라스미드로 형질전환된 바실러스 서브틸리스 DB104를 바실러스 서브틸리스 DB104/pPS1으로 명명하였다. 형질전환체가 배양될때 플라스미드 pSNP1이 사용된 경우와 비슷한 프로테아제 활성이 배양물 상등액과 세포 추출물에서 발견되었고, 아미노산의 치환은 효소활성에 영향을 주지 않는다고 확인되었다. 제16도는 플라스미드 pPS1의 제한 지도이다.

서브틸리신의 프로모터로부터 시그널서열을 포함한 약 0.3kbDNA 단편이 EcoRⅠ과 BamHⅠ으로 자르고, 플라스미드 pPS1안에 P43 프로모터와 리보소옴 결합 부위를 포함한 EcorⅠ-BamHⅠ 단편으로 치환된다. 그렇게 제작된 발현 플라스미드는 pNAPS1으로 명명되고, 이 플라스미드로 형질전환된 바실러스 서브틸리스를 바실러스 서브틸리스 DB104/pNAPS1으로 명명되었다. 형질전환체가 배양되고, 배양물 상등액과 세포 추출물에 대한 프로테아제 활성이 조사되고 두 샘플에서 프로테아제 활성이 감지되었다. 발현된 효소의 양은 바실러스 서브틸리스 DB104/pSN1과 비교시 증가되었다. 제17도는 플라스미드 pNAPS1의 제한 지도이다.

프로테아제 TCES 유전자와 프로테아제 PFUS 유전자의 경우와 비슷한 방법에 의해, 이러한 유전자와 상동성을 가진 프로테아제 유전자를 피로코커스 푸리오수스와 써모코커스 셀러와 다른 고열안정성 균으로부터 얻을 수 있었다. 그러나 프라이머로 상기 올리고뉴클레오타이드 PRO-1F, PRO-2F, PRO-2R, 및 PRO-4R을 사용하고, 주형으로서 스타필로써무스 마리너스 DSM3639와 써모박테로이드 프로테티쿠스 DSM5265의 크로모좀 DNA을 사용하여 PCR에서, 써모코커스 셀러에서 발견된 것처럼 증폭된 DNA 단편의 증폭을 발견되지 않았다. PCR에 의한 유전자증폭의 효율은 주로 프라이머와 주형 DNA의 3' 말단 부분의 어닐링(annealing) 효율에 의해 영향받는다.

PCR에 의한 DNA의 증폭이 관찰되지 않을 때조차 프로테아제 유전자는 같은 아미노산을 암호할 것이나 이번에 사용된 것과 다른 뉴클레오타이드 서열을 가진 올리고뉴클레오타이드를 합성 및 사용하여 검출할 수 있다. 대안적으로, 프로테아제 유전자는 크로모좀 DNA와 프로브로써 상기 올리고뉴클레오타이드 또는 다른 고열안정성 프로테아제 유전자의 일부를 이용하여 사우던 혼성화를 수행하여 검출할 수 있다.

서열목록 SEQ ID No. 8에 나타난 프로테아제 PFUL의 650개의 아미노산 서열의 잔기 323 내지 잔기 650의 서열을 암호화한 약 1kb DNA 단편이 제조되고, 이것이 스타필로써무스 마리너스(Staphylothermus marinus) DSM3639와 써모박테로이드 프로테오리티커스(Thermobacteroides proteoliticus) DSM5265의 크로모좀 DNA를 사용하여 게놈의 사우던 혼성화를 수행하기 위하여 프로브로써 사용될 수 있다. 그 결과로, Pst1(다까라 슈조(주)에서 제조)으로 자른 스타필로써무스 마리너스 크로모좀 DNA를 사용할 때, 시그널이 약 4.8kb 위치에서 관찰되었다. 한편, XbaⅠ으로 분해된 써모박테리오이드 프로테오리티커스 크로모좀 DNA가 사용될 때 시그널은 약 3.5kb 위치에서 관찰된다.

이로부터 프로테아제 PFUL, 프로테아제 PFUS, 프로테아제 TCES 유전자와 상동성을 가진 서열이 또한 스타필로써무스 마리너스와 써모박테리오이드 프로테오리티커스 DNA 크로모좀에 존재함이 밝혀졌다. 그리하여 검출된 DNA 단편으로부터 스타필로써무스 마리너스나 써모박테리오이드 프로테오리티커스 내에 존재하는 고열안정성 프로테아제를 암호화하는 유전자를 단리하여 프로테아제 TCES나 프로테아제 PFUS의 유전자를 분리하고 동정한 방법과 같은 방법에 의해 분리하고 동정할 수 있다.

본 발명의 고열안정성 프로테아제 유전자인, 프로테아제 TCES 유전자가 도입된 형질전환체(바실러스 서브틸리스 DB104/pSTC3)가 10μl/ml 카나마이신을 포함한 LB 배지에서, 37℃에서 배양하여 배양물내에 고열안정성 프로테아제를 발현시켰다. 배양 후 원심분리에 의해 상등액을 모아 황산암모니움으로 염석 및 투석하여 조효소 제조물을 얻는다. 따라서, 바실러스 서브틸리스 DB104/pSTC3으로부터 얻은 조효소 제조물은 TC-3으로 명명되었다.

비슷한 과정에 의해, 프로테아제 PFUS 유전자가 도입된 형질전환체 바실러스 서브틸리스 DB104/pSNP1으로부터 또는 유전자가 프로테아제 TCES와 프로테아제 PFUS의 혼성 프로테아제를 암호화하는 형질전환체 바실러스 서브틸리스 DB104/pSPT1으로부터 조효소 제조물을 얻을 수 있다. 바실러스 서브틸리스 DB104/pSNP1와 바실러스 서브틸리스 DB104/pSPT1으로부터 얻을 수 있는 조효소 제조물을 각각 NP-1과 PT-1으로 명명하였다.

본 발명의 고열안정성 프로테아제(PFUS) 유전자, 고열안정성 프로테아제 유전자를 도입시킨 형질 전환체 바실러스 서브틸리스 DB104/pNAPS1를 세포에서 또는 종래조건의 배양물내에서, 예로, 10μl/ml 카나마이신을 포함한 LB 배지에서, 37℃에서 배양하여 고열안정성 프로테아제를 발현한다. 배양완결후, 원심 분리하여 세포와 세포상등액을 분리하고 이들중 어느 것으로부터 프로테아제 PFUS의 조효소 제조물을 다음 과정에 의해 얻을 수 있다.

효소가 세포로부터 정제될 때, 첫째, 라이소자임을 처리하여 세포를 용해시키고, 용해물을 열처리하고 원심 분리하여 상등액을 회수한다. 이 상등액을 황산 암모니움으로 분획화하고 정제된 효소를 얻기위하여 소수성 크로마토그래피를 실행한다. 바실러스 서브틸리스 DB104/pNAPS1으로부터 얻어진 정제된 효소 제조물은 NAPS-1으로 명명되었다.

한편, 배양물 상등액을 투석하여 음이온 교환 크래마토그래피를 하였다. 용출된 활성 분획물을 수집하고, 열처리하고, 황산 암모니움로 분획화하고, 프로테아제 PFUS의 정제된 효소를 얻기위해서 소수성 크래마토그래피를 하였다. 정제된 효소 제조물은 NAPS-1S로 명명되었다.

이렇게 얻어진 정제된 생성물 NAPS-1과 NAPS-1S를 SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 전기 영동할때, 두가지 효소 제조물이 약 45kDa의 분자량에 해당하는 하나의 밴드를 보여준다. 이러한 두가지 효소 제조물은 동일한 효소 제조물로 정제 과정 중에 열처리에 의해 프로 서열이 제거됨에 의해 성숙 효소(활성형)로 전환된다.

예를 들면, 본 발명에 의해 얻어진 고열안정성 프로테아제 유전자 TC-3, NP-1, PT-1, NAPS-1이 도입된 형질전환체에 의해 생성된 프로테아제 제조물은 다음과 같은 물리 화학적 성질을 가지고 있다.

(1) 활성도

본 발명에서 얻은 효소는 짧은 사슬의 폴리펩타이드를 생성하기 위하여 젤라틴을 가수 분해 한다. 또한, 그 효소는 짧은 사슬의 폴리펩타이드를 생성하기 위해 카세인을 가수 분해한다.

또한, 본 발명에서 얻은 효소는 숙시닐-L-루실-L-루실-L-발릴-L-타이로신-4-메틸코마린-7-아마이드(Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA)를 가수분해하여 형광 물질(7-아미노-4-메틸코마린)을 생성한다.

또한, 본 발명에서 얻은 효소는 황색물질(p-니트로아닐린)을 생성하기 위하여 숙시닐-L-알라닐-L-알라닐-L-프롤릴-L-페닐알라닐-p-니트로아닐라이드(Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA)를 가수분해한다.

(2) 효소 활성의 측정을 위한 방법

본 발명에서 수득된 효소 제조물의 효소 활성을 합성 펩타이드 기질을 사용하여 측정할 수 있다.

본 발명에서 수득된 효소 제조물 TC-3의 효소 활성을 기질로서 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA(펩타이드 연구소 제조)를 사용하여 측정할 수 있다. 즉, 효소 활성에 대해 검출하려는 효소 제조물을 대략 희석하고, 용액 20μl에 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA 62.5μM을 함유하는 01.M 인산 나트륨 완충제(pH 7.0) 80μl에 첨가하고, 이어서 75℃에서 30분간 인큐베이션한다. 반응을 30% 아세트산 20μl를 첨가하여 멈추고, 형광 강도를 생성된 7-아미노-4-메틸쿠마린의 생성량을 정량화하기 위하여, 355nm의 여기 파장 및 460nm의 형광 파장에서 측정하고, 결과적인 값을 효소 활성을 조사하기 위하여 효소 제조물의 첨가없이 인큐베이션할때 얻어지는 값과 비교한다. 본 발명에 의해 수득된 효소 제조물의 TC-3은 pH 7.0 및 75℃에서 측정된 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA 가수분해 활성을 보인다.

또한, 효소 제조물 NP-1, PT-1, NAPS-1 및 NAPS-1S의 효소 활성은 기질로서 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Na(Sigma 제조)를 사용하여 광도 측정법으로 측정할 수 있다. 즉, 효소 활성에 대해 검출하려는 효소 제조물은 적절히 희석하고, 이 용액 50μl에 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Na를 함유하는 0.1M 인산 칼륨 완충제(pH 7.0)(Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Na 용액) 50μl를 첨가하고, 95℃에서 30분간 인큐베이션한다. 반응을 얼음-냉각으로 중지시키고, 405nm에서의 흡광도를 생성된 p-니트로아닐린의 양을 측정하고, 효소 활성을 조사하기 위하여 결과 값을 효소 제조물의 첨가없이 인큐베이션 했을때의 것과 비교했다. 이때, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Na의 0.2mM 용액을 효소 제조물 NP-1, PT-1에 대해 사용하고, 1mM 용액을 효소 제조물 NAPS-1 및 NAPS-1S에 대해 사용했다. 본 발명에 따라 수득된 효소 제조물, NP-1, PT-1, NAPS-1 및 NAPS-1S는 pH 7.0 및 95℃에서 측정된 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Na 가수분해 활성을 갖는다.

(3) 다영한 기질에 대한 활성의 검출

합성 펩타이드 기질에 대한 본 발명에서 수득한 효소 제조물의 활성은 상기 (2)에서 기술된 효소 활성을 측정하는 방법에 의해 확인한다. 즉, 본 발명에서 수득된 효소 제조물 TC-3은 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA 가수분해 활성을 갖고, 효소 제조물 NP-1, PT-1, NAPS-1 및 NAPS-1S는 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Na 가수분해 활성을 갖는다. 또한 효소 제조물 NP-1, PT-1, NAPS-1 및 NAPS-1S를 효소 제조물 TC-3에 대해 사용한 상기(2)에 기술된 효소 활성 측정 방법으로 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA 가수분해 활성에 대해 조사하고, 이들 효소 제조물이 기질을 분해하는 활성을 가짐이 밝혀졌다. 또한, 효소 제조물 TC-3을 효소 제조물 NP-1 및 PT-1에 대해 사용한 상기 (2)에서 기술된 효소 활성 측정 방법에 의해 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Na 가수분해 활성에 대해 조사하고 기술을 분해하는 활성이 인식됐다. 또한 본 발명에서 수득된 효소 제조물의 젤라틴에 대한 활성은 SDS 폴리아크릴아마이드 젤상에 대해 효소의 젤라틴 분해를 확인하여 검출할 수 있다. 즉, 효소 활성에 대해 검출하려는 효소 제조물을 적절하게 희석하고, 샘플 용액 10μl에 샘플 완충제(50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 5% SDS, 5% 2-머캅토에탄올, 0.005% 브로모페놀 블루, 50% 글리세롤) 2.5μl를 첨가하여 0.05% 젤라틴을 함유하는 0.1% SDS-10% 폴리아크릴아마이드 젤을 사용하여 100℃에서 5분간 전기영동시켰다. 이동이 완결된후, 젤을 50mM 인산염 완충제(pH 7.0)에 침지시키고, 효소 반응을 수행하기 위하여 95℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 젤을 30분간 2.5% 코마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R-250, 25% 에탄올 및 10% 아세트산중에서 염색하고, 과잉의 염료를 제거하기 위하여 7% 아세트산중에 3 내지 15시간 동안 옮겼다. 프로테아제 활성의 존재는 젤라틴을 젤밖으로 확산하는 펩타이드로 가수분해하고, 결과적으로 젤의 관련 부분은 코마시 브릴리언트 블루로 염색되지 않는다는 사실로 검출할 수 있다. 본 발명에 수득된 효소 제조물 TC-3, NP-1, PT-1, NAPS-1 및 NAPS-1S는 95℃에서 젤라틴 가수분해 활성을 가졌다.

또한, 프로테아제 PFUS 유전자로부터 유도된 효소 제조물은 상기 활성 측정 방법에서 젤상의 거의 같은 위치에서 젤라틴 가수분해 활성을 갖는 것으로 인식된다. 이로부터, 이들 효소 제조물에서 전구체 효소가 성숙형 효소로의 진행은 유사한 방법으로 일어난다.

더욱이, 카제인에 대한 가수분해 활성은 0.05% 카제인을 함유하는 0.1% SDA-10% 폴리아크릴아마이드젤이 사용된것 이외에는 젤라틴 활성을 검출에 사용하는 것과 같은 방법에 따라 검출할 수 있다. 본 발명에서 수득된 효소 제조물, TC-3, NP-1, PT-1, NAPS-1 및 NAPS-1S는 95℃에서 카제인 가수분해 활성을 가졌다.

다르게는, 본 발명에 의해 수득된 효소 제조물 TC-3, NP-1, PT-1, NAPS-1 및 NAPS-1S의 카제인 가수분해 활성을 하기의 방법으로 측정할 수 있다. 적절히 희석된 효소 제조물의 100μl를 0.2% 카제인을 함유하는 0.1M 인산 칼륨 완충제(pH 7.0) 100μl에 첨가하고, 95℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 반응을 15% 트리클로로아세트산 100μl를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 상기 반응 혼합물을 원심분리하여 수득된 상등액에 함유된 산-용해성 단쇄 폴리펩타이드의 양을 280nm에서의 흡광도로 결정하여 효소 활성을 조사하기 위하여 효소 제조물의 첨가없이 인큐베이션했을 때와 비교했다. 본 발명에 따라 수득된 효소 제조물 TC-3, NP-1, PT-1, NAPS-1 및 NAPS-1S는 95℃에서 카제인 가수분해 활성을 가졌다.

(4) 최적 온도

본 발명에 따라 수득된 효소 제조물 TC-3의 최적 온도는 온도를 변화시키는 것 이외에는 상기 (2)에 나타난 효소 활성 측정 방법을 이용하여 조사했다. 제18도에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 수득된 효소 제조물 TC-3는 37 내지 95℃에서 활성을 나타내고, 최적 온도는 70 내지 80℃이었다. 즉 제18도는 본 발명에서 수득된 효소 제조물 TC-3의 활성과 온도사이의 관계를 나타내는 도면이며, 세로 좌표는 상대적 활성도와 최대 활성도(%) 사이의 관계를 나타내며, 가로 좌표는 온도를 나타낸다.

또한, 본 발명에서 수득된 효소 제조물 NAPS-1의 최적 온도는 온도를 변화시키는 것 이외에는 상기 (2)에 나타난 효소 활성 측정 방법을 이용하여 조사했다.

제19도에 나타난 바와 같이, 효소 제조물 NAPS-1은 pH7.0의 측정 조건에서 40 내지 110℃의 온도에서 활성을 나타내고, 최적 온도는 80 내지 95℃이었다. 즉 제19도는 본 발명에서 수득된 효소 제조물 NAPS-1의 활성과 온도사이의 관계를 나타내는 도면이며, 세로 좌표는 상대 습도 내지 최대 활성도(%) 사이의 관계를 나타내며, 가로 좌표는 온도를 나타낸다.

(5) 최적 pH

본 발명에 따라 수득된 효소 제조물 TC-3의 최적 온도는 상기(2)에 나타난 효소 활성 측정 방법을 이용하여 조사했다. 즉, Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA 용액을 다양한 pH를 갖는 완충제를 사용하여 제조하고, 상기 용액을 사용하여 수득된 효소 활성을 비교하였다. 완충제로서 나트륨 아세테이트 완충제를 pH 3 내지 6에서 사용하고, 인산 나트륨 완충제를 pH6 내지 8에서 사용하며, 붕산 나트륨 완충제를 pH 8 내지 9에서 사용하고, 인산 나트륨-수산화 나트륨 완충제를 pH 10 내지 11에서 사용하였다. 제20도에서 나타난 바와 같이, 효소 제조물 TC-3은 pH5.5 내지 9에서 활성을 나타내고, 최적 pH는 pH 7 내지 8이었다. 즉, 제20도는 본 발명에서 수득된 효소 제조물 TC-3의 활성과 pH 사이의 관계를 나타내는 도면이며, 세로 좌표는 상대적 활성도를 나타내며, 가로 좌표는 pH를 나타낸다.

또한, 본 발명에서 수득된 효소 제조물 NP-1의 최적 pH는 상기 (2)에서 나타난 효소 활성 측정 방법을 이용하여 조사했다. 즉 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Na 용액을 다양한 pH를 갖는 완충제를 이용하여 제조하고, 이 용액을 사용하여 수득된 효소 활성을 비교하였다. 완충제로서 나트륨 아세트테이트 완충제를 pH 4 내지 6에서 사용하고, 인산 나트륨 완충제를 pH 6 내지 8에서 사용하며, 붕산 나트륨 완충제를 pH 5 내지 10에서 사용하고, 인산 나트륨-수산화 나트륨 완충제를 pH 10.5에서 사용하였다. 제21도에 나타낸 바와같이, 효소 제조물 NP-1은 pH5.5 내지 10에서 활성을 나타내고, 최적 pH5.5 내지 8이었다. 즉, 제21도는 본 발명에서 수득된 효소 제조물 NP-1의 활성과 pH사이의 관계를 나타내는 도면이며, 세로 좌표는 상대적 활성도(%)를 나타내며, 가로 좌표는 pH를 나타낸다.

더욱이, 본 발명에서 수득된 효소 제조물 NAPS-1의 최적 pH를 상기(2)에서 나타난 효소 활성 측정 방법에 의해 조사했다. 즉, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Na 용액을 다양한 pH를 갖는 완충제를 이용하여 제조하고, 이 용액을 사용하여 수득된 효소 활성을 비교하였다. 완충제로서 나트륨 아세테이트 완충제를 pH4 내지 6에서 사용하고, 인산 나트륨 완충제 pH6 내지 8에서 사용하며, 붕산 나트륨 완충제를 pH 8.5 내지 10에서 사용했다. 제22도에 나타난 바와 같이, 효소 제조물 NAPS-1은 pH 5 내지 10에서 활성을 나타내고, 최적 pH는 pH 6 내지 8이었다. 즉, 제22도는 본 발명에서 수득된 효소 제조물 NAPS-1의 활성과 pH 사이의 관계를 나타내는 도면이며, 세로 좌표는 상대적 활성도(%)를 나타내며, 가로 좌표는 pH를 나타낸다.

(6) 열 안정성

본 발명에서 수득된 효소 제조물 TC-3의 열안정성을 조사했다. 즉, 효소 제조물을 다양한 기간 동안 pH 7.5의 20mM 트리스-HCl중의 80℃에서 인큐베이션하고, 그의 적절한 양을 상기(2)에 나타난 방법에 의해 효소 활성을 측정하기 위해서 취하고, 비열처리된 것과 비교하였다. 제23도에 나타난 바와 같이 본 발명에 의해 수득된 효소 제조물 TC-3은 3시간 열처리후에도 활성의 90%이상을 가졌고, 따라서, 상기 열처리에 안정했다. 즉, 제23도는 본 발명에서 수득된 효소 제조물 TC-3의 열안정성을 보여주고, 세로 좌표는 열처리후의 잔류 활성을 나타내고, 가로좌표는 시간을 나타낸다.

또한, 본 발명에서 수득된 효소 제조물 NP-1의 열안정성을 조사했다. 즉, 효소 제조물을 다양한 기간 동안 pH 7.5의 20mM 트리스-HCl중의 95℃에서 인큐베이션하고, 그의 적절한 분취량을 상기(2)에 나타난 방법에 의해 효소 활성을 측정하기 위해서 취하고, 비열처리된 것과 효소 활성을 비교하였다. 제24도에 나타난 바와 같이 본 발명에 의해 수득된 효소 제조물 NP-1은 95℃에서 인큐베이션했을 때에도 놀라웁게 증가된 효소 활성을 갖는 것으로 관찰된다. 이는 전구체로서 생성된 프로테아제가 열처리동안 자가 촉매(self-catalytic) 활성을 야기시키는 것으로 생각된다. 또한 활성에서 어떤 감소도 3시간 이하의 열처리에서 관찰되지 않았다. 즉 제24도는 본 발명에서 수득된 효소 제조물 NP-1의 열안정성을 보여주는 도면이고, 세로 좌표는 열처리후의 잔류 활성(%)을 나타내고, 가로 좌표는 시간을 나타낸다.

또한, 열처리에 의해 활성화된 상기 효소 제조물 NP-1은 열안정성에 대해 조사했다. 즉, 효소 제조물 NP-1을 95℃에서 30분간 열처리하여 활성화시키고, 다양한 기간 동안 95℃에서 인큐베이션하고, 효소 활성을 비열처리된 것과 비교하였다. 동시에, 다양한 완충제(pH 5의 나트륨 아세테이트 완충제, pH 7의 인산 나트륨 완충제, pH 9의 붕산 나트륨 완충제, pH 11의 인산 나트륨-수산화 나트륨, 각 경우에 20mM)를 사용했다. 제25도에 나타낸 바와 같이 본 발명에 의해 수득된 효소 제조물 NP-1은 pH9의 완충제 처리했을때, 8시간 열처리후에도 활성의 90%이상을 가졌고, 24시간 동안 열처리후에도 대략 50%를 가져서, 따라서, 상기 열처리에 안정했다. 즉, 제25도는 본 발명에서 수득된 효소 제조물 NP-1의 열안정성을 보여주고, 세로 좌표는 열처리후의 잔류 활성(%)을 나타내고, 가로 좌표는 시간을 나타낸다.

또한, 본 발명에서 수득된 효소 제조물 NAPS-1의 열안정성을 조사했다. 즉, 효소 제조물을 다양한 기간 동안 pH7.5의 20mM 트리스-HCl중의 95℃에서 인큐베이션하고, 그의 적절한 분취량을 상기(2)에 나타난 방법에 의해 효소 활성을 측정하기 위해서 취하고, 비열처리된 것과 효소 활성을 비교하였다. 제26도에 나타난 바와 같이 본 발명에 의해 수득된 효소 제조물 NAPS-1은 95℃에서 3시간 동안 열처리한 후 조차도 80%이상의 효소 활성을 가져서, 따라서 상기 열처리에 대해서도 안정하다. 즉 제26도는 본 발명에서 수득된 효소 제조물 NAPS의 열안정성을 보여주는 도면이고, 세로 좌표는 열처리후의 잔류 활성(%)을 나타내고, 가로 좌표는 시간을 나타낸다.

(7) pH 안정성

본 발명에서 수득된 효소 제조물 NP-1의 pH 안정성을 하기 과정에 따라 조사했다. 95℃에서 30분간 열처리하여 활성화된 효소 제조물 NP-1을 함유하는 다양한 pH의 20mM의 각 50μl를 95℃에서 60분간 처리하고, 그의 적절한 분취량을 상기(2)에 나타난 방법에 의해 효소 활성을 측정하고, 비처리된 것과 효소 활성을 비교하였다. 완충제로서 나트륨 아세테이트 완충제를 pH 4 내지 6에서 사용하고, 인산 칼륨 완충제를 pH 6 내지 8에서 사용하며, 붕산 나트륨 완충제를 pH 9내지 10에서 사용하고, 인산 나트륨-수산화 나트륨 완충제를 pH 11에서 사용했다. 제27도에 나타난 바와 같이 본 발명에 의해 수득된 효소 제조물 NP-1은 95℃에서, pH 5 내지 11에서 60분간 처리했을때에도 95%이상의 활성을 유지했다. 즉 제27도는 본 발명에서 수득된 효소의 pH 안정성을 보여주는 도면이고, 세로 좌표는 열처리후의 잔류 활성(%)을 나타내고, 가로 좌표는 시간을 나타낸다.

(8) 세제에 대한 안정성

본 발명에서 수득된 효소 제조물 NP-1을 세제로서 SDS를 사용하여 조사했다. 효소 제조물 NP-1을 95℃에서 30분간 열처리하여 활성화시켰다. 오직 효소 제조물을 함유하는 용액 및 최종 농도가 0.1% 또는 1%되게 SDS를 추가로 함유한 용액의 각각 50μl를 제조하였다. 이들 용액을 95℃에서 다양한 기간동안 인큐베이션시키고, 60분간 처리하고, 그의 적절한 양을 상기(2)에 나타난 방법에 의해 효소 활성을 측정하고, 비처리된 것과 효소 활성을 비교하였다. 제28도에 나타난 바와같이, 본 발명에 의해 수득된 활성화된 효소 제조물 NP-1은 95℃에서 8시간 동안 열처리후에도 80% 이상의 활성을 가졌고, SDS와 독립적으로 24시간 열처리후에도 활성의 대략 50%를 가져서, SDS의 존재에서 조차 높은 안정성을 가졌다. 즉 28도는 본 발명에 의해 수득된 효소 제조물 NP-1의 SDS DP 대한 안정성을 보여주고, 세로 좌표는 잔류 활성도(%)를 나타내고, 가로 좌표는 시간을 나타낸다.

또한, 본 발명에서 수득된 효소 제조물 NAPS-1을 세제로서 SDS를 사용하여 조사했다. 오직 효소 제조물 NAPS-1을 함유하는 용액 및 최종 농도가 0.1% 또는 1%되게 SDS를 추가로 함유한 용액의 각각 50μlㅣ를 제조하였다. 이들 용액을 95℃에서 다양한 기간동안 인큐베이션시키고, 60분간 처리하고, 그의 적절한 분취량을 상기(2)에 나타난 방법에 의해 효소 활성을 측정하고, 비처리된 것과 효소 활성을 비교하였다. 제29도에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의해 수득된 활성화된 효소 제조물 NAPS-1은 95℃에서 3시간 동안 열처리후에도 SDS의 존재와 독립적으로 대략 80%의 활성을 가졌다. 즉 제29도는 본 발명에 의해 수득된 효소 제조물 NAPS-1의 SDS에 대한 안정성을 보여주는 것이고, 세로 좌표는 잔류 활성도(%)를 나타내고, 가로 좌표는 시간을 나타낸다.

상기 결과들을 비교할때, 효소 제조물 NAPS-1이 효소 제조물 NP-1과 비교하여 놀라웁게 감소된 잔류활성을 가짐이 나타난다. 그러나, 이들 현상은 양 제조물에 함유된 효소 단백질의 SDS에 한 안전성에서의 차이에 기초한 것으로는 생각치 않는다. 정제된 효소 제조물이 NAPS-1가 NP-1과 비교하여 덜 오염된 단백질을 갖는 것이 상기 현상의 원인으로 생각된다. 따라서, 불활성화는 자가-분해에 의해 쉽게 일어난다.

(9) 유기 용매에 대한 안정성

본 발명에서 수득된 효소 제조물 NAPS-1의 유기 용매에 대한 안정성을 아세토니트릴을 이용하여 조사하였다. 최종 농도가 25% 또는 50%가 되게 아세토니트릴을 함유하는 효소 제조물 NAPS-1용액의 각 50μl를 다양한 기간동안 95℃에서 인큐베이션시키고, 그의 적절한 분취량을 상기(2)에 나타난 방법에 의해 효소 활성을 측정하고, 비처리된 것과 효소 활성을 비교하였다. 제30도에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의해 수득된 활성화된 효소 제조물 NAPS-1은 처리전의 80%이상이었고, 50% 아세토니트릴의 존재하에서 95℃에서 1시간 동안 처리후에도 80% 이상이었다. 즉, 제30도는 본 발명에 따라 수득된 효소 제조물 NAPS-1의 아세토니트릴에 대한 안정성을 보여주는 도면이다.

(10) 변성제에 대한 안정제

본 발명에서 수득된 효소 제조물 NAPS-1의 다양한 변성제에 대한 안정성을 우레아 및 구아니딘 하이드로클로라이드를 사용하여 조사하였다. 최종 농도가 3.2M 또는 6.4M되게 우레아를 또는 최종 농도가 1M, 3.2M 또는 6.4M되게 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유하는 효소 제조물 NAPS-1 용액의 각 50μl를 제조하였다. 이들 용액을 다양한 기간동안 95℃에서 인큐베이션시키고, 그의 적절한 분취량을 상기(2)에 나타난 방법에 의해 효소 활성을 측정하고, 비처리된 것과 효소 활성을 비교하였다. 제31도에 나타난 바와같이, 본 발명에 의해 수득된 활성화된 효소 제조물 NAPS-1은 우레아에 내성을 보였고, 처리전의 70%이상, 6.4몰 우레아의 존재하에서 95℃에서 1시간 동안 처리후에도 80% 이상의 활성을 가졌다. 즉, 제31도는 우레아에 대한 안정성을 보여주는 도면이고, 제32도는 구아니딘 하이드로클로라이드에 대한 안정성을 보여주는 도면이다. 세로 좌표는 잔류 활성을 나타내고 가로 좌표는 사건을 나타낸다.

(11) 다양한 시약의 효과

본 발명에 의해 수득된 효소 제조물 TCES 및 NAPS-1에 대한 다양한 시약의 효과를 조사하였다. 즉, 상기 효소 제조물을 농도가 1mM되게 다양한 시약의 존재에서 37℃에서 30분간 처리하고, 그의 분취량을 시약이 첨가되지 않은 때의 대조군과 비교하기 위하여 상기(2)에 기술된 방법에 의해 효소 활성을 결정하기 위하여 취했다.

[표 1]

표 1에 나타난 바와 같이, PMSF(페닐메탄설포닐 플루라이드) 및 키모스타틴으로 처리할때, 양 효소 제조물은 매우 감소된 활성을 가졌다. 또한, 고통 경감제로 처리했을때, 활성에서의 감소가 TCES에서 관찰되었고, EDTA로 처리했을때, NAPS-1에서 활성의 감소가 관찰되었다. 다른 시약의 경우에, 다량의 감소는 활성에서 관찰되지 않았다.

(12) 분자량

본 발명에 의해 수득된 효소 제조물 NAPS-1의 분자량을 0.1% SDS-10% 폴리아크릴아마이드 젤을 사용하여 결정하였다. 효소 제조물 NAPS-1은 SDS-PAGE 상에서 약 45kDa의 분자량을 보였다. 다른한편, 효소 제조물 NAPS-1S는 효소 제조물 NAPS-1의 것과 같은 분자량을 보였다.

(13) N-말단 아미노산 서열

성숙한 효소, 프로테아제 PFUS의 N-말단 아미노 서열은 본 발명에 의해 수득된 효소 제조물 NAPS-1을 사용하여 결정하였다. 0.1% SDS-10% 폴리아크릴아마이드상에서 전기영동된 효소 제조물 NAPS-1을 PVDF막에 옮기고, 막상의 효소의 N-말단 아미노산 서열을 단백질 시퀀서(sequencer)를 사용하여 자동 에드만(Edman) 분해에 의해 결정하였다. 이렇게 결정된 성숙형 프로테아제 PFUS의 아미노산 서열이 서열 목록의 SEQ ID No. 42에 나타나 있다. 이 서열은 서열목록의 SEQ ID No.35에 의해 나타내지는 프로테아제 PFUS의 아미노산 서열의 아미노산 서열 133 내지 144의 순서와 일치했고, 성숙한 프로테아제 PFUS는 이 부분 뒤를 포함하는 폴리펩타이드로 구성된 효소임이 밝혀졌다. 따라서, 밝혀진 성숙 프로테아제 PFUS의 아미노산 서열은 서열목록의 SEQ ID No. 3에 의해 나타내진다. 또한, 상기 기술된 바와같이, 428번째의 아미노산(서열목록 SEQ ID No.35에 의해 나타내지는 아미노산 서열중의 560째의 아미노산에 상응)이 글리신 또는 발린인 것과 독립적으로 프로테아제 PFUS이 효소 활성에 영향이 없다. 추가로 서열목록의 SEQ ID No. 34에 의해 나타내지는 프로테아제 PUFS 유전자의 뉴클레오타이드 서열안에서, 성숙형 효소를 암호화하는 영역의 뉴클레오타이드 서열이 SEQ ID No. 4에 나타나 있다. 서열중의 1283번째 염기가 구아닌 또는 티민일 수 있다.

PCR에 의한 시험관내 유전자 증폭의 경우에, 뉴클레오타이드의 잘못된 삽입이 신장(elongation) 반응 동안 일어나 결과적인 DNA의 서열에서 뉴클레오타이드 치환에 이르게 된다. 이 빈도는 자주 PCR에 대해 사용된 효소의 종류, 반응 혼합물의 조성, 증폭시키려는 DNA의 뉴클레오타이드 서열에 영향을 받는다. 그러나, 유전자의 특정 영역이 보통 수행되는 바와 같이 간단히 증폭될 때, 이 빈도는 400 뉴클레오타이드당 기껏해야 하나의 뉴클레오타이드이다. 본 발명에서, PCR은 프로테아제 TCES 또는 프로테아제 PFUS의 유전자의 단리 또는 그를 위한 발현 플라스미드의 제작에 사용되었다. 결과적인 유전자의 뉴클레오타이드 순서에서의 뉴클레오타이드 치환의 수는 있다 하더라도 수개 뉴클레오타이드이다. 한 유전자상의 뉴클레오타이드 치환이 반드시 번역 코돈의 열화때문에 발현된 단백질에서 아미노산 치환에 이르지는 않는 것을 고려할때, 가능한 아미노산 치환의 수는 전체 잔기중에서 최대로 2 내지 3으로 평가될 수 있다. 본 명세서에 개시된 프로테아제의 아미노산 서열 및 프로테아제 TCES 및 프로테아제 PFUS의 뉴클레오타이드 서열이 천연적인 것을 부인할 수는 없다.

그러나, 본 발명의 목적은 고온에서 고활성을 갖는 고열 안정성 프로테아제 및 그를 암모화하는 유전자를 개시하는 것이며, 그러므로, 프로테아제와 그 유전자는 천연적인 것의 같은 효소 및 그를 암호화하는 같은 유전자에 한정되지 않는다. 본 분야에 숙련된자에게는 가능한 뉴클레오타이드 치환을 갖는 유전자라도 엄격한(stringent) 조건에서 천연 유전자와 혼성화할 수 있다는 것이 명백할 것이다.

또한, 본 명세서에서, 흥미있는 유전자를 얻는 방법은 (1) 발현 클로닝용 라이브러리를 고열성 크로모좀 DNA로부터 만들고, 프로테아제 활성의 발현을 스크리닝하고, (2) 가능하게는 고열안정성 프로테아제를 발현하는 유전자를 혼성화 또는 아미노산의 동족체에 기초한 PCR 및 이들 유전자의 발현 생성물의 효소 작용에 의해 단리시켜, 즉 고열안정성 프로테아제 활성이 적절한 미생물을 사용하여 확인되는 것으로 명백히 개시되어 있다. 그러므로, 다양한 돌연변이가 공지된 돌연변이 도입방법을 사용하여 본 발명의 고열안정성 프로테아제 유전자에 도입된후 도입된 돌연변이를 갖는 유전자 서열이 고열안정성 프로테아제를 암호화하는지를 상기 방법을 이용하여 쉽게 결정할 수 있다. 도입하려는 돌연변이의 종류는 돌연변이 도입의 결과로서 얻어진 유전자 서열이 실질적인 본 발명의 고열안정성 프로테아제와 같은 프로테아제 활성을 발현하는 한 특정한 것으로 제한되지는 않는다. 그러나, 발현된 단백질이 프로테아제 활성을 유지하도록, 바람직하게는 세린 프로테아제와 공동으로 보전되는 4개 지역 이외의 지역으로 도입된다.

돌연변이는 고열안정성 프로테아제를 암호화하는 유전자의 어떤 지역으로 임의로 도입할 수 있거나, 달리는 원하는 돌연변이를 특정의 예비-결정된 위치(부위-지정 돌연변이)에 도입할 수 있다. 돌연변이를 임의로 도입하는 방법으로서, 예를 들어 DNA를 화학적으로 처리하는 방법이 있다. 이 경우에, 플라스미드는 돌연변이가 도입되는 지역이 부분적으로 단일 가닥이고, 중아황산 나트륨이 상기 부분적으로 단일 가닥 지역에 작용하여 염기 시토신을 우라실로 전환시키고, 따라서 C:G 내지 T:A로의 전이 돌연변이를 도입하였다. 또한, 단일 가닥 부분이 [α-S] dNTP의 존재하에서 이중가닥으로 수선되는 과정동안 염기 치환을 생성하는 방법이 또한 알려져 있다. 이들 방법은 상세한 내용은 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 79, page 1408-1412(1982), and Gene, volume 64, page 313-319(1988)]에 개시되어 있다.

임의 돌연변이는 뉴클레오타이드 삽입의 신빙성이 낮아지는 조건에서 PCR을 수행하여 또한 도입될 수 있다. 특히, 반응 시스템에 망간의 첨가는 효과적이고, 이 방법의 상세한 내용은 문헌[Anal. Biochem., volume 224, page 347-355(1995)]에 기술되어 있다. 부위-지정 돌연변이를 도입하는 방법으로서, 예를들어 관심있는 유전자가 단일 가닥으로 만들고, 상기 단일 가닥 부분에 도입하려는 돌연변이에 따라 설계된 프라이머를 합성하며, 프라이머를 오직 도입된 돌연변이를 갖는 가닥만이 선택적으로 복제되는 생체내 시스템으로 도입되는 부분에 어닐링되는 시스템을 사용하는 방법이다. 이 방법의 상세한 내용은 문헌[Methods in Ezymology, volume 154, page 367(1987)]에 기술되어 있다. 예를들어 Takara Shuzo Co., Ltd.에 의해 제조된 돌연변이 도입 키트, 뮤탄트 K(mutant K)가 사용될 수 있다. 부위-지정 돌연변이는 또한 PCR에 의해 수행될 수 있고, 상세한 내용은 문헌[the method in PCR Technology, page 61-70(1989), edited by Ehlich and published by Takara Shuzo Co., Ltd.]에 기술되어 있다. 다르게는 예를 들어, Takara Shuzo Co., Ltd.에 의해 제조된 시험관내 돌연변이 키트중의 LA-PCR을 이용할 수 있다. 상기 방법을 사용하여, 치환, 결손 및 삽입의 돌연변이가 도입될 수 있다.

따라서, 본 발명의 고열안정성의 것과 유사한 열안정성과 최적 온도를 가지나 작은 차이, 예를 들어 최적 pH를 갖는 효소는 본 발명의 고열안정성 프로테아제 유전자를 염기로서 사용하는 돌연변이를 도입하여 숙주에서 생성시킬 수 있다. 이 경우에 고열안정성 프로테아제 유전자의 기초(base) 뉴클레오타이드 서열은 반드시 하나의 고열안정성 프로테아제로부터 유도된 서열로 제한되지 않는다.

혼성(hybrid) 유전자는 상동성 서열을 교환하여 본 발명에 의해 개시된 바와 같이 서로 상동성인 서열을 갖는 두개 이상의 고열안정성 프로테아제 유전자를 재조합시켜 만들수 있고, 유전자에 의해 암호화되는 혼성 효소를 숙주에서 생성시킬 수 있다. 또한 혼성 유전자의 경우 이것 이 고열안정성 프로테아제 유전자인지는 유전자 생성물의 효소 작용, 즉 프로테아제 활성에 대해 시험하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 상기 플라스미드 pSPT1을 사용하여, N-말단 부분의 프로테아제 PFUS로부터 유도되고, C-말단 부분이 프로테아제 TCES로부터 유도된 혼성 프로테아제가 바실러스 서브틸리스(Bacilus subtilis)에서 생성될 수 있고, 이 혼성 프로테아제는 95℃에서 프로테아제 활성을 갖는다.

혼성 효소는 동시에 두개 이상의 기초 효소 성질을 갖는 것으로 예상된다. 예를들어 본 명세서에 개시된 프로테아제 PFUS와 프로테아제 TES를 비교할때, 프로테아제 TCES가 세포외 분비 효율과 관련하여 우수하고, 프로테아제 PFUS가 열안정성과 관련하여 우수하다. 단백질의 N-말단에 위치한 시그널 서열은 세포외 분비 효율에 큰 영향을 갖기 때문에, 발현 벡터가 pSPT1과 대조적으로 프로테아제 TCES로부터 유도된 N-말단 부분 및 프로테아제 PFUS로부터 유도된 C-말단 부분은 갖는 단백질이 생성된다면, 프로테아제 PFUS의 것과 동일한 열안정성을 갖는 고열안정성 프로테아제가 프로테아제 TCES의 것과 동등한 분비 효율로 분비될 수 있다. 또한, 효소가 세포외에 분비될때, 시그널 서열이 효소로부터 절단되기 때문에, 효소의 성질에는 거의 영향을 끼치지 않는다. 그러므로, 고열안정성 프로테아제가 증온균을 사용하여 생성할때, 그의 시그널 서열이 반드시 고열성균(hyperthermophile)으로부터 유도될 필요는 없고, 중온균으로부터 유도된 시그널 서열은 흥미있는 단백질이 고효율로 세포외 분비되는 한 문제가 없다.

특히, 사용하는 숙주에서 높게 발현되는 분비 단백질의 시그널 서열이 이용되는 경우, 고분비가 예상된다.

상기 혼성 유전자의 제작시, 반드시 재조합의 부위-지정하여 수행될 필요는 없다. 다르게는 혼성 유전자가 예를 들어 혼성 유전자의 구성시 재료인 고열안정성 프로테아제의 두개 이상의 DNA를 혼합하고, 이들은 DNA 분해효소로 단편화시키며, DNA 폴리머라제를 이용하여 이들 단편을 재구성하여 만들 수 있다. 이 방법의 상세한 내용은 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 91, page 10747-10751(1994)]에 기술되어 있다. 이 경우에, 고열안정성 유전자를 암호화하는 유전자의 서열은 단리시킬 수 있고, 상기 기술된 바와 같이 발현된 단백질의 고열안정성 프로테아제 활성을 조사하여 결과적인 혼성 유전자로부터 동정할 수 있다. 또한, 세린 프로테아제와 공통인 4개 영역을 암호화하는 서열은 이렇게 얻어진 유전자의 서열에 보존된다고 예상된다.

그러므로, 본 분야에 숙련된자에게는 결과적인 혼성 유전자가 적절한 혼성화 조건에서 서열목록의 SEQ ID Nos. 9, 10, 11 및 12에 의해 나타내지는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 PRO-1F, PRO-2F, PRO-2R 및 PRO-4R로부터 선택된 DNA와 혼성화할 수 있다. 또한, 상기 돌연변이 도입에 의해 수득된 신규의 고열안정성 프로테아제 유전자가 적절한 혼성화 조건에서 서열목록 의 SEQ ID Nos. 9, 10,11 및 12에 의해 나타내지는 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 DNA 서열을 갖는 유전자, 예를 들어 프로테아제 PFUL 유전자와 혼성화할 수 있다.

본 명세서에서, 본 출원인은 고열안정성 유전자의 수득에 중점을 두었다. 그러나, 높은 열안정성과 다른 성질을 갖는 신규의 프로테아제를 암호화하는 유전자는 본 발명의 고열안정성 프로테아제 유전자와 열안정성을 갖지않는 본 발명의 고열안정성 프로테아제 유전자와의 서열 상동성을, 프로테아제의 혼성 유전자를 구성하여, 예를 들어 서브레비스(subtilisin)의 열안정성을 개선하도록 혼성 유전자를 구성하여, 만들수 있다.

본 발명에서 본 출원인은 유전자에 의해 암호화되는 단백질에 의해 유지된 프로테아제 활성을 검출하고 효소 제조물을 생성하기 위하여 유전자가 도입되는 숙주로서 대장균(Escherichia coli), 및 바실러스 서브틸리스(Bacilis subtilis)를 사용했다. 그러나 유전자가 도입되는 숙주는 특정한 것에 한정되지 않는다. 형질전환 방법이 바실러스 서브틸리스(Bacilus brevis), 락토바실러스(Lactobacillus), 효모, 몰드 진균, 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포 등과 같은 숙주에 대해 설정되었으면, 어떤 숙주도 사용될 수 있다. 발현된 단백질이 활성 형태이고, 이것이 해롭거나 치사 효과를 가져오지 않는한 접혀지는(folded) 것이 중요하다. 상기 열거된 숙주중에서 배지에 그의 생성물을 분비하는 것으로 알려진 바실러스 브레비스, 락토바실러스 및 몰드 진균이 바실러스 서브틸리스외에 산업적 규모로 흥미있는 프로테아제의 대량 생산을 위한 숙주로서 사용될 수 있다.

[실시예]

하기 실시예가 본 발명의 범주를 제한하지 않지만 추가로 본 발명위 상세한 사항을 기술한다.

[실시예 1]

(1) 고열안정성 프로테아제 유전자를 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드의 제조

서열목록 SEQ ID No. 8에 의해 나타내지는 프로테아제 PFUL의 아미노 서열과 공지된 박테리움으로부터 유도된 알칼리성 세린 프로테아제의 것과 비교하여, 그들에 공통적인 상동성 아미노산 서열이 존재함이 밝혀졌다. 그들중에서 세개의 영역이 선택되어 고열안정성 프로테아제 유전자를 검출하는 PCR용 프라이머로서 사용된 올리고뉴클레오타이드가 설계되었다.

제2,3 및 4도는 상기 프로테아제 PFUL의 세개의 영역에 상응하는 아미노산 서열, 상기 영역들을 암호화하는 프로테아제 PFUL 유전자의 뉴클레오타이드의 서열, 및 그를 기초로 합성된 올리고뉴클레오타이드 PRO-1F, PRO-2F, PRO-2R 및 PRO-4R사이의 관계를 보여준다. SEQ ID Nos. 9, 10, 11 및 12는 각각 올리고뉴클레오타이드 PRO-1F, PRO-2F, PRO-2R 및 PRO-4R의 뉴클레오타이드의 서열을 보여준다.

(2) 써모코커스 셀러(Thermococcus celer)의 크로모좀 DNA의 제조

Deutsche Sammlunf von Microorganisn und Zellkulturen GmbH로부터 입수된 써모코커스 셀러 DSM2476 배양물 10ml를 원심분리하여 세포를 수집하고, 25% 슈크로즈를 함유하는 50mM 트리스-HCl, pH 8.0의 100μl에 현탁시켰다. 이 현탁액에 0.5M EDTA 100μl 및 10mg/ml 라이소자임 10μl를 첨가했다. 그리고 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, SET 용액 800μl(150mM NaCl, 1mM EDTA, 20mM 트리스-HCl, pH 8.0), 10% SDS 및 20mg/ml 프로테인아제 K를 그에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응을 페놀 클로로포름을 추출하여 중지시키고, TE 완충제(10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 0.1mM EDTA) 50μl에 용해된 DNA를 회수하기 위하여 에탄올로 침전시켜, 크로모좀 DNA를 수득했다.

(3) PCR에 의한 고열안정성 프로테아제 유전자의 검출

상기 써모코커스 셀러의 크로모좀 DNA 및 올리고뉴클레오타이드 PRO-1F와 PRO-2R, 또는 PRO-2F 및 PRO-4R로부터 PCR 반응 혼합물을 준비하고, 35사이클 반응을 수행하고,각 사이클은 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간으로 구성됐다. 이들 반응혼합물의 분취량을 아가로즈 젤 전기영동시켰을때, 올리고뉴클레오타이드 PRO-1F와 PRO-2R을 사용했을 경우에 세개 DNA 단편의 증폭이 관찰되고, 올리고뉴클레오타이드 PRO-2F와 PRO-4R을 사용했을 경우에 한 DNA의 증폭이 관찰되었다. 이 증폭된 단편을 아가로즈 젤에서 회수하여 그의 DNA 말단을 DNA 블런팅 키트(Taka Shuzo., Ltd. 제조)를 사용하여 평활하게(blunt) 만들고, T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 인산화시켰다. 이러서, 플라스미드 벡터 pUC19(Taka Shuzo., Ltd. 제조)를 HincⅡ(Taka Sguzo., Ltd. 제조)로 분해했다. 결과적인 단편을 그의 말단에서 알칼리성 포스파타제로 탈인산화시키고, 상기 PCR-증폭된 DNA 단편과 혼합시켜 연결되게 한후, 대장균 JM109에 도입시켰다. 플라스미드를 결과적인 형질전환체로부터 제조하였고, 적절한 크기의 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 선택하여, 디데옥시 방법으로 삽입된 단편의 서열화를 했다.

이들 플라스미드중에서, 올리고뉴클레오타이드 PRO-1F와 PRO-2R을 사용하여 증폭된 약 150bp DNA 단편을 함유하는 플라스미드 p1F-2R(2)의 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 아미노 서열과 올리고뉴클레오타이드 PRO-2F와 PRO-4R을 사용하여 증폭된 약 550bp의 DNA 단편을 함유하는 p2F-4R의 뉴클레오타이드로부터 추론된 아미노산은 프로테아제 PFUL, 서브틸리신 등의 아미노 서열과 상동성을 갖는 서열을 함유했다. 서열목록의 SEQ ID No. 13은 p1F-2R(2)중의 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드의 서열 및 그로부터 추론된 아미노산 서열을 보여주고, 서열목록의 SEQ ID No. 14는 p2F-4R중에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드의 서열 및 그로부터 추론된 아미노산 서열을 보여준다. 서열목록 SEQ ID No. 13에 의해 나타내지는 뉴클레오타이드 서열에서, 뉴클레오타이드 첫번째부터 21번째 뉴클레오타이드 서열 및 서열목록 SEQ ID No. 14에 의해 나타내지는 뉴클레오타이드 서열에서, 113번째 내지 145번째 뉴클레오타이드의 서열 및 뉴클레오타이드 1번째 내지 32번째 및 532번째 내지 564번째 뉴클레오타이드의 서열은 PCR용 프라이머로 사용된 올리고뉴클레오타이드(각각 올리고뉴클레오타이드 PRO-1F, PRO-2F, PRO-2R 및 PRO-4R에 상응)의 서열이다.

제5도는 플라스미드 p2F-4R의 제한 지도의 도면이다.

(4) 써모코커스 셀러로부터의 프로테아제 유전자의 스크리닝

써모코커스 셀러의 크로모좀 DNA는 제한 효소 Sau3AⅠ(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)로 부분적으로 분해하고 dATP 및 dGTP의 존재하에서 클레나우 단편(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)의 단편을 사용하여 DNA 말단의 부분적인 수선을 했다. DNA 단편을 람다 GEM-11 XhoⅠ Half-부위 Arms 벡터(PROmega 제조)와 혼합하여 연결시키고, 이를 시험관내에서 기가팩 골드(Gigapack Gold)(Stratagene 제조)를 사용하여 패키징하여 써모코커스 셀러의 크로모좀 DNA 단편을 함유하는 람다 파지 라이브러리를 제조하였다. 라이브러리의 일부분을 대장균 LE 392에 혈질전환시켜 플레이트 플라크를 형성하고, 플라크를 하이본드(Hybond-N+막(Amersham 제조)에 옮겼다. 옮긴후 막을 1.5M NaCl을 함유하는 0.5N NaOH로 처리하고, 이어서 3M NaCl을 함유하는 0.5M 트리스-HCl, pH 7.5로 처리하여, 6×SSC로 세척하고, 공기 건조시켜 UV 투시기(transilluminator)상에서 자외선 조사시켜 파지 DNA를 막에 고정시켰다.

다른 한편, 플라스미드 p2F-4R을 PmaCⅠ 및 StuⅠ(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)로 분해시키고, 이를 1% 아가로즈 젤 전기영동을 시켜, 분리된 약 0.5kb DNA 단편을 사용하고, 랜덤 프리이머 DNA 표지 키트 Ver.2(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조) 및 [α-³²P]dCTP(Amersham 제조)를 사용하여³²P-표지된 DNA 프로브를 제조하였다.

DNA가 고정된 막을 혼성화 완충제(0.5% SDA, 0.1% SBA, 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% Ficoll 400, 0.01% 변성된 연어 정자 DNA)를 함유하는 동일한 완충제에 옮기고, 50℃에서 15시간 동안 혼성화시켰다. 혼성화가 완성된후 막을 0.5% SDS를 함유하는 2×SSC로 실온에서 세척하며, 이어서, 0.5% SDS를 함유하여 2×SSC로 실온에서 세척하며, 이어서, 0.5% SDS를 함유하는 1×SSC로 50℃에서 세척했다. 추가로 막을 1×SSC로 린싱하고, 공기 건조시켜 6시간 동안 -80℃에서 노출시켜 자기 방사 기록을 얻었다. 약 3,000 파지 콜로니를 스크리닝하고, 결과로서 프로테아제 유전자를 함유하는 하나의 클론을 수득했다. 자기 방사 기록상의 시그널에 기초하여 상기 파지 클론의 위치를 확인하고, 막을 옮기는데 사용된 플레이트에 상응하는 플라크를 1% 클로로포름을 함유하는 1ml SM 완충제(50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1M NaCl, 8mM MgSO₄, 0.01% 젤라틴)중으로 단리시켰다.

(5) 써모코커스 셀러로부터 유도된 프로테아제 유전자를 함유하는 파지 DNA 단편의 검출

상기 파지 클론을 이용하여 형질도입된 대장균 LE392를 NZCMY 배지(Biolol 제조)에서 37℃에서 15시간 동안 배양하여 배양물을 얻고, 그로부터 상등액을 수집하여, QIAGEN-lambda 키트(QLAGEN 제조)를 사용하여 파지 DNA를 얻었다. 결과적인 파지 DNA를 각각 BamHⅠ, EcoRⅠ, EcoRV, HindⅢ, KpmⅠ, NcoⅠ, PstⅠ, SacⅠ, Sal1, SmaⅠ 및 SphⅠ(모두 Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)로 분해하였다. 이어서, DNA를 젤로부터 문헌[Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd edition(1986) edited by T. Maniatis et al., published by Cold Spring Harbor Laboratory]에 기술된 사우던 트랜스퍼 방법에 따라 Hybond-N+ 막에 옮겼다. 결과적인 막을 50℃에서 4시간 동안 혼성화 완충제에서 처리하고, 실시예1-(4)에서 사용된³²P-표지된 DNA 프로브를 함유하는 동일한 완충제에 옮기고, 50℃에서 18시간 동안 혼성화시켰다. 혼성화가 완성된후, 막을 0.5% SDS를 함유하는 1×SSC에서 50℃에서 세척하고, 1×SSC로 린싱하여 공기 건조시켰다. 막을 -80℃에서 6시간 동안 X-선 필름에 노출시켜 자기방사기록을 얻었다. 이 자기방사기록은 약 9kb DNA 단편이 KpnⅠ로 분해된 파지 DNA 경우에 프로테아제 유전자를 함유함을 나타냈다.

이어서 상기 프로테아제를 함유하는 파지 DNA를 KpnⅠ로 분해하고, 추가로 연속적으로 BamHⅠ, PstⅠ 및 SphⅠ로 분해하여, 1% 아가로즈 젤 전기영동을 하였다. 상기 기술된 것과 유사한 방법에 따라 사우던 혼성화를 수행하고, 약 5kb Kpn-I-BamHⅠ 단편이 프로테아제 유전자를 함유함이 나타났다.

(6) 써모코커스 셀러로부터 유도된 프로테아제 유전자를 함유하는 DNA 단편의 클로닝

상기 프로테아제 유전자를 함유하는 파지 DNA를 KpnⅠ 및 BamHⅠ으로 분해하고, 이를 1% 아가로즈 젤 전기영동을 시켜 젤로부터 약 5kb DNA 단편을 분리하고 단리시켰다. 이어서, 플라스미드 벡터 pUC119(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)를 KpnⅠ 및 BamHⅠ으로 분해하고, 이를 상기 약 5kb 단편과 혼합하여 연결시키고 대장균 JM109에 도입하였다. 플라스미드를 결과적인 형질전환체로부터 제조하고, 약 5kb DNA 단편을 함유하는 플라스미드를 선택하여 플라스미드 pTC3이라고 명명하였다.

제6도는 플라스미드 pTC3의 제한 지도를 보여준다.

(7) 써모코커스 셀러로부터 유도된 프로테아제 유전자를 함유하는 플라스미드 pTCS6의 제조

상기 플라스미드 pTC3을 SacⅠ로 분해하고, 1% 아가로즈 젤로 전기영동시켜 프로테아제 유전자를 함유하는 파지 DNA 단편을 검출하기 위해 실시예 1-(5)에 기술된 것과 같은 방법으로 수행했다. 결과적인 자기 방사 기록상의 시그널은 플라스미드 pTC3을 SacⅠ로 분해하여 얻은 약 1.9kb DNA 단편이 고열안정성 프로테아제 유전자를 함유함을 나타냈다.

이어서, 플라스미드 pTC3을 SacⅠ로 분해하고, 1% 아가로즈 젤로 전기영동시켜 약 1.9kb DNA 단편을 단리시켰다. 이어서, 플라스미드 벡터 pUC119(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)를 SacⅠ로 분해시켜 알칼리성 포스파타제 탈포스포릴화시키고, 약 1.9kb 단편과 혼합하여 대장균 JM 109에 도입시켰다. 플라스미드를 결과적인 형질전환체로부터 제조하고, 약 1.9kb 단편의 오직 한 분자만을 함유하는 플라스미드를 선 택하고 플라스미드 pTCS6으로 명명했다.

제7도는 플라스미드 pTCS6의 제한 지도이다.

(8) 플라스미드 pTCS6에 함유된 써모코커스 셀러로부터 유도된 프로테아제 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위하여 플라스미드에 삽입된 DNA 단편 부분이 다양한 길이로 결손된, 결손 돌연변이를 킬로 서열 결손 키트 C(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)를 사용하여 제조하였다. 이들 중에서 적절한 길이의 결손을 갖는 수개 돌연변이체를 선택하고, 각 삽입된 DNA 단편 부분의 뉴클레오타이드 서열을 디데옥시 방법에 의해 결정하고, 이들 결과를 플라스미드 pTCS6에 함유된 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위하여 조합시켰다. 서열목록의 SEQ ID No. 15는 결과적인 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.

(9) 카세트 및 카세트 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 써모코커스 셀러로부터 유도된 프로테아제 유전자의 5' 상류 영역의 클로닝

써모코커스 셀러로부터 유도된 프로테아제 유전자의 5' 상류지역을 시험관내 클로닝 키트(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)에서 LA PCR을 이용하여 수득하였다.

서열목록 SEQ ID No. 15에 의해 나타내지는 플라스미드 pTCS5에 함유된 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 기초해서, 카세트 PCR에 사용하기 위한 프라이머 TCE6R의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.

이어서, 써모코커스 셀러의 크로모좀 DNA를 HindⅢ(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)에 의해 완전히 분해하고, 단편을 연결(ligation) 반응에 의해 HindⅢ 카세트에 연결시켰다. 이를 주형으로 사용하여 프라이머 C1(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)을 함유하는 PCR 반응 혼합물을 제조하고, 일연의 반응, 94℃ 1분간 1사이클, 94℃에서 30초, 55℃에서 1분간, 72℃에서 3분간씩 30사이클, 72℃에서 10분간의 1사이클을 수행하였다. 이 반응 혼합물의 분취량을 아가로즈 젤 전기영동시켜 증폭된 약 1.8kb 단편을 관찰했다. 이 증폭된 단편을 HindⅢ 및 SacⅠ로 분해하고, 생성된 약 1.5kb DNA 단편을 아가로즈 젤 전기영동후 젤로부터 회수했다. HindⅢ 및 SacdⅠ로 분해된 플라스미드 벡터 pUC119를 상기 약 1.5kb DNA 단편과 혼합하여 연결시키고, 대장균 JM109에 도입했다. 결과적으로 형질 전환체에 의해 은신된(harboured) 플라스미드를 조사하고, 오직 한분자의 약 1.5kb 단편을 갖는 플라스미드를 선택하여 플라스미드 pTC4로 명명했다.

제8도는 플라스미드 pTC4의 제한 지도이다.

(10) 플라스미드 pTC4와 프로테아제 TCES 유전자에 함유된 써모코커스 셀러로부터 유도된 DNA 단편의 뉴클레오타이드의 결정

플라스미드 pTC에 삽입된 써모코커스 셀러로부터 유도된 프로테아제 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위하여 플라스미드에 삽입된 DNA 단편 부분이 다양한 길이로 결손된 결손 돌연변이체를 킬로 서열 결여 키트를 사용하여 제조했다. 이들 중에서, 적절한 길이의 결손을 갖는 수개 돌연변이체를 선택하고, 각 삽입된 DNA 단편 부분의 뉴클레오타이드 서열을 디데옥시 방법을 결정하고, 이 결과를 플라스미드 pTCS4에 함유된 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해서 혼합했다. 서열목록 SEQ ID No. 15는 결과적인 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.

실시예 1-(8)에서 얻어진 플라스미드 pTCS6에 함유된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열과 혼합하여 써모코커스 셀러로부터 유도된 프로테아제 유전자의 전체 뉴클레오타이드 서열을 결정했다. 서열목록의 SEQ ID No. 1과 2는 뉴클레오타이드 서열에 존재하는 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열 및 써모코커스 셀러로 부터 유도된 프로테아제로부터 추론된 아미노산 서열을 보여준다. 유전자에 의해 암호화되는 써모코커스 셀로부터 유도된 프로테아제를 프로테아제 TCES라고 명명했다.

(11) 프로테아제 TCES 유전자를 함유하는 플라스미드 pBTC6의 제조

플라스미드 pTC6을 HindⅢ 및 SspⅠ(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)로 분해하고, 이를 1% 아가로즈 젤 전기영동을 시켜 분리된 1.8kb DNA 단편을 회수했다. 이어서, 플라스미드 벡터 pBT 322(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)를 HindⅢ 및 EcoRV로 분해하고, 이를 상기 약 1.8kb 단편과 혼합하여 연결시키고 대장균 JM109에 도입하였다. 플라스미드를 결과적인 형질전환체로부터 제조하고, 약 1.8kb DNA 단편의 오직 한 분자만 함유하는 플라스미드를 선택 및 플라스미드 pBTC5라고 명명하였다.

이어서, pBTC5를 HindⅢ 및 KpnⅠ로 완전히 분해시키고, 이를 평활 단면화시키고, 분자내 연결을 시키며, 대장균 JM109에 도입하였다. 플라스미드를 결과적인 형질 전환체로부터 제조하고, BamHⅠ 부위가 제거된 플라스미드를 선택하여 pBTC5HK라고 명명했다.

추가로, 플라스미드 pBTC5HK를 BamHⅠ로 분해하고, 평활단면화시켜 분자내 연결시키고, 대장균 JM109에 도입하였다. 플라스미드를 결과적인 형질전환체로부터 제조하고, BamHⅠ 부위가 제거된 플라스미드를 선택하여 pBTC5HKB라고 명명하였다.

프로테아제 TCES 유전자상의 개시 코돈앞에 EcoRⅠ 부위 및 BamHdⅠ 부위를 도입할 수 있는 프라이머 TCE12 및 플라스미드 pTCS6의 SacⅠ부위의 3'부분에 상보적인 16pb-길이 뉴클레오타이드 서열을 갖고, Cla1 부위와 종료 코돈에 도입할 수 있는 프라이머 TCE 20R을 합성했다. 서열목록의 SEQ ID Nos. 18과 19는 각각 프라이머 TCE12와 프라이머 TCE 20R의 뉴클레오타이드의 서열을 보여준다. PCR 반응 혼합물을 이들 두개의 프라이머 및 주형으로서 써모코커스 셀러의 크로모좀 DNA를 사용하여 제조하였다. 양 말단에 이들 두개 올리고뉴클레오타이드를 갖고, 프로테아제 TCES 유전자의 일부를 함유하는 약 0.9kb DNA 단편을 증폭시키기 위하여 각 사이클이 94℃에서 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분간인 25사이클의 반응을 수행했다.

상기 약 0.9kb DNA 단편을 EcoRⅠ 및 ClaⅠ(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)로 분해하고, EcoRⅠ-ClaⅠ 분해된 플라스미드 pBTC5HKB와 혼합하고, 대장균 JM109에 도입하였다. 플라스미드를 결과적인 형질전환체로부터 제조하고, 약 0.9kb 단편의 오직 한 분자만을 함유하는 플라스미드를 선택하고 플라스미드 pBTC6이라고 명명했다.

(12) 프로테아제 TCES 유전자를 함유하는 플라스미드 pTC12의 제조

플라스미드 pBTC6을 BamHⅠ 및 SphⅠ로 분해하고, 이를 1% 아가로즈 젤 전기영동시켜 분리된 약 3kb DNA 단편을 회수했다. 이어서, 바실러스 서브티리스 p43 프로모터로부터 유도된 리보좀 결합 부위를 플라스미드 벡터 pUC18(Takara shuzo Co., Ltd. 제조)의 KpmⅠ 부위와 BamHⅠ 부위 사이에 도입된다(서열의 도입에 사용된 합성 올리고뉴클레오타이드 BS1과 BS2의 뉴클레오타이드 서열이 서열목록의 SEQ ID Nos.20과 21사이에 나타나 있다). 플라스미드 pUC-p43D를 BamHⅠ 및 SphⅠ로 분해하고, 이를 미리 회수된 약 3kb DNA 단편과 혼합하여 대장균 JM109에 도입시켰다. 플라스미드를 결과적인 형질 전환체로부터 제조하고, 상기 약 3kb DNA 단편의 오직 한 분자만 함유하는 플라스미드를 선택하여 플라스미드 pTC12라고 명명했다.

(13) 바실러스 서브틸리스로 형질 전환시키기 위한 프로테아제 TCES 유전자를 함유하는 플라스미드 pSTC3의 제조

상기 플라스미드 pTC12를 KpnⅠ 및 SphⅠ로 분해하고, 이를 1% 아가로즈 젤 전기영동시켜 분리된 약 3kb DNA 단편을 회수했다. 이어서, 플라스미드 벡터 pUB-p43을 SacⅠ로 분해하고, 이를 평활말단화시켜 자가결합시켜 Sac1 부위가 제거된 플라스미드 벡터 pUB-p43S를 수득했다. 이를 KpnⅠ 및 SphⅠ로 분해하여, 이를 미리 회수된 약 3kb 단편과 혼합하여 연결되게 하고, 이를 바실러스 서브틸리스 DB104에 도입했다. 플라스미드를 결과적인 카나마이신-저항 형질전환체로부터 제조하고, 상기 약 3kb DNA 단편의 오직 한 분자만 함유하는 플라스미드를 선택하여 플라스미드 pSTC2라고 명명했다.

이어서, 플라스미드 pSTC2를 Sac1로 분해하고, 분자내 연결시켜 바실러스 서브틸리스 DB104에 도입했다. 플라스미드를 결과적인 카나마이신-내성 형질 전환체로부터 제조하고, 오직 SacⅠ 부위만 함유하는 플라스미드를 플라스미드 pSTC3이라고 명명했다.

이어서, 플라스미드 pSTC3을 은신한 바실러스 서브틸리스 DB104를 바실러스 서브틸리스 DB104/pSTC3이라 명명했다.

제10도는 플라스미드 pSTC3의 제한 지도를 보여준다.

[실시예 2]

(1) 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)의 크로모좀 DNA의 제조

피로코커스 푸리오수스 DMS3638을 다음과 같이 배양했다. 1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 가용성 전분, 3.5% 자마린·에스(Jamarin·S)의 고체(Jamarin 연구소 제조), 0.5% 자라민 에스·고체(자마린 연구소 제조) 0.003% MaSO₄, 0.001% NaCl, 0.0001% FeSO₄·7H₂O 0.0001% CoSO₄, 0.0001% CaCl₂·7H₂O, 0.0001% ZnSO₄, 0.1ppm CuSO₄·5H₂O, 0.1ppm H₃BO₃, 0.1ppm KAL(SO₄)₂, 0.1ppm Na₂MoO₄·2H₂O, 0.25ppm NiCl₂·H₂O를 2ℓ 배지병에 위치시키고, 120℃에서 2분간 멸균시켰다. 질소를 배지에 불어넣어 비용해된 산소를 몰아내고, 상기 박테리아 균주를 배지에 접종시키고, 95℃에서 16시간 동안 정치 배양했다.

배양 완성 후, 세포를 원심분리에 의해 수집했다.

이어서, 결과적인 세포를 25% 슈크로즈를 함유하는 50mM 트리스-HCl 4ml(pH 8.0)에 현탁시키고, 이 현탁액에 0.2M EDTA 2ml 및 라이소자임(5mg/ml) 0.8ml를 첨가하며, 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, SET 용액(150mM NaCl, 1mM EDTA, 20mM 트리스-HCl, pH8.0, 5% sps 4ml 및 프로테인아제 K(10mg/ml) 400μl) 24ml를 첨가하여 37℃에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응을 페놀-클로로포름으로 추출하고, 에탄올 침전하여 크오모좀 DNA를 약 3.2mg을 수득했다.

(2) 피로코커스 푸리오수스 크로모좀 DNA의 게놈성 사우던 혼성화

피로코커스 푸리오수스의 크로모좀 DNA의 SacⅠ, NotⅠ, XbaⅠ, EcoRⅠ과 XhoⅠ(모두 다까라 슈조(주)에서 제조)로 각각 분해하였다. 반응 혼합물의 분취량을 SacⅠ과 EcoRⅠ으로 분해한 후, 1% 아가로즈 젤 전기영동시켜 실시예 1-(5)에 기술된 과정에 따라서 사우던 혼성화를 수행하였다.

주형으로써 EcoRⅠ과 PstⅠ으로 상기 플라스미드를 분해하여 얻어진 약 3.0kb DNA 단편을 이용하고, BcaBEST DNA 표지키트(다까라 슈조(주)에서 제조)과 [a-³²P] dCTP를 사용해서 제조된³²P 표지된 DNA를 프로브로서 사용하였다. 막은 실온에서 최종 0.5%가 될때까지 SDS를 포함한 2×SSC에서 세척하고, 2×SSC로 세척하여 오토라디오그램을 얻었다. 그 결과 피로코커스 푸리오수스 크로모좀 DNA를 SacⅠ으로 분해하여 생성된 약 5.4kb와 3.0kb의 두 DNA 단편에서 시그날이 관찰되어 프로테아제 유전자는 각 단편 상에 존재함을 시사했다. SacⅠ(다까라 슈조(주)에서 제조)으로 분해된 단편은 SpheⅠ(다까라 슈조(주)에서 제조)으로 추가로 분해할때 약 5.4kb 단편에 대한 상기의 시그날은 변화를 보이지 않는다. 3.0kb 단편에서 보여준 시그날은 손실되었고, 약 0.6kb 단편에서 새로이 관찰되었다.

서열목록 SEQ ID No. 7에 나타난 프로테아제 PFUL 유전자에는 Spe1부위가 존재하지 않기 때문에 Sac1과 Spe1으로 잘라 얻어진 약 0.6kb 단편상의 시그날은 새로운 고열안정성 프로테아제(이후 프로테아제 PFUS로 언급한다)로 유래한다고 제안되었다. 더 나아가 피로코쿠스 푸리오수스 크로모좀 DNA를 Xba1 분해한 생성물은 시그날이 약 3.3kb와 9.0kb의 두 단편 DNA에서 관찰되었다. 제1도에 나타난 프로테아제 PFUL 유전자의 제한지도로부터 약 3.3kb 단편은 프로테아제 PFUL 유전자를 포함하고, 약 9.0kb 단편은 프로테아제 PFUS 유전자를 포함한다고 생각된다. 상기 크로모좀 DNA가 Xba1과 Sac1으로 분해할때, 시그날은 약 2.0kb 단편과 약 3.0kb 단편에서 관찰되었다. 서열목록 SEQ ID No. 7에서 보여준 프로테아제 PFUL 유전자에 존재하는 Sac1과 Xba1 절단부위의 위치로부터, 프로테아제 PFUL 유전자는 약 3.0kb Sac1-Xba1 단편에 존재한다고 추정되었다. 한편, 프로테아제 PFUS 유전자는 약 3.0kb 단편에 존재한다고 생각되었다. Sac1으로 분해한 결과를 종합하면, Sac1만으로 분해하여 얻어진 약 3.0kb DNA 단편 상에는 어떤 XbaI부위도 존재하지 않음을 알 수 있다.

(3) 프로테아제 PFUS 유전자를 포함한 0.6kb Spe1-Sac1 단편의 클로닝

피로코커스 푸리오수스의 크로모좀 DNA는 Sac1과 Spe1으로 분해하여 1% 아가로오즈 겔 전기영동하여 젤로부터 약 0.6kb에 해당하는 DNA 단편을 회수했다. 그리고 플라스미드 pBluescript SK(-)(스트라젠에서 제조)를 SacⅠ과 SpeⅠ으로 분해한 후, 연결하기 위해 약 0.6kb DNA 단편과 섞고, 크로모좀 DNA 단편을 포함한 플라스미드 라이브러리를 얻기 위해 대장균 JM109로 도입한다. 형질 전환된 대장균 JM109는 집락(colony)을 형성하기 위해 평판 배지에 뿌리고, 생성된 집락을 하이본드-N요막(Hybond-Ntmenbrcure)에 옮겨, 새로운 LB 평판배지에서 약 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다.

이막에 1.5M 염화나이트륨을 포함한 0.5M 수산화나트륨으로 처리한 후, 1.5M 염화나트륨을 포함한 0.5M트리스-염산(Tris-HCl)(pH 7.5)를 처리하고, 2×SSC로 씻어 공기중에서 건조시키고 UV 투시기(transilluminator)상에서 자외선을 조사하여 막에 플라스미드 DNA를 고정시켰다. 이 막을 혼성화 완충제에서 50% 2시간동안 처리하고 실시예 2-(2)에서 기술된 사우던 혼성화(southern hybridization)에 사용된³²P로 표지된 DNA 프로브를 포함한 같은 완충제에 50℃에서 18시간동안 혼성화하기 위해서 옮겼다.

혼성화 완성후 막을 상온, 0.5% SDS를 포함한 2×SSC 농도에서 세척하고 37℃에서 세척한다.

막은 2×SSC로 린스하고 공기중에서 말리고 오토라디오그램을 얻기 위해서 -80℃에서 12시간동안 X-필름에 노출시킨다.

그 결과 약 500클론이 스크리닝되고, 프로테아제 유전자를 포함한 3클론을 얻었다. 오토라디오그램의 시그날로부터, 이러한 클론의 위치가 조사되고 막을 옮기기 위해 사용된 평판 배지상의 대응 집락을 CG 배지에서 단리했다.

(4) PCR에 의한 프로테아제 PFUS 유전자의 검출

프로브로서 PCR에 의해 고열성 프로테아제 유전자의 검출에 사용된 올리고뉴클레오타이드는 프로테아제 PFUL 유전자상에서 알려져 있는 미생물로부터 유래한 알칼리성 세린 프로테아제의 아미노산서열과 상당한 상동성을 가진 두 지역을 암호화한 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 고안되었다. 제2도와 3도에 나타낸 프로테아제 PFUL의 아미노산 서열에 기초하여 프라이머 1FP1, 1FP2, 2RP1과 2RP2가 합성되었다.

서열목록 SEQ ID Nos. 22, 23, 24와 25는 올리고뉴클레오타이드 1FP1, 1FP2, 2RP1과 2RP2의 뉴클레오타이드 서열이다.

올리고뉴클레오타이드 1FP1과 2RP1, 또는 1FP1과 2RP2, 또는 1FP2와 2RP1, 또는 1FP2와 2RP2, 상기 세가지 클론으로부터 제조된 플라스미드를 포함한 PCR 반응혼합합물이 제조되고, 30싸이클이 수행되고, 각 사이클은 94℃에서 30초, 37℃에서 2분, 72℃에서 1분동안 실행했다. 이러한 반응 혼합물의 분취량을 각각 아가로즈 젤 전기영동할때, 프라이머 1FP2와 2RP2가 사용될때 상기 세가지 플라스미드 모두에서 약 150bp DNA 단편의 증폭이 관찰되었다.

상기 세가지클론 중 하나가 선택되고 플라스미드 pSS3로 명명되었다.

(5) 플라스미드 pSS3에 포함된 프로테아제 PFUS 유전자의 염기서열결정

플라스미드에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열은 주형으로서 플라스미드 pSS3를 사용하고 프라이머로 M4와 프라이머 RV(다까라 슈조(주)에서 제조)을 사용하여 디데옥시 방법에 의해 결정했다. 서열목록의 SEQ ID No. 26는 뉴클레오타이드 서열과 뉴클레오타이드 서열에 의해 추론된 아미노산 서열이다.

프로테아제 PFVL, 프로테아제 TCES와 서브털리신의 아미노산 서열 비교에 의해 플라스미드 pSS3에 삽입된 DNA 단편은 이러한 프로테아제와 상동성을 가진 아미노산을 암호화한다고 추정되었다.

(6) 역방향 PCR 방법에 의한 프로테아제 PFUS의 N-말단 암호화영역과 C-말단 암모화영역의 클로닝

프로테아제 PFUS의 N-말단과 C-말단의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 얻기 위해서, 역방향 PCR이 수행되었다. 역방향 PCR에 사용된 프라이머는 플라스미드 pSS3에 삽입된 DNA 단편의 염기서열에 기초하여 합성되었다. 서열목록 SEQ ID Nos. 27, 28과 29는 프라이머 NPF-1 NPF-2와 NPR-3의 염기서열이다.

피로코커스 푸리오수스의 크로모좀 DNA는 SacⅠ과 XbaⅠ으로 잘라 분자내 연결을 하였다. 연결반응 혼합액의 분취량과 프라이머 NPF-1과 NPR-3 또는 NPF-2와 NPR-3를 포함한 PCR 혼합물을 제조하고 30싸이클을 수행했으며 각 싸이클은 94℃, 30초 및 67℃, 10분 동안으로 구성되었다. 이러한 반응 혼합물의 분취량을 아가로즈 젤에서 전기 영동할때 약 3.0kb 증폭된 단편이 프라이머 NPF-2와 NPR-3가 사용된 경우에는 관찰되었다. 이 증폭된 단편은 아가로즈 젤로부터 회수되어 플라스미드백터 pT7BlueT(노바겐(Novagen)에서 제조)에 섞어 연결시키고 대장균 JM109에 도입하였다. 플라스미드는 결과적인 형질전환체로부터 제조되고, 약 3kb 단편을 포함한 플라스미드가 선택되어 플라스미드 pS322로 명명되었다.

한편, 약 9kb의 증폭된 단편이 프라이머 NPF-1과 NPR-3를 이용한 경우에서 관찰되었다. 이 증폭된 단편은 아가로즈 젤에서 회수되어 DNA 블런팅 키트를 사용하여 DNA 말단을 평활로 만들고, XbaⅠ으로 추가 분해했다.

이것을 연결시키기 위해 플라스미드 벡터 pBluescript SK(-)를 XbaⅠ과 HinCⅡ로 잘라 섞고, 대장균 JM109로 도입했다. 결과적인 형질전환체로부터 제조된 5kb DNA 단편을 포함한 플라스미드를 선택하여 pSKX5로 명명하였다.

(7) 플라스미드 pS322와 pSKX5에 포함된 프로테아제 PFUS 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 서열화

프로테아제 PFUS의 N-말단 부위를 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 주형으로서 플라스미드 pS322와 프라이머로서 NPR-3를 사용하여 디데옥시 방법에 의해 결정되었다. 서열목록 SEQ ID No. 30은 결과적인 뉴클레오타이드 서열의 일부와 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호되는 것으로 추론된 아미노산 서열을 나타낸다.

더욱이, 프로테아제 PFUS 유전자의 3' 말단에 해당하는 영역의 뉴클레오타이드 서열은 주형으로서 플라스미드 pSKX6와 프라이머 RV를 사용하여 디데옥시 방법에 의해 결정했다. 서열목록 SEQ ID No. 31은 결과적인 뉴클레오타이드 서열의 일부를 보여준다.

(8) 전 길이 프로테아제 PFUS 유전자의 증폭에 사용된 프라이머의 합성

실시예 2-(7)에서 얻은 뉴클레오타이드 서열에 기초하여, 프로테아제 PFUS 유전자의 전 길이의 증폭에 사용된 프라이머를 설계하였다. 서열목록 SEQ ID No. 30에 있는 프로테아제 PFUS의 N-말단을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 기초로 프라이머 NPF-4는 프로테아제 개시코돈의 앞의 BamHⅠ부위로 도입될 수 있다.

서열목록 SEQ ID No. 32는 프라이머 NPF-4의 뉴클레오타이드 서열이다.

또한, 서열목록 SEQ ID No. 31에 나타낸 프로테아제 PFUS의 3' 부분의 근처에 뉴클레오타이드 서열에 기초하여, 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가진 프라이머 NPR-4가 합성되었다. 서열목록의 SEQ ID No. 33이 프라이머 NPR-4의 뉴클레오타이드 서열이다.

(9) 바실러스 서브틸리스의 형질 전환을 위한 피로코커스 푸리오수스로부터 유도된 프로테아제의 혼성 유전자를 포함한 플라스미드 pSPT1의 제조

LA PCR Kit(다까라 슈조(주)에서 제조)를 사용하여, 프라이머 NPF-4와 NPR-4와 피로코커스 푸리오수스의 크로모좀 DNA를 포함한 PCR 반응혼합물(이후, LA PCR kit의 사용에 의해 제조된 PCR 반응 혼합물을 LA-PCR 반응 혼합물이라 한다)은 각 싸이클은 94℃에서 20초, 55℃에서 1분, 68℃에서 7분으로 구성된 30싸이클반응을 양 말단에 이러한 두 프라이머를 가지고 프로테아제 PFUS 유전자의 암호화부분을 가진 약 6kb DNA 단편을 증폭하기 위해 실행하였다.

약 6kb DNA 단편을 BamHⅠ과 SacⅠ으로 자르고, 1% 아가로즈 젤에서 전기영동하여 분리된 약 0.8kb DNA 단편을 회수하였다. 이 단편을 BamHⅠ과 SacⅠ으로 자른 플라스미드 pSTC3와 섞어, 연결한후 바실러스 서브틸리스 DB104에 도입하였다. 플라스미드는 결과적인 카나마이신에 내성을 갖는 형질전환체로부터 제조되어 상기 0.8kb 단편의 단지 한 분자만을 포함한 플라스미드를 선택하여 플라스미드 pSPT1으로 명명하였다.

플라스미드 pSPT1을 가진 바실러스 서브틸리스 DB104는 바실러스 서브틸리스 DB104/pSTP1으로 명명되었다.

제14도는 플라스미드 pSPT1의 제한 지도이다.

(10) 바실러스 서브틸리스의 형질전환을 위한 프로테아제 PFUS 유전자를 포함한 플라스미드 pSNP1의 제조

실시예 2-(9)에서 증폭된 약 6kb DNA 단편은 SpeⅠ과 SphⅠ으로 잘라 1% 아가로즈 젤에서 전기영동하여 분리된 약 5.7kb DNA 단편을 회수하였다. 이것을 SpeⅠ과 SphⅠ으로 자른 플라스미드와 섞어 연결한 후, 바실러스 서브틸리스 DB104에 도입하였다. 카나마이신에 내성을 갖는 형질전환체로부터 제조된 약 5.7kb 단편의 오직 한 분자만을 포함한 플라스미드를 선택하여 플라스미드 pSNP1로 명명하였다.

플라스미드 pSNP1으로 형질전환된 바실러스 서브틸리스는 바실러스 서브틸리스 DB104/pSNP1으로 명명되었다.

제15도는 플라스미드 pSNP1의 제한 지도이다.

(11) 플라스미드 pSNP1에 포함된 프로테아제 PFUS 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 결정

플라스미드 pSNP1으로 삽입된 프로테아제 유전자를 포함한 약 6kb DNA 단편이 여러 종의 제한효소로 적당한 크기로 단편화되어 그 단편들은 플라스미드 벡터 pUC119 도는 pBluescript SK(-)로 서브클로닝되었다. 그 뉴클레오타이드 서열은 주형으로서 결과물인 재조합 플라스미드와 시판되는 일반적인(universal) 프라이머를 사용하여 디데옥시 방법에 의하여 결정했다. 적당한 크기를 가진 단편으로부터 얻을 수 없었던 부분에 대해서는, 프라이머 워킹 방법(Primer working method)을 합성 프라이머를 사용하여 이용했다. 그리하여 플라스미드 pSNP1으로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열안에 존재하는 오픈리딩프레임의 뉴클레오타이드 서열은 결정되고, 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 피로코커스 푸리오수스로부터 유래한 프로테아제의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID Nos. 34와 35에 나타나있다.

(12) 프로테아제 유전자의 증폭에 대한 프라이머의 합성

전길이의 PFUS 유전자의 증폭에 사용하고 그 유전자의 3' 부분에 혼성화하기 위한 프라이머를 고안하기 위하여 유전자의 3' 부분의 뉴클레오타이드 서열이 결정되었다. 첫째, 플라스미드 pSNP1을 BamHⅠ으로 잘라 얻어진 프로테아제 PFUS 유전자의 3' 부분을 포함한 약 0.6kb DNA 단편을, BamHⅠ으로 자르고 알칼리성 포스파타아제로 탈인산화시킨 플라스미드 백터 PVC119와 연결했다.

그 결과인 재조합 플라스미드는 플라스미드 pSNPD 명명되고 프로테아제 PFUS의 3' 부분에 해당하는 영역의 뉴클레오타이드 서열이 주형으로서 이것을 사용하여 디데옥시 방법에 의해 결정되었다. 서열목록 SEQ ID No. 38은 BamHⅠ 부위로부터 80bp 상류 뉴클레오타이드까지 상기 영역에(상보적 사슬의 서열) 존재하는 뉴클레오타이드 서열이다. 그리고나서, 그 서열에 기초하여, 프로테아제 PFUS 유전자의 3' 부분과 혼성화되고 SphⅠ 부위를 갖는 프라이머 NPM-1이 합성되었다. 서열목록 SEQ ID No. 39는 프라이머 NPM-1의 뉴클레오타이드 서열이다.

또한, 프로테아제 PFUS 유전자 내에 개시코돈으로부터 약 1.7kb 하류에 존재한 BamHⅠ부분를 제거하기 위한 프라이머 mutRR과 mutFR이 합성되었다. 서열목록 SEQ ID Nos. 40과 41은 프라이머 mutRR과 mutFR의 뉴클레오타이드 서열을 각각 보여준다.

(13) 전 길이의 프로테아제 PUFS 유전자를 포함한 플라스미드 pPSI의 제조

주형으로서 피로코커스 푸리오수스 염색체 DNA를 함유하는 두 세트의 LA-PCR 반응혼합물과 프라이머 NPF-4, muttRR의 조합물 또는 프라이머 mutFR, NPM-1의 조합물이 제조되고 각 싸이클은 94℃에서 30초, 55℃에서 1분, 68℃에서 3분으로 구성된 30싸이클을 수행하엿다. 이 반응혼합물의 일부 분취량을 사용하여 아가로즈 젤에서 전기영동시킬 때, 프라이머 NPF-4와 mutRR을 사용한 경우에 약 1.8kb DNA 단편이 증폭되고, 프라이머 mutFR과 NMP-1을 사용한 경우에는 약 0.6kb DNA 단편이 증폭되었다.

SUPREC-02(다까라슈조(주)에서 제조)를 사용하여 프라이머를 제거한 각 증폭된 DNA 단편은 두세트의 PCR 혼합물로부터 제조되었다. 이러한 두종의 증폭된 DNA 단편을 포함하고 프라이머와 LA Taq가 포함되지 않은 LA-PCR 반응혼합물이 제조되었고, 이것은 94℃에서 10분동안 열에 의해 변성(denaturation)을 시킬때 사용되고, 30℃에서 30분간 이상 냉각하고 헤테로 듀플렉스(hetero duplex)를 형성하기 위해 30℃에서 15분간 유지시킨다. 그리고 나서, 이 반응혼합물에 LA Taq를 첨가하여 72℃에서 3분간 인큐베이션시키고, 프라이머 NPF-4 및 NPM-1을 첨가하여 25싸이클을 반응시키고, 각 싸이클은 94℃에서 30초, 55℃에서 1분, 68℃에서 3분 동안 수행하였다. 이 반응 혼합물에서 약 2.4kb DNA 단편이 증폭됨을 관찰하였다.

약 2.4kb DNA 단편은 BamHⅠ과 SphⅠ으로 자르고, 그 단편은 실시예 2-(11)에서 기술된, BamHⅠ과 SphⅠ으로 잘라 전 길이 프로테아제 유전자 PFUS가 미리 제거된 플라스미드 pSNP1과 섞어 연결하여 바실러스 서브틸리스 DB104에 도입하였다. 플라스미드는 카나마이신에 내성을 가지는 형질전환체로부터 제조되어 약 2.4kb 단편의 오직 한 분자만을 가진 플라스미드가 선택되어 플라스미드 pPS1으로 명명되었다. 플라스미드 DB104로 형질전환된 바실러스 서브틸리스 DB104는 바실러스 서브틸리스 DB104/pPS1으로 명명되었다.

제16도는 플라스미드 pPS1의 제한 지도이다.

(14) 서브틸리신 유전자의 프로모터부터 시그날 서열까지 영역의 DNA 단편의 증폭

서브틸리신 유전자의 프로모터부터 시그날 서열까지의 영역을 얻기 위한 프라이머가 합성되었다. 첫째, 문헌[J. Bacteriol., volume 171, page 2657-2664(1989)]에 기술된 서브틸리신 유전자의 프로모터 영역의 뉴클레오타이드 서열을 참조하여, 상기 영역의 상류의 일부와 혼성화하고 EcoRⅠ 부위를 포함하는 프라이머 SUB4가 합성되었다(서열목록 SEQ ID No. 36은 프라이머 SUB4의 뉴클레오타이드 서열이다). 그리고, 문헌[J. Bacteriol., volume 158, page 411-418(1984)]에 기술된 서브틸리신을 암호화하는 영역의 뉴클레오타이드 서열을 참조하여, 시그날 서열 바로 뒤에 BamHⅠ 부위를 도입할 수 있는 프라이머 BmR1을 합성했다(서열목록 SEQ ID No. 37은 프라이머 BmR1의 뉴클레오타이드 서열이다).

문헌[J. Bacteriol., volume 17, page 2657-2665(1989)]에 기술된 서브틸리신 유전자를 포함한 플라스미드 pKWZ를 프라이머 SUB4와 BmR1을 함유하는 PCR반응혼합물을 제조하기 위해서 주형으로 사용하고, 각 싸이클은 94℃에서 30초, 55℃에서 1분, 68℃에서 2분으로 구성된 30싸이클 반응을 수행하였다. 반응혼합물을 아가로즈 젤상에서 전기 영동하여 약 0.3kb DNA 단편이 증폭됨을 확인했다.

(15) 바실러스 서브틸리스의 형질전환을 위한 프로테아제 PFUS 유전자를 포함한 플라스미드 pNAPS1의 제조

약 0.3kb DNA 단편을 EcoRⅠ과 BamHⅠ으로 절단하고 미리 EcoRⅠ과 BamHⅠ으로 절단된, 실시예 2-(B)에서 기술된 플라스미드 pPS1과 혼합하여 결찰시킨 후, 바실러스 서브틸리스 DB104로 도입하였다. 플라스미드는 카나마이신에 내성을 갖는 형질전환체로부터 제조되어 약 0.3kb 단편의 한 분자만을 포함한 플라스미드가 선택되어 플라스미드 pNAPS1으로 명명되었다. 또한, 바실러스 서브틸리스 DB104를 플라스미드 pNAPS1으로 형질전환시켜 바실러스 서브틸리스 DB104/pNAPS1으로 명명하였다.

제17도는 플라스미드 pNAPS1의 제한 지도이다.

[실시예 3]

(1) 고열안정성 프로테아제 유전자를 검출하기 위한 프로브의 제조

프로테아제 PFUL 유전자를 포함한 플라스미드 pTPR12를 BalⅠ과 HincⅡ(둘다 다까라 슈조(주)에서 제조)으로 자른 후, 이를 1% 아가로즈 젤에서 전기영동하여 분리된 약 1kb DNA 단편을 회수하였다.³²P로 표시된 DNA 프로브가 주형으로서 DNA 단편과 BcaBEST DNA 표지키트와 [α-³²P] dCTP를 사용하여 제조되었다.

(2) 고온성균 스타필로써무스 마리너스(staphylothermus marionus)와 써모박테리오이드 프로테오리티커스(Thermobacteriodes proteoliticus)에 존재하는 고열안정성 프로테아제 유전자의 검출.

실시예 1-(3)에 기술된 과정에 따라, 염색체 DNA는 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuturen GmbH로부터 얻은 스타필로써무스 마리너스 DSM 3639와 써모박테리오이드 플로테오리티커스 DSM 5265의 각각의 10ml 배양으로부터 제조되었다. 두가지 크롬모좀 DNA는 EcoRⅠ, PstⅠ, HindⅢ, XbaⅠ과 SacⅠ으로 각각 잘라, 이를 1% 아가로즈 젤에서 전기영동한 후 실시예 1-(5)에 기술된 과정에 따라서 사우던 혼성화를 수행하였다. 프로브로서, 실시예 3-(1)에서 제조된³²P 표시된 DNA 프로브를 사용했다. 막을 37℃에서 최종적으로 0.5% SDS를 포함한 2×SSC에서 씻고, 2×SSC에서 린스한 후에 오토라디오그램을 얻었다. 이 오토라디오그램으로부터 크로모좀 DNA를 PstⅠ으로 자른 스타필로써무스 마리너스 경우에는 약 4.8kb DNA 단편에서, 크로모좀 DNA 단편에서 시그날이 검출되었고, 이는 프로테아제 PFUL 유전자와 혼성화한 고열안정성 프로테아제 유전자가 스타필로써무스 마리너스와 써모박테로이드 프로테오리티커스 크로모좀 DNA상에 존재함을 시사한다.

[실시예 4]

(1) 프로테아제 PFUS와 TCES의 조(curde) 효소 제조물의 제조

본 발명의 고열안정성 프로테아제(바실러스 서브틸리스 DB104/pSTC3)를 포함한 플라스미드 pSTC3가 도입된 바실러스 서브틸리스 DB104를 10μg/ml 카나마이신을 포함한 5ml LB배지(트립톤 10g/ℓ, 효모추출물 5g/ℓ, 염화나트륨 5g/ℓ, pH 7.2)에서 37℃에서 8시간 배양하였다. 250ml의 유사한 배지가 1ℓ 엘렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 제조되었고, 이에 상기 배양물의 5ml를 접종하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액에 황산암모니움을 75% 포화까지 첨가하여, 그 결과로 침전물을 원심분리에 의해 회수하였다. 회수된 침전물은 20mM Tris-HCl(pH 7.5) 4ml에 현탁시킨후, 같은 완충액에 대해 투석하여 투석액을 조효소 제조물로 사용하였다(효소 제조물 TC-3).

조효소 제조물은 본 발명의 고열안정성 프로테아제를 포함한 플라스미드 pSNP1이 도입된 바실러스 서브틸리스 DB104, 또는 본 발명의 고열안정성 프로테아제를 포함한 플라스미드 pSPT1이 도입된 바실러스 서브틸리스 DB104로부터 상기 기술된 과정에 따라서 제조되었고, 그 제조물은 각각 NP-1과 PT-1으로 명명되었다.

이러한 효소 제조물은 젤라틴 포함한 SDS-폴리아크릴 아마이드 젤을 사용한 효소활성 검출방법이나 다른 활성 검출방법에 의해 프로테아제 활성을 조사하는데 사용했다.

(2) 프로테아제 PFUS의 정제된 효소제조물의 제조

10μl/ml 카나마이신을 포함한 5ml LB 배지를 가진 두 시험관에 실시예 2-(18)에서 얻은 본 발명의 고열안정성 프로테아제 유전자를 포함한 플라스미드 pNAPS1을 도입(바실러스 서브틸리스 DB104/pNAPS1)한 바실러스 서브틸리스로 접종하고 37℃, 7시간 동안 진탕하면서 배양하였다. 각각이 120ml의 유사한 배지를 함유하는 500ml 부피의 6개의 엘렌메이어 플라스크를 준비하고 각 플라스크에 상기 배양물 1ml을 접종하고, 37℃, 17시간동안 진탕하면서 배양하였다. 배양물은 세포와 세포상등액 을 얻기위해 원심분리하였다.

15ml의 50mM Tris-HCL, pH 7.5에 세포들을 현탁시키고 30mg의 라이소자임(시그마에서 제조)을 첨가한 후, 37℃에서 1.5시간 분해하였다.

이 분해액을 95℃, 15분동안 열처리한 후, 원심분리에 의해 상등액을 수집하였다. 결과적인 상등액 12ml에 포화된 황산암모니움 용액 4ml을 첨가하여, 이를 0.45μm 필터유니트(sterivex HV, 밀리포어에서 제조)로 여과시키고 여액을 25% 포화시킨 황산암모니움을 함유하는, 25mM Tris-HCl, pH7.5로 평형화시킨 POROS PH칼럼(4.6mm×150mm:퍼셉티브 바이오시스템(Perseptive Biosystems)에서 제조)에 적재시켰다. 프로테아제 PFUS를 용출하기 위해서 칼럼을 평형화에 사용된 완충액으로 세척하고, 황산암모니움 농도를 25% 포화상태에서 0%까지 낮추는 동시에 아세토니트릴의 농도를 0%에서 20%까지 증가시키면서 구배용출을 수행하여 정제된 효소 제조물 NAPS-1을 수득하였다.

750ml의 배양 상등액을 25mM Tris-HCl에 대해 투석하고, 같은 완충액으로 평형화시킨 Econ-Pack Q 카트리지(BioRad에서 제조)에로 흡수하였다.

이어서, 흡수된 효소는 0에서 1.5M 염화나트륨의 선형구배에서 용출시켰다. 그 결과물인 활성분획물을 95℃에서 1시간동안 열처리하고, 포화된 황산암모니움 용액 1/3부피를 첨가한다. 0.45μm 필터유니트(sterivex HV)를 사용하여 여과한 후에, 여액을 25%로 포화된 황산암모니움을 함유하는 25mM Tris-HCl, pH 7.5로 평형화시킨 POROS PH컬럼(4.6mm×150mm)위에 적재시켰다. 칼럼에 흡수된 PFUS 프로테아제는 정제된 효소 제조물 NAPS-1을 얻기 위해 효소 제조물 NAPS-1과 같은 과정에 의해 용출시켰다.

적당한 양의 정제된 효소 제조물 NAPS-1 또는 NAPS-1S에 효소제조물에서 단백질을 침전시키기 위해 최종 농도가 8.3%까지 트리클로로아세트산을 첨가하고, 원심분리에 의해 회수한다. 회수된 침전 단백질을 증류수에 용해시키고, 샘플완충제(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 5% SDS, 5% 2-머캅토에탄올, 0.005% 브로모페놀블루, 50% 글리세롤)양을 첨가하고, 100℃, 5분간 처리한 후 0.1% SDS-10% 폴리아크릴아마이드 젤을 사용하여 전기영동시킨다. 이동후 젤을 2.5% 코마시 브릴리안트 블루 R-250, 25% 에탄올, 10% 아세트산에서 30분동안 염색하여 25% 메탄올 및 7% 아세트산에 옮기고 과잉 염료를 3-15시간에 걸쳐 제거하였다.

두 종류의 효소제조물 NAPS-1과 NAPS-1S는 하나의 밴드를 보여주며, 이동된 거리로부터 추론된 분자량은 약 4.5kDa이다.

(3) 성숙된 프로테아제 PUFS의 N-말단 서열화

실시예 4-(2)에서 제조된 정제된 효소제조물 NAPS-1을 0.1% SDS-10% 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동한 후 젤상의 단백질을 세미드라이 블로터(semidry Blotter)(Nihon Eido에서 제조)를 사용하여 PVDF막(밀리포어에서 제조) 위에로 블로팅시켰다.

블로팅(Blotting)은 문헌[Electrophoresis volume 11, page 573-580(1990)0]에 기술된 방법에 따라서 수행하였다. 블로팅후에 막을 50% 메탄올중의 1% 코마시브릴리안트 블루 R-250로 염색한 후 60% 메탄올 용액으로 탈색시켰다. 염색된 막의 일부를 절단한 후, G1000A 단백질 서열화기(Sequencer)를 사용하여 자동화된 에드만 분해(Edman degradation)에 의해 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다.

SEQ ID No. 42는 결과적인 N-말단 아미노산서열을 나타낸다.

[서열목록]

SEQ ID No:1

서열길이:659

서열 유형:아미노산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:펩타이드

서열 기술:

SEQ ID No:2

서열길이:1977

서열 유형:핵산

가닥성:이중

기하학:선형

분자유형:게놈 DNA

본래 공급원:써모코커스 셀러

균주:DSM2476

서열 기술:

SEQ ID No:3

서열길이:522

서열 유형:아미노산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:펩타이드

특징:428위치에서의 Xaa가 Gly 또는 Val

서열 기술:

Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gln Val Met Ala

SEQ ID No:4

서열길이:1568

서열 유형:핵산

가닥성:이중

기하학:선형

분자유형:게놈 DNA

본래 공급원:피로코커스 푸리오수스

균주:DSM3638

특징:1283위치에서의 N이 G 또는 T.

서열 기술:

SEQ ID No:5

서열길이:659

서열 유형:아미노산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:펩타이드

본래 공급원:써모코커스 셀러

서열 기술:

SEQ ID No:6

서열길이:1977

서열 유형:핵산

가닥성:이중

기하학:선형

분자유형:게놈 DNA

본래 공급원:써모코커스 셀러

서열 기술:

SEQ ID No:7

서열길이:4765

서열 유형:핵산

가닥성:이중

기하학:선형

분자유형:게놈 DNA

본래 공급원:피로코커스 푸리오수스

균주:DSM 3638

서열 기술:

SEQ ID No:8

서열길이:1398

서열 유형:아미노산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:펩타이드

서열 기술:

SEQ ID No:9

서열길이:35

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

GGWWSDRRTG TTRRHGTHGC DGTDMTYGAC ACBGG35

SEQ ID No:10

서열길이:32

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

KSTCACGGAA CTCACGTDGC BGGMACDGTT GC32

SEQ ID No:11

서열길이:33

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

ASCMGCAACH GTKCCVGCHA CGTGAGTTCC GTG33

SEQ ID No:12

서열길이:34

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

CHCCGSYVAC RTGBGGAGWD GCCATBGAVG TDCC34

SEQ ID No:13

서열길이:145

서열 유형:핵산

가닥성:이중

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(PCR 단편)

서열 기술:

SEQ ID No:14

서열길이:564

서열 유형:핵산

가닥성:이중

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(PCR 단편)

서열 기술:

SEQ ID No:15

서열길이:1859

서열 유형:핵산

가닥성:이중

기하학:선형

분자유형:게놈 DNA

본래 공급원:써모코커스 셀러

균주:DSM 2476

서열 기술:

SEQ ID No:16

서열길이:20

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성)

서열 기술:

TGTAGTAGTC GTTTATCGGG20

SEQ ID No:17

서열길이:1464

서열 유형:핵산

가닥성:이중

기하학:선형

분자유형:게놈 DNA

서열 기술:

SEQ ID No:18

서열길이:33

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

AAAAGAATTC GGATCCATGA AGAGGTTAGG TGC33

SEQ ID No:19

서열길이:28

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

TTTTATCGAT CAGGCGTCCC AGGCGTTG28

SEQ ID No:20

서열길이:22

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

CATTATAGGT AAGAGAGGAA TG22

SEQ ID No:21

서열길이:30

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

GATCCATTCC TCTCTTACCT ATAATGGTAC30

SEQ ID No:22

서열길이:19

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

TAGCAGTAAT TGACACGGG19

SEQ ID No:23

서열길이:19

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

TAGCAGTAAT TGACACTGG19

SEQ ID No:24

서열길이:22

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

CTGTTCCAGC TACGTGAGTT CC22

SEQ ID No:25

서열길이:22

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

CTGTTCCAGC TACATGAGTT CC22

SEQ ID No:26

서열길이:507

서열 유형:핵산

가닥성:이중

기하학:선형

분자유형:게놈 DNA

본래 공급원:피로코커스 푸리오수스

균주:DSM3638

서열 기술:

SEQ ID No:27

서열길이:30

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

TGACACTGGA ATTGACGCTT CTCATCCAGA30

SEQ ID No:28

서열길이:30

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

TCTCCAAGGA AAAGTAATTG GGTGGGTAGA30

SEQ ID No:29

서열길이:30

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

GTTGCCATAA CTTGAGCTGC AGACTCATCC30

SEQ ID No:30

서열길이:420

서열 유형:핵산

가닥성:이중

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(PCR 단편)

서열 기술:

SEQ ID No:31

서열길이:420

서열 유형:핵산

가닥성:이중

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(PCR 단편)

서열 기술:

SEQ ID No:32

서열길이:28

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

AGAGGGATCC ATGAAGGGGC TGAAAGCT28

SEQ ID No:33

서열길이:28

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

AGAGGCATGC GCTCTAGACT CTGGGAGAGT28

SEQ ID No:34

서열길이:1962

서열 유형:핵산

가닥성:이중

기하학:선형

분자유형:게놈 핵산

본래 공급원:피로코커스 푸리오수스

균주 DSM3638

서열 기술:

SEQ ID No:35

서열길이:654

서열 유형:아미노산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:펩타이드

서열 기술:

Met Lys Gly Leu Lys Ala Leu Ile Leu Val Ile Leu Val Leu Gly

SEQ ID No:36

서열길이:25

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

SEQ ID No:37

서열길이:25

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

SEQ ID No:38

서열길이:80

서열 유형:핵산

가닥성:이중

기하학:선형

분자유형:게놈 DNA

본래 공급원:피로코커스 푸리오수스

균주:DSM3638

서열 기술:

SEQ ID No:39

서열길이:30

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

AGAGGCATGC GTATCCATCA GATTTTTGAG30

SEQ ID No:40

서열길이:20

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

AGTGAACGGA TACTTGGAAC20

SEQ ID No:41

서열길이:20

서열 유형:핵산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:다른 핵산(합성 DNA)

서열 기술:

GTTCCAAGTA TCCGTTCACT20

SEQ ID No:42

서열길이:12

서열 유형:아미노산

가닥성:단일

기하학:선형

분자유형:펩타이드

서열 기술:

Claims (13)

1. 서열목록의 SEQ ID No. 1에 의해 나타내지는 아미노산 서열을 가는 고열안정성 프로테아제 또는 그의 기능적 균등물.
2. 제1항에 정의된 고열안정성 프로테아제 또는 그의 기능적 균등물을 암호화하는 고열안정성 프로테아제 유전자.
3. 제2항에 있어서, 서열목록의 SEQ ID No. 2에 의해 나타내지는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 고열안정성 프로테아제 유전자.
4. 제2항에 있어서, 제3항에 정의된 고열안정성 프로테아제 유전자와 혼성화할 수 있는 고열안정성 프로테아제 유전자.
5. 서열목록의 SEQ ID No. 3에 의해 나타내지는 아미노산 서열을 갖는 고열안정성 프로테아제 또는 그의 기능적 균등물.
6. 제5항에 정의된 고열안정성 프로테아제 또는 그의 기능적 균등물을 암호화하는 고열안정성 프로테아제 유전자.
7. 제6항에 있어서, 서열목록의 SEQ ID No. 4에 의해 나타내지는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 고열안정성 프로테아제 유전자.
8. 제6항에 있어서, 제7항에 정의된 고열안정성 프로테아제 유전자와 혼성화할 수 있는 고열안정성 프로테아제 유전자.
9. 서열목록의 SEQ ID No. 5에 의해 나타내지는 아미노산 서열을 갖는 고열안정성 프로테아제 또는 그의 기능적 균등물.
10. 제9항에 정의된 고열안정성 프로테아제 또는 그의 기능적 균등물을 암호화하는 고열안정성 프로테아제 유전자.
11. 제10항에 있어서, 서열목록의 SEQ ID No. 6에 의해 나타내지는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 고열안정성 프로테아제 유전자.
12. 제10항에 있어서, 제11항에 정의된 고열안정성 프로테아제 유전자와 혼성화할 수 있는 고열안정성 프로테아제 유전자.
13. 제2항 내지 4항, 제6항 내지 8항 및 제10항 내지 12항에서 정의된 고열안정성 프로테아제 유전자중의 어느 하나를 함유하는 형질전환체를 배양하고, 이어서 배양물로부터 고열안정성 프로테아제를 수획하는 것을 포함하여 고열안정성 프로테아제를 제조하는 방법.