WO1997021823A1 - Genes de proteases ultrathermostables - Google Patents

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WO1997021823A1
WO1997021823A1 PCT/JP1996/003253 JP9603253W WO9721823A1 WO 1997021823 A1 WO1997021823 A1 WO 1997021823A1 JP 9603253 W JP9603253 W JP 9603253W WO 9721823 A1 WO9721823 A1 WO 9721823A1
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Hikaru Takakura
Mio Morishita
Katsuhiko Yamamoto
Masanori Mitta
Kiyozo Asada
Susumu Tsunasawa
Ikunoshin Kato
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Takara Shuzo Co., Ltd.
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes

Definitions

  • FIG. 16 is a restriction map of plasmid pPS1.
  • FIG. 24 is a diagram showing the thermal stability of the enzyme preparation NP-1.
  • the hyperthermostable protease gene of the present invention By introducing a mutation based on the hyperthermostable protease gene of the present invention in this manner, it has the same heat resistance and optimal temperature as the hyperthermostable protease of the present invention, It is also possible to cause the host to produce enzymes whose properties are slightly different.
  • the base sequence of the base hyperthermostable protease gene is not necessarily limited to a sequence derived from one hyperthermostable protease.
  • a hybrid gene is prepared by connecting two or more hyperthermostable protease genes homologous to the sequence disclosed in the present invention with a homologous region, and producing the hybrid gene. The host can produce the encoding hybrid enzyme.
  • FIG. 8 shows a restriction map of plasmid pTC4.
  • plasmid vector pUB18-P43 was digested with SacI, the ends were smoothed, and self-ligated to remove the SacI site.
  • the removed plasmid vector pUB18-P43S was prepared. This was digested with KpnI and Sphl, mixed with the previously recovered DNA fragment of about 3 kb, ligated, and introduced into Bacillus subtilis DB104. Plasmid was prepared from the resulting kanamycin-resistant transformant, and a plasmid containing only one molecule of the 0 ⁇ -eight fragment of about 31 ⁇ was selected and named plasmid pSTC2. did.
  • the obtained cells were suspended in 4 ml of 5 ⁇ Tris-HC1 ( ⁇ 8.0) containing 25% sucrose, and 2 ml of 0.2 M EDTA, 0.8 ml was added to the suspension.
  • lysozyme 5 rag / ml
  • [SET solution 150 mM NaC then 1 mM EDTA, 20 mM tris-HC1, HC1, H8) 0
  • 4 ml of 5% SDS and 400 1 of proteinase K (1 Omg nil) were added, and the reaction was stopped by further performing a 1-chloroform extraction with incubation at 37 ° C for 1 hour.
  • the precipitate was collected to obtain about 3.2 ng of chromosomal DNA.
  • a promoter for obtaining the promoter-signal sequence region of the subtilisin gene. Lima is the best. First, referring to the nucleotide sequence of the promoter region of the subtilisin gene described in Journal of Bacteriol., Vol. 171, pp. 2657 to 2665 (1989), the upstream region of the region is referred to. Then, a primer SUB4 containing the EcoRI site (SEQ ID NO: 36 in the sequence listing shows the base sequence of the primer SUB4) was prepared. Next, referring to the nucleotide sequence of the subtilin-coding region described in J. Bacteriol., Vol. 158, pp. 411-418 (1984), immediately after the signal sequence, Primer BmR1 (SEQ ID NO: 37 in the sequence listing shows the base sequence of primer BmRI) capable of introducing BamH1 site was synthesized.
  • proteoli 1000 squid digested with Xba I A signal was observed in a DNA fragment of about 3.5 kb in the chromosomal DNA of human chromosomal DNA, and a hyperthermostable protease protein that hybridized with the protease PFUL gene was identified as Staphylothermus marinus and Samobacteroides. It was shown to be present in the chromosomal DNA.
  • GCCAAGCTCA CCTTCACCGG CTCCGTCGCC GACAAGGGAA GCGCCACCCA CACCTTCGAC 1380 GTCAGCGGCG CCACCTTCGT GACCGCCACC CTCTACTGGG ACACGGGCTC GAGCGACATC 1440

Description

明 細 書 超耐熱性プロテアーゼ遺伝子 技術分野
本発明は、 工業用酵素として有用な超耐熱性プロテアーゼ、 それをコー ドする遺伝子および該酵素の遺伝子工学的製造方法に関する。 背景技術
プロテアーゼは蛋白質中のぺプチド結合を切断する酵素であり、 動物、 植物、 微生物より数多くの酵素が見い出されている。 その用途は研究用試 薬、 医薬の他、 洗剤への添加、 食品の加工、 逆反応を利用した化学合成と いった工業的分野にも及び、 産業上極めて重要な酵素といえる。 工業的分 野で使用されるプロテア一ゼには物理的、 化学的に高い安定性を要求され ることから、 特に耐熱性の酵素が好んで使用されている。 バチルス （Baci l lus) 属細菌の生産するプロテアーゼは割合に高い耐熱性を示すことから、 現在、 産業的に使用されているプロテア一ゼの主流を占めている。 しかし、 ざらに優れた酵素が望まれており、 高温で生育する微生物、 例えば、 好熱 性バチルス厲細菌より酵素を取得しょうとする試みもなされている。
—方、 超好熱菌と呼ばれる一群の微生物は高温環境によく適応しており、 さまざまな耐熱性酵素の供給源として期待されている。 これら超好熱菌の ひとつであるピロコッカス . フリオサス（Pyrococcus furiosus) がプロテ ァーゼを生産することが知られている [アプライ ド · アン ド · エンバイ口 ンメ ンタル♦マイクロバイオロジー （Appl. Environ. Microbiol. ) 第 5 6卷、 第 1 9 9 2〜 1 9 9 8頁 （1 9 9 0 ) 、 エフ ' ィ一 · ェム · エス ' マイクロバイオロジカル . レターズ （FEMS Microbiol. Letters) ¾ 71 巻、 第 17〜20頁 （ 1990) 、 ジャーナル ·ォブ ' ジェネラル · マイ クロバイオロジー （J. Gen. Microbiol. ) 第 137巻、 第 1 193〜 1 1 99頁 （1991) ] 。
また、 ピロコッカス属に属する超好熱菌、 K0D 1株 （Pyrococcus sp. Strain K0D1) はチオールプロテアーゼ （システィンプロテア一ゼ） を生 産することが報告されている [アプライ ド ·アンド ·エンバイロンメンタ ノレ .マイクロバイオロジー （Appl. Environ. Microbiol. ) 第 60 き、 第 4559〜 4566頁 （1994) ] 。 同じく超好熱菌であるサーモコ ッ カス （Therinococcus) 属、 スタフイ ロサ一マス （Staphylothermus) 属、 サ一モバクテロイデス （Thermobacteroides) 属の細菌についてもプロテ ァ一ゼの生産が知られている [アプライ ド ·マイク口バイオ口ジ一 ' アン ド .バイオテクノロジー （Appl. Microbiol. Biotechnol. ) 第 34巻、 第 715-719頁 （1991) ] 。 発明の目的
これら超耐熱菌の生産するプロテアーゼは高い耐熱性を持つことから、 これまでの酵素にない用途へも応用が期待されるが、 上記の文献のほとん どにおいては無細胞抽出液、 あるいは培養液上清より得られた粗^素液中 に耐熱性のプロテアーゼ活性が存在することが示されているだけであり、 精製、 純化された酵素の性質等については明らかにされていない。 唯一、 KOD 1株の生産するプロテアーゼは精製酵素が得られているが、 システ ィンプロテアーゼは酸化によって容易に失活するという欠点を有しており、 工業的な使用には不利である。 また、 これら超好熱菌からの酵素の取得に は高温での微生物培養操作を要するため、 工業的な酵素製造方法 c:しては 問題を有している。
本発明の目的は上記の課題を解決するために、 工業的な使用に有利な超 好熱菌のプロテアーゼを提供すること、 該超好熱菌のプロテア一ゼをコ一 ドする遺伝子を単離すること、 および該遺伝子を用いた超耐熱性プロテア ーゼの遺伝子工学的製造方法を提供することにある。 発明の開示
本発明者らは超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を取得するため、 独自にピロ コッカス · フリォサス D S M 3 6 3 8菌体および培養液上清プロテア一ゼ を精製し、 酵素の部分アミノ酸配列を決定することを試みた。 しかし、 菌 体、 培養液上清のどちらの場合もプロテア一ゼの精製は極めて困難であり、 部分ァミノ酸配列を決定し得る純度の酵素標品を得ることはできなかった。 目的とする酵素タンパクの一次構造に関する情報なしに酵素遺伝子をク ローニングする方法としては発現クローニング法があり、 例えば、 ピロコッ カス ·ボウゼィ （Pyrococcus wosei) 由来のプルラナーゼ遺伝子 （W0 9 2 / 0 2 6 1 4 ) はこの方法により取得されている。 発現クローニング法 には一般にプラスミ ドベクターが使用されるが、 この場合には目的遺伝子 がその内部で切断されることなく、 かつプラスミ ドベクターに挿入可能な 程度の比較的小さな D N A断片に切断されるような制限酵素を用いなけれ ばならず、 必ずしもすベての酵素遺伝子のクローニングに適用可能ではな い。 さらに数多くのクローンについて酵素活性の発現を調べる必要があり、 操作が繁雑である。
本発明者らはプラスミ ドベクターにかえて、 より大きな D N A断片 （3 0〜5 O kb) を保持できるコスミ ドベクターを用いてピロコッカス . フリ ォサスのコスミ ドライブラリ一を作成し、 該ライブラリ一中にプロテア一 ゼ活性を発現するコスミ ドクローンを検索することにより、 プロテア一ゼ 遺伝子を単離することを試みた。 コスミ ドベクターを用いることにより酵 素遺伝子内部が切断されるおそれが減るとともに、 スクリ一二ングする形 質転換体の数を減らすことができる。 その反面、 コスミ ドベクターはブラ スミ ドベクターに比べて宿主内でのコピー数が高くないため、 酵素の発現 量が低く活性を検出できない可能性がある。
本発明者らは、 まず、 目的とする酵素が高い耐熱性を有する点に着目し、 コスミ ドライブラリー中の形質転換体を個別に培養して得られた菌体から 耐熱性の蛋白質のみを含むライゼ一トを調製する工程を組み合わせ、 この ライゼ一トを酵素活性の検出に用いた。 さらにプロテア一ゼ活性の検出に ゼラチンを含む S D S —ポリアクリルァミ ドゲル電気泳動法を用いること により、 ごく微量の酵素活性の検出を可能にした。
かく して、 本発明者らはピロコッカス · フリオサスのコスミ ドライブラ リ一よりプロテアーゼ活性を発現する数個のコスミ ドクローンを取得し、 このクローン中に含まれる挿入 D N A断片よりプロテア一ゼをコ一ドする 遺伝子の単離に成功した。 また、 該遺伝子のコードするプロテア -ゼが極 めて高い耐熱性を有することも確認した。
該遺伝子の塩基配列から推定される超耐熱性プロテア一ゼのァミノ酸配 列と、 既知の微生物由来プロテアーゼのアミノ酸配列との比較から、 該超 耐熱性プロテアーゼの前半部分のァミ ノ酸配列とサブチリシンに代表され る一群のアル力リ性セリンプロテア一ゼとの間に相同性が存在することが 示され、 特に酵素の触媒活性に重要とされる 4つのァミノ酸残基周辺で極 めて高い相同性が認められた。 このように常温菌由来のプロテア一ゼが容 易に失活するような高温で活性を示すピロコッカス ' フリオサスの生産す るプロテア一ゼに常温菌由来の酵素と類似した構造が保存されていること が示されたことより、 ピロコッカス ' フリォサス以外の超好熱菌において も同様の構造が保存されたプロテア一ゼが生産されていることが示唆され た。
そこで、 本発明者らは得られた超耐熱性プロテアーゼ遺伝子のうち、 サ ブチリシンなどと相同性の高い領域をコードする塩基配列が超耐熱性プロ テアーゼ遺伝子を探索するプローブとして有用である可能性に着目し、 該 塩基配列をもとに作成した台成 D N Aをプライマーに用いた P C Rによる 超好熱菌由来のプロテアーゼ遺伝子の検出、 およびそのクローニングを試 みた。 その結果、 超好熱菌サーモコッカス .セラー （Thermococcus celer) D S M 2 4 7 6に上記の遺伝子と相同性を有する遺伝子断片の存在が認め られた。 該遺伝子全長のクローニングは困難であり、 これは該遺伝子の産 物が宿主に対して負荷になるためと考えられた。
本発明者らは、 クローニングの宿主に枯草菌 （Bacillus subtilis) を 用いたところ、 該遺伝子全長の保持が可能であるとともに、 発現されたプ 口テア一ゼが菌体外に分泌されることを見い出し、 さらに発現されたプロ テアーゼが 9 5 °Cにおいてプロテアーゼ活性を示すこと、 高い耐熱性を有 することを明らかにした。 なお、 該遺伝子にコードされるプロテア一ゼの 分子量は上記のピロコッカス 'フリォサス由来の高分子量プロテアーゼの 半分以下であった。
また、 該遺伝子の断片をプローブとしたハイプリダイゼーションにより、 ピロコッカス . フリォサスに上記の高分子プロテア一ゼとは異なる第 2の プロテアーゼ遺伝子が存在することも見い出した。 該遺伝子は上記のサー モコッカス 'セラー由来の超耐熱性プロテアーゼと同程度の分子量のプロ テア一ゼをコ一ドしており、 該遺伝子を単離して枯草菌に導入することに より、 該遺伝子の発現産物も菌体外に分泌された。 発現されたプロテア一 ゼは 9 5 °Cで酵素活性を示すとともに高い耐熱性を有していた。 また、 該 プロテアーゼがプロセッシングを受けて生成する成熟型プロテア一ゼのァ ミノ酸配列も明らかにされた。
これらの 2種のプロテアーゼは、 特別な操作をすることなく菌体外に分 泌されており、 その遺伝子自身にコードされているシグナルぺプチドが枯 草菌内で機能していると考えられる。 両プロテアーゼの培養液当たりの発 現量は、 上記のピロコッカス ' フリオサス由来の高分子プロテア一ゼが大 腸菌あるいは枯草菌において発現される場合に比べて著しく高い。 また、 サブチリシン遺伝子のプロモーター、 およびシグナル配列を利用して該遺 伝子を発現させた場合にはさらにプロテア一ゼの発現量が増加した。 さらに、 本発明者らはこれらの両プロテアーゼのキメラ蛋白質てあるハ イブリッ ド ·プロテアーゼをコードする遺伝子を作成し、 該遺伝子により 発現される酵素も、 また上記の超耐熱性プロテアーゼ同様に高温条件下で プロテアーゼ活性を示すことを確認し、 本発明を完成するに至った。 発明の概要
本発明の第 1の態様は、 配列表の配列番号 1に記載したァミノ^配列を 有する超耐熱性プロテア一ゼまたはその機能的同等物、 ならびに、 それら の超耐熱性プロテア一ゼをコ一ドする超耐熟性プロテアーゼ遺伝子、 とり わけ、 配列表の配列番号 2に記載した塩基配列を有する超耐熱性プロテア ーゼ遺伝子を提供するものである。 さらに、 この超耐熱性プロテアーゼ遺 伝子とハイプリダイズし、 超耐熱性プロテアーゼをコ一ドする遺伝子も提 供する。
また、 本発明の第 2の態様は、 配列表の配列番号 3に記載した"ミノ酸 配列を有する超耐熱性プロテアーゼまたはその機能的同等物、 ならびに、 それらの超耐熱性プロテア一ゼをコードする超耐熱性プロテア一ゼ遺伝子、 とりわけ、 配列表の配列番号 4に記載した塩基配列を有する超耐熱性プロ テアーゼ遺伝子を提供するものである。 さらに、 この超耐熱性プロテア一 ゼ遺伝子とハイブリダィズし、 超耐熱性プロテア一ゼをコ一ドする遺伝子 も提供する。
また、 本発明の第 3の態様は、 配列表の配列番号 5に記載したアミノ酸 配列を有する超耐熱性プロテアーゼまたはその機能的同等物、 ならびに、 それらの超耐熱性プロテア一ゼをコ一ドする超耐熱性プロテアーゼ遺伝子、 とりわけ配列表の配列番号 6に記載した塩基配列を有する超耐熱性プロテ ァーゼ遺伝子を提供するものである。 さらに、 この超耐熱性プロテアーゼ 遺伝子とハイプリダイズし、 超耐熱性プロテア一ゼをコ一ドする遺伝子も 提供する。
さらに、 本発明はこれらの本発明の超耐熱性プロテア一ゼ遺伝子を含有 する形質転換体を培養し、 該培養物から超耐熱性プロテアーゼを採取する ことを特徴とする該超耐熱性プロテアーゼの製造方法も提供する。
本明細書において用いる 「機能的同等物」 なる語は以下のようなものを 意味する。
天然に存在するタンパクにはそれをコードする遺伝子の多型や変異の他、 生成後のタンパクの生体内および精製中の修飾反応などによってそのァミ ノ酸配列中に、 1または数個 （例えば、 全アミノ酸の 5 %程度まで） のァ ミノ酸の欠失、 挿入、 付加、 置換等の変異が起こりうるが、 それにもかか わらず変異を有しないタンパクと実質的に同等の生理、 生物学的活性を示 すものがあることが知られている。 このように構造的に若千の差違があつ てもその機能については大きな違いが認められないものを機能的同等物と 呼ぶ。 人為的にタンパクのァミ ノ酸配列に上記のような変異を導入した場 合も同様であり、 この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが 可能である。 例えば、 ヒ トインターロイキン 2 ( I L— 2 ) のアミノ酸配 列中のあるシスティン残基をセリンに置換したポリぺプチドがィンタ一口 ィキン 2活性を保持することが知られている [サイエンス （Science) 、 第 2 2 4巻、 1 4 3 1頁 （1 9 8 4 ) ] 。
本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子より転写、 翻訳される遺伝子産物 は、 細胞外への分泌に必要なシグナルペプチドと、 活性が発現する棼には 除去されるプロべプチドの 2つの領域を含む前駆体酵素 （プレブ口酵素） である。 上記の遺伝子を導入された形質転換体がこのシグナルべプチドを 切断できる場合には、 シグナルペプチドを除去された前駆体酵素 （プロ酵 素） が細胞外に分泌される。 さらに、 プロ酵素同志の自己消化反応によつ てプロべプチドが除かれた活性型酵素が生成される。 このように本発明の 遺伝子から得られるプレブ口酵素、 プロ酵素、 活性型酵素はいずれも最終 的には同等の機能を有するタンパクであり、 「機能的同等物」 の範囲内に 属するものである。
また、 当業者には自明のとおり、 シグナルペプチドは目的遺伝子の発現 に用いられる宿主に応じて適当なものを選んでも差し支えなく、 また細胞 外への分泌発現を望まない場合にはこれを除去してもかまわない。 したがつ て、 本発明に開示された超耐熱性プロテア一ゼ遺伝子のうち、 シグナルべ プチドをコ一ドする部分を除いたもの、 あるいはこれを他の塩基 S列によつ て置き換えたものも、 本質的に同等の活性を示すプロテア一ゼをコ一ドす るという意味において本発明の範囲内のものと解釈される。
本明細書において用いる、 「超耐熱性プロテア一ゼ遺伝子にハイプリダ ィズ」 する遺伝子とは、 該超耐熱性プロテアーゼ遺伝子と、 ス ト リ ンジェ ン トな条件、 すなわち、 0 . 5 % S D S、 0 . 1 %ゥシ血清アルブミ ン （B SA) 、 0. 1 %ポリ ビニルピロ リ ドン、 0. 1 %フイ コール 400、 0. 01 %変性サケ精子 DNAを含む 6 X S S C (l x S S Cは 0. 15M NaCl、 0. 015 Mクェン酸ナトリウム、 pH 7. 0を示す） 中で、 5 0°Cにて 12〜20時間のィンキュベ一シヨ ンを行うという条件で、 ハイ プリダイズする遺伝子をいう。 図面の簡単な説明
図 1は、 プラスミ ド pTPR l 2、 プラスミ ド pUB P l 3に含有され るピロコッカス · フリオサス由来の DN A断片の制限酵素地図を示す図で ある。
図 2は、 オリゴヌクレオチド PRO— 1 Fの設計を示す図である。
図 3は、 ォリゴヌクレオチド P RO— 2 Fおよび P RO— 2 Rの設計を 示す図である。
図 4は、 オリゴヌクレオチド P RO— 4 Rの設計を示す図である。
図 5は、 プラスミ ド p 2 F— 4 Rの制限酵素地図である。
図 6は、 プラスミ ド pTC 3の制限酵素地図である。
図 7は、 プラスミ ド p T C S 6の制限酵素地図である。
図 8は、 プラスミ ド pTC 4の制限酵素地図である。
図 9は、 プラスミ ド p STC 3の構築操作を示す図である。
図 10は、 プラスミ ド p S TC 3の制限酵素地図である。
図 11は、 各種のプロテア一ゼのァミノ酸配列を比較する図である。 図 12は、 図 11のつづきである。
図 13は、 ピロコッカス · フリオサス染色体 DN A上のプロテアーゼ P FUS遺伝子周辺の制限酵素地図を示す図である。
図 14は、 プラスミ ド p S PT 1の制限酵素地図である。 図 15は、 プラスミ ド p S N P 1の制限酵素地図である。
図 16は、 プラスミ ド p P S 1の制限酵素地図である。
図 17は、 プラスミ ド p NA P S 1の制限酵素地図である。
図 18は、 酵素標品 TC— 3の至適温度を示す図である。
図 19は、 酵素標品 NAP S— 1の至適温度を示す図である。
図 20は、 酵素標品 TC— 3の至適 pHを示す図である。
図 21は、 酵素標品 NP— 1の至適 pHを示す図である。
図 22は、 酵素標品 NAPS— 1の至適 pHを示す図である。
図 23は、 酵素標品 TC一 3の熱安定性を示す図である。
図 24は、 酵素標品 NP— 1の熱安定性を示す図である。
図 25は、 活性化した酵素標品 NP— 1の熱安定性を示す図である。 図 26は、 酵素標品 NAP S— 1の熱安定性を示す図である。
図 27は、 酵素標品 NP— 1の pH安定性を示す図である。
図 28は、 酵素標品 NP— 1の SDSに対する安定性を示す図である。 図 29は、 酵素標品 NAP S— 1の SDSに対する安定性を示す であ 図 30は、 酵素標品 N A P S— 1のァセトニトリルに対する安定性を示 す図である。
図 31は、 酵素標品 NAP S— 1の尿素に対する安定性を示す図である。 図 32は、 酵素標品 NAP S— 1のグァニジン塩酸塩に対する安定性を 示す図である。 発明の好ましい具体例
本発明に係る超耐熱性プロテアーゼ遺伝子は、 超好熱菌の遺伝子ライブ ラリ一のスクリ一二ングによって得ることができる。 超好熱菌としてはピ 口コッカス属に属する細菌が使用でき、 ピロコッカス · フ リォサスの染色 体のコスミ ドライブラリーより目的の遺伝子をスク リ一二ングし、 得るこ とができる。
ピロコッカス . フリオサスとしては、 例えば、 ピロコ ッカス · フリオサ ス D SM3638が使用でき、 該菌株は ドィツチヱ 'ザムルンク ' フォン ミ クロオルガニスメ ン · ゥン ト · ツェルクルチユウレン GmbH (Deutsc he Sammlung von Mikroorganisraen und Zellkulturen GmbH) より入キロ J" 能な菌株である。
ピロコッカス . フリォサスの染色体のコスミ ドライブラリ一の一例とし てはピロコッカス · フリオサス DSM3638の染色体 DN Aを制限酵素 Sau3 A I (宝酒造社製） で部分消化して得られた DNA断片と、 トリプ ルヘリ ックスコスミ ドベクタ一 （ス トラタジーン社製） とをライゲ一ショ ンした後、 イン · ビトロ ·パッケージング法によってラムダファージ粒子 中にパッケージングすることにより得ることができる。 つぎに、 該ライブ ラ リ一を適当なィー · コリ （Escherichia coli) 、 例えば、 ィー · コリ D H 5ひ MCR (BRL社製） に形質導入することによって得られる形質転 換体を培養した後、 菌体を集めて熱処理 （例、 100°C、 10分間） 、 超 音波処理、 再熱処理 （例、 100て、 10分間） し、 得られたライゼー ト 中のプロテアーゼ活性の有無をゼラチンを含む S D S—ポリアク リルァミ ドゲル電気泳動法を利用してスク リ一二ングすることができる。
これにより、 上記の熱処理に耐性のプロテアーゼを発現する超耐熱性プ 口テアーゼ遺伝子を含むコスミ ドクローンを得ることができる。
さらに、 このようにして得られたコスミ ドクローンより調製したコスミ ドを適当な制限酵素で断片化し、 各断片を組み込んだ組換えプラスミ ドを 作製することができる。 ついで、 該プラスミ ドで適当な微生物を形質転換 し、 得られた形質転換体の発現するプロテアーゼ活性を調べることにより、 目的とする超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含む組換えプラスミ ドを得るこ とができる。
すなわち、 上記のコスミ ドクローンの 1つから調製したコスミ ド^ Not I、 PvuII (ともに宝酒造社製） で消化して得られる約 7. 5kbの DNA 断片を単離して、 あらかじめ Notl リンカ一 （宝酒造社製） を導入 たプ ラスミ ドベクター pUC 19 (宝酒造社製） の Notl— Sraa lサイ 卜間に 挿入することができる。 該プラスミ ドはプラスミ ド pTPR 12と命名さ れ、 また、 該プラスミ ドで形質転換されたィー ' コリ J M 109は Esche richia coli J M109/p TPR 12と命名、 表示され、 平成 6年 5月 24日 （原寄託日） よりブダペスト条約の下、 日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1番 3号の、 通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 F ERM B P— 5103として寄託されている。
該 Escherichia coli J M 109 / p T P R 12のライゼ一卜は、 ゼラ チンを含む S D S—ポリアクリルアミ ドゲル上で、 上記のコスミ ドクロー ンと同様のプロテアーゼ活性を示す。
さらに、 該プラスミ ド pTPR l 2に挿入されたピロコッカス ' フリオ サス由来の DN A断片の塩基配列は通常の方法、 例えば、 ジデォキシ法に よって決定することができる。 プラスミ ド pTPR 12の挿入 DNA断片 のうち、 2つの Dra Iサイ トではさまれた約 4. 8kb部分の塩基配列を配 列表の配列番号 7に示す。 また、 該塩基配列より推定される遺伝子産物の アミノ酸配列を配列表の配列番号 8に示す。 こうして、 その遺伝子の塩基 配列、 さらにはそのァミノ酸配列が明らかにされたピロコッカス ' フリオ サス由来の超耐熱性プロテアーゼはプロテアーゼ P FU Lと命名されてい る。 配列表の配列番号 8に示されるように、 該プロテアーゼ P FU Lは 1 398残基からなり、 分子量 15万をこえる高分子量のプロテアーゼであ る。
プロテアーゼ P FUL遺伝子は枯草菌 （Bacillus subtilis) を宿主と して発現させることができる。 バチルス ·サブチリスとしてはバチルス · サブチリス DB 104が使用でき、 該菌株はジーン （Gene) 第 83卷、 第 215〜 233頁 （1989) 記載の公知の菌株である。 クロ一ニングべ クタ一としてはプラスミ ド p UB 18— P 43が使用でき、 該プラスミ ド はカルガリー大学、 スイーラム ' ウォン （Sui- Lam Wong) 博士より惠与さ れたプラスミ ドである。 また、 該プラスミ ドは選択マーカーとしてカナマ ィシン耐性遺伝子を含んでいる。
上記プラスミ ド pTPR l 3より Dral消化によって得られる約 4. 8 kbの DN A断片が上記プラスミ ドベクタ一 p U B 18— P 43の Smalサ ィ トに導入されたプラスミ ド pUB P 13がある。 該プラスミ ド中、 プロ テア一ゼ P FUL遺伝子はバチルス ·サブチリス中で機能する P 43プロ モーター [ジャーナル ·ォブ ·バイオ口ジカル ' ケミス ト リ一 （J. Biol. Chem. ) 第 259卷、 第 8619〜 8625頁 （1984) ] の下流に位 置している。 該プラスミ ドで形質転換されたバチルス♦サブチリス DB 1 04は Bacillus subtilis DB 104/pUB P 13と命名されている。 該形質転換体のラィゼー卜は上記の Escherichia coli J M 109/p T PR 12と同様のプロテア一ゼ活性を示す。
しかし、 該形質転換体の培養液上清にはごく微量のプロテアーゼ活性し か検出されない。 これはプロテアーゼ PFULの分子量が極めて大きく、 バチルス ·サブチリス中で効率よく翻訳されないこと、 およびプロテア一 ゼ PFUL遺伝子にコードされるシグナル配列がバチルス，サブチリス中 でうまく機能しないこと等に起因すると考えられる。 また、 プロテアーゼ P FU Lに存在する C末端側のぺプチド鎖は細胞膜への結合領域であり、 該酵素が膜結合型のプロテアーゼである可能性も考えられる。
図 1にピロコッカス . フリォサス染色体上のプロテアーゼ P FU L遺伝 子周辺の制限酵素地図、 ならびにプラスミ ド pTPR 12、 プラスミ ド p UB P 13に挿入された DNA断片を示す。 また、 図中の矢印はプロテア ーゼ P FU Lをコードするオープン ' リーディング * フレームを示す。 配列表の配列番号 8に示される上記のプロテアーゼ P FU Lのァミノ酸 配列を既知の微生物由来プロテア一ゼのァミノ酸配列と比較することによ り、 プロテアーゼ PFULの前半部分のァミノ酸配列とサブチリシンに代 表される一群のアル力リ性セリ ンプロテアーゼ [プロテイン 'エンジニア リング （Protein Engineering) 第 4巻、 第 719~737頁 （1991) ] との間に相同性が存在し、 特にプロテアーゼの触媒活性に重要とされる 4つのァミノ酸残基周辺に極めて高い相同性が存在することがわかる c このように超好熱菌ピロコッカス ' フリォサスの生産するプロテア一ゼ P FULのァミノ酸配列中に常温菌由来のプロテアーゼに共通して存在す る領域が保存されていることが明らかとなったことより、 ピロコッカス · フリォサス以外の超好熱菌の生産する同種のプロテアーゼにもこの領域が 存在していることが期待できる。
すなわち、 配列表の配列番号了に示された塩基配列のうち、 サブチリシ ン等と相同性の高い領域のァミノ酸配列をコードする部分の配列をもとに 適当な長さの DNAを調製し、 これをハイプリダイゼーションのプローブ、 あるいは P C R等の遺伝子増幅法のプライマーに用いることによ^;、 各種 の超好熱菌に存在する本酵素類似の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子をスクリ 一二ングすることができる。
上記の方法では目的の遺伝子の一部のみを含む DN A断片が得られるこ とがある力 \ その際には得られた DN A断片の塩基配列を調べてそれが目 的の遺伝子の一部であることを確かめた上、 該 DNA断片、 あるいはその —部をプローブとしてハイプリダイゼーションを行う力、、 または該 DNA 断片の塩基配列に基づいて合成されたプライマ一を用いて P CRを行うこ とにより、 目的の遺伝子全体を取得することができる。
上記のハイプリダイゼーションは以下の条件で行うことができる。 すな わち、 DN Aを固定したメンブレンを 0. 5% SDS、 0. 1% ゥシ血 清アルブミ ン （B SA) 、 0. 1 % ポリビニルピロリ ドン、 0. 1% フィ コール 400、 0. 01 % 変性サケ精子 DN Aを含む 6 x S S C ( 1 x S S Cは 0. 15M Na C l、 0. 015 クェン酸ナ トリウム、 p H 7. 0を示す） 中で、 50°Cにて 12〜20時間、 適当な標識を付したプ ローブとともにインキュベートする。 インキュベーション終了後、 0. 5 % S D Sを含む 2 X S S C中、 37 °Cでの洗净から始めて、 S S C濃度 は 0. I Xまでの範囲で、 また、 温度は 50°Cまでの範囲で変化させ、 固 定された D N Aにハイブリダイズしたプローブ由来のシグナルがバックグ ラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄する。
また、 こう して得られた新たな超耐熱性プロテア一ゼ遺伝子をもとにし たプローブ、 あるいはプライマ一を作製し、 上記同様の方法によってさら に別の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の取得が可能なことも当業者には自明 のことである。
図 2、 3および 4にプロテアーゼ PFULのアミノ酸配列のうちサブチ リ シン等と高い相同性を示す領域の配列、 その部分をコー ドするプロテア —ゼ P FUL遺伝子の塩基配列、 およびそれをもとに合成したオリゴヌク レオチド PRO— 1 F、 PRO— 2F、 ？ 0— 21^ぉょび？1¾0—41^ の塩基配列の関係を示す。 さらに、 配列表の配列番号 9、 10、 1 1およ び 12にそれぞれオリ ゴヌ ク レオチ ド PRO— 1 F、 PRO— 2 F、 PR 0— 2Rおよび PRO— 4 Rの塩基配列を示す。 すなわち、 配列表の配列 番号 9〜12は本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子のスク リ一二ングに 使用されるオリゴヌクレオチ ドの 1例の塩基配列である。
該ォリ ゴヌクレオチ ドを組み合わせてプライマーに用い、 各種のお i好熱 菌の染色体 DNAを铸型とした P C Rによりプロテア一ゼ遺伝子を検出す ることができる。
超好熱菌としては、 ピロコッカス属、 サーモコッカス厲、 スタフ ロザ 一マス属、 サーモバクテロイデス属等に属する細菌が使用でき、 サ一モコッ カス属に属する細菌としては、 例えば、 サ一モコッカス ' セラ一 （Thermo coccus celer) D SM2476が使用でき、 該菌株はドイ ツチヱ ·ぜムル ンク ' フォン ' ミ ク口オルガニスメ ン ' ゥン ト ' ッヱルクルチユウレン G mbHより入手可能な菌株である。 サーモコッカス · セラ一 DSM247 6の染色体 DN Aを铸型とし、 上記のォリ ゴヌクレオチ ド P RO—丄 Fと PRO— 2 Rの組み合わせ、 あるいは PRO— 2 Fと PRO— 4 RO組み 台わせをプライマーに用いて P C Rを行った場合には特異的な DNA断片 の增幅が認められ、 プロテアーゼ遺伝子の存在を知ることができる e また、 これらの DN A断片を適当なブラスミ ドベクタ一に挿入した組換えプラス ミ ドを作製した後、 挿入 DN A断片の塩基配列をジデォキシ法で調べるこ とにより、 該断片にコ一 ドされるァミ ノ酸配列を推定することができる。 オリ ゴヌクレオチド PRO— 1 Fと PRO— 2 Rとを用いて増幅された 約 15 ObpのDNA断片、 あるいはオリ ゴヌク レオチド PRO— 2 Fと P R0— 4 Rとを用いて增幅された約 550 bpの DN A断片をプラスミ ドべ クタ一 PUC 18 (宝酒造社製） の Hin iサイ トに挿入して作製された 組換えプラスミ ドはそれぞれプラスミ ド p 1 F— 2R (2) 、 プラスミ ド 2 F— 4 Rと命名されている。 配列表の配列番号 13にプラスミ ド 1 F- 2 R (2) の挿入 DNA断片の塩基配列とそれから推定されるァミノ 酸配列を、 また、 配列表の配列番号 14にプラスミ ド p 2 F— 4 Rの挿入 DN A断片の塩基配列とそれから推定されるアミノ酸配列をそれぞれ示す c 配列表の配列番号 13に示された塩基配列のうち 1番目から 21番目にか けてと、 1 13番目から 145番目にかけての配列、 および配列表の配列 番号 14に示された塩基配列のうち 1番目から 32番目にかけてと、 53 2番目から 564番目にかけての配列は、 PCRにプライマーとして用い たォリゴヌクレオチド （それぞれォリゴヌクレオチド P RO— 1 F、 PR 0— 2R、 P R〇_ 2 Fおよび P RO— 4 Rに相当する） 由来の配列であ る。 配列表の配列番号 13および 14に示されたァミノ酸配列中にはプロ テアーゼ PFUL、 および各種微生物由来のアル力リ性セリンプロテア一 ゼのァミノ酸配列と相同性のある配列が存在しており、 上記の P C R増幅 DNA断片がプロテアーゼ遺伝子を铸型として増幅されたものであること を示している。
プラスミ ド p 2 F— 4 Rの制限酵素地図を図 5に示す。 図中、 太実線が プラスミ ドベクター pUC 18への挿入 DNA断片である。
つぎに、 上記のオリゴヌクレオチド、 あるいは上記の P C Rにより得ら れた增幅 DN A断片をプローブに用いて超好熱菌の遺伝子ライブラリ一を スクリーニングすることにより、 超耐熱性プロテアーゼ遺伝子、 例えばサ 一モコッカス ' セラーの生産する超耐熱性プロテアーゼの遺伝子を得るこ とができる。
サーモコッカス ' セラーの遺伝子ライブラリ一の一例としては、 サ一モ コッカス ' セラー D SM2476の染色体 D N Aを制限酵素 S au 3 A Iで 部分消化して得られた DN A断片と、 ラムダ G EM— 1 1ベクター （プロ メガ社製） とをライゲ一シヨ ンした後、 イ ン ' ビトロ · パッケージング法 によってラムダファージ粒子中にパッケージングすることによって得られ るライブラ リ一がある。 つぎに、 該ライブラ リ一を適当なィー · コリ （Es cherichia coli) 、 例えばィ一 ' コリ L E 392 (プロメガ社製） に形質 導入してプレー ト上でプラークを形成させた後、 上記の PCRにより得ら れた增幅 DN A断片をプローブに用いたプラークハイプリダイゼ一ショ ン を行い、 目的の遺伝子を含むファ一ジクローンを得ることができる。
さらに、 このようにして得られたファージクローンより調製したファー ジ DN Aを適当な制限酵素で消化し、 上記のプローブを用いたサザンハイ プリダイゼーショ ンを行い、 プロテアーゼ遺伝子を含む DN A断片を検出 することができる。
上記のプラークハイプリダイゼ一ショ ンによって得られたファージクロ ーンより調製されたファージ DNAを Kpn I と BamH I (ともに宝酒造社 製） で消化した場合には約 5 kbの D N A断片がプローブとハイブリダイズ しており、 この約 5kbの DN A断片を単離してプラスミ ドベクタ一 pUC 1 19 (宝酒造社製） の Kpn I— BamH Iサイ 卜間に挿入した組換えブラ スミ ドを作製することができる。 該プラスミ ドはプラスミ ド pTC 3と命 名され、 該プラスミ ドで形質転換されたィー ' コリ J M 109は Escheri chia coli J M109ZpTC 3と命名されている。 プラスミ ド p TC 3 の制限酵素地図を図 6に示す。 図中、 太実線がプラスミ ドベクター pUC 119への挿入 DNA断片である。
該プラスミ ド p TC 3に挿入された DNA断片のうち、 プロテアーゼ遺 伝子を含まない部分を以下に示す操作により除く ことができる。 すなわち、 プラスミ ド pTC3を Sac l (宝酒造社製） で消化した後に上記同様の操 作でサザンハイブリダィゼーシヨンを行うと、 約 1. 9kbの DNA断片が プローブとハイブリダイズすることがわかる。 そこでこの約 1. 9 kbの D NA断片を単離し、 これをプラスミ ドベクタ一 pUC 1 18 (宝酒造社製） の Sac Iサイ トに挿入した組換えプラスミ ドを作製することができる。 該 プラスミ ドはプラスミ ド pTC S 6と命名され、 該プラスミ ドで形質転換 されたィー . コリ J M109は Escherichia coli JM109/pTC S 6と命名されている。 プラスミ ド p TC S 6の制限酵素地図を図 7に示す。 図中太実線がプラスミ ドベクター pUC 118への挿入 DNA断片である。 該プラスミ ド p TC S 6に挿入された DNA断片の塩基配列をジデォキ シ法によって調べることにより、 該 DN A断片中にプロテアーゼ遺伝子が 存在することを確かめることができる。 配列表の配列番号 15に該断片の 塩基配列を示す。 該塩基配列を、 配列表の配列番号 13および 14に示さ れるプラスミ ド p 1 F— 2R (2) 、 プラスミ ド p 2 F— 4 Rの挿入 DN A断片の塩基配列と比較することにより、 プラスミ ド pTC S 6に挿入さ れた DN A断片はプラスミ ド p 2 F _ 4 Rと共通の DN A断片を含んでい るが、 プロテアーゼ遺伝子の 5' 側領域を欠いていることがわかる。
このようにプラスミ ド P TC S 6に含まれるサーモコッカス ·セラー由 来の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子はその一部を欠いてはいるが当業者に自 明のとおり、 （1) 遺伝子ライブラリーのスクリーニングをやり直す、 （2 ) 染色体 DNAを用いたサザンハイブリダィゼーシヨンを行う、 （3) 力 セッ ト、 およびカセッ 卜プライマーを用いる P C Rで 5' 上流領域の DN A断片を取得する （宝酒造遺伝子工学製品ガイ ド、 1994一 1995年 版、 第 250〜 251頁） 等の方法により超耐熱性プロテアーゼ遺伝子全 長をカバーする DN A断片を得ることができる。
本発明者らは （3) の方法を選択した。 すなわち、 上記のサーモコッカ ス ·セラーの染色体 DNAを数種の制限酵素で完全消化し、 使用しに制限 酵素に対応するカセッ ト （宝酒造社製） とライゲーシヨ ンを行う。 このラ ィゲーシヨン産物を铸型とし、 プライマー TC E 6R (配列表の配列番号 16にプライマー TCE 6 Rの塩基配列を示す） およびカセッ トプライマ — C 1 (宝酒造社製） をプライマーに用いる P CRを行う。 制限酵素 Hin dill (宝酒造社製） を用いて上記の操作を行った場合には約 1. 8l:bの D N A断片が増幅され、 この増幅断片を HindIII、 S ac Iで消化して^られ る約 1. 5kbの DNA断片をプラスミ ドベクター p UC 1 19の H;ndIII -Sac Iサイ ト間に挿入した組換えプラスミ ドを作製することができる。 該プラスミ ドは pTC 4と命名され、 該プラスミ ドで形質転換され 一 ' コリ J Ml 09は Escherichia coli J Ml 09/pTC 4と命名されて いる。 プラスミ ド p TC 4の制限酵素地図を図 8に示す。 図中、 太実線が プラスミ ドベクター pUC 1 19への挿入 DNA断片である。
該プラスミ ド pTC 4に挿入された DN A断片の塩基配列をジデォキシ 法によって調べることにより、 該 DN A断片中にプロテアーゼ遺伝子が存 在することを確かめることができる。 配列表の配列番号 17に該断片の塩 基配列を示す。 該塩基配列から推定されるアミ ノ酸配列と種々のプロテア ーゼとの比較から、 上記プラスミ ド pTC4の挿入 DNA断片がプラスミ ド p TC S 6に欠けていた超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の 5' 側領域を力 バーしていることがわかる。 該塩基配列と、 配列表の配列番号 15に示し たプラスミ ド pTCS 6の挿入 DNA断片の塩基配列とを総合することに より、 サ一モコッカス .セラ一由来の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子全長の 塩基配列を知ることができる。 得られた塩基配列中に存在するオ-プン · リーディ ング ·フレームの塩基配列を配列表の配列番号 2に、 また、 該塩 基配列から推定されるアミ ノ酸配列を配列表の配列番号 1にそれぞれ示す: こうして、 それをコードする遺伝子の塩基配列、 およびそのアミノ酸配列 が明らかにされたサ一モコッカス 'セラー由来の超耐熱性プロテアーゼは プロテアーゼ TCE Sと命名されている。 プロテア一ゼ TCE S遺伝子の 全長は、 プラスミ ド pTC 4および PTC S 6の挿入 DNA断片を組み合 わせることにより再構成することができる。
該遺伝子が発現するプロテアーゼ活性の確認は、 pTC 4と PTCS 6 に含まれている 2つの DN A断片からプロテアーゼ TC E S遺伝子全長を 再構成し、 これを 1 a cプロモーターの下流に挿入した発現プラスミ ドを 大腸菌 （Echerichia coli) に導入することによって行うことができると 考えられる。 し力、し、 この方法では目的の発現プラスミ ドを導入した形質 転換体は得られず、 菌体内に該遺伝子の発現産物が生成されることが大腸 菌にとって有害、 または致死的になることが予想される。 このような場合 には、 例えば、 枯草菌 （Bacillus subtilis) を宿主としてプロテアーゼ を細胞外に分泌発現させ、 その活性を確認することが考えられる。
上記のプロテアーゼ TC E S遺伝子を枯草菌において発現させるための 宿主としては上記のバチルス ·サブチリス D B 104が使用でき、 また、 クローニングベクターとしてはプラスミ ド pUB 18— P 43が使用でき ただし、 大腸菌の宿主一ベクター系はベクターの種類が豊富であり、 形 質転換を簡便、 かつ高効率に行えるという利点を持っため、 発現プラスミ ド構築の種々の操作のうちの可能なものは大腸菌を用いて行うほうが望ま しい。 すなわち、 大腸菌内では、 プロテアーゼ TC E S遺伝子全長が再構 成されないようにプラスミ ド pTC 4および pTC S 6由来の 2つのプロ テアーゼ遺伝子断片の間に終止コ ドンを含む任意の塩基配列を挿入し、 該 遺伝子産物の発現を不可能とした伏態でブラスミ ド楕築操作を行うことが .
できる。 そして、 構築の最終段階でこの挿入配列を除いて図 10に示して ある目的の発現プラスミ ド p STC 3を作製することができる。
以下、 図 9に示したプラスミ ド P STC 3の構築操作を説明する〕 まず、 プラスミ ド pTC S 6に挿入された約 1. 8kbの Hindlll— Ssp I断片をプラスミ ドベクター P BR 322 (宝酒造社製） の Hindlll— E coR Vサイ ト間に挿入した組換えプラスミ ド p BT C 5を作製し、 さらに、 該プラスミ ドに含まれるプラスミ ドベクター p U C 118のマルチクロー ニングサイ ト由来の Hindlll— Kpn I間の DN A断片、 およびプラスミ ド ベクター P BR322上に存在する BamH Iサイ 卜を除いたプラスミ ド p B T C 5 HK Bを作製する。
つぎに、 上記のプロテアーゼ TC E S遺伝子の塩基配列をもとに、 プロ テア一ゼ T C E Sの開始コ ドンの直前に EcoR I、 BamH Iサイ 卜を導入 できるプライマー TCE 12、 および該塩基配列中に 1箇所だけ存在する Sac Iサイ 卜の 3' 側に Cla Iサイ 卜と終止コ ドンを導入できるブライマ -TCE 2 ORを合成する。 配列表の配列番号 18および 19にそれぞれ プライマー TC E 12およびプライマー TC E 20 Rの塩基配列を示す。 この 2つのプライマーを用い、 サーモコッカス 'セラーの染色体 DN A を铸型とした P C Rによって增幅される約 0. 9kbの D N A断片を EcoR I、 Cla I (宝酒造社製） で消化した後、 上記プラスミ ド P BTC 5HK Bの EcoR I— Cla Iサイ ト間に挿入することにより得られるプラスミ ド p BTC 6は、 プロテアーゼ TC E S遺伝子の Sac Iサイ 卜に終止コ ドン を含む 69bpの塩基配列が挿入された変異遺伝子を有している。
バチルス .サブチリスの P 43プロモーター由来のリボソーム結合部位 配歹 ij [ジャーナル .ォブ ·バイオロジカル ' ケミストリー （J. Biol. Che m. ) 第 259卷、 第 8619〜 8625頁 （1984) ] をプラスミ ドべ クタ一 pUC 18の Kpnl - BamH Iサイ 卜間に導入したプラスミ ド pU C-P 43を作製する。 該配列の導入に用いられた合成ォリゴヌクレオチ ド B S 1、 および B S 2の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号 20およ び 21に示す。 つぎに、 上記プラスミ ド p BTC 6を BamH I、 Sph I (宝 酒造社製） で消化して得られる、 プロテアーゼ TCE Sの変異遺伝子を含 む約 3kbの DNA断片を、 上記プラスミ ド p U C— P 43の BamH I— S phiサイ ト間に挿入したプラスミ ド pTC 12を構築することができる。 以上のブラスミ ド構築操作はすべて大腸菌を宿主として行うことができ る。
バチルス ·サブチリスへのクローニングに用いられるプラスミ ドべクタ -pUB 18 -P 43に存在する Sac】サイ トをあらかじめ除去しておき、 該プラスミ ドの Κρπ I— Sph Iサイ ト間に上記の p T C 12より得られ る約 3kbの Kpnl - Sph I D N A断片を挿入したプラスミ ド p STC2 をバチルス ·サブチリス DB 104を宿主として作製することができる c 該プラスミ ドにはその 5' 側に P 43プロモータ一およびリボソーム結 合部位配列を持ったプロテアーゼ TC E Sの変異遺伝子を含んでいる。 該プラスミ ド p STC 2を Sac!で消化した後、 分子内ライゲーショ ン を行って得られる組換えプラスミ ドは上記の変異遺伝子の Sac 1サイ ト に含まれている挿入塩基配列が除かれている。 該組換えプラスミ ドはブ ラスミ ド p STC 3と命名され、 該プラスミ ドで形質転換されたバチル ス ·サブチリス DB 104は Bacillus subtilis DB 10— 4ダ p ST C 3と命名、 表示され、 平成 7年 12月 1曰 （原寄託日） よりブタぺス ト条約の下、 曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号の、 工業技術院生 命工学工業技術研究所に受託番号 F ERM B P— 5635として寄託 されている。 該形質転換体を培養し、 培養液上清、 および菌体抽出物に ついてプロテアーゼ活性を調べると、 どちらにも耐熱性のプロテアーゼ 活性が認められる。
図 10に、 ブラスミ ド p STC 3の制限酵素地図を示す。 図中、 太実線 がプラスミ ドベクター p U B 18— P 43への挿入 DN A断片である。 プロテアーゼ PFUL、 プロテアーゼ TCE S、 および サブチリシン のァミノ酸配列を、 図 11および 12に示したように相同性のある'項域が 一致するように並べてみると、 プロテアーゼ P FULにはその C末端側だ けではなく、 相同性がある領域の間にも、 プロテアーゼ TC E S、 および サブチリシンには認められない配列が存在することがわかる。 これより、 ピロコッカス . フリオサスには、 プロテアーゼ P FU Lのほかに、 それよ りも分子量が小さいプロテアーゼ TC E S、 またはサブチリ シンのような プロテアーゼが存在する可能性も考えられる。 このようなプロテア一ゼを コードする遺伝子を探索するために、 プロテアーゼ TCE Sの遺伝子のう ち、 3種のプロテアーゼ間でよく保存されているアミノ酸配列をコ一ドし ている塩基配列を含む断片、 例えば、 上記のプラスミ ド p l F— 2 R (2) に挿入されている約 150 bpの DN A断片をプローブに用い、 ピロコッカ ス · フリオサスより調製した染色体 DN Aをターゲッ トにしてサザンハイ プリダイゼーションを行うことができる。 プローブに用いている DN A断 片はプロテアーゼ PFULの遺伝子とも相同性があるので、 ハイプリダイ ゼーションの条件によってはその遺伝子断片もシグナルとして検出される 力 <、 プロテアーゼ P FUL遺伝子の塩基配列、 および制限酵素地区の情報 から、 染色体 DN Aの切断に用いたそれぞれの制限酵素について該遗伝子 に由来するシグナルの位置を予め知ることができる。 いくつかの制限酵素 を用いた場合にはプロテアーゼ P FUL遺伝子について予想される位置の 他にほぼ同じく らいの強度の別のシグナルが認められ、 ピロコッ ス ' フ リオサスにプロテアーゼ P FUL以外に、 少なくとも、 もう 1つのプロテ ァーゼが存在する可能性が示される。
上記の新規なシグナルに対応する遺伝子を単離するにあたつては、 プロ テアーゼ TCE Sの場合のように発現産物が大腸菌にとって有害、 または 致死的となり、 その結果遺伝子が単離できないということが起こらないよ うに、 まず遺伝子の一部分だけをクローニングする。 例えば、 ピロコッカ ス · フリォサスの染色体 DN Aを制限酵素 Sac Iおよび Spe I (宝酒造社 製） で消化し、 これを用いて上記と同様にプロテアーゼ T C E S遺伝子の 部分断片をプローブとしたサザンハイプリダイゼーションを行うと、 Sac Iだけで切断した場合に得られた、 新規の遺伝子に由来する約 3kbに相当 するシグナルが消失し、 それに代わって約 0. 6 kbの新たなシグナルが生 じていることがわかった。 この約 0. 6kbの Spe I— Sac I断片は最大で も 200残基程度のアミノ酸配列をコードするにすぎず、 活性を有するプ 口テアーゼを発現できるとは考えられない。 Sac Iおよび Spe Iで消化し たピロコッカス ' フリォサス染色体 DN Aをァガロース電気泳動に供し、 約 0. 6kbに相当する DNA断片をゲルより回収する。
つぎに、 該断片をプラスミ ドベクター pBluescriptS K (-) (ストラタ ジーン社製） の Spe I— Sac Iサイ ト間に挿入し、 得られる組換えプラス ミ ドでィ一 · コリ J Ml 09を形質転換する。 この形質転換体より、 上記 のサザンハイプリダイゼーションに使用したものと同じプローブを用いた コロニーハイプリダイゼーショ ンによって目的の断片が組込まれたクロ一 ンを取得することができる。 得られたクローンの保持するプラスミ ドがプ 口テア一ゼをコ一ドする配列を有するかどうかは、 上記の各種プロテア一 ゼに共通のァミノ酸配列をもとに作製されたプライマー 1 F P 1、 1 F P 2、 2RP 1、 および 2 RP 2を用いた P CR (配列表の配列番号 22、 23、 24、 および 25にプライマー 1 FP 1、 1 F P 2、 2RP 1、 お よび 2 R P 2の塩基配列を示す） 、 あるいは該クローンより調製したブラ スミ ドの挿入 DNA断片の塩基配列を調べることによって確認することが できる。 こうしてプロテアーゼ遺伝子の存在が確認されたプラスミ ドはプ ラスミ ド p S S 3と命名されている。 該プラスミ ドの挿入 DN A断片の塩 基配列、 およびそれから推定されるァミ ノ酸配列を配列表の配列番号 26 に不一 9
該プラスミ ド p S S 3に挿入された DN A断片の塩基配列より推定され るアミノ酸配列にはサブチリシン、 プロテアーゼ P FUL、 プロテア一ゼ T C E S等の配列と相同性があることが示される。 こうしてピロコッカス ' フリォサスより新たにその一部が得られた、 プロテア一ゼ P F U L遺伝子 とは異なるプロテアーゼ遺伝子の産物は、 プロテアーゼ P FU Sと命名さ れている。 該プロテアーゼの N末端側をコ一ドする領域、 すなわち、 上記 の S pelサイ 卜の 5' 側の領域、 および C末端側をコードする領域、 すな わち、 上記の Sac Iサイ 卜の 3' 側の遺伝子断片は、 インバース PC R法 によって得ることができる。 あらかじめプロテア一ゼ PFUS遺伝子、 お よびその近傍の染色体中の制限酵素サイ 卜が明らかであれば、 適 ¾な制限 酵素を用いてィンバース P CRを行うことができる。 該制限酵素サイ トは、 ピロコッカス · フリォサスの染色体 DN Aを種々の制限酵素で切断したう え、 上記プラスミ ド p S S 3の挿入 DN A断片をプローブに用いてサザン ハイプリダイゼーションを行うことによって知ることができ、 上 ΪΕ1の Spe Iサイ トの 5' 側約 3kbの位置に Saclサイ ト力 \ また、 Saclサイ トの 3' 側約 5kbの位置に Xbalサイ 卜があることが示される。
ィンバース PC Rに使用するプライマーは、 上記のプラスミ ド！： S S 3 に含まれる Spe I— Sac I断片の末端付近に設定することができる = Sac Iサイ ト付近に設定したプライマ一を NPF— 1、 および NP F— 2、 S pe Iサイ ト付近に設定したプライマーを NPR— 3とし、 その塩基配列を それぞれ配列表の配列番号 27、 28、 および 29に示す。
ピロコッカス .フリオサスの染色体 DNAを Sac I、 あるいは Xba l (宝 酒造社製） でそれぞれ消化した後、 分子内ライゲーシヨンを行い、 この反 応液をィンバース PCRの铸型とすることができる。 染色体 DNAを Sac Iで消化した場合にはィンバース P CRによって約 3kbの断片が增幅され、 これをブラスミ ドベクター p T 7 B 】 u e T (Novagen社製） に挿人して 得られる組換えプラスミ ドはプラスミ ド p S 322と命名されている。 一 a 2
方、 Xb lで消化した染色体 DN 7 Aでは約 9kbの断片が増幅される。 該增 幅断片を Xba Iで消化して得られる約 5 kbの断片を回収し、 これをプラス ミ ドベクター pBluescriptSK (-)に挿入して得られる組換えプラスミ ド はプラスミ ド p SKX5と命名されている。 上記のプラスミ ド p S S 3に 含まれる Spe I - Sac I断片をプローブに用いて行ったサザンハイプリダ ィゼーションの結果、 およびプラスミ ド p S 322と p SKX5を制限酵 素で解析した結果を総合することによって、 プロテアーゼ P FU S遺伝子、 およびその近傍の染色体の制限酵素地図を得ることができる。 該制限酵素 地図を図 13に示す。
また、 プラスミ ド p S 322に挿入されている 5' 側の断片の塩基配列 を Spe Iサイ 卜から 5' 向きに解析し、 その領域にコ一 ドされている酵素 タンパクのアミノ酸配列を推定することができる。 得られた塩基配列、 お よびそれから推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号 30に示す。 こ の領域のアミノ酸配列はサブチリシン等のプロテアーゼの配列と相同性が あることから、 この相同性に基づいてプロテアーゼ PFUSの開始コ ドン を推定することができ、 プロテアーゼ P FU Sの開始コ ドンの直前に Bam H Iサイ 卜が導入できるプライマ一 NPF— 4を設定することができる。 一方、 プラスミ ド p S KX 5に挿入されているプロテア一ゼ P FU S遺伝 子の 3' 側の断片の塩基配列を Xba Iサイ トから 5' 向きに解折すること により決定された塩基配列を配列表の配列番号 31に示す。 該塩基配列に 基づいて Xba Iサイ ト近傍に S phiサイ 卜を導入できるプライマ一 N P R 一 4を設定することができる。 上記のプライマー NPF— 4および N PR 一 4の塩基配列を配列表の配列番号 32および 33に示す。 この 2種のプ ライマ一を用い、 ピロコッカス ' フリォサスの染色体 DN Aを铸型にして プロテア一ゼ P FU S遺伝子の全長を増幅することができる。
プロテア一ゼ PFUSもプロテアーゼ TC E Sと同様に、 枯草菌の系で 発現させることができる。 プロテアーゼ P Fじ Sを発現させるためのブラ スミ ドは、 プロテアーゼ TC E Sの発現プラスミ ド p STC 3をもとにし て構築できる。 まず、 上記の P C Rによって増幅されるプロテア一ゼ P F US遺伝子全長を含む DN A断片を BamH I と Sac Iで消化した後、 酵素 の N末端側をコードする約 0. 8kbの断片を回収する。 そしてこの断片を プラスミ ド p STC 3の、 同じくプロテア一ゼ T C E Sの N末端側をコー ドする BamH I— Sac I断片と置き換える。 得られたプロテアーゼ TCE S遺伝子とプロテア一ゼ P F U S遺伝子とのハイプリ ッ ドタンパクをコ一 ドする発現プラスミ ドはブラスミ ド p S PT 1と命名されている。 図 14 に、 プラスミ ド p S P T 1の制限酵素地図を示す。
つぎに、 上記の P CR増幅 DNA断片を Spe I と Sph Iで消化して得ら れる約 5. 7 kbの断片を単離し、 上記プラスミ ド p S PT l中のプロテア —ゼ TCE Sの C末端側をコ一ドする Spel— Sph I断片と置き換える。 このようにして構築された発現ブラスミ ドはブラスミ ド p S NP 1と命名 され、 また、 該プラスミ ドで形質転換されたバチルス 'サブチリス D B 1 04は Bacillus subtilis DB 104/p SNP lと命名、 表示され、 平成 7年 12月 1日 （原寄託曰） より、 ブタペスト条約の下、 日本国茨城 県つくば巿東 1丁目 1番 3号の、 工業技術院生命工学工業技術研究所に受 託番号 F ERM BP— 5634として寄託されている。 図 15にプラス ミ ド p S N P 1の制限酵素地図を示す。
上記の Bacillus subtilis DB 104/p SNP 1を培養し、 培養液 上清、 および菌体抽出物についてプロテアーゼ活性を調べると、 どちらに も耐熱性のプロテア一ゼ活性が認められる。
プロテア一ゼ P FU Sをコードする遺伝子の塩基配列は、 上記のプラス ミ ド p SNP 1に挿入された DN A断片を制限酵素で適当なサイズに断片 化し、 該断片を適当なクローニングベクターにサブクローニングした後、 これを铸型としたジデォキシ法によって決定することができる。 配列表の 配列番号 34にこうして得られた塩基配列中に存在するオープン · リ一ディ ング · フレームの塩基配列を示す。 また、 配列表の配列番号 35に該塩基 配列から推定されるプロテア一ゼ P F U Sのアミノ酸配列を示す。
さらに、 上記のプラスミ ド p S PT 1で形質転換されたバチルス♦サブ チリス DB 104、 Bacillus subtilis DB 104/p S PT lを培養し た場合も、 培養液上清、 および菌体抽出物の両方にプロテア一ゼ活性が見 い出される。 配列表の配列番号 6に該プラスミ ドの挿入 DN A断片上に存 在する、 プロテアーゼ TC E Sとプロテア一ゼ P FU Sのハイプリ ッ ド . プロテア一ゼをコ一ドするオープン · リ一ディ ング · フレームの塩基配列 - を示す。 また、 配列表の配列番号 5に該塩基配列から推定されるハイブリツ ド · プロテア一ゼのァミノ酸配列を示す。
本発明のプロテアーゼの発現量は、 バチルス ·サブチリスで高発現され る遺伝子、 特に分泌タンパクの遺伝子を利用することによって増加させる ことができる。 このような遺伝子としては 一アミラーゼゃ種々の菌体外 プロテアーゼの遺伝子等が使用でき、 例えばサブチリシンのプロモーター とシグナル配列を利用してプロテアーゼ P F U Sの発現量を増加させるこ とができる。 すなわち、 サブチリシン遺伝子のシグナル配列をコードする 領域の後にプロテアーゼ P F U S遺伝子全長を両遺伝子の翻訳のフレーム がー致するように連結することにより、 サブチリシン遺伝子のプロモータ 一の制御下に融合タンパクとしてプロテアーゼ P FUSを発現させること ができる。
サブチリシンのプロモーターとシグナル配列はジャーナル ·ォブ .バク テリォロジ一 （J.Bacteriol. ) 第 171巻、 第 2657〜 2665頁 （1 989) に記載のプラスミ ド p KWZに挿人されているサブチリシン遺伝 子のものを使用することができる。 該遺伝子の塩基配列は、 プロモーター 配列を含む 5' 上流領域については上記の文献に、 また、 サブチリシンを コードする領域についてはジャーナル ·ォブ 'バクテリォロジ一 （J. Bact eriol. ) 第 158巻、 第 41 1〜 418頁 （ 1984) にそれぞれ記載さ れている。 これらの配列をもとに、 該遺伝子のプロモーター配列上流に E coR Iサイ トを導入するためのプライマー SUB 4と、 サブチリシンのシ グナル配列をコードする領域の後ろに BaraH Iサイ トを導人するためのプ ライマー BmR 1をそれぞれ合成する。 配列表の配列番号 36および 37 にそれぞれプライマー SUB 4、 BmR 1の塩基配列を示す。 プライマ一 SUB 4、 BmR lを用い、 プラスミ ド p KW Zを铸型とした P C Rによ- てサブチリシン遺伝子のプロモータ一〜シグナル配列コード領域を含む約 0. 3kbの DN A断片を增幅することができる。
該 DN A断片の下流に接続されるプロテアーゼ P FU S遺伝子 、 PC R法によってピロコッカス · フリオサスの染色体 DN Aより取得すること ができる。 該遺伝子の 5' 側にハイブリダィズするプライマーとしては上 記のプライマー NPF— 4が使用できる。 また、 3' 側にハイブ11ダイズ するプライマーは、 該遺伝子の終止コ ドン下流の塩基配列を確認したうえ で作製することができる。 すなわち、 上記のプラスミ ド p SNP 1を Bam H Iで消化して生じる約 0. 6 kbの断片をブラスミ ドベクター p U C 1 1 9の BamH Iサイ 卜にサブクローニングして得られるプラスミ ド p SNP Dの塩基配列の一部を決定する （該塩基配列を配列表の配列番号 38に示 す） 。 該配列をもとに、 プロテアーゼ PFUS遺伝子の 3' 側にハイプリ ダイズし、 かつ Sph Iサイ トを導入できるプライマ一 NPM— 1を合成す る。 配列表の配列番号 39にプライマー N PM— 1の配列を示す。
—方、 BamH Iサイ 卜を利用してプロテア一ゼ P F U S遺伝子を上記の 0. 3kbDNA断片に接続する場合には、 該遺伝子中に 1箇所存在する B amH Iサイ 卜が操作の支障となる。 この BamH Iサイ トを P C R—mutage nesis法によって除くためのプライマー mu t RR、 m u t F Rは配列表 の配列番号 34に示されるプロテアーゼ P FU S遺伝子の塩基配列をもと に作製することができる。 プライマー mu t RR、 mu t F Rの塩基配列 をそれぞれ配列表の配列番号 40、 41に示す。 なお、 これらのプライマ 一を用いて B amH Iサイ 卜を除去した場合には、 該サイ 卜に導人される塩 基置換のためにそこにコードされるアミノ酸、 すなわち配列表の配列番号 35に示されるプロテアーゼ P FU Sのアミノ酸配列中、 560番目に存 在するダリシン力くバリ ンに置換される。
これらのプライマ一を使用することにより、 サブチリシン遺伝子のプロ モータ一〜シグナル配列コード領域に接続するためのプロテア一ゼ P F ϋ S遺伝子を得ることができる。 すなわち、 ピロコッカス ·フリォサスの染 色体 DN Αを铸型とし、 プライマー mu t RRと NPF— 4、 およびブラ イマ一 mu t FRと NPM— 1の 2通りのプライマー対と、 铸型としてピ ロコッカス， フリォサスの染色体 DN Aとを使用する 2種類の P C Rを行 う。 さらに、 両 P C Rで增幅された DN A断片を混合して形成されるへテ 口 . デュープレックス （hetero duplex) を铸型とし、 プライマー N P F 一 4および NPM— 1を用いて 2回目の PCRを行う。 こう して、 その内 部に BaniH Iサイ トを含まない約 2. 4 kbのプロテアーゼ P F U S遺 ί云子 全長を増幅することができる。
上記の P C R増幅 DN Α断片を BamH I、 S ph Iで消化して得られる約 2. 4kbの DN A断片を単離し、 上記プラスミ ド p SNP 1中のプロテア ーゼ P FU S遺伝子を含む BamH I— Sph I断片と置き換える。 このよう にして構築された発現プラス ミ ドはプラスミ ド p PS lと命名され、 該プ ラスミ ドで形質転換されたバチルス · サブチリス D B 104は Bacillus s ubtilis DB 104/P P S 1と命名されている。 該形質転換体を培養し た場合、 培養液上清、 および菌体抽出物の両方にプラスミ ド p SNP lを 使用した場合と同様のプロテアーゼ活性が見い出され、 上記のァミ ノ酸置 換が酵素活性に影響を与えていないことが確認される。 図 16に、 プラス ミ ド p P S 1の制限酵素地図を示す。
上記のサブチリ シンのプロモーターからシグナル配列を含む約 0. 3kb の DNA断片を EcoR I、 BaraH Iで消化し、 上記ブラスミ ド p P S 1中 の P 43プロモーターとリポソ一ム結台部位配列を含む EcoR I— BamH I断片と置き換える。 このようにして構築された発現プラスミ ドは pNA PS 1と命名され、 該プラスミ ドで形質転換されたバチルス ' サブチリス D B 104は Bacillus subtilis D B 104 / p N A P S 1と命名されて いる。 該形質転換体を培養し、 培養液上清および菌体抽出物についてプロ テア一ゼ活性を調べると、 どちらにも耐熱性のプロテアーゼ活性が認めら れ、 その発現量は Bacillus subtilis DB 104/ p SNP lに ベて增 加している。 図 17にプラスミ ド p NAP S 1の制限酵素地図を示す。 プロテア一ゼ TC E S遺伝子、 およびプロテアーゼ P F U S遺伝子の場 台と同様の方法により、 これらの遺伝子に相同性を有するプロテアーゼ遺 伝子をピロコッカス ' フ リオサス、 サ一モコッカス ' セラー以外の超好熱 菌より取得することができる。 しかしながら、 上記したオリゴヌ クレオチ ド PRO— 1 F、 PRO— 2 F、 PRO— 2R、 PRO— 4 Rをプライマ 一に用い、 スタフイ ロサ一マス · マリナス （Staphylothermus marinus) D SM3639およびサーモバクテロイデス · プロテオリティカス （Ther raobacteroides proteoliticus) D S 5265の染色体 DN Aを铸型に 用いた P CRでは、 サ一モコッカス ' セラーで見られるような DXA断片 の増幅は見られなかった。
なお、 PCRによる遺伝子増幅の効率はプライマー 3' 末端部分と錶型 DNAとのァニーリ ングの効率に大きく左右されることが知られている。 上記の P CRによって DN Aの增幅が見られない場合でも、 今回用いたも のと塩基配列は異なるが、 同じァミ ノ酸配列をコー ドするオリ ゴヌクレオ チドを合成してプライマ一に用いることにより、 プロテア一ゼ遺伝子を検 出することができる。 あるいは、 上記したオリゴヌク レオチ ドや他の超耐 熱性プロテア一ゼ遺伝子の一部をプローブとし、 染色体 DN Aを用いたサ ザンハイプリダイゼーショ ンを行うことによってもプロテアーゼ遺伝子を 検出することができる。
配列表の配列番号 8に示されたプロテアーゼ P FULのァミ ノ酸配列の 323番目の残基から 650番目の残基までの配列をコー ドする約 lkbの DN A断片を調製し、 これをプローブとしてスタフイ ロサーマス . マリナ ス DSM3639およびサーモバクテロイデス . プロテオリティカス DS M 526 δの染色体 DNAを用いたゲノ ミ ックサザンハイブリダイゼ一シ ンを行うことができる。 その結果、 Pstl (宝酒造社製） で消化したス夕 フイ ロサ一マス . マリナス染色体 DN Aを用いた場合には約 4. 8l:bの位 置に、 また、 Xba Iで消化したサーモバクテロイデス · プロテオリティカ ス染色体 D N Aでは約 3. 5 kbの位置にシグナルが認められる。
これより、 スタフィロザーマス ·マリナスおよびサーモバクテロイデス ' プロテオリティカスの染色体 DN Aにもプロテアーゼ P FUL、 プロテア —ゼ P F US. およびプロテア一ゼ T C E S等の遺伝子と相同性のある配 列が存在することが明らかになった。 こうして検出された DN A断片より、 プロテアーゼ TC E S、 およびプロテアーゼ P FU Sをコ一ドする遺伝子 を単離、 同定したときと同様の方法を用いることによって、 ス夕フイロサ —マス ·マリナスおよびサーモバクテロイデス ·プロテオリティカスに存 在する超耐熱性プロテア一ゼをコ一ドする遺伝子を単離、 同定することが できる。
本発明の超耐熱性プロテア一ゼ遺伝子であるプロテアーゼ T C E S遺伝 子を導入された形質転換体、 Bacillus subtilis DB 104/p STC 3 は通常の条件、 例えば、 10 ig/mlのカナマイシンを含む L B培地中、 3 7 °Cで培養することにより培養液中に超耐熱性プロテアーゼを発現する。 培養終了後、 遠心分離によって集めた培養液上清について硫酸ァンモニゥ ムによる塩析処理、 および透析処理を行って粗精製酵素標品を得ることが できる。 こうして Bacillus subtilis DB 104/p STC 3より得ら れた粗精製酵素標品は TC一 3と命名されている。
同様の操作によってプロテアーゼ P FU S遺伝子を導入された形質転換 体 Bacillus subtilis DB 104Zp SNP l、 およびプロテア一ゼ T C E Sとプロテアーゼ P F ϋ Sとのハイブリッ ドプロテア一ゼをコ一ドす る遺伝子を導入された形質転換体 Bacillus subtilis D B 104/p S P T 1より粗精製酵素標品を得ることができる。 Bacillus subtilis D B 104/p SNP および Bacillus subtilis DB 104/p S PT l より得られた粗精製酵素標品はそれぞれ NP— 1、 PT— 1と命名されて いる。
また、 本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子であるプロテアーゼ P FU S遺伝子を導入された形質転換体、 Bacillus subtilis D B 104 / p N AP S 1も通常の条件、 例えば、 10 g/mlのカナマイシンを含む L B培 地中、 37 °Cで培養することにより菌体内および培養液中に超耐熱性プロ テア一ゼを発現する。 培養終了後、 遠心分離により菌体と培養液上清とを 分け、 そのそれぞれから以下に示す操作によって、 プロテアーゼ P FUS の精製標品を得ることができる。
菌体より酵素を精製する場合には、 まずリゾチ一厶処理によって菌体を 溶菌させ、 さらに熱処理を行った後、 遠心分離によって上清を回収する。 この上清について硫酸ァンモニゥム分画、 続いて疎水クロマトグラフィ一 を行うことで、 精製標品を得ることができる。 こうして Bacillus subtil is DB 104/pNAP S 1より得られた精製酵素標品は N A P S— 1 と命名されている。
また、 培養液上清は透析処理した後、 陰イオン交換クロマトグラフィ一 を行う。 溶出された活性画分を集めて熱処理した後に硫酸アンモニゥム分 画を行い、 さらに疎水クロマトグラフィーを行い、 プロテアーゼ P FUS の精製標品を得ることができる。 該標品は NAP S— 1 Sと命名されてい る。
こうして得られた精製標品 NAP S— 1、 NAP S— 1 Sについて SD S—ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動を行うと、 両酵素標品とも分子量約 45 kDaの単一のバン ドを示す。 これらの 2つの酵素標品は、 ともに精製 操作中の熱処理によりプロ配列が除去されて成熟型 （活性型） 酵素に転換 された、 実質的に同一の酵素標品である。
本発明により得られる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を導人された形質転 換体が生産する超耐熱性プロテアーゼ標品、 例えば、 TC一 3、 NP— 1、 P T— 1、 NA P S - 1および N A P S - 1 Sの酵素化学的および理化学 的性質は、 つぎのとおりである
( 1 ) 作用
本発明で得られる酵素はゼラチンを分解し、 短鎖ポリベプチドを生成す る。 さらに、 カゼインを分解し、 短鎖ポリペプチドを生成する。
また、 本発明で得られる酵素はスクシニルー L—ロイシル一 L一口イシ ノレ一 Lーノくリル一 L—チロシン一 4—メチルクマリ ン一 7—アミ ト （ S u c -L e u-L e u-V a 1 -Ty r -MCA) を加水分解し蛍光物質 （7 一アミノー 4一メチルクマリン） を生成する。
また、 本発明で得られる酵素はスクシニルー L—ァラニルー L一ァラニ ル一 L一プロリル一 Lーフヱ二ルァラニン一 p—二 トロアニリ ド （： S u c - A 1 a - A 1 a-P r o-P h e -p-NA) を加水分解し黄色物質 （ p 一二トロア二リン） を生成する。
(2) 酵素活性測定方法
本発明で得られる酵素標品の酵素活性は合成べプチド基質を使用して測 定することができる。
本発明で得られる酵素標品 TC一 3の酵素活性は、 S u c— L e u— L e u-V a 1 -Ty r -MCA (ぺプチド研究所社製） を基質に月いて測 定される。 すなわち、 酵素活性を検出しょうとする酵素標品を適 に希釈 し、 その試料溶液 20〃1に 62. の S u e— L e u— L e u— V a 1 -T y r一 MC Aを含む 0. 1 Mリ ン酸ナトリゥム緩衝液 （ ]〕 H 7. 0) 80 1を加ぇ、 75 °Cで 30分間保温した。 20 1の30½酢酸を 加えて反応を停止した後、 励起波長 355 nm、 蛍光波長 460 nmでの 蛍光強度を測定して生成した 7—アミ ノー 4—メチルクマリ ン量を定量し、 この値を酵素標品を加えずに保温したものと比較して酵素活性を調べた。 本発明により得られる酵素標品 T C一 3は測定された p H 7. 0、 75°C において S u e— L e u— L e u— V a 1— Ty r—MC A分解活性を有 していた。
また、 本発明で得られる酵素標品 NP— 1、 PT— 1、 NAP S— 1お よび NA P S— 1 Sの酵素活性は、 S u e— A l a - A 1 a— P r o— P h e— p— NA (シグマ社製） を基質に用いて分光光学的に測定される。 すなわち、 酵素活性を検出しょうとする酵素標品を適度に希釈し、 その試 料溶液 50 / 1に S u e— A l a— A l a— P r o— P h e— p— NAを 含む 0. 1Mリン酸カリウム緩衝液 （pH 7. 0) (S u e— A l a— A 1 a— P r o— Ph e— p— NA溶液） 50 1を加え、 95°Cで 30分 間保温した。 氷冷して反応を停止した後、 405 nmにおける吸光度を測 定して生成した P—二トロアニリン量を定量し、 この値を酵素標品を加え ずに保温したものと比較して酵素活性を調べた。 なお、 このとき S u e— A 1 a— A l a - P r o— Ph e— p— NA溶液は、 酵素標品 NP— 1、 および PT— 1については 0. 2πιΜ、 酵素標品 N A P S— 1および N A P S— 1 Sについては ImMの濃度のものを使用した。 本発明により得ら れる酵素標品 NP— 1、 PT— 1、 NAP S— 1および NAP S— I Sは 測定された ρ H 7. 0、 95°Cにおいて S u c - A 1 a— A l a— P r o -P h e- p—N A分解活性を有していた。
(3) 各種基質に対する活性の検出
本発明で得られる酵素標品の合成べプチド基質に対する活性は、 上記の (2) に記載した酵素活性測定方法により確認される。 すなわち、 本発明 により得られる酵素標品 T C— 3は S u c -L e u-L e u-V a 1 -T y r - M C A分解活性を、 また酵素標品 N P— 1、 P T— 1、 NAPS- 1および NAPS— I Sは S u e— A l a - A 1 a— P r o— P h e— p — NA分解活性を、 それぞれ有している。 なお、 酵素標品 NP— 1、 PT — 1、 NAP S— 1および NAP S— 1 Sについて酵素標品 T C— 3に用 いられる上記 （2) に記載の酵素活性測定方法によって S u c— L e u— L e u-V a l -Ty r一] MC A分解活性を調べたところ、 これらの酵素 標品が該基質を分解する活性を有していることが示された。 さらに、 酵素 標品 TC一 3について酵素標品 NP— 1、 PT— 1に用いられる上記 (2) に記載の酵素活性測定方法によって S u c -A l a-A l a-P r o-P h e - p— N A分解活性を調べたところ、 該基質を分解する活性が認めら れた。 また、 本発明で得られる酵素標品のゼラチンに対する活性は、 酵 素によるゼラチンの分解を SDS—ポリアクリルアミ ドゲル上で確認する 方法により検出される。 すなわち、 酵素活性を検出しょうとする酵素標品 を適度に希釈し、 その試料溶液 10 1に 2. 5 1の試料用緩衝液 （50 πιΜ トリス一 HC 1、 H 7. 5、 5 % SDS、 5 % 2—メルカプトェ 夕ノール、 0. 005 % プロモフヱノールブルー、 50% グリセロール） を加えて 100°C、 5分間処理した後、 0. 05%のゼラチンを含む 0. 1 % S D S— 10%ポリアクリルアミ ドゲルを用いて電気泳動した。 泳動 終了後、 ゲルを 5 OmMリン酸カリウム緩衝液 （pH了. 0) 中に浸し、 95°Cで 3時間保温して酵素反応を行い、 ついで、 ゲルを 2. 5%クーマ シ一ブリ リアントブルー R— 250、 25%エタノール、 10%酢酸中で 30分間染色し、 さらに、 25%メタノール、 7%酢酸中にゲルを移し、 3〜15時間かけて余分の色素を除いた。 プロテアーゼによってぺプチド に分解されたゼラチンは酵素反応中にゲル外に拡散し、 ゲルのその部分が クーマシーブリ リアン卜ブルーで染色されなくなることから、 プロテア一 ゼ活性の存在を検出した。 本発明により得られる酵素標品、 TC— 3、 N P— 1、 PT— 1、 N A P S— 1および N A P S— 1 Sは 95°Cにおいて ゼラチン分解活性を有していた。
なお、 プロテアーゼ P FU S遺伝子に由来する酵素標品 NP— 1、 NA P S— 1および N'A P S— 1 Sは上記の活性検出方法においてゲル上のほ ぼ同一の位置にゼラチン分解活性が認められる。 このことから、 これらの 標品においては同様の様式で前駆体酵素から成熟型酵素へのプロセッシン グが起こつていることが示される。
また、 カゼインに対する分解活性は、 0. 05%のカゼインを含む 0. 1%SDS- 10%ポリアクリルアミ ドゲルを用いる以外は上記のゼラチ ンに対する活性の検出に用いられたものと全く同じ方法により、 検出する ことができる。 本発明により得られる酵素標品、 TC一 3、 NP— 1、 P T一 1、 NAP S— 1および NAP S— 1 Sは 95°Cにおいてカゼイン分 解活性を有していた。
また、 本発明により得られる酵素標品、 TC一 3、 NP— 1、 AP S — 1および NAP S— 1 Sのカゼィン分解活性を以下に示す方法によって 測定することができる。 0. 2%カゼインを含む 0. 1Mリン酸カリウム 緩衝液 （pH7. 0) 100 に適度に希釈した酵素標品 100 / lを加 え、 95 °Cで 1時間保温した後、 100 /1の 15%トリクロ口酢酸を加 えて反応を停止した。 この反応液を遠心分離して得られる上清中に含まれ る酸可溶性の短鎖ポリべプチド量を 28 Onraにおける吸光度から測定し、 酵素標品を加えずに保温したものと比較して酵素活性を調べた。 本発明に より得られる酵素標品、 TC— 3、 NP— 1、 NAP S— 1および NAP S— 1 Sは測定された p H 7. 0、 95 °Cにおいてカゼイン分解活性を有 していた。
(4) 至適温度
本発明により得られる酵素標品 TC一 3の至適温度を、 上記の （2) に 示した酵素活性測定方法を使用し、 ただし反応温度を種々の温度に ¾更す ることによって調べた。 図 18に示すように酵素標品 TC一 3は 37〜9 5 °Cで活性を示し、 その至適温度は 70〜80°Cであった。 すなわち、 図 18は本発明で得られる酵素標品 TC一 3の活性と温度との関係を す図 であり、 縦轴は最大活性に対する相対活性 （％) 、 横軸は温度を示す。 また、 本発明で得られる酵素標品 NAP S— 1の至適温度を上記: (2) に示した酵素活性測定方法を使用し、 ただし反応温度を種々の温度に変更 することによって調べた。 図 19に示すように酵素標品 NA P S— 1は測 定条件 pH7. 0において 40〜1 10°Cの間で活性があり、 その至適温 度は 80〜95°Cであった。 すなわち、 図 19は本発明により得られる酵 素標品 NAPS— 1の活性と温度の関係を示す図であり、 縦軸は最大活性 に対する相対活性 （％) 、 横軸は温度を示す。
(5) 至適 pH
本発明により得られる酵素標品、 TC一 3の至適 pHを上記 （2) に示 した酵素活性測定方法により調べた。 すなわち、 S u e— L e u— L e u - V a 1 -Ty r一 M C A溶液を種々の p Hの緩衝液を用いて調製し、 こ れらの溶液を使用して得られる酵素活性の比較を行った。 緩衝液には、 P H3〜6においては酢酸ナトリウム緩衝液、 pH6〜8においてはリン酸 ナトリウム緩衝液、 p H 8〜9においてはホウ酸ナトリウム緩衝液、 P H 10〜 1 1においてはリン酸ナトリゥム一水酸化ナ卜リゥ厶緩衝液を用い た。 図 20に示されるように酵素標品 TC— 3は pH5. 5から 9の間で 活性を示し、 その至適 p Hは p H 7〜8であった。 すなわち、 図 20は本 発明で得られる酵素標品 TC— 3の活性と p Hとの関係を示す図であり、 縦軸は相対活性 （％) 、 横軸は pHを示す。
また、 本発明で得られる酵素標品 NP— 1の至適 pHを上記の （2) に 示した酵素活性測定方法により調べた。 すなわち、 S u e— A l a— A 1 a - P r 0 - P h e— p N A溶液を種々の p Hの緩衝液を用いて調製し、 これらの溶液を使用して得られる酵素活性の比較を行った。 緩衝液には、 pH4〜6においては酢酸ナ卜リウ厶緩衝液、 pH 6〜8においてはリン 酸カリウム緩衝液、 pH8. 5〜 10においてはホウ酸ナトリウム緩衝液、 p H 10. 5においてはリン酸ナトリウム—水酸化ナトリウム緩衝液を用 いた。 図 21に示されるように酵素標品 NP— 1は pH5〜l 0の間で活 性を示し、 その至適 p Hは p H 5. 5〜8であった。 すなわち、 図 21は 本発明で得られる酵素標品 N P一 1の活性と p Hとの関係を示す図であり、 縦軸は相対活性 （％) 、 横軸は pHを示す。
さらに、 本発明で得られる酵素標品 N A P S— 1の至適 p Hを上記の (2)に示した酵素活性測定方法により調べた。 すなわち、 S u c—A l a -A 1 a -P r o-P h e -p N A溶液を種々の p Hの緩衝液を用いて調 製し、 これらの溶液を使用して得られる酵素活性の比較を行った c 緩衝液 には、 p H 4〜6においては酢酸ナトリウム緩衝液、 pH6〜8において はリ ン酸カリウム緩衝液、 pH8. 5〜10においてはホウ酸ナトリウム 緩衝液を用いた。 図 22に示されるように酵素標品 NAP S— 1は pH5 〜 10の間で活性を示し、 その至適 pHは p H6〜8であった。 すなわち- 図 22は本発明で得られる酵素標品 N A P S一 1の活性と p Hとの関係を 示す図であり、 縦軸は相対活性 （％) 、 横軸は pHを示す。
(6) 熱安定性
本発明により得られる酵素標品 TC— 3の熱安定性を調べた。 すなわち. 酵素標品を 20 mM 卜リス一 HC 1、 p H 7. 5中、 80°Cで種々の時間 保温した後、 そのうちの適当量をとつて上記 （2) に示した方法により酵 素活性を測定し、 熱処理を行わなかったものと比較した。 図 23に示され るように本発明により得られる酵素標品、 丁( ー3は80 、 3時間の熱 処理の後も 90%以上の活性を有しており、 上記の熱処理に対して安定で あった。 すなわち、 図 23は本発明で得られる酵素標品 TC一 3の熱安定 性を示す図であり、 縦軸は熱処理後の残存活性 （％) 、 横軸は時間を示す。 また、 本発明により得られる酵素標品 NP— 1の熱安定性を調べた。 す なわち、 酵素標品を 2 OmM トリス一 HC 1、 pH7. 5中、 953Cで種 々の時間保温した後、 そのうちの適当量をとつて上記 （2) に示した方法 で酵素活性を測定し、 熱処理を行わなかったものと比較した。 図 24に示 されるように本発明により得られる酵素標品 NP— 1は 95 °Cで保温した 場合には酵素活性の著し 、増加が観察される。 これは前駆体として生産さ れたプロテア一ゼが熱処理中に自己触媒的な活性化を起こすためと考えら れる。 また、 3時間までの熱処理において活性の低下はまったく認められ なかった。 すなわち、 図 24は本発明で得られる酵素標品 NP— 1の熱安 定性を示す図であり、 縦軸は熱処理後の残存活性 （％) 、 横軸は時間を示 す。
また、 上記の酵素標品、 NP_ 1を熱処理によって活性化したものにつ いて熱安定性を調べた。 すなわち、 酵素標品 NP— 1を 95°Cで 30分間 熱処理して活性化した後、 さらに 95 °Cで種々の時間保温し、 上記同様に 活性を測定して熱処理を行わなかったものと比較した。 同時に緩衝液も種 々の pHのもの （p H 5においては酢酸ナトリウム緩衝液、 pH 7におい てはリン酸カリゥ厶緩衝液、 p H 9においてはホウ酸ナトリゥ厶緩衝液、 p H 11においてはリン酸ナトリゥム一水酸化ナ卜リゥ厶緩衝液、 すべて 2 OmM) を用いた。 図 25に示されるように本発明により得られる活性 化した酵素標品 NP— 1は p H 9の緩衝液中で処理した場合、 8時間の熱 処理の後では 90%以上の活性を、 また 24時間の熱処理の後でもほぼ 5 0 %程度の活性を有しており、 上記の熱処理に対して非常に安定であった c すなわち、 図 25は本発明で得られる酵素標品 NP— 1の熱安定性を示す 図であり、 縦軸は熱処理後の残存活性 （％) 、 横軸は時間を示す。
また、 本発明により得られる酵素標品 NA P S— 1の熱安定性を調べた c すなわち、 酵素標品を 2 OmM トリス— HC し pH7. 5中、 95 で 種々の時間保温した後、 そのうちの適当量をとつて上記 （2) に示した方 法で酵素活性を測定し、 熱処理を行わなかったものと比較した。 図 26に 示されるように本発明により得られる酵素標品 NAP S— 1は 95°C、 3 時間の熱処理の後も 80%以上の活性を有しており、 上記の熱処理に対し て安定であった。 すなわち、 図 26は本発明で得られる酵素標品 NA P S - 1の熱安定性を示す図であり、 縦蚰は熱処理後の残存活性 （％) 、 横軸 は時間を示す。
(7) pH安定性
本発明により得られる酵素標品 NP— 1の p H安定性を以下に示す操作 によって調べた。 95°Cで 30分間熱処理を行うことで活性化した酵素標 品 NP— 1を含む 2 OmMの各種 pHの緩衝液 50 1を 95°Cで 60分間 処理した後、 そのうちの適当量をとつて上記 （2) に示した方法によって 酵素活性を測定し、 処理を行わなかったものと比較した。 緩衝液には、 p H 4〜6においては酢酸ナ卜リゥ厶緩衝液、 p H 6〜8においてはリン酸 カリウム緩衝液、 p H 9〜 10においてはホウ酸ナトリウム緩衝液、 pH 1 1においてはリン酸ナトリゥム一水酸化ナトリゥム緩衝液をそれぞれ用 いた。 図 27に示されるように本発明により得られる酵素標品 NP_ 1は p H 5〜 11の間では 95 °C、 60分間の処理後も 95 %以上の活性を保 持していた。 すなわち、 図 27は本発明により得られる酵素の p H安定性 を示す図であり、 縦軸は残存活性 （％) 、 横軸は pHを示す。
(8) 界面活性剤に対する安定性
本発明により得られる酵素標品 NP— 1の界面活性剤に対する安定性を、 界面活性剤として SD Sを使用して調べた。 95°C、 30分間の熱処理に よって酵素標品 NP— 1を活性化し、 該標品のみを含む溶液、 およびこれ に終濃度 0. 1%ぁるぃは1%の303を添加した溶液50 1ずつを調 製した。 これらの溶液を 95 °Cで種々の時間保温した後、 そのうちの適当 量をとつて上記 （2) に記載の方法で酵素活性を測定し、 処理を行わなか- たものと比較した。 図 28に示されるように本発明により得られる活性化 した酵素標品、 NP— 1は S D Sの有無にかかわらず、 95°C、 8時間の 熱処理の後では 80%以上の活性を、 24時間の熱処理の後でもほぼ 50 %程度の活性を有しており、 SD S存在下においても高い安定性を有して いた。 すなわち、 図 28は本発明により得られる酵素標品 NP— 1の SD Sに対する安定性を示す図であり、 縦軸は残存活性 （％) 、 横軸は時間を 示す。
また、 本発明により得られる酵素標品 NAP S— 1の界面活性剤に対す る安定性を界面活性剤として S D Sを使用して調べた。 酵素標品 N A P S 一 1のみを含む溶液、 およびこれに終濃度 0. 1%あるいは 1%の SD S を添加した溶液 50 1ずつを調製し、 これらの溶液を 95 °Cで種々の時 間保温した後、 そのうちの適当量をとつて上記 （2) に記載の方注で酵素 活性を測定し、 処理を行わなかったものと比較した。 図 29に示されるよ όに本発明により得られる酵素標品、 NA P S— 1は S D Sの有^にかか わらず、 95°C、 3時間の熱処理の後もほぼ 80%程度の活性を有してい た。 すなわち、 図 29は本発明により得られる活性化した酵素標品 NA P S— 1の S D Sに対する安定性を示す図であり、 縦軸は残存活性 （％) 、 横蚰は時間を示す。
上記の結果を比較した場合、 酵素標品 N A P S一 1は酵素標品 NP— 1 に比べて残存活性の低下が著しいことが示される。 しかしながらこの現象 は両標品中に含まれる酵素タンパク自体の S D Sに対する安定性の差とは 考えにくい。 精製酵素標品である N A P S— 1は N P— 1に比べて夾雑タ ンパク量が少なく、 そのために自己消化による不活化が起こりやすいこと が上記の現象の原因と考えられる 4 5。
(9) 有機溶剤に対する安定性
本発明により得られる酵素標品 NAP S - 1の有機溶剤に対する安定性 をァセ卜二トリルを使用して調べた。 終濃度 25%、 あるいは 50%のァ セトニトリルを含む酵素標品 NAP S— 1溶液 50 1を 95てで種々の 時間保温した後、 そのうちの適当量をとつて上記 （2) に記載の方法で活 性を測定し、 処理を行わなかったものと比較した。 図 30に示されるよう に本発明により得られる酵素標品 NAP S— 1は 50%ァセ卜二ト リルの 存在下、 95て、 1時間の処理の後も処理前の 80%以上の沄性を有して いた。 すなわち、 図 30は本発明により得られる酵素標品 NAP S_ 1の ァセトニト リルに対する安定性を示す図であり、 縱蚰は残存活性、 横軸は 時間を示す。
( 10) 変性剤に対する安定性
本発明により得られる酵素標品 N A P S一 1の各種変性剤に対する安定 性を尿素、 グァニジン塩酸塩を使用して調べた。 終濃度 3. 2M、 6. 4 Mの尿素、 あるいは終濃度 1M、 3. 2M、 6. 4 Mのグァニジン塩酸塩 を含む酵素標品 NA P S— 1溶液 50 1を調製した。 これらの溶液を 9 5 °Cで種々の時間保温した後、 そのうちの適当量をとつて上記 （ 2) に記 載の方法で活性を測定し、 処理を行わなかったものと比較した。 図 31に 示されるように本発明により得られる酵素標品、 N A P S— 1は尿素に対 しては耐性を示し、 終濃度 6. 4Mの尿素の存在下、 95°C、 1時間処理 後も処理前の 70%以上の活性を有していた。 すなわち、 図 31は尿素に 対する安定性を、 また図 32はグァニジン塩酸塩に対する安定性を示す図 であり、 それぞれ縦轴は残存活性、 横軸は時間を示す。
(11) 各種試薬の影響
本発明により得られる酵素標品 T C E S、 および N A P S一 1について、 プロテアーゼ阻害剤として知られている各種の試薬の影響を調べた。 すな わち、 上記の酵素標品を終濃度 ΙπιΜの各種試薬の存在下、 37 、 30 分間処理した後、 その一部をとつてそれぞれ上記 （2) に記載の方法で酵 素活性を測定し、 試薬を加えなかった場台 （対照） の活性と比 した。 結 果を表 1に示す。
表 1 試薬 TC E S N A P S - 1 対照 100% 100%
EDTA 103. 5% 36. 1%
PMS F 8. 1% 0. 1% アンチパイン 19. 0% 81. 9% キモス夕チン 0% 6. 6%
□ 104. 5% 89. 3% ぺプスタチン 105. 2% 100. 1%
N—ェチルマレイ ミ ド 82. 6% 102. 6% 表 1に示されるように、 PMS F (フヱニルメタンスルフォニルフルォ ライ ド） 、 およびキモス夕チンで処理した場合には両酵素標品ともその活 性が著しく低下した。 また、 アンチパイン処理では TC E Sに、 EDTA 処理では 1\' A P S - 1にそれぞれ活性の低下が認められた。 それ以外の試 薬では大きな活性の低下は見られなかった。
(12) 分子量
本発明により得られる酵素標品 N A P S— 1の分子量を 0. 1 % S D S 一 10%ポリアクリルァミ ドゲルを用いた SD S— PAGEにより測定し た。 酵素標品 NAP S— 1は S D S— PAGE上で約 45kDaの分子量を 示した。 また、 酵素標品 NA P S— 1 Sも酵素標品 N A P S一 1と同一の 分子量を示した。
(13) N末端ァミノ酸配列
本発明により得られる酵素標品 N A P S— 1を用いてプロテア一ゼ P F USの成熟型酵素の N末端アミ ノ酸配列を決定した。 0. 1%SDS— 1 0%ポリアクリルァミ ドゲル上で電気泳動した酵素標品 N A P S— 1を P VDF膜に転写した後、 膜上の酵素タンパクの N末端ァミノ酸配列をプロ ティンシーケンサーを用いた自動ェドマン法により決定した。 こう して決 定されたプロテア一ゼ P FU Sの成熟型酵素の N末端ァミノ酸配列を配列 表の配列番号 42に示す。 該配列は配列表の配列番号 35に示されたプロ テア一ゼ PFUSのアミノ酸配列の 133番目〜 144番目の配列に一致 しており、 成熟型のプロテア一ゼ P F U Sはこの部分以降のポリべプチド からなる酵素であることが示された。 こうして明らかとなったプロテア一 ゼ P FU Sの成熟型酵素のァミノ酸配列を配列表の配列番号 3に示す。 な お、 上記のように、 該配列中、 428番目のアミノ酸 （配列表の配列番号 35に示されたァミ ノ酸配列では 560番目のアミノ酸にあたる） はグリ シン、 バリンのどちらであってもプロテアーゼ P F USの酵素活性には影 響ない。 さらに、 配列表の配列番号 34に示されたプロテアーセ P U F S 遺伝子の塩基配列のうち、 上記の成熟型酵素をコードする領域の塩基配列 を配列表の配列番号 4に示す。 該配列中 1283番目の塩基はグァニン、 チミンのどちらであってもかまわない。
P C Rによるイン♦ ビトロの遺伝子増幅では伸長反応中に間違った塩基 の取り込みが起こり、 得られた DN Aの配列に塩基置換が生じることがあ る。 この頻度は P C Rに用いる酵素の種類、 反応液の組成、 反応条件、 增 幅する DN Aの塩基配列などによって大きく左右されるが、 通常行われる ような、 単純にある遺伝子の領域を増幅するという場合には、 その頻度は 多くても 4 0 0塩基中に 1塩基程度である。 本発明において、 プロテア一 ゼ T C E Sやプロテア一ゼ P F U Sの遺伝子の単離やその発現プラスミ ド の構築のために P C Rを用いたが、 得られた遺伝子の塩基配列中に塩基置 換が起こっていたとしてもその数は数塩基程度であり、 翻訳コ ドンの縮重 のために遺伝子上の塩基置換が必ずしも発現蛋白のァミノ酸の置換に結び つかないことを考慮に入れると、 生じうるアミノ酸置換の数は全残基中多 くても、 2〜3個と見積もることができる。 本発明で開示されるプロテア ーゼ T C E Sやプロテア一ゼ P F U Sの遺伝子の塩基配列およびァミノ酸 配列が天然のものと異なる可能性は否定できないが、 本発明の目的は、 高 温下で高い活性を有する超耐熱性プロテアーゼおよびそれをコードする遺 伝子を開示するところにあり、 これは天然のものと同一の酵素、 およびそ れをコードする遺伝子に限定されるものではない。 そして、 上記のように 塩基置換が含まれる可能性のある遺伝子であっても、 それが十分厳密な条 件で天然の遺伝子とハイプリダイズしうることは、 当業者には自明のこと である。
さらに、 本明細書には、 （1 ) 超好熱菌の染色体 D N Aより発現クロー ニングのためのライブラリ一を作製し、 プロテア一ゼ活性の発現をスクリ 一二ングする、 （2 ) アミノ酸配列の相同性に基づいてハイブリダィゼー ションまたは P C Rにより超耐熱性プロテアーゼの活性を発現する可能性 のある遺伝子を単離し、 これらの遺伝子の発現産物の酵素作用、 すなわち- 超耐熱性プロテアーゼの活性を適当な微生物を宿主に用いて確認する、 と いう目的の遺伝子の取得方法が明確に開示されてある。 したがって公知の 変異導入方法を用いて本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子に種々の変異 を導入した後、 変異を導入された遺伝子配列が超耐熱性プロテア一ゼをコ -ドしうるかどうかは上記の方法を用いることによって容易に知ることが できる。 導入する変異の種類は、 変異導入の結果得られた遺伝子配列が本 発明の超耐熱性プロテアーゼと実質上同等の超耐熱性プ口テア一ゼ活性を 発現するものであれば特に限定はないが、 発現タンパクがプロテアーゼ活 性を保持するためにはセリ ンプロテア一ゼに共通して保存されている 4力 所の領域以外に導入されることが望ましい。
変異は、 超耐熱性プロテア一ゼをコ一ドする遺伝子の任意の領域にラン ダムに導入することができ （random mutagenesis) 、 また、 予め定めてお いた特定の位置に望み通りの変異を導入することもできる （部位持異的変 異導入、 site- directed rautagenesis)。 ランダムに変異を導入する 法と しては、 例えば、 DN Aを化学的に処理する方法があり、 この場合にはま ず変異を導入したい領域が部分的に一本鎖となっているプラスミ ドを作製 し、 この一本鎖部分に亜硫酸水素ナトリウムを作用させることによって塩 基のシ トシンをゥラシルに変換し C ： G→T ： Aの 卜ランジショ ン変異を 導入する。 また、 一本鎖とした部分を [ひ — S] d NT P存在下で 2本鎖 に修復する過程で塩基置換を生じさせる方法も知られている。 これらの方 法の詳細は、 プロシーディ ングス♦ォブ 'ザ ' ナショナル 'アカデミー ' ォブ .サイエンス ·ォブ .ザ . USA (Pro Natl. Acad. Sci. USA) 第 79巻、 第 1408〜 1412頁 （1982) 、 およびジーン （Gene) 第 64巻、 第 313~319頁 （1988) に記載されている。
ランダムな変異は、 ヌクレオチド取込みの忠実度が低くなるような条件 下で P CRを行うことによつても導入することができる。 特に反応系にマ ンガンを加えると有効であり、 この方法の詳細はアナリティカル · バイオ ケミストリー （Anal. Biochem. ) 第 224巻、 第 347〜 353頁 （19 95) に詳記されている。 部位特異的変異導入を行う方法としては、 例え ば、 目的の遺伝子を一本鎖化し、 この一本鎖部分に導入したい変異に応じ てデザィンしたプライマーを合成してァニ一ルさせた後、 これを変異を導 入した方のストランドのみが選択的に複製されるィン · ビボの系に導入す る系を利用する方法がある。 この方法の詳細はメソッズ · イン 'ェンザィ モロジ一 （Methods in Enzyraology) 、 第 154巻、 第 367頁 〔198 7) に記載されており、 例えば、 宝酒造社製の変異導入キッ 卜、 ミュー夕 ン Kを用いることができる。 部位特異的変異導入も、 P CRを利用して行 うことができ、 その方法の詳細は、 エーリ ツヒ編、 ストック トン社発行、 PCRテクノロジー （PCR Technology) 第 61〜 70頁 （1989) に記 載されており、 また 例えば、 宝酒造社製の L A— P C Rイ ン ビ卜ロ ミュー夕ジエネシスキッ トを用いることができる。 そして上記の方法を用 いることによって、 置換、 欠失、 挿入の変異を導入することができる。 このようにして本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子をベースにして変 異を導入することにより、 本発明の超耐熱性プロテアーゼと同様の耐熱性 や至適温度を有するが、 たとえば至適 p H等の性質が少し異なつているよ うな酵素を宿主に生産させることも可能である。 この場合、 もとになる超 耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列は必ずしも 1つの超耐熱性プロテア ーゼに由来する配列だけに限定する必要はない。 本発明で開示したような 配列に相同性がある 2つ、 またはそれ以上の超耐熱性プロテアーゼの遺伝 子を相同性のある領域でつなぎかえてハイプリ ッ ド遺伝子を作成し、 該遺 £子がコードするハイプリ ッ ド酵素を宿主に生産させることができる。 ハ イブリ ッ ド遺伝子の場合にも 遺伝子の発現産物の酵素作用、 すなわちプ 口テアーゼ活性をテス卜することによって超耐熱性プロテアーゼ遺伝子で あるかどうかを知ることができる。 例えば、 上記のプラスミ ド p S PT l を用いれば、 N末端側がプロテアーゼ PFUSに由来し、 C末端側がプロ テアーゼ T C E Sに由来するハイプリ ッ ド *プロテア一ゼを枯草南に生産 させることができ、 このハイプリ ッ ド ·プロテア一ゼは 9 5 °Cでプロテア —ゼ活性を有している。
ハイブリ ツ ド酵素には、 そのもとになつている 2つまたはそれ以上の酵 素の特性を合わせ持つことが期待できる。 例えば、 本発明で開示されるプ 口テアーゼ T C E Sとプロテアーゼ P F U Sを比較すると、 細胞外への分 泌効率に関してはプロテア一ゼ T C E Sがすぐれ、 耐熱性に関してはプロ テアーゼ P F U Sがすぐれている。 細胞外への分泌の効率には蛋白質の N 末端にあるシグナル配列が大きく影響を与えるので、 p S P T 1の場合と は逆に N末端側がプロテアーゼ T C E Sに由来し、 C末端側がプロテア一 ゼ P F U Sに由来する蛋白質ができるように発現プラスミ ドを構築すれば、 プロテアーゼ P F U Sと同等の耐熱性を有する超耐熱性プロテア一ゼをプ 口テアーゼ T C E Sと同等の分泌効率で枯草菌を用いて分泌生産すること ができる。 また、 シグナル配列は酵素蛋白質が細胞外へ分泌されるときに 本体の酵素と切り離されてしまうので、 酵素そのものの性質に関してはさ ほど重要ではない。 したがって、 常温菌を用いて超耐熱性プロテア一ゼを 生産させる場合には、 そのシグナル配列は必ずしも超耐熱菌由来である必 要はなく、 目的の蛋白質が高い効率で細胞外に分泌されるものであれば常 温菌由来のものでも問題はない。
特に、 使用する宿主で高発現されている分泌夕ンパクのシグナルぺプチ ドを用いた場合に高い分泌効率が期待される。
上記のハイプリ ッ ド遺伝子を作製するにあたって、 そのつなきかえは必 ずしも部位特異的に行う必要はない。 例えば、 ハイプリ ッ ド遺伝:子の作製 の材料となる 2つ、 またはそれ以上の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の D N Aを混台した後、 これらを D N A分解酵素で断片化し、 イン ' ビトロの 系でこれらの断片を DN Aポリメラ一ゼを用いて再構成することによって もハイブリツ ド遺伝子を作製する二とができる。 この方法の詳細はプロシ —ディ ングス .ォブ .ザ .ナショナル ·アカデミー ·ォブ .サイエンス ' ォブ ·ザ · USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 第 91卷、 第 1074 7〜 10751頁 （1994) に記載されている。 この場合にも、 得られ たハイプリッ ド遺伝子の中から上記同様にその発現蛋白質の超耐熱性プロ テアーゼ活性を調べることによって超耐熱性プロテア一ゼをコ一ドする遺 伝子の配列を単離、 同定することができる。 また、 このようにして得られ た遺伝子の配列にはセリンプロテア一ゼに共通の 4力所の領域をコ一ドす る配列が保存されていることが期待される。
したがって、 得られたハイプリッ ド遺伝子も、 適切なハイブリダィゼー シヨ ンの条件を設定することによって、 例えば、 配列表の配列番号 9、 1 0、 11および 12に表される塩基配列を有するオリゴヌク レオチド PR 0— 1 F、 PRO— 2 F、 P RO— 2 Rおよび PRO— 4 Rから選択され る DN Aにハイブリダィズ可能であることは、 当業者には自明である。 ま た、 上記の変異導入によって得ることができる新規の超耐熱性プロテア一 ゼ遺伝子は、 適切なハイプリダイゼーションの条件を設定することによつ て配列番号 9、 10、 11、 および 12に表される塩基配列から選択され る DN A配列を含有する遺伝子、 たとえばプロテアーゼ P Fじ L遺伝子と ハイプリダイズしうることも明らかである。
本明細書においては、 耐熱性プロテアーゼ遺伝子を得ることに焦点をあ てて記載しているが、 本発明の超耐熱性プロテア一ゼ遺伝子と配列に相同 性があるが超耐熱性ではないプロテアーゼ遺伝子、 例えば、 サブチリシン の遺伝子とのハイプリッ ド遺伝子を作製することによってサブチリシンの 耐熱性を向上させ、 サブチリシンが本来持っている特性と高い耐熱性とを 兼ね備えた新規なプロテアーゼをコ一ドする遺伝子を作製することも可能 である。
本発明では、 遺伝子がコ一ドする蛋白質の有するプロテアーゼ活性の検 出、 および酵素標品の生産のために遺伝子を導入する宿主として大腸菌ま たは枯草菌を用いたが、 形質転換の方法が確立されているものであれば遺 伝子を導入する宿主に特に限定はなく、 例えば、 バチルス 'ブレビス （Ba cillus brevis) 、 乳酸菌、 酵母、 糸状菌、 動物細胞、 植物細胞、 昆虫等 を用いることができる。 ここでは、 発現された蛋白質が活性型になるよう にポリペプチドがうまくフォールデイングし、 しかも、 それが宿主に対し て有害、 または 致死的にならないことが重要である。 また、 ここであげ た宿主の中でも、 特に その発現産物を培地中に分泌させることが知られ、 容易、 かつ低コス卜で培養できるバチルス · ブレビス、 乳酸菌および糸状 菌等は、 枯草菌に加えて目的のプロテアーゼを工業レベルで大量に生産す るための宿主として用いることができる。 実施例
以下に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれ らに限定されるものではない。
実施例 1
( 1 ) 超耐熱性プロテアーゼ遺伝子検出用ォリゴヌクレオチドの作製 配列表の配列番号 8に示したプロテア—ゼ P F U Lのァミノ酸配列と、 既知の微生物由来アル力リ性セリ ンプロテア一ゼのァミノ酸配列との比較 から、 これらに共通して存在する相同アミノ酸配列が明らかとなった。 こ のうち 3つの領域を選び、 P C Rによる超耐熱性プロテア一ゼ遣伝子の検 出にプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計を行った。 図 2、 3および 4に上記の 3つの領域にあたるプロテアーゼ P FU Lの 了ミ ノ酸配列、 その部分をコードするプロテア一ゼ P FUL遺伝子の塩基 配列、 およびそれをもとに合成したオリゴヌクレオチド P RO— 1 F、 P
RO— 2 F、 PRO- 2 Rおよび P RO— 4 Rの塩基配列の関係を示す。 また、 配列表の配列番号 9、 10、 1 1および 12にオリゴヌクレオチド PRO— 1 F、 PRO— 2 F、 P R 0— 2 Rおよび P R 0— 4 Rの塩基配 列を示す。
(2) サーモコッカス ·セラーの染色体 DNAの調製
ドィ ツチヱ 'ザムルンク ' フォン ' ミ ク口オルガニスメ ン · ゥン ト ' ッ . ルクルチユウレン GmbHより入手したサーモコッカス ' セラー D SM2 476培養液 1 Omlより遠心分離にて菌体を集め、 25%スクロースを含 む 50raM 卜 リス一 HC ] (p H 8. 0) 100 / 1に懸濁した。 この懸 濁液に 20 1の 0. 5M EDTA、 10 1のリゾチーム （l OmgZml) を加えて 20 °C、 1時間保温した後、 800 1の S E T溶液 （ 150 mM N a C ImM EDTA、 2 OmM ト リス— HC 1、 H 8. 0) 、 50 1の 10%SDS、 10〃1のプロティナ一ゼ K ( 2 Omg ml) を加 え、 さらに 37°C、 1時間保温した。 フヱノ一ルークロロホルム抽出を行. て反応を停止した後、 ェタノール沈殿を行って回収した DNAを 50 1 の T E緩衝液 （10 mM トリスー HC 1、 p H 8. 0、 lmM EDTA) に溶かして染色体 DNA溶液とした。
(3) PCRによる超耐熱性プロテア一ゼ遺伝子の検出
上記のサ一モコッカス ·セラーの染色体 DN Aとォリゴヌクレオチド P RO— 1 Fおよび P RO— 2 R、 あるいは、 P R 0— 2 Fおよび P R 0— 4 Rを含む P C R反応液を調製し、 94°C、 1分〜 55°C、 1分〜 72° 1分を 1サイクルとした 35サイクルの反応を行った。 この反応液の一部 を用いてァガロースゲル電気泳動を行うと、 オリゴヌクレオチド P R 0— 1 Fおよび PRO— 2 Rを用いたもので 3種類、 オリゴヌクレオチド PR 0— 2 Fおよび P RO— 4 Rを用いたもので 1種類の DN A断片の增幅が 認められた。 これらの増幅断片をァガロースゲルより回収し、 DMAブラ ンティ ングキッ ト （宝酒造社製） を用いて DNAの末端を平滑化した後、 さらに、 T 4ポリヌクレオチドキナーゼ （宝酒造社製） を用いて末端をリ ン酸化した。 ついで、 プラスミ ドベクタ一 pUC 19 (宝酒造社製） を H incil (宝酒造社製） で消化し、 アルカリホスファターゼ （宝酒造社製） 処理して末端を脱リ ン酸化した後、 上記の PC R増幅 DN A断片と混合し てライゲ一ションを行い、 ィー ' コリ JM109に導入した。 得られた形 質転換体よりプラスミ ドを調製し、 適当な大きさの DN A断片が挿入され ているものを選んでジデォキン法により挿入断片の塩基配列を決定した。 これらのプラスミ ドのうち、 オリゴヌクレオチド PRO— 1 Fおよび P RO- 2 Rを用いて増幅された約 150 bpの DN A断片を含むプラスミ ド 1 F- 2 R (2) 、 およびオリゴヌクレオチド P R 0— 2 Fおよび P R 0— 4 Rを用いて増幅された約 550 bpの DN A断片を含むブラスミ ド p 2 F— 4 Rについて得られた塩基配列より推定されるァミノ酸配列にはプ 口テアーゼ PFUL、 およびサブチリ シン等のァミノ酸配列と相司性のあ る配列が含まれていた。 配列表の配列番号 13にプラスミ ド p 1 F— 2R
(2) の挿入 DN A断片の塩基配列とそれから推定されるァミ ノ较配列を、 また、 配列表の配列番号 14にブラスミ ド p 2 F— 4 Rの挿入 DN A断片 の塩基配列とそれから推定されるァミノ酸配列をそれぞれ示す。 配列表の 配列番号 13に示された塩基配列のうち 1番目から 21番目にかけてと、
113番目から 145番目にかけての配列、 および配列表の配列番号 14 に示された塩基配列のうち 1番目から 32番目にかけてと、 532番目か ら 564番目にかけての配列は、 PCRにプライマ一として用いられたォ リゴヌ ク レオチ ド （それぞれォリゴヌク レオチ ド PR0— 1 F、 PRO— 2R、 PRO— 2 Fおよび PRO— 4 Rに相当する） 由来の配列である。 図 5にプラスミ ド p 2 F— 4 Rの制限酵素地図を示す。
(4) サーモコッカス · セラー由来プロテアーゼ遺伝子のスク リーニン グ
上記のサーモコッカス · セラーの染色体 DN Aを制限酵素 Sau 3 A I (宝 酒造社製） で部分消化し、 dATP、 d GTP存在下でク レノウ · フラグ メ ン ト （宝酒造社製） を作用させて DNA末端を部分修復した。 この DN A断片をラムダ GEM— 1 1 Xho I ハーフサイ 卜アームべクタ一 （プロ メガ社製） と混台してライゲ一シヨ ンを行った後、 ガイガーパックゴール ド （ス トラタジーン社製） を用いたィン · ビトロ 'パッケージングを行い、 サーモコッカス ' セラ一の染色体 DN A断片を含むラムダファージライブ ラ リ一を作製した。 このライブラリ一の一部をィ一 ' コリ L E 392 (プ 口メガ社製） に形質導入してプレー ト上にプラークを形成させた後、 ブラ ークをハイボン ドー N +メ ンブレン （アマンャム社製） 上に 卜ランスファ 一した。 トランスファー後のメ ンブレンを 1. 5M N a C lを含む0. 5 N N a 0 H , ついで、 3M N a C 1を含む 0. 5M ト リスー H C 1 (pH7. 5) で処理し、 さらに 6 X S S Cで洗浄後、 風乾し、 UVトラ ンスイルミネーター上で紫外線照射してファージ DN Aをメ ンブレンに固 定した。
一方、 プラスミ ド p 2 F— 4 Rを PmaC Iおよび Stu I (ともに宝酒造 社製） で消化後、 1 %ァガロースゲル電気泳動を行い、 分離された約 0. 5kbの DNA断片を回収した。 該断片を铸型とし、 ランダムプライマー D NAラベリ ングキッ ト Ver.2 (宝酒造社製） および [ 一32 P ] d C T
- α I - P (アマシャム社製） を用いて32 P—標識された DNAプローブを作製し た。
上記の DN Aを固定したメンブレンをハイブリダイゼーション緩衝液 ( 0. 5 % S D S、 0. 1 % B S A、 0. 1 % ポリ ビニルビ [] リ ドン、 0. 1 % フイ コール 400、 0. 01 % 変性サケ精子 DN Aを含む 6 X S S C) 中、 50°Cで 2時間処理した後、 32 P—標識した DN Aプローブ を含む同緩衝液に移し、 50°Cで 15時間ハイプリダイゼーションを行つ た。 ハイブリダィゼーシヨン終了後、 メンブレンを 0. 5 %SDSを含 む 2 X S S C中、 室温で洗浄し、 ついで 0. 5% S D Sを含む： - X S S Cを用いて 50°Cで洗浄した。 さらにメンプレンを 1 X S S Cですすいだ 後に風乾し、 X線フィルムを当てて一 80°Cで 6時間露光し、 オートラジ ォグラムを作製した。 約 3000個のファージクローンをスク リーニング した結果、 プロテアーゼ遺伝子を含む 1つのファージクローンを得た。 ォ -トラジオグラム上のシグナルの位置からこのファージクローンの位置を 調べ、 メンブレンへのトランスファーに用いられたプレー卜上の対応する プラークを 1%のクロ口ホルムを含む lralの SM緩衝液 （50mM トリス — HC 1、 H 7. 5、 1 M N a C 8mM Mg S 04 0. 01% ゼラチン） 中に単離した。
(5 ) サーモコッカス ·セラー由来プロテアーゼ遺伝子を含むファージ DN A断片の検出
上記のファージクローンを用いて形質導入されたィ一 ' コリ L E 392 を NZC YM培地 （Biol 01社製） 中、 37てで15時間培養して得ら れる培養液より上清を集め、 キアゲン一ラムダキッ ト （Q I AGEN社製） を用いてファージ DN Aを調製した。 得られたファージ DNAを BamH I、 EcoR I、 EcoRV、 Hindi, Kpn I、 Nco I、 Pst l、 S ac Sal I、 S ma Iおよび S phi (以上、 宝酒造社製） でそれぞれ消化し、 1 %ァ ガロースゲル電気泳動を行った。 続いてマニアテイス （T. Maniatis) ら 編集、 コールド ·スプリ ング · ハーバー ' ラボラ トリ一発行のモレキユラ 一' クロ一二ンク ： ァ ' ラボラ トリー 'マニュァノレ (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual) 第 2版 （ 1986) に記載のサザントラ ンスフ ァ 一法によって泳動後のゲルからハイボンドー N +メンブレン上に DN Aを トランスファーした。
得られたメンブレンをハイプリダイゼーション緩衝液中、 50°Cで 4時 間処理した後、 上記の実施例 1一 （4) で使用した32 P—標識した DNA プローブを含む同緩衝液に移し、 50°Cで 18時間ハイプリダイゼーショ ンを行った。 ハイブリダィゼーシヨン終了後、 メンブレンを 0. 5% S D Sを含む 1 X S S C中、 50°Cで洗浄し、 ついで 1 X S S Cですすいだ 後に風乾した。 メンブレンに X線フィルムを当てて一 80°Cで 2時間露光 し、 オートラジオグラムを作製した。 このオートラジオグラムより、 Kpn Iで消化したファージ D Ν Αでは約 9 kbの D Ν Α断片にプロテア一ゼ遺伝 子が含まれていることが示された。
つぎに、 上記のプロテアーゼ遺伝子を含むファージ DNAを Kpn Iで消 化した後、 さらに BamH I、 Pst l、 および S ph Iでそれぞれ消化し、 1 %ァガロースゲル電気泳動を行った。 上記同様の操作によりサザンハイブ リダイゼーションを行い、 約 5kbの Kpn I一 BamH I断片にプロテアーゼ 遺伝子が含まれていることが示された。
(6) サーモコッカス ·セラー由来プロテア一ゼ遺伝子を含む DN A断 片のクローニング
上記のプロテア一ゼ遺伝子を含むファージ DNAを Kpn Iおよび BamH Iで消化して 1 %ァガロースゲル電気泳動を行い、 分離された約 5kbの D N A断片をゲルより回収した。 ついでプラスミ ドベクタ一 pUC 1 19 (宝 酒造社製） を Kpn Iおよび BaraH Iで消化し、 上記の約 5 kbの D N A断片 と混合してライゲーションを行い、 ィ一 · コリ JM109に導入した。 得 られた形質転換体よりプラスミ ドを調製し、 上記の約 5kbの A断片が 含まれているものを選んでこれをプラスミ ド p T C 3と命名した。
図 6にプラスミ ド pTC 3の制限酵素地図を示す。
(7) サーモコッカス ·セラ一由来プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミ ド PTC S 6の調製
上記プラスミ ド pTC 3を Saclで消化後、 1%ァガロースゲルを用い て電気泳動し、 実施例 1一 （5) に記載のプロテアーゼ遺伝子を含むファ ージ DNA断片の検出と同じ操作により、 サザンハイプリダイゼ一ション を行った。 得られたオートラジオグラム上のシグナルより、 プラスミ ド P TC 3を Sac Iで消化して得られる約 1. 9^の0^八断片に超耐熱性プ 口テア一ゼ遺伝子が含まれていることが示された。
そこで、 プラスミ ド p T C 3を Sac Iで消化した後、 1%ァガロース電 気泳動を行い、 約 1. 9kbのDNA断片を単離した。 ついで、 プラスミ ド ベクターを PUC 118 (宝酒造社製） を Sac Iで消化し、 ァ 力リホス ファターゼを用いて脱リン酸化した後、 上記の約 1. 9kb断片と混合して ライゲ一ションを行い、 ィー · コリ J M109に導入した。 得られた形質 転換体よりプラスミ ドを調製し、 上記の約 1. 9kb断片 1分子 Oみが含ま れているものを選んで、 これをプラスミ ド pTC S 6と命名した。
図 7にプラスミ ド pTC S 6の制限酵素地図を示す。
(8) プラスミ ド pTC S 6に含まれるサーモコッカス ' セラー由来 D N A断片の塩基配列の決定
上記プラスミ ド p T C S 6に挿入されたサーモコッカス 'セラー由来プ 口テア一ゼ遺伝子の塩基配列を決定するために、 キローシークェンス用デ レーシヨ ンキッ 卜 （宝酒造社製） を用いて、 該プラスミ ドの挿入 DN A断 片部分を種々の長さに欠失させたデレーンヨンミュータン卜を作製した。 これらのうち、 適当な長さの欠失が起こったものをいくつか選び、 ジデォ キン法によりそれぞれの挿入 DN A断片部分の塩基配列を解読したうえ、 これらの結果を総合してプラスミ ド pTC S 6に含まれる挿入 DNA断片 の塩基配列を決定した。 配列表の配列番号 15に得られた塩基配列を示す。
(9) カセッ トおよびカセッ トプライマ一を用いた P CRによるサ一モ コッカス 'セラー由来プロテアーゼ遺伝子の 5' 上流領域のクローニング サーモコッカス 'セラ一由来プロテアーゼ遺伝子の 5' 上流領域は L A ？ 尺ィン， ビトロ クローニングキッ 卜 （宝酒造社製） を使用して得 た。
配列表の配列番号 15に示されたプラスミ ド pTC S 6に含まれる挿入 DN A断片の塩基配列をもとにカセッ ト P CRに使用するプライマー T C E 6 Rを合成した。 配列表の配列番号 16にプライマー TCE 6Rの塩基 配列を示す。
次に、 上記のサーモコッカス 'セラ一の染色体 DNAを Hindlll (宝酒 造社製） で完全消化し、 ライゲーシヨン反応により Hindlllカセッ ト （宝 酒造社製） につないだ。 これを铸型としてプライマ一TC E 6 Rおよび力 セッ トプライマー C 1 (宝酒造社製） を含む PC R反応液を調製し、 94 °C、 1分を 1サイクル、 続いて 94°C、 30秒〜 55°C、 1分〜72° 3分を 30サイクル、 72°C、 10分を 1サイクルの一連の反応を行った c この反応液の一部を用いてァガロース電気泳動を行うと、 約 1. 8kbの增 幅断片が認められた。 この増幅断片を Hindlllおよび Sac Iで消化し、 生 じた約 1. 5 kbの DN A断片をァガロースゲル電気泳動の後にゲルより回 収した。 Hindlllおよび Sac Iで消化したプラスミ ドベクタ一 pし' C 11 9を上記の約 1. 5kbの DN A断片と混合してライゲーシ ヨ ンを行い、 ィ — ' コリ J M 109に導入した。 得られた形質転換体に保持されているプ ラスミ ドを調べ、 上記の 1. 5 kb断片が 1分子だけ挿入されたプラスミ ド を選び、 これをプラスミ ド pTC 4と命名した。
図 8にプラスミ ド p T C 4の制限酵素地図を示す。
(10) プラスミ ド pTC 4に含まれるサーモコッカス 'セラ一由来 D N A断片およびプロテアーゼ T C E S遺伝子の塩基配列の決定
上記プラスミ ド pTC 4に挿入されたサ一モコッカス ·セラ一由夹プロ テア一ゼ遺伝子の塩基配列を決定するために、 キローシークェンス用デレ —シヨンキッ 卜を用いて、 該プラスミ ドの揷入 DN A断片部分を種々の長 さに欠失させたデレーンヨンミュータン卜を作製した。 これらのうち、 適 当な長さの欠失が起こったものをいくつか選び、 ジデォキン法によりそれ ぞれの挿入 DN A断片部分の塩基配列を解読したうえ、 これらの桔果を総 合してプラスミ ド p TC 4に含まれる挿入 DN A断片の塩基配列を決定し た。 配列表の配列番号 15に得られた塩基配列を示す。
該配列と実施例 1一 （8) で得られたプラスミ ド p TC S 6に含まれる 挿入 DN A断片の塩基配列とを総合し、 サーモコッカス ·セラ一由来プロ テア一ゼ遺伝子の全塩基配列を決定した。 該塩基配列中に存在するオーブ ン . リーディ ング . フレームの塩基配列、 および該配列から推定されるサ 一モコッカス .セラ一由来プロテア一ゼのァミノ酸配列をそれそれ配列表 の配列番号 2、 および 1に示す。 該遺伝子にコ一ドされるサ一モコッカス セラー由来プロテアーゼをプロテアーゼ TC E Sと命名した。
( 1 1) プロテアーゼ TC E S遺伝子を含むプラスミ ド p BT C 6の調 製 上記プラスミ ド pTC S 6を HindIII、 S sp I (宝酒造社製：' で消化し た後、 1 %ァガロース電気泳動を行い、 分離された約 1. 8kbの DNA断 片を回収した。 ついで、 プラスミ ドベクター p BR 322 (宝酒造社製） を HindIII、 EcoRVで消化し、 上記の約 1. 8 kbの D N A断片と混合し てライゲ一ショ ンを行った後、 ィ一 ' コリ J Ml 09に導入した。 得られ た形質転換体よりプラスミ ドを調製し、 上記の約 1. 8kb断片 1分子のみ が含まれているものを選んで、 これをプラスミ ド p BTC 5と命名した。 つぎに、 プラスミ ド p BTC 5を HindIII、 Kpn Iで完全に消化し、 平 滑末端化した後、 分子内ライゲ一ショ ンを行い、 ィ一 . コリ J Ml 09に 導入した。 得られた形質転換体よりプラスミ ドを調製し、 上記の 2つの制 限酵素サイ 卜が除去されているものを選んでプラスミ ド p BTC 5HKと 叩'名した。
さらに、 プラスミ ド p BTC 5HKを BamH Iで消化し、 平滑末端化し た後、 分子内ライゲ一ショ ンを行い、 ィ一 ' コリ JM109に導入した。 得られた形質転換体よりプラスミ ドを調製し、 BamH Iサイ トが除去され ているものを選んでブラスミ ド p B T C 5 HKBと命名した。
プロテアーゼ TCE Sプロテア一ゼ遺伝子上の開始コ ドンの直前に Eco R Iサイ トおよび BamH Iサイ 卜が導入できるプライマー T C E 12、 お よびプラスミ ド p TC S 6の Sac Iサイ 卜の 3' 側に 16 bp相補的で C la Iサイ トと終止コ ドンを導入できるプライマー TC E 20 Rを台成した。 プライマー TC E 12、 およびプライマー TC E 20 Rの塩基配列を配列 表の配列番号 18および 19に示す。 これら 2つのプライマーを用い、 サ 一モコッカス ' セラーの染色体 DN Aを铸型とした P CR反応液を調製し、 94°C、 30秒〜 55て、 1分〜72 、 1分を 1サイクルとした 25サ ィクルの反応を行い、 この 2つのオリゴヌク レオチ ドを両端に持ち、 プロ テア一ゼ TC E S遺伝子の一部を含む約 0. 9kbの DN A断片を增幅した。 上記の約 0. 9kbD!\: A断片を EcoR I、 C la I (宝酒造社製） で消化 し、 EcoR i、 Cla Iで消化した上記のプラスミ ド p B T C 5 HK Bと混 台してライゲーショ ンした後、 ィー ' コ リ J Ml 09に導人した 得られ た形質転換体よりプラス ミ ドを調製し、 上記の約 0. 9kb断片 1分子のみ が含まれているものを選んで、 これをプラスミ ド p BTC 6と命名した。
(12) プロテアーゼ TC E S遺伝子を含むプラスミ ド p TC 12の調 製
上記ブラスミ ド p B T C 6を BamH I、 S ph Iで消化した後、 1 %ァガ ロース電気泳動を行い、 分離された約 3 kbの D!\; A断片を回収した。 つい で、 プラスミ ドベクタ一 p UC 18 (宝酒造社製） の Kpn I、 Baml Iサ ィ 卜間にバチルス · サブチリス P 43プロモーター由来のリポソ一ム結 合部位配列 （該配列の導入に用いられた台成ォリゴヌクレオチ KB S 1、 および B S 2の塩基配列を配列表の配列番号 20、 および 21に示す） を 導入したブラスミ ド p U C— P 43 S Dを BaraH I、 Sph Iで消化し、 先 に回収した約 3kbの DNA断片と混合してライゲーショ ンを行い、 ィ一 · コリ J M 109に導入した。 得られた形質転換体よりプラスミ ドを調製し、 上記の約 3 kbの DN A断片 1分子のみが含まれているものを選んで、 これ をプラスミ ド p TC 12と命名した。
(13) バチルス - サブチリスを形質転換するためのプロテアーゼ TC E S遺伝子を含むプラスミ ド p STC 3の調製
上記プラスミ ド pTC 12を Kpn I、 Sphlで消化した後、 1%ァガロ ース電気泳動を行い、 分離された約 3kbの DN A断片を回収した。 次に、 プラスミ ドベクター p U B 18— P 43を Sac Iで消化した後、 末端を平 滑化した後にセルフライゲーシヨ ンさせることによって Sac Iサイ トが除 去されたプラスミ ドベクタ一 p U B 18— P 4 3 Sを調製した。 これを K pn I、 Sph lで消化した後、 先に回収した約 3kbの DN A断片と混台して ラィゲーンョ ンを行い、 バチルス · サブチリス D B 104に導入した。 得 られたカナマイシン耐性の形質転換体よりプラスミ ドを調製し、 上記の約 31^の0^-八断片 1分子のみが含まれているものを選んで、 これをプラス ミ ド p S T C 2と命名した。
ついで、 上記プラスミ ド p STC 2を Sac Iで消化した後、 分子内ライ ゲーショ ンを行い、 バチルス · サブチリス DB 104に導入した。 得られ たカナマイシン耐性の形質転換体 6よりプラスミ ドを調製し、 Sac Iサイ ト
5
を 1つしか持たないものを選んで、 これをプラスミ ド p STC 3と命名し た。
次に該プラスミ ド p STC 3を保有するバチルス · サブチリス DB 10 4を Bacillus subtilis DB 104/p STC 3と命名した。
図 10にプラスミ ド p S TC 3の制限酵素地図を示す。
実施例 2
( 1 ) ピロッコッカス . フリォサスの染色体 DN Aの調製 ピロッコッカス · フ リオサス D SM3638の培養は以下のとおりに行つ た。 1% 卜リプトン、 0. 5% 酵母エキス、 1% 可溶性デンプン、 3. 5% ジャマリ ン S · ソ リ ツ ド （ジャマリ ンラボラ ト リ一社製） 、 0. 5 % ジャマリ ン S · リキッ ド （ジャマリ ンラボラ 卜 リ一社製） 、 0. 00 3% Mg S04, 0. 001 % N a C l、 0. 0001 % F e S 0, · 7H20、 0. 0001 % C o S 04、 0. 0001 % C a C 12 · 7 H2 0、 0. 0001 % Zn S04、 0. 1 p m C u S〇4 * 5H20、 0. 1 pm H3B03 0. 1 p p m KA 1 (SO,,) 2、 0. 1 p p m N a 2Mo 04 · 2 H20, 0. 25 p P m ι C 12 · H2〇の組成の培地を 2リ ッ トル容のメディ ウ厶ボトルに入れ、 120。C、 20分間殺菌した後、 窒素ガスを吹き込んで溶存酸素を除去した後、 これに上記菌株を接種して 95°C、 16時間静置培養した。 培養終了後、 遠心分離によって菌体を集 めた。
つぎに、 得られた菌体を 25%スクロースを含む 5 ΟπιΜ ト リスー HC 1 (ρ Η 8. 0) 4 mlに懸濁し、 この懸濁液に 2 mlの 0. 2M E D T A , 0. 8 mlのリゾチーム （5 rag/ml) を加えて 20°C、 1時間保温した後、 24 m; [の S E T溶液 （ 150 mM N a C し 1 mM E D T A、 20 mM 卜 リス一 HC 1、 H 8. 0) 、 4mlの 5%SD S、 400 1のプロティ ナーゼ K ( 1 Omg nil) を加え、 さらに 37°C、 1時間保温した フ ノ ール一クロロホルム抽出を行って反応を停止した後、 ェタノ一ル沈殿を行- て約 3. 2ingの染色体 DN Aを得た。
(2) ピロッコッカス · フ リオサスの染色体 DN Aのゲノ ミ ックサザン ハイブリダイゼーシヨ ン
ピロコッカス . フ リオサスの染色体 DN Aを Sac I、 Not I、 Xba I、 EcoR I、 および Xhol (以上、 宝酒造社製） でそれぞれ消化した。 反応 液の一部をさらに Sac I、 および EcoR 1で消化し、 1%ァガニースゲル 電気泳動を行った後、 実施例 1一 （5) に記載の操作でサザンハイブリ ダ ィゼイシヨ ンを行った。 なお、 プローブには上記プラスミ ド p l F— 2 R
(2) を EcoR I と Pst Iで消化して得られる約 0. 3^の13\八断片を 铸型とし、 B c a BE ST DNAラベリ ングキッ ト （宝酒造社製） およ び [«-32P] d CTPを用いて調製した32 P—標識 DNAを用 .、た。 ま た、 メ ンブランは最終的に 0. 5%の S D Sを含む 2 X S S C 、 室温で 洗浄し、 2 X S S Cですすいだ後にオー トラジオグラムを作製した。 この 結果、 ピロコ ッカス · フ リオサスの染色体 DN Aを Sac 1で消 して生じ る約 5. 4kb、 および約 3. Okbの 2つの DNA断片にシグナルが認めら れ、 このそれぞれの断片上にプロテア一ゼ遺伝子が存在することが示され た。 Sac I消化断片をさらに S pe l (宝酒造社製） で消化した場台、 上記 の約 5. 4kbの断片に変化はないが、 約 3. Okbの断片に見られたシグナ ルは消失し、 新たに約 0. 6 kbの断片にシグナルが認められた。 配列表の 配列番号 7に示されたプロテア一ゼ PFじ L遺伝子中には Spelサイ トは 存在しないことから、 Sac I と Spe Iで消化して得られる約 0. 6kbの D N A断片上のシグナルは新規な超耐熱性プロテア一ゼ （以下プロテアーゼ PFUSと記載する） 遺伝子に由来するものであることが示唆された。 ま た、 ピロコッカス ' フリオサスの染色体 DN Aを Xba Iで消化したもので は約 3. 3kb、 および約 9. Okbの二つの DN A断片にシグナルが認めら れた。 図 1に示されたプロテアーゼ P FUL遺伝子の制限酵素地図より上 記の約 3. 3kbの断片にはプロテア一ゼ P F U L遺伝子が含まれ、 約 9. Okbの断片にはプロテアーゼ P FU S遺伝子が含まれていることが推定さ れた。 上記染色体 DNAを Xba l と Sac lで消化すると、 シグナルは約 2. Okbと約 3. Okbの断片に認められた。 配列表の配列番号 7に示されたプ 口テアーゼ P FU L遺伝子中に存在する Sac I、 Xba Iの切断部位の位置 より、 約 2. Okbの Sac I -Xba I断片中にプロテア一ゼ P FU L遺伝子 が存在することが推定された。 一方、 約 3. Okbの断片にはプロテアーゼ PFU S遺伝子が存在することが推定され、 上記の Sac I消化の結果とあ わせて、 Sac I単独の消化で得られる上記の約 3. 0^の01\'八断片中に は Xba Iサイ トは存在しないことが示された。
(3) プロテア一ゼ P FU S遺伝子を含む 0. 6kb Spe l - Sac l断 片のクローニング
ピロコッカス · フリォサスの染色体 DN Aを Sac 1 と S pe Iで消化し、 一 6 1 %ァガロースゲルを用いて電気泳動した後、 約 0. 6kbに相当する DN A断片をゲルより回収した。 ついで、 プラスミ ド pB luescriptS K (-) (ス トラタジーン社製） を Sacl と Spelで消化し、 上記の約 0. 6kt^DN' A断片と混合してライゲーショ ンを行った後、 ィ一 · コ リ J Ml 09に導 入し、 染色体 DNA断片を含むプラスミ ドライブラ リーを作製した。 形質 転換したィ一 · コリ J Ml 09をプレー 卜にまいてコロニーを形成させた 後、 生じたコロニーをハイボン ド一 N +メ ンブレンに トランスフ ·Γ—し、 新しい L Βプレー ト上で 37° (：、 2時間保温した。 このメ ンブランを 1. 5^1 ^' 3 (： 1を含む0. 5N N a OH、 っぃでl. 5M Na C lを含 む 0. 5 M ト リスー H C 1 ( p H 7. 5 ) で処理し、 さらに 2 :く S S C で洗浄後、 風乾し、 UVトランスイルミネーター上で紫外線照射してブラ スミ ド DN Aをメ ンブランに固定した。 このメ ンブランをハイプリ ダイゼ ーシヨ ン緩衝液中、 50°Cで 2時間処理した後、 実施例 2— （2) に記載 のサザンハイブリダイゼーショ ンに用いられたものと同じ32 P—標識した DN Aプローブを含む同緩衝液に移し、 50°Cで 18時間ハイフ リダイゼ ーシヨ ンを行った。 ハイブリダィゼーシヨ ン終了後メ ンブランを 0. δ % S D Sを含む 2 X S S C中、 室温で洗浄し、 ついで、 37 °Cで洗浄した。 さらに、 メ ンブランを 2 X S S Cですすいだ後、 風乾し、 X線フ ィルムを 当てて一 80°Cで 12時間露光し、 オー トラジォグラムを作製したつ 約 5 00個のクローンをスク リ一二ングした結果、 プロテアーゼ遺伝子を含む 3個のクローンを得た。 ォー 卜ラジオグラム上のシグナルからこれらのク ローンの位置を調べ、 メ ンブランの トランスファーに用いたプレー ト上の 対応するコロニーを L B培地中に単離した。
(4) P C Rによるプロテアーゼ P FU S遺伝子の検出
プロテアーゼ P FU L遺伝子のうち、 既知の微生物由来アル力 リ性セリ ンブロテア一ゼのァ ミ ノ酸配列と相同性の高い二つの領域をコ一 ドする塩 基配列を選び、 P CRによる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の検出にプライ マ一として用いるオリゴヌ ク レオチ ドの設計を行った。 図 2および図 3に 示されるプロテアーゼ PFULのア ミ ノ酸配列をもとにプライマー 1 F P
1、 1 F P 2、 2 R P 1および 2 R P 2を台成した。 配列表の配列番号 2
2、 23、 24および 25にオリゴヌクレオチ ド 1 F P 1、 1 F P 2、 2 RP 1および 2 RP 2の塩基配列を示す。
上記の 3クローンから調製したプラスミ ドとオリゴヌク レオチ ド 1 F P 1および 2RP 1、 あるいは、 1 F P 1および 2RP 2、 あるいは、 1 F P 2および 2RP 1、 あるいは、 1 F P 2および 2RP 2を含む P CR反 応液を調製し、 94°C、 30秒〜 37て、 2分〜 72°C、 1分を 1サイク ルとした 30サイクルの反応を行った。 この反応液の一部を用いてァガロ ースゲル電気泳動を行うと、 上記の 3つのプラスミ ドすべてにおいてブラ イマ一 1 F P 2および 2 R P 2を用いたもので約 150 の0 八断片の 増幅が認められ、 これらのプラスミ ド上にプロテアーゼ遺伝子が存在する ことが示された。
上記の 3クローンのうち 1つを選んで、 これをプラスミ ド p S S 3と命 名した。
(5) プラスミ ド p S S 3に含まれるプロテアーゼ P F U S遺伝子の塩 基配列の決定
上記のプラスミ ド p S S 3を铸型とし、 プライマ一 M 4およびプライマ 一 RV (共に宝酒造社製） を用いたジデォキシ法により該プラスミ ドの挿 入 DN A断片の塩基配列を決定した。 配列表の配列番号 26に得られた塩 基配列および該塩基配列がコー ドしていると推定されるァミ ノ酸配列を示 す。 該ァ ミ ノ酸配列を、 プロテアーゼ P F U L、 プロテア一ゼ T C E Sお よびサブチリ シンのアミ ノ酸配列と比較することによって、 プラスミ ド p S S 3に挿入された DN A断片はこれらのプロテア一ゼと相同性のあるァ ミ ノ酸配列をコ一 ドすることが推定された。
(6) インバース P C R法によるプロテア一ゼ P FU Sの N末端側コ一 ド領域および C末端側コー ド領域のクローニング
プロテアーゼ P F U Sの N末端側、 および C末端側のァ ミ ノ酸配列をコ ― ドする遺伝子を得るためにィンバース P CR法を実施した。 ィンパース P C Rに用いるプライマーは上記のプラスミ ド p S S 3の挿入 DN A断片 の塩基配列をもとに合成した。 配列表の配列番号 27、 28および 29に プライマ一 NP F— 1、 N P F— 2および N PR— 3の塩基配列を示す。 ピロコッカス · フリオサスの染色体 DN Aを Sac Iおよび Xba lで消化 した後、 分子内ライゲーショ ンを行った。 ライゲーショ ン反応液の一部と プライマー NP F— 1および NPR—3、 あるいは NP F— 2および NP R— 3を含む P CR反応液を調製し、 94°C、 30秒〜67 、 10分を 1サイ クルとした 30サイクルの反応を行った。 この反応液の一部を用い てァガロースゲル電気泳動を行うと、 Sac Iで消化して得た DN Aを铸型 とし、 プライマー NP F— 2および N PR— 3を用いたもので約 3kbの增 幅断片が認められた。 この増幅断片をァガロースゲルより回収し、 プラス ミ ドベクター p T7 Β 1 u e T (Novagen社製） と混合してライゲ一ショ ンを行い、 ィー · コ リ J M 1 09に導入した。 得られた形質転換体よりプ ラスミ ドを調製し、 約 3kbの DNA断片が含まれているものを選んで、 こ れをプラスミ ド p S 322と命名した。
—方、 Xba Iで消化して得た DN Aを铸型とし、 プライマ一 N P F— 1 および N PR— 3を用いたもので約 9 kbの増幅断片が認められた。 この增 幅断片をァガロースゲルより回収し、 DN'Aブランティ ングキッ 卜を用い て DN Aの末端を平滑化した後、 さらに Xba Iで消化した。 これを Xbal と HincIIで消化したブラスミ ドべク 夕一pBluescriptS K (-)と混台して ライゲーンョ ンを行い、 ィー ' コ リ J Ml 09に導入した。 得られた形質 転換体よりプラスミ ドを調製し、 約 5kbの DNA断片が挿入されているも のを選び、 これをプラスミ ド p SKX5と命名した。
(7) プラスミ ド p S 322および p S K X 5に含まれるプロテアーゼ PFUS遺伝子の塩基配列の決定
プラスミ ド p S 322を铸型とし、 プライマー N PR— 3を用いたジデ ォキシ法により、 プロテアーゼ PF USの N末端領域をコー ドする遺伝子 の塩基配列を決定した。 配列表の配列番号 30に得られた塩基配列の一部、 および該塩基配列がコ一ドしていると推定されるアミ ノ酸配列を示す。 さらに、 プラスミ ド p SKX5を铸型とし、 プライマ一 RVを用いたジ デォキシ法によりプロテア一ゼ P FU S遺伝子の 3' 側にあたる領域の塩 基配列を決定した。 配列表の配列番号 31に得られた塩基配列の一部を示
9 o
(8) プロテアーゼ P FU S遺伝子全長の増幅に用いるプライマ一の合 成
実施例 2— (7) で得られた塩基配列をもとに、 プロテアーゼ P FUS 遺伝子全長の増幅に用いるプライマーの設計を行った。 配列表の配列番号 30に示されるプロテア一ゼ P FU Sの N末端部分をコー ドする塩基配列 をもとにプロテア一ゼ P F U S遺伝子の開始コ ドン直前に BamH Iサイ ト を導入できるプライマー NPF— 4を合成した。 配列表の配列番号 32に プライマ一 NP F— 4の塩基配列を示す。 また、 配列表の配列番号 31に 示されるプロテアーゼ PFUSの 3' 側領域に存在する Xba 1サイ 卜近傍 の塩基配列をもとに、 該塩基配列に相補的な配列と S phiの認識配列とを 有するプライマー N PR— 4を合成した。 配列表の配列番号 33にブラィ マ一 N P R— 4の塩基配列を示す。
( 9 ) バチルス ·サブチリスを形質転換するためのピロコッカス ' フリ ォサス由来のプロテアーゼとプロテアーゼ T C E Sのハイブリ ッ ド遺伝子 を含有するプラスミ ド p S PT lの調製
L A P CR キッ ト （宝酒造社製） を使用し、 上記のプライマ一 NP F— 4、 NPR— 4とピロコッカス ' フリォサスの染色体 DN Aとを含む PCR反応液を調製し （以後、 LA PCR キッ トを使用して調製され た P C R反応液を L A— P C R反応液とする） 、 94°C、 30秒〜 55° (：、 1分〜 68° (：、 7分を 1サイクルとして 20サイクルの反応を行い、 この 2つのプライマ一を両端に持ち、 プロテア一ゼ P FU S遺伝子のコー ド領 域を含む約 6 kbの DN A断片を増幅した。
上記の約 6kbの DNA断片を BamH I、 Sac Iで消化した後、 1 %ァガ ロースゲル電気泳動を行い、 分離された約 0. 8^の0 八断片を回収し た。 この断片を BamH I、 S ac Iで消化した上記プラスミ ド p S T C 3と 混合してライゲ一ションした後、 バチルス ·サブチリス DB 104に導入 した。 得られたカナマイシン耐性の形質転換体よりプラスミ ドを調製し、 上記の約 0. 8 kb断片 1分子のみが挿人されたプラスミ ドを選び、 これを プラスミ ド p S PT 1と命名した。
また、 該プラスミ ド p S P T 1を保有するバチルス ·サブチリス D B 1 04を Bacillus subtilis DB 104/p S PT lと命名した。
図 14にプラスミ ド p S PT 1の制限酵素地図を示す。
(10) バチルス ·サブチリスを形質転換するためのプロテアーゼ P U F S遺伝子を含有するプラスミ ド p SNP 1の調製
実施例 2— (9) で増幅された上記の約 6kbの DNA断片を Spe I、 S ph iで消化した後、 1 %ァガロース電気泳動を行い、 分離された約 5. 7 kbの DN A断片を回収した。 これを S pel、 S ph Iで消化した上記プラス ミ ド p S P T 1と混合してライゲ一シヨ ンした後、 バチルス · サブチリス DB 1 04に導入した。 得られたカナマイシン耐性の形質転換体よりブラ スミ ドを調製し、 上記約 5. 7 kb断片 1分子のみが挿入されたプラスミ ド を選び、 これをブラスミ ド p S N P 1と命名した。 また、 該プラスミ ド p S NP 1で形質転換されたバチルス · サブチリス DB 104を Bacillus subtilis DB 104/p S P lと命名した。
図 15にプラスミ ド p S P 1の制限酵素地図を示す。
(11) プラスミ ド p SNP lに含まれるプロテア一ゼ P FU S遺伝子 の塩基配列の決定
上記プラスミ ド p SNP 1に挿入されたプロテアーゼ遺伝子を含む約 6 kbの DN A断片を種々の制限酵素で適当なサイズに断片化し、 該断片をプ ラスミ ドベクター p U C 119または pBluescriptS K (-)にサブク口一 ニングした。 得られた組換えプラスミ ドを铸型とし、 市販のユニバーサル プライマーを用いたジデォキン法により塩基配列の決定を行なった。 適当 なサイズの断片が得られない部分については合成プライマーを利用するプ ライマ一ウォーキング法を用いた。 こう して決定されたプラスミ ド p SN P 1に挿入された DNA断片の塩基配列中に存在するオープン · リーディ ング · フレームの塩基配列、 および該配列から推定されるピロコッカス · フリォサス由来プロテア一ゼのァミ ノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号 34および 35に示す。
(12) プロテアーゼ PF US遺伝子を増幅するためのプライマーの台 成
プロテアーゼ P FU S遺伝子全長の増幅に使用される、 該遺伝子の 3' 側にハイブリダィズするプライマーを設計するために、 該遺伝子の 3' 側 領域の塩基配列を決定した。 まず、 上記のプラスミ ド p S JP lを BamH Iで消化して得られる、 プロテア一ゼ P F U S遺伝子の 3' 側 ^域を含む 約 0. 6kbの DNA断片を、 予め BaraH 1で消化し、 アルカリホスファタ —ゼで脱リン酸化したブラスミ ドベクタ一 p U C 119にサブク口一ニン グした。 得られた組換えプラスミ ドはプラスミ ド p SNPDと命名され、 これを铸型としたジデォキン法によりプロテア一ゼ P F U S遺伝子の 3' 側にあたる領域の塩基配列を決定した。 配列表の配列番号 38に該領域に 存在する BamH Iサイ 卜より上流 80 bpまでの塩基配列 （相補鎖の配列） を示す。 つぎに、 該配列をもとにしてプロテアーゼ P F US遺伝子の 3' 側にハイプリダイズし、 Sph Iの認識配列を含むプライマー N PM— 1を 合成した。 配列表の配列番号 39にプライマ一 NPM— 1の塩基配列を示 す。
また、 プロテア一ゼ P F U S遺伝子の内部、 開始コ ドンから約 1. 7kb 下流に存在する BamH Iサイ トを除くためのプライマー mu t RR、 mu t FRを合成した。 配列表の配列番号 40. 41にそれぞれプライマー m u t RR、 m u t F Rの塩基配列を示す。
(13) プロテアーゼ PUF S遺伝子を全長を含有するプラスミ ド p P S 1の調製
铸型としてピロコッカス · フリオサスの染色体 DMAを、 またプライマ —として上記プライマ一 NPF— 4と mu t R Rの組合せ、 あるいはブラ ィマ一 mu t F Rと N PM— 1の組合せを含む 2組の L A— P C R反応液 を調製し、 それぞれ 94°：、 30秒〜 55°C、 1分〜 68て、 3分を 1サ ィクルとした 30サイクルの反応を行った。 この反応液の一部 用いてァ ガロース電気泳動を ί亍ぅと、 プライマー N P F— 4および m u RRを用 いた場台は約 1. 8kbの、 プライマー m u t F Rおよび N PM— 1を用い た場台は約 0. 6 kbの D N A断片が增幅した。
上記の 2種類の PCR反応液より SUPRE C— 02 (宝酒造社製） を 用いてプライマーが除去された増幅 DN A断片を調製した。 これらの両增 幅 DNA断片を含み、 プライマ一、 および LA T a qは含まない LA— PCR反応液を調製して 94°C、 10分間の熱変性を行い、 30分かけて 30°Cまで冷却した後、 30°Cで 15分間保温してヘテロ ·デュープレツ クス （hetero duplex) を形成させた。 次にこの反応液に L A T a qを 添加して 72°Cで 3分間反応させ 7た 5 後、 さらにプライマ一 NP F— 4、 N PM— 1を添加して 94° (：、 30秒〜55 、 1分〜 68°C、 3分を 1サ ィクルとして 25サイクルの反応を行った。 この反応液中には約 2. 4kb の DNA断片の増幅が見られた。
上記約 2. 4kbの DNA断片を BamH I、 Sphlで消ィヒし、 この断片を 予め BamH I、 Sphlで消化してプロテアーゼ P F U S遺伝子全長を除去 した実施例 2— (1 1) に記載のプラスミ ド p SNP 1と混台してライゲ ーションを行った後、 バチルス ·サブチリス DB 104に導入した。 得ら れたカナマイシン耐性の形質転換体よりプラスミ ドを調製し、 上記の約 2. 4kb断片 1分子のみが挿入されたプラスミ ドを選び、 これをプラスミ ド p P S 1と命名した。 また、 該プラスミ ド p P S 1で形質転換されたバチル ス ·サブチリス D B 104を Bacillus subtilis DB 104ノ p P S lと 命名した。
図 16にプラスミ ド p P S 1の制限酵素地図を示す。
(14) サブチリシン遺伝子のプロモータ ^シグナル配列領域の D N A断片の増幅
サブチリシン遺伝子のプロモータ一〜シグナル配列領域を得るためのブ ライマ一を台成した。 まず、 ジャーナル ' ォブ . バクテリオロジー （J.Ba cteriol. ) 第 171卷、 第 2657〜 2665頁 （ 1989 ) に記載のサ ブチリ シン遺伝子のプロモーター領域部分の塩基配列を参考に、 該領域の 上流にハイブリダィズし、 EcoR Iサイ トを含むプライマー S U B 4 (配 列表の配列番号 36にプライマー S U B 4の塩基配列を示す） を台成した。 次にジャーナル · ォブ · バクテリオロジ一 (J. Bacteriol. ) 第 158巻、 第 411〜 418頁 （1984) に記載のサブチリ ンンをコー 卜する領域 の塩基配列を参考に、 シグナル配列の直後に BamH 1サイ トを導入できる プライマー BmR 1 (配列表の配列番号 37にプライマー BmR Iの塩基 配列を示す） を合成した。
ジャーナル . ォブ · パクテリォロジ一 （J. Bacteriol. ) 第 171卷、 第 2657〜 2665頁 （1989) に記載のサブチリ シン遺伝子を含むプ ラスミ ド pKWZを铸型とし、 上記のプライマー S UB 4、 Bn.R lを含 む P CR反応液を調製し、 94°C、 30秒〜 55° (：、 1分〜 68°C、 2分 を 1サイ クルとする 30サイクルの反応を行った。 この反応液の一部を用 いてァガロース電気泳動を行うと、 約 0. 3kbの DNA断片が増幅してい ることが確認された。
(15) バチルス · サブチリスを形質転換するためのプロテアーゼ P F US遺伝子を含有するプラスミ ド p NAP S 1の調製
上記約 0. 3kbの DN A断片を EcoR I、 BamH Iで消化した後、 予め EcoR I、 BamH Iで消化した実施例 2— (13 ) のブラスミ ド p P S 1 と混合してライゲーショ ンした後、 バチルス ·サブチリス DB 04に導 入した。 得られたカナマイ シン耐性の形質転換体よりプラスミ '、を調製し、 上記の約◦. 3kb断片 1分子のみが挿入されたプラスミ ドを選び、 これを プラスミ ド p N A P S 1と命名した。 また、 該プラスミ ド p N Λ P S 1で 形質転換されたバチルス ' サブチリス D B 1◦ 4を Bacillus subtilis D B 1 04/p N A P S 1と命名した。
図 1 7にプラスミ ド p N A P S 1の制限酵素地図を示す。
実施例 3
( 1 ) 超耐熱性プロテアーゼ遺伝子検出のためのプローブの調整 プロテアーゼ PFUL遺伝子を含有する上記のプラスミ ド pTPR 12 を Bal l と HincII (ともに宝酒造社製） で消化後、 1%ァガロースゲル 電気泳動を行い、 分離された約 lkbの DN A断片を回収した。 該 DNA断 片を铸型とし、 B c a BE ST DNAラベリ ングキッ トおよび [ひ-32 P ] d C T Pを用いて32 P—標識された DNAプローブを調製した。
(2) 超好熱菌スタフイ ロサ一マス ' マリナスおよびサ一モバクテロイ デス ·プロテオリティカスに存在する超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の検出 ドイ ツチエ ·ザ厶ルンク · フォン . ミ ク口オルガ二スメ ン ' ゥン 卜 ' ツユ ルクルチユウレン GmbHより入手したスタフイ ロサーマス . マリナス D SM3639およびサーモバクテロイデス ·プロテオリティカス DSM5 265培養液それぞれ 1 Omlより、 実施例 1一 （3) に記載の操作にした がって染色体 DN Aを調製した。 両染色体 DN Aを EcoR I、 Pst l、 H indIII、 Xba Iおよび Sac Iでそれぞれ消化し、 1 %ァガロースゲルを用 いて電気泳動した後、 実施例 1— (5) に記載の操作でサザンハイブリダ ィゼーシヨンを行った。 なお、 プローブには実施例 3— (1) で調製した 32P—標識 DNAプローブを用いた。 また、 メンブランは最終的に 0. 5 %の S D Sを含む 2 X S S C中、 37 °Cで洗浄し、 2 x S S Cですすいだ 後にオートラジオグラムを作製した。 このオートラジオグラムより、 Pst Iで消化したスタフィ ロザーマス · マリナスの染色体 DNAで約 4.8kbの DNA断片、 Xba Iで消化したサ一モバクテロイデス ·プロテオリ千イカ スの染色体 DNAで約 3. 5kbの DN A断片にシグナルが認められ、 プロ テアーゼ P F U L遺伝子とハイプリダイズする超耐熱性プロテア一ゼ遣伝 子がスタフィ ロザーマス · マリナスおよびサ一モバクテロイデス .プロテ オリティカスの染色体 DN A中に存在することが示された。
実施例 4
(1) プロテアーゼ P FUSおよび TC E S粗精製酵素標品の調製 実施例 1で得られた、 本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含有する プラスミ ド p STC 3を導入したバチルス ·サブチリス DB 104、 Baci llus subtilis DB 104Zp STC 3を 10 g/nilのカナマイシンを含 む L B培地 （トリプトン 10 g/リ ツ 卜ル、 酵母エキス 5 g/リ ッ トル、 N a C 1 5 gノリ ッ トル、 pH 7. 2 ) 5 ml中、 37 °Cで 8時間培養した。 1リ ッ トル容の三角フラスコに同様の培地 250 mlを準備し、 上記の培養 液 5 mlを接種して 37°Cで 16時間培養した。 培養液を遠心分離して得ら れた上清に了 5%飽和となるよう硫酸ァンモニゥ厶を加え、 生じた沈澱物 を遠心分離によって回収した。 回収した沈殿物を 4 mlの 2 OmM トリスー HC 1、 pH 7. 5に懸濁した後、 同緩衝液に対して透析し、 得られた透 析内液を粗精製酵素標品 （酵素標品 TC一 3) とした。
また本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含有するプラスミ ド p SN P l、 あるいはプラスミ ド p S PT 1を導入したバチルス ·サブチリス D B 104、 Bacillus subtilis D B 104 / p S N P 1あるい Bacillu s subtilis DB 104Zp S PT lより、 上記同様の操作で粗精製酵素 標品を調製し、 それぞれ N'P— 1、 PT— 1と命名した。
これらの酵素標品を用いて、 上記のゼラチンを含む S D S—ポリアクリ ルアミ ドゲルを用いる酵素活性検出法、 あるいはその他の活性測定方法に よってプロテアーゼ活性を調べた。 (2) プロテアーゼ P F U S精製酵素標品の調製
実施例 2— ( 18) で得られた本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を 含有するブラス ミ ド p N A P S 1を導入したバチルス ·サブチリス D B 1 04、 Bacillus subtilis DB 104/ pNAP S lを、 10 //gZmlの カナマイシンを含む L B培地 5 nilを含む試験管 2本に接種し、 37°Cで 7 時間振とう培養した。 同様の培地 125 mlずつを含む 500 ml容の三角フ ラスコ計 6本を準備し、 フラスコ 1本当たり上記培養液を 1 ml接種して 3 7°Cで 17時間振とう培養した。 培養液は遠心分離して、 菌体と培養液上 清を得た。
菌体は 15mlの 5 OmM ト リ スー HC 1、 pH 7. 5に懸濁し、 30 nig のリゾチーム （シグマ社製） を加えた後に、 37°Cで 1. 5時間消化した。 消化液をさらに 95 °Cで 15分間加熱処理した後、 遠心分離して上清を集 めた。 得られた上清 12mlに飽和硫酸アンモニゥ厶溶液 4ralを加え、 0. 45 ιηフィルターュニッ 卜 （ステリベックス H V ： ミ リポア社製） を用 いてろ過を行った後、 ろ液を 25%飽和の硫酸アンモニゥムを含む 2 δπι Μ 卜リス一 HC I、 p H 7. 5で平衡化した POROS PHカラム （4 . 6mmx 15 Οππη : パーセプティブ社製） に負荷した。 カラムを平衡化に 使用した緩衝液で洗浄した後、 硫酸アンモニゥム濃度を 25%飽和から 0 %飽和に低下させると同時にァセトニトリル濃度を 0%から 20%に增加 させる直線濃度勾配溶出を行い、 PFUSプロテア一ゼを溶出させ、 精製 酵素標品 NAP S— 1を得た。
培養液上清 750mlは 25mM トリスー HC l、 pH 8. 0に対して 透析し、 同じ緩衝液で平衡化した E c 0 n 0— P a c k Qカー トリ ッジ (5ml： バイオラッ ド社製） に吸着させた。 ついで、 吸着した酵素を 0〜 1. δ N a C 1の直線濃度勾配により溶出させた。 得られた活性画分 を 95 °Cで 1時間加熱処理した後、 3分の 1量の飽和硫酸アンモニゥム溶 液を加えた。 0. 45 mフィルタ一ユニッ ト （ステリベックス HV) を 用いてろ過を行った後、 ろ液を 25 %飽和の硫酸ァンモニゥムを含む 25 mM トリスー HC l、 pH 7. 5で平衡化した POROS PHカラム (4. 6mmx 150關） に負荷した。 上記の酵素標品 NAP S— 1の場合 と同様の操作によってカラムに吸着した P F USプロテア一ゼを溶出させ、 精製酵素標品 NAP S— 1 Sを得た。
精製酵素標品 NAP S— 1、 および NAP S— 1 Sの適量に終濃度 8. 3%のトリクロ口酢酸を加えて標品中のタンパク質を沈殿させ、 これを遠 心分離によって回収した。 回収されたタンパク質沈殿物を蒸留水に溶解し た後、 1Z4量の試料用緩衝液 （5 OraM トリスー HC し p H 7. 5、 5 % SDS、 5% 2 _メルカプトエタノール、 0. 005% ブ口モフエ ノールブルー、 50% グリセロール） を添加し、 100°C、 5分間処理 した後に 0. 1 %SD S— 10%ポリアクリルアミ ドゲルを用いて電気泳 動を行った。 泳動終了後、 2. 5%クーマン一 'ブリ リアントブル一 R— 250、 25%エタノール、 10%酢酸中で 30分間染色を行い、 続いて 25%メタノール、 7%酢酸中にゲルを移し、 3〜 15時間かけて余分の 色素を除いた。 精製酵素標品 N A P S— 1、 N A P S - 1 Sはどちらも単 一のバンドを示し、 泳動距離からの推定分子量は約 45kDaであった。
(3) 成熟型のプロテアーゼ PUF Sの N末端の決定
実施例 4一 (2) で調製した精製酵素標品 NAP S— 1を 0. 1%SD S— 10%ポリアクリルアミ ドゲルを用いて電気泳動した後、 セミ ドライ ブロッター （日本エイ ドウ社製' を用いてゲル上のタンパクを PVD F膜
(ミ リポア社製） に転写した。 転写操作はエレク トロフォ レンス （Electr ophoresis) 、 第 1 1巻、 第 573〜 580頁 （ 1990) に記載の方法 に準じた。 転写後の膜を 0. 1% クーマ ン一ブリ リ アン トブルー R— 2 50、 50% メ タノール溶液により染色した後、 60%メ タノールで脱 色した。 膜上に現れた染色された部分を切り取って G 1000 Aプロティ ンシーケンサー （ヒューレッ ト パッカー ド社製） を用いた自動エ ドマン 法により N末端アミ ノ酸配列の決定を行った。 配列表の配列番号 42に得 られた N末端ァミ ノ酸配列を示す。
配列表 配列番号 ： 1
配列の長さ ： 6 5 9
配列の型 ： アミ ノ酸
鎖の数 ： 一本鎖
卜ポロジー ： 直鎖状
配列の種類： ペプチ ド
配列 ：
Met Lys Arg Leu Gl y Ala Val Val Leu Ala Leu Val Leu Val Gl y
5 10 15
Leu Leu Ala G】y Thr Ala Leu Ala Ala Pro Val Lys Pro al Val
20 25 30
Arg Asn Asn Ala Val Gin Gin Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Thr Pro
35 40 45
Gly Leu Phe し ys し ys Val Gin Arg Met Asn Trp Asn Gin Glu Val
50 55 60
Asp Thr Val He Met Phe Gly Ser Tyr Gly Asp Arg Asp Arg Ala
65 70 75
Val し ys Val Leu Arg Leu Met Gly Ala Gin Val Lys Tyr Ser Tyr
80 85 90 lys lie lie Pro Ala Val Ala Va l Lys lie し ys Ala Arg Asp Leu
95 100 105
Leu Leu lie Ala Gly Met l ie Asp Thr Gly Tyr Phe Gly Asn Thr
110 115 120
Arg Val Ser Gl y lie Lys Phe l ie (iln Glu Asp Tyr Lys Val Gin 125 130 135
Val Asp Asp Ala Thr Ser Val Scr Gin He Gly Ala Asp Thr Val
140 145 150
Trp Asn Ser Leu Gly Tyr Asp Gl y Ser Gl y Val Val Val Ala l ie
155 160 165
Val Asp Thr Gly l ie Asp Ala Asn His Pro Asp Leu Lys Gly Lys
170 175 180
Val lie Gly Trp Tyr Asp Ala Val Asn Gly Arg Ser Thr Pro Tyr
185 190 195
Asp Asp Gin Gly His Gly Thr Hi s Val Ala Gly l ie Val Ala Gly
200 205 210
Thr Gly Ser Val Asn Ser Gin Tyr lie Gly Val Ala Pro Gly Ala
215 220 225
Lys Leu Val Gly Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser
230 235 240
Val Ser Thr lie lie Ala Gly Val Asp Trp Val Val Gin Asn Lys
245 250 255
Asp Lys Tyr Gly lie Arg Val lie Asn Leu Ser し eu Gly Ser Ser
260 265 270 bin Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ser し eu Ser Gin Ala Val Asn Asn
275 280 285
Ala Trp Asp Ala Gly lie Val Val Cys Val Ala Ala Gly Asn Ser
290 295 300
Gly Pro Asn Thr Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys
305 310 315
Val l ie Thr Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Asp Asn lie Ala Ser 320 325 330
Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu Lys Pro Glu
335 340 345
Val Val Ala Pro Gly Val Asp lie l ie Ala Pro Arg Ala Ser Gly
350 355 360
Thr Ser Met Gly Thr Pro lie Asn Asp Tyr Tyr Thr Lys Ala Ser
365 370 375
Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Val Gly Ala Leu
380 385 390 l ie Leu Gin Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys Thr
395 400 405
Ala Leu lie Glu Thr Ala Asp lie Val Ala Pro Lys Glu lie Ala
410 415 420
Asp lie Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Val Tyr Lys Ala lie
425 430 43D
Lys Tyr Asp Asp Tyr Ala Lys し eu Thr Phe Thr Gly Ser Val Ala
440 445 450
Asp Lys Gly Ser Ala Thr His Thr Phe Asp Val Ser Gly Ala Thr
455 460 465
Phe Val Thr Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Thr Gly Ser Ser Asp lie
470 475 480
Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Glu Val Asp Tyr Ser
485 490 495
Tyr Thr Ala Tyr Tyr Gly Phe Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro
500 505 510
Thr Ala Gly Thr Trp Thr Val Lys Val Val Ser Tyr Lys Gly Ala 515 520 525
Ala Asn Tyr Gin Val Asp Val Val Ser Asp Gly Ser Leu Ser in
530 535 540
Ser Gl y Gl y Gly Asn Pro Asn Pro Asn Pro Asn Pro Asn Pro Thr
545 550 555
Pro Thr Thr Asp Thr Gin Thr Phe Thr Gly Ser Val Asn Asp Tyr
560 565 570
Trp Asp Thr Ser Asp Thr Phe Thr Met Asn Val Asn Ser Gly Ala
575 580 585
Thr Lys He Thr Gly Asp Leu Thr Phe Asp Thr Ser Tyr Asn Asp
590 595 600
Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Leu Val Asp Arg
605 610 615
Ser Thr Ser Ser Asn Ser Tyr Glu His Val Glu Tyr Ala Asn Pro
620 625 630
Ala Pro Gly Thr Trp Thr Phe Leu Val Tyr Ala Tyr Ser Thr Tyr
635 640 645
Gly Trp Ala Asp Tyr Gin し eu Lys Ala Val Val Tyr Tyr Gly
650 655 配列番号 ： 2
配列の長さ ： 1 9 7 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： Genomi c DNA 起源 ： サ一モコッカス ' セラー
株名 ： D S M 2 4 7 6
配列 ：
ATGAAGAGGT TAGGTGCTGT GGTGCTGGCA CTGGTGCTCG TGGGTCTTCT GGCCGGAACG 60 GCCCTTGCGG CACCCGTAAA ACCGGTTGTC AGGAACAACG CGGTTCAGCA GAAGAACTAC 120 GGACTGCTGA CCCCGGGACT GTTCAAGAAA GTCCAGAGGA TGAACTGGAA CCAGGAAGTG 180
GACACCGTCA TAATGTTCGG GAGCTACGGA GACAGGGACA GGGCGGTTAA GGTACTGAGG 240
CTCATGGGCG CCCAGGTCAA GTACTCCTAC AAGATAATCC CTGCTGTCGC GGTTAAAATA 300
AAGGCCAGGG ACCTTCTGCT GATCGCGGGC ATGATAGACA CGGGTTACTT CGGTAACACA 360
AGGGTCTCGG GCATAAAGTT CATACAGGAG GATTACAAGG TTCAGGTTGA CGACGCCACT 420
TCCGTCTCCC AGATAGGGGC CGATACCGTC TGGAACTCCC TCGGCTACGA CGGAAGCGGT 480
GTGGTGGTTG CCATCGTCGA TACGGGTATA GACGCGAACC ACCCCGATCT GAAGGGCAAG 540
GTCATAGGCT GGTACGACGC CGTCAACGGC AGGTCGACCC CCTACGATGA CCAGGGACAC 600
GGAACCCACG TTGCGGGTAT CGTTGCCGGA ACCGGCAGCG TTAACTCCCA GTACATAGGC 660
GTCGCCCCCG GCGCGAAGCT CGTCGGCGTC AAGGTTCTCG GTGCCGACGG TTCGGGAAGC 720
GTCTCCACCA TCATCGCGGG TGTTGACTGG GTCGTCCAGA ACAAGGACAA GTACGGGATA 780
AGGGTCATCA ACCTCTCCCT CGGCTCCTCC CAGAGCTCCG ACGGAACCGA CTCCCTCAGT 840
CAGGCCGTCA ACAACGCCTG GGACGCCGGT ATAGTAGTCT GCGTCGCCGC CGGCAACAGC 900
GGGCCGAACA CCTACACCGT CGGCTCACCC GCCGCCGCGA GCAAGGTCAT AACCGTCGGT 960
GCAGTTGACA GCAACGACAA CATCGCCAGC TTCTCCAGCA GGGGACCGAC CGCGGACGGA 1020
AGGCTCAAGC CGGAAGTCGT CGCCCCCGGC GTTGACATCA TAGCCCCGCG CGCCAGCGGA 1080
ACCAGCATGG GCACCCCGAT AAACGACTAC TACACCAAGG CCTCTGGAAC CAGCATGGCC 1140
ACCCCGCACG TTTCGGGCGT TGGCGCGCTC ATCCTCCAGG CCCACCCGAG CTGGACCCCG 1200
GACAAGGTGA AGACCGCCCT CATCGAGACC GCCGACATAG TCGCCCCCAA GGAGATAGCG 1260
GACATCGCCT ACGGTGCGGG TAGGGTGAAC GTCTACAAGG CCATCAAGTA CGACGACTAC 1320
GCCAAGCTCA CCTTCACCGG CTCCGTCGCC GACAAGGGAA GCGCCACCCA CACCTTCGAC 1380 GTCAGCGGCG CCACCTTCGT GACCGCCACC CTCTACTGGG ACACGGGCTC GAGCGACATC 1440
GACCTCTACC TCTACGACCC CAACGGGAAC GAGGTTGACT ACTCCTACAC CGCCTACTAC 1500
GGCTTCGAGA AGGTCGGCTA CTACAACCCG ACCGCCGGAA CCTGGACGGT CAAGGTCGTC 1560
AGCTACAAGG GCGCGGCGAA CTACCAGGTC GACGTCGTCA GCGACGGGAG CCTCAGCCAG 1620
TCCGGCGGCG GCAACCCGAA TCCAAACCCC AACCCGAACC CAACCCCGAC CACCGACACC 1680
CAGACCTTCA CCGGTTCCGT TAACGACTAC TGGGACACCA GCGACACCTT CACCATGAAC 1740
GTCAACAGCG GTGCCACCAA GATAACCGGT GACCTGACCT TCGATACTTC CTACAACGAC 1800
CTCGACCTCT ACCTCTACGA CCCCAACGGC AACCTCGTTG ACAGGTCCAC GTCGAGCAAC 1860
AGCTACGAGC ACGTCGAGTA CGCCAACCCC GCCCCGGGAA CCTGGACGTT CCTCGTCTAC 1920
GCCTACAGCA CCTACGGCTG GGCGGACTAC CAGCTCAAGG CCGTCGTCTA CTACGGG 1977 配列番号 ： 3
配列の長さ ： 5 2 2
配列の型 ： アミ ノ酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： ペプチ ド
配列の特徴 ： 4 2 8番目の Xaaは Glyか Val
配列 ：
Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin Val Met Ala
5 10 15
Thr Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly lie Thr lie
20 25 30
Gly He lie Asp Thr Gly lie Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gin
35 40 45
Gly し ys Val l ie Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr 50 55 60
Pro Tyr Asp Asp His Gly His Gl y Thr Hi s Val Ala Ser l ie Ala
65 70 75
Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala
80 85 90
Pro Gly Ala Lys Leu Ala Gly lie Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly
95 100 105
Ser Gly Ser l ie Ser Thr lie l ie Lys Gly Val Glu Trp Ala Val
110 115 120
Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly l ie Lys Val lie Asn Leu Ser Leu
125 130 135
Gly Ser Ser Gin Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ala Leu Ser Gin Ala
140 145 150
Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val Val Val Val Ala Ala
155 160 165
Gly Asn Ser Gl y Pro Asn Lys Tyr Thr lie Gly Ser Pro Ala Ala
170 175 180
Ala Ser Lys Val lie Thr Val Gl y Ala Val Asp Lys Tyr Asp Val
185 190 195 lie Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu
200 205 210
Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp He l ie Ala Ala Arg
215 220 225
Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gin Pro He Asn Asp Tyr Tyr Thr
230 235 240
Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly l ie 245 250 255
Al a Ala Leu Leu Leu Gin Ala Hi s Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys
260 265 270
Val Lys Thr Ala し eu lie Glu Thr Ala Asp lie Val Lys Pro Asp
275 280 285
Glu l ie Ala Asp lie Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr
290 295 300
Lys Ala He Asn Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gl
305 310 315
Tyr Val Ala Asn Lys Gly Ser Gin Thr His Gin Phe Val lie Ser
320 325 330
Gly Ala Ser Phe Val Thr Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn
335 340 345
Ser Asp Leu Asp Leu Tyr し eu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gin Val
350 355 360
Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr Gly Phe Glu Lys Val Gly Tyr
365 370 375
Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr l ie Lys Val Val Ser Tyr
380 385 390
Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gin Val Asp Val Val Ser Asp Gly Ser
395 400 405
Leu Ser Gin Pro Gly Ser Ser Pro Ser Pro Gin Pro Glu Pro Thr
410 415 420
Val Asp Ala Lys Thr Phe Gin Xaa Ser Asp His Tyr Tyr Tyr Asp
425 430 435
Arg Ser Asp Thr Phe Thr Met Thr Val Asn Ser Gly Ala Thr Lys 440 445 450
l i e Thr Gl y Asp Leu Val Phe Asp Thr Scr Tyr lii s Asp Leu Asp
455 460 465
Leu Tyr し eu Tyr Asp Pro Asn Gi n し ys Leu Va l Asp Arg Ser Glu
470 475 480
Ser Pro Asn Ser Tyr Glu Hi s Val Glu Tyr Leu Thr Pro Ala Pro
485 490 495
Gly Thr Trp Tyr Phe し eu Val Tyr Ala Tyr Tyr Thr Tyr Gly Trp
500 505 510
Ala Tyr Tyr Glu Leu Thr Ala し ys Val Tyr Tyr Gly
515 520 配列番号 ： 4
配列の長さ ： 1 5 6 6
配列の型 ：核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： Genomic DNA
起源 ： ピロコッカス . フリォサス
株名 ： D S M 3 6 3 8
配列の特徴 ： 1 2 8 3番目の Nは Gか T
配列 ：
GCAGAATTAG AAGGACTGGA TGAGTCTGCA GCTCAAGTTA TGGCAACTTA CGTTTGGAAC 60 TTGGGATATG ATGGTTCTGG AATCACAATA GGAATAATTG ACACTGGAAT TGACGCTTCT 120 CATCCAGATC TCCAAGGAAA AGTAATTGGG TGGGTAGATT TTGTCAATGG TA (； GAGTTAT 180 CCATACGATG ACCATGGACA TGGAACTCAT GTAGCTTCAA TAGCAGCTGG TACTGGAGCA 240 GCAAGTAATG GCAAGTACAA GGGAATGGCT CCAGGAGCTA AGCTGGCGGG AATTAAGGTT 300 CTAGGTGCCG ATGGTTCTGG AAGCATATCT ACTATAATTA AGGGAGTTGA GTGGGCCGTT 360 GATAACAAAG ATAAGTACGG AATTAAGGTC ATTAATCTTT CTCTTGGTTC AAGCCAGAGC 420 TCAGATGGTA CTGACGCTCT AAGTCAGGCT GTTAATGCAG CGTGGGATGC TGGATTAGTT 480 GTTGTGGTTG CCGCTGGAAA CAGTGGACCT AACAAGTATA CAATCGGTTC TCCAGCAGCT 540 GCAAGCAAAG TTATTACAGT TGGAGCCGTT GACAAGTATG ATGTTATAAC AAGCTTCTCA 600 AGCAGAGGGC CAACTGCAGA CGGCAGGCTT AAGCCTGAGG TTGTTGCTCC AGGAAACTGC 660 ATAATTGCTG CCAGAGCAAG TGGAACTAGC ATGGGTCAAC CAATTAATGA CTATTACACA 720 GCAGCTCCTG GGACATCAAT GGCAACTCCT CACGTAGCTG GTATTGCAGC CCTCTTGCTC 780 CAAGCACACC CGAGCTGGAC TCCAGACAAA GTAAAAACAG CCCTCATAGA AACTGCTGAT 840 ATCGTAAAGC CAGATGAAAT AGCCGATATA GCCTACGGTG CAGGTAGGGT TAATGCATAC 900 AAGGCTATAA ACTACGATAA CTATGCAAAG CTAGTGTTCA CTGGATATGT TGCCAACAAA 960
GGCAGCCAAA CTCACCAGTT CGTTATTAGC GGAGCTTCGT TCGTAACTGC CACATTATAC 1020
TGGGACAATG CCAATAGCGA CCTTGATCTT TACCTCTACG ATCCCAATGG AAACCAGGTT 1080
GACTACTCTT ACACCGCCTA CTATGGATTC GAAAAGGTTG GTTATTACAA CCCAACTGAT 1140
GGAACATGGA CAATTAAGGT TGTAAGCTAC AGCGGAAGTG CAAACTATCA AGTAGATGTG 1200
GTAAGTGATG GTTCCCTTTC ACAGCCTGGA AGTTCACCAT CTCCACAACC AGAACCAACA 1260
GTAGACGCAA AGACGTTCCA AGNATCCGAT CACTACTACT ATGACAGGAG CGACACCTTT 1320
ACAATGACCG TTAACTCTGG GGCTACAAAG ATTACTGGAG ACCTAGTGTT TGACACAAGC 1380
TACCATGATC TTGACCTTTA CCTCTACGAT CCTAACCAGA AGCTTGTAGA TAGATCGGAG 1440
AGTCCCAACA GCTACGAACA CGTAGAATAC TTAACCCCCG CCCCAGGAAC CTGGTACTTC 1500
CTAGTATATG CCTACTACAC TTACGGTTGG GCTTACTACG AGCTGACGGC TAAAGTTTAT 1560
TATGGC 1566 配列番号： 5
配列の長さ ： 6 5 9 配列の型 ： ア ミ ノ酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列 ：
Met Lys Gly Leu Lys Ala Leu I le Leu Val I le Leu Val Leu Gly
5 10 15
Leu Val Val Gly Ser Val Ala Ala Ala Pro Glu Lys Lys Val Glu
20 25 30
Gin Val Arg Asn Val Glu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Thr Pro Gl y
35 40 45
Leu Phe Arg Lys Ile Gin Lys Leu Asn Pro Asn Glu Glu I le Ser
50 55 60
Thr Val Ile Val Phe Glu Asn His Arg Glu Lys Glu Ile Ala Val
65 70 75
Arg Val Leu Glu Leu Met Gl y Ala Lys Val Arg Tyr Val Tyr Hi s
80 85 90
Ile Ile Pro Ala Ile Ala Ala Asp し eu Lys Val Arg Asp leu leu
95 100 105
Val Ile Ser Gly Leu Thr Gly Gly Lys Ala Lys Leu Ser Gly Val
110 115 120
Arg Phe Ile Gin Glu Asp Tyr Lys Val Thr Val Ser Ala Glu Leu
125 130 135
Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin Val Met Ala Thr Tyr Val
140 145 150
Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Ile Thr Ile Gl y Ile Ile 155 160 165
Asp Thr G】y He Asp Ala Scr Hi s Pro Asp Leu Gin Gly Lys Val
170 175 180 lie Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp
185 190 195
Asp His Gly His Gly Thr Hi s Val Ala Ser l ie Ala Ala Gly Thr
200 205 210
Gly Ala Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala
215 220 225
Lys Leu Ala Gly lie Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser
230 235 240 lie Ser Thr He lie Lys Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys
245 250 255
Asp Lys Tyr Gly He Lys Val lie Asn Leu Ser し eu Gl y Ser Ser
260 265 270
Gin Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ser Leu Ser Gin Ala Val Asn Asn
275 280 285
Ala Trp Asp Ala Gl y He Val Val Cys Val Ala Ala Gly Asn Ser
290 295 300
Gly Pro Asn Thr Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys
305 310 315
Val lie Thr Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Asp Asn l ie Ala Ser
320 325 330
Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu Lys Pro Glu
335 340 345
Val Val Ala Pro Gly Val Asp lie l ie Ala Pro Arg Ala Ser Gly 350 355 360
Thr Ser Met Gly Thr Pro l ie Asn Asp Tyr Tyr Thr Lys Ala Ser
365 370 375
Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Val Gly Ala Leu
380 385 390 lie Leu Gin Ala Hi s Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys Thr
395 400 405
Ala Leu lie Glu Thr Ala Asp lie Val Ala Pro Lys Glu He Ala
410 415 420
Asp lie Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Val Tyr し ys Ala lie
425 430 435
Lys Tyr Asp Asp Tyr Ala Lys し eu Thr Phe Thr Gly Ser Val Ala
440 445 450
Asp Lys Gly Ser Ala Thr His Thr Phe Asp Val Ser Gly Ala Thr
455 460 465
Phe Val Thr Ala Thr leu Tyr Trp Asp Thr Gly Ser Ser Asp lie
470 475 480
Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Glu Val Asp Tyr Ser
485 490 495
Tyr Thr Ala Tyr Tyr Gly Phe Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro
500 505 510
Thr Ala Gly Thr Trp Thr Val Lys Val Val Ser Tyr Lys Gly Ala
515 520 525
Ala Asn Tyr Gin Val Asp Val Val Ser Asp Gly Ser leu Ser Gin
530 535 540
Ser Gly Gly Gly Asn Pro Asn Pro Asn Pro Asn Pro Asn Pro Thr 545 550 555
Pro Thr Thr Asp Thr Gin Thr Phe Thr Gl y Ser Val Asn Asp Tyr
560 565 570
Trp Asp Thr Ser Asp Thr Phe Thr Met Asn Val Asn Ser Gly Ala
575 580 685
Thr し ys l ie Thr Gly Asp Leu Thr Phe Asp Thr Ser Tyr Asn Asp
590 595 600
Leu Asp Leu Tyr し eu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn し eu Val Asp Arg
605 610 615
Ser Thr Ser Ser Asn Ser Tyr Glu His Val Glu Tyr Ala Asn Pro
620 625 630
Ala Pro Gly Thr Trp Thr Phe Leu Val Tyr Ala Tyr Ser Thr Tyr
635 640 645
ly Trp Ala Asp Tyr Gin Leu し ys Ala Val v'al Tyr Tyr Gly
650 655 配列番号 ： 6
配列の長さ ： 1 9 7 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： Genomic DNA
配列 ：
ATGAAGGGGC TGAAAGCTCT CATATTAGTG ATTTTAGTTC TAGGTTTGGT AGTAGGGAGC 60 GTAGCGGCAG CTCCAGAGAA GAAAGTTGAA CAAGTAAGAA ATGTTGAGAA GAACTATGGT 120 CTGCTAACGC CAGGACTGTT CAGAAAAATT CAAAAATTGA ATCCTAACGA GGAAATCAGC 180
Figure imgf000098_0001
Figure imgf000098_0002
c > o
GTCAACAGCG GTGCCACCAA GATAACCGGT GACCTGACCT TCGATACTTC CTACAACGAC 1800
CTCGACCTCT ACCTCTACGA CCCCAACGGC AACCTCGTTG ACAGGTCCAC GTCGAGCAAC 1860
AGCTACGAGC ACGTCGAGTA CGCCAACCCC GCCCCGGGAA CCTGGACGTT CCTCGTCTAC 1920
GCCTACAGCA CCTACGGCTG GGCGGACTAC CAGCTCAAGG CCGTCGTCTA CTACGGG 1977 配列番号 ： 7
配列の長さ ： 4 7 6 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ：二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： Genomic DNA
起源 ： ピロコッカス · フ リォサス
株名 ： D S M 3 6 3 8
配列 ：
TTTAAATTAT AAGATATAAT CACTCCGAGT GATGAGTAAG ATACATCATT ACAGTCCCAA 60 AATGTTTATA ATTGGAACGC AGTGAATATA CAAAATGAAT ATAACCTCGG AGGTGACTGT 120 AGAATGAATA AGAAGGGACT TACTGTGCTA TTTATAGCGA TAATGCTCCT TTCAGTAGTT 180
CCAGTGCACT TTGTGTCCGC AGAAACACCA CCGGTTAGTT CAGAAAATTC AACAACTTCT 240
ATACTCCCTA ACCAACAAGT TGTGACAAAA GAAGTTTCAC AAGCGGCGCT TAATGCTATA 300
ATGAAAGGAC AACCCAACAT GGTTCTTATA ATCAAGACTA AGGAAGGCAA ACTTGAAGAG 360
GCAAAAACCG AGCTTGAAAA GCTAGGTGCA GAGATTCTTG ACGAAAATAG AGTTCTTAAC 420
ATGTTGCTAG TTAAGATTAA GCCTGAGAAA GTTAAAGAGC TCAACTATAT CTCATCTCTT 480
GAAAAAGCCT GGCTTAACAG AGAAGTTAAG CTTTCCCCTC CAATTGTCGA AAAGGACGTC 540
AAGACTAAGG AGCCCTCCCT AGAACCAAAA ATGTATAACA GCACCTGGGT AATTAATGCT 600
CTCCAGTTCA TCCAGGAATT TGGATATGAT GGTAGTGGTG TTGTTGTTGC AGTACTTGAC 660
ACGGGAGTTG ATCCGAACCA TCCTTTCTTG AGCATAACTC CAGATGGACG CAGGAAAATT 720 ATAGAATGGA AGGATTTTAC AGACGAGGGA TTCGTGGATA CATCATTCAG CTTTAGCAAG 780 GTTGTAAATG GGACTCTTAT AATTAACACA ACATTCCAAG TGGCCTCAGG TCTCACGCTG 840 AATGAATCGA CAGGACTTAT GGAATACGTT GTTAAGACTG TTTACGTGAG CAATGTGACC 900 ATTGGAAATA TCACTTCTGC TAATGGCATC TATCACTTCG GCCTGCTCCC AGAAAGATAC 960
TTCGACTTAA ACTTCGATGG TGATCAAGAG GACTTCTATC CTGTCTTATT AGTTAACTCC 1020
ACTGGCAATG GTTATGACAT TGCATATGTG GATACTGACC TTGACTACGA CTTCACCGAC 1080
GAAGTTCCAC TTGGCCAGTA CAACGTTACT TATGATGTTG CTGTTTTTAG CTACTACTAC 1140
GGTCCTCTCA ACTACGTGCT TGCAGAAATA GATCCTAACG GAGAATATGC AGTATTTGGG 1200
TGGGATGGTC ACGGTCACGG AACTCACGTA GCTGGAACTG TTGCTGGTTA CGACAGCAAC 1260
AATGATGCTT GGGATTGGCT CAGTATGTAC TCTGGTGAAT GGGAAGTGTT CTCAAGACTC 1320
TATGGTTGGG ATTATACGAA CGTTACCACA GACACCGTGC AGGGTGTTGC TCCAGGTGCC 1380
CAAATAATGG CAATAAGAGT TCTTAGGAGT GATGGACGGG GTAGCATGTG GGATATTATA 1440
GAAGGTATGA CATACGCAGC AACCCATGGT GCAGACGTTA TAAGCATGAG TCTCGGTGGA 1500
AATGCTCCAT ACTTAGATGG TACTGATCCA GAAAGCGTTG CTGTGGATGA GCTTACCGAA 1560
AAGTACGGTG TTGTATTCGT AATAGCTGCA GGAAATGAAG GTCCTGGCAT TAACATCGTT 1620
GGAAGTCCTG GTGTTGCAAC AAAGGCAATA ACTGTTGGAG CTGCTGCAGT GCCCATTAAC 1680
GTTGGAGTTT ATGTTTCCCA AGCACTTGGA TATCCTGATT ACTATGGATT CTATTACTTC 1740
CCCGCCTACA CAAACGTTAG AATAGCATTC TTCTCAAGCA GAGGGCCGAG AATAGATGGT 1800
GAAATAAAAC CCAATGTAGT GGCTCCAGGT TACGGAATTT ACTCATCCCT GCCGATGTGG 1860
ATTGGCGGAG CTGACTTCAT GTCTGGAACT TCGATGGCTA CTCCACATGT CAGCGGTGTC 1920
GTTGCACTCC TCATAAGCGG GGCAAAGGCC GAGGGAATAT ACTACAATCC AGATATAATT 1980
AAGAAGGTTC TTGAGAGCGG TGCAACCTGG CTTGAGGGAG ATCCATATAC TGGGCAGAAG 2040
TACACTGAGC TTGACCAAGG TCATGGTCTT GTTAACGTTA CCAAGTCCTG GGAAATCCTT 2100
AAGGCTATAA ACGGCACCAC TCTCCCAATT GTTGATCACT GGGCAGACAA GTCCTACAGC 2160
GACTTTGCGG AGTACTTGGG TGTGGACGTT ATAA AGGTC TCTACGCAAG GAACTCTATA 2220
CCTGACATTG TCGAGTGGCA CATTAAGTAC GTAGGGGACA CGGAGTACAG AACTTTTGAG 2280 C AGMACTG
Figure imgf000101_0001
CMATCTA
Figure imgf000101_0002
CTCTSAC
-Τ2 GCAACAATAG TGGTTCCTGT TCCTAAGAAG GCCGAAAACA TCGAGGTAA (； TGGAGACCAC 3900
GTAATTTCCT ATAGTATAGA GGAAGGAGAG TACGCCAAGT ACGTTATAAT TACAGTGAAG 3960
TTTGCATCAC CTGTAACAGT AACTGTTACT TACACTATCT ATGCTGGCCC AAGAGTCTCA 4020
ATCTTGACAC TTAACTTCCT TGGCTACTCA TGGTACAGAC TATATTCACA GAAGTTTGAC 4080
GAATTGTACC AAAAGGCCCT TGAATTGGGA GTGGACAACG AGACATTAGC TTTAGCCCTC 4140
AGCTACCATG AAAAAGCCAA AGAGTACTAC GAAAAGGCCC TTGAGCTTAG CGAGGGTAAC 4200
ATAATCCAAT ACCTTGGAGA CATAAGACTA TTACCTCCAT TAAGACAGGC ATACATCAAT 4260
GAAATGAAGG CAGTTAAGAT ACTGGAAAAG GCCATAGAAG AATTAGAGGG TGAAGAGTAA 4320
TCTCCAATTT TTCCCACTTT TTCTTTTATA ACATTCCAAG CCTTTTCTTA GCTTCTTCGC 4380
TCATTCTATC AGGAGTCCAT GGAGGATCAA AGGTAAGTTC AACCTCCACA TCTCTTACTC 4440
CTGGGATTTC GAGTACTTTC TCCTCTACAG CTCTAAGAAG CCAGAGAGTT AAAGGACACC 4500
CAGGAGTTGT CATTGTCATC ΤΤΤΑΤΑΤΑΤΛ CCGTTTTGTC AGGATTAATC TTTAGCTCAT 4560
AAATTAATCC AAGGTTTACA ACATCCATCC CAATTTCTGG GTCGATAACC TCCTTTAGCT 4620
TTTCCAGAAT CATTTCTTCA GTAATTTCAA GGTTCTCATC TTTGGTTTCT CTCACAAACC 4680
CAATTTCAAC CTGCCTGATA CCTTCTAACT CCCTAAGCTT GTTATATATC TCCAAAAGAG 4740
TGGCATCATC AATTTTCTCT TTAAA 3' 4765 配列番号： 8
配列の長さ ： 1 3 9 8
配列の型 ： アミ ノ酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ペプチ ド
配列 ：
Met Asn Lys Lys Gly Leu Thr Va l Leu Phe l i e Ala l ie Met Leu
5 10 15 Leu Ser Val Val Pro Val His Phe Val Ser Ala Glu Thr Pro Pro
20 25 30
Val Ser Ser Glu Asn Ser Thr Thr Ser l ie Leu Pro Asn Gin Gin
35 40 45
Val Val Thr Lys Glu Val Ser Gin Ala Ala Leu Asn Ala l ie Met
50 55 60 lys Gly Cln Pro Asn Met Val し eu He l ie Lys Thr Lys Glu Gly
65 70 75 し ys し eu Glu Glu Ala Lys Thr Glu Leu Glu Lys Leu Gly Ala Glu
80 85 90 l ie Leu Asp Glu Asn Arg Val Leu Asn Met Leu し eu Val し ys He
95 100 105
Lys Pro Glu Lys Val Lys Glu し eu Asn Tyr lie Ser Ser Leu Glu
110 115 120
Lys Ala Trp Leu Asn Arg Glu Val Lys Leu Ser Pro Pro lie Val
125 130 135
Glu Lys Asp Val Lys Thr Lys Glu Pro Ser Leu Glu Pro Lys Met
140 145 150
Tyr Asn Ser Thr Trp Val He Asn Ala Leu Gin Phe lie Gin Glu
155 160 165
Phe Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Val Val Val Ala Val Leu Asp Thr
170 175 180
Gly Val Asp Pro Asn His Pro Phe Leu Ser lie Thr Pro Asp Gly
185 190 195
Arg Arg Lys lie l i e Glu Trp Lys Asp Phe Thr Asp Glu Gly Phe
200 205 210 Val Asp Thr Ser Phe Ser Phe Ser Lys Val Val Asn Gly Thr Leu
215 220 225 lie l ie Asn Thr Thr Phe Gin Val Ala Ser Gly Leu Thr Leu Asn
230 235 240
Glu Ser Thr Gly Leu Met Glu Tyr Val Val Lys Thr Val Tyr Val
245 250 255
Ser Asn Val Thr lie Gly Asn lie Thr Ser Ala Asn Gl y l ie Tyr
260 265 270
His Phe Gl y し eu Leu Pro Glu Arg Tyr Phe Asp し eu Asn Phe Asp
275 280 285
Gly Asp Gin Glu Asp Phe Tyr Pro Val Leu Leu Val Asn Ser Thr
290 295 300
Gly Asn Gly Tyr Asp lie Ala Tyr Val Asp Thr Asp Leu Asp Tyr
305 310 315
Asp Phe Thr Asp Glu Val Pro Leu Gly Gin Tyr Asn Val Thr Tyr
320 325 330
Asp Val Ala Val Phe Ser Tyr Tyr Tyr Gly Pro Leu Asn Tyr Val
335 340 345
Leu Ala Glu lie Asp Pro Asn Gly Glu Tyr Ala Val Phe Gl y Trp
350 355 360
Asp Gly His Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Gly
365 370 375
Tyr Asp Ser Asn Asn Asp Ala Trp Asp Trp し eu Ser Met Tyr Ser
380 385 390
Gly Glu Trp Glu Val Phe Ser Arg Leu Tyr Gly Trp Asp Tyr Thr
395 400 405 Asn Va l Thr Thr Asp Thr Val Gin G l y Val Ala Pro Gly Ala Gin
410 415 420 l ie Met Ala lie Arg Val し eu Arg Ser Asp Gly Arg Gly Ser Met
425 430 435
Trp Asp He He Glu Gly Met Thr Tyr Ala Ala Thr His Gly Ala
440 445 450
Asp Val lie Ser Met Ser Leu Gly Gly Asn Ala Pro Tyr Leu Asp
455 460 465
Gly Thr Asp Pro Glu Ser Val Ala Val Asp Glu Leu Thr Glu Lys
470 475 480
Tyr Gly Val Val Phe Val lie Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro Gly
485 490 495 lie Asn lie Val Gly Ser Pro Gly Val Ala Thr Lys Ala l ie Thr
500 505 510
Val Gly Ala Ala Ala Val Pro lie Asn Val Gly Val Tyr Val Ser
515 520 525
Gin Ala Leu Gly Tyr Pro Asp Tyr Tyr Gly Phe Tyr Tyr Phe Pro
530 535 540
Ala Tyr Thr Asn Val Arg lie Ala Phe Phe Ser Ser Arg Gly Pro
545 550 555
Arg He Asp Gly Glu He Lys Pro Asn Val Val Ala Pro Gly Tyr
560 565 570
Gly lie Tyr Ser Ser Leu Pro Met Trp lie Gly Gly Ala Asp Phe
575 580 585
Met Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Val Val
590 595 600 Al a Leu Lcu l ie Ser Gly Ala Lys Ala Glu Gl y l ie Tyr Tyr Asn
605 610 615
Pro Asp l i e l ie Lys Lys Val し eu Gl u Ser Gl y Ala Thr Trp し eu
620 625 630
Glu Gly Asp Pro Tyr Thr G ly Gin Lys Tyr Thr Glu Leu Asp Gin
635 640 645
Gly His Gly Leu Val Asn Val Thr Lys Ser Trp Glu l ie Leu Lys
650 655 660
Ala lie Asn Gly Thr Thr Leu Pro l ie Val Asp His Trp Ala Asp
665 670 675 lys Ser Tyr Ser Asp Phe Ala Glu Tyr し eu Gly Val Asp Val lie
680 685 690
Arg Gly Leu Tyr Ala Arg Asn Ser lie Pro Asp lie Val Glu Trp
695 700 705
His lie Lys Tyr Val Gly Asp Thr Glu Tyr Arg Thr Phe Glu lie
710 715 720
Tyr Ala Thr Glu Pro Trp l ie Lys Pro Phe Val Ser Gly Ser Val
725 730 735 l ie し eu Glu Asn Asn Thr Glu Phe Val し eu Arg Val Lys Tyr Asp
740 745 750
Val Glu Gly Leu Glu Pro Gly Leu Tyr Val Gly Arg lie lie lie
755 760 765
Asp Asp Pro Thr Thr Pro Val lie Glu Asp Glu lie Leu Asn Thr
770 775 780 l ie Val l i e Pro Glu Lys Phe Thr Pro Glu Asn Asn Tyr Thr Leu
785 790 795 Thr Trp Tyr Asp He Asn Gly Pro G lu Met Val Thr Hi s Hi s Phe
800 805 810
Phe Thr Val Pro Glu Gly Val Asp Val Leu Tyr Ala Met Thr Thr
815 820 825
Tyr Trp Asp Tyr Gly Leu Tyr Arg Pro Asp Gly Met Phe Val Phe
830 835 840
Pro Tyr Gin Leu Asp Tyr Leu Pro Ala Ala Val Ser Asn Pro Met
845 850 855
Pro Gly Asn Trp Glu Leu Val Trp Thr Gly Phe Asn Phe Ala Pro
860 865 870
Leu Tyr Glu Ser Gly Phe Leu Val Arg l ie Tyr Gly Val Glu lie
875 880 885
Thr Pro Ser Val Trp Tyr lie Asn Arg Thr Tyr Leu Asp Thr Asn
890 895 900
Thr Glu Phe Ser lie Glu Phe Asn lie Thr Asn He Tyr Ala Pro
905 910 915 l ie Asn Ala Thr Leu He Pro l ie Gly Leu Gly Thr Tyr Asn Ala
920 925 930
Ser Val Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Phe Phe lie Lys Gly lie
935 940 945
Glu Val Pro Glu Gly Thr Ala Glu Leu Lys lie Arg lie Gly Asn
950 955 960
Pro Ser Val Pro Asn Ser Asp Leu As し eu Tyr eu Tyr Asp Ser
965 970 975
Lys Gly Asn Leu Val Ala し eu Asp Gly Asn Pro Thr Ala Glu Glu
980 985 990 l u Val Va l Vai Glu Tyr Pro Lys Pro Gl y Val Tyr Ser l ie Val 995 1000 1005
Val His Gly Tyr Ser Val Arg Asp Glu Asn Gly Asn Pro Thr Thr
1010 1015 1020
Thr Thr Phe Asp Leu Val Val Gin Met Thr Leu Asp Asn Gl y Asn
1025 1030 1035 l ie し ys leu Asp Lys Asp Ser l ie l ie Leu Gly Ser Asn Gl u Ser
1040 1045 1050
Val Val Val Thr Ala Asn lie Thr lie Asp Arg Asp Hi s Pro Thr
1055 1060 1065
Gly Val Tyr Ser Gly lie l ie Glu lie Arg Asp Asn Glu Val Tyr
1070 1075 1080
Gin Asp Thr Asn Thr Ser l ie Ala Lys lie Pro lie Thr Leu Val
1085 1090 1095 lie Asp Lys Ala Asp Phe Ala Val Gly Leu Thr Pro Ala Glu Gly
1100 1105 1110
Val Leu Gly Glu Ala Arg Asn Tyr Thr Leu l ie Val Lys His Ala
1115 1120 1125
Leu Thr Leu Glu Pro Val Pro Asn Ala Thr Val lie lie Gly Asn
1130 1135 1140
Tyr Thr Tyr Leu Thr Asp Glu Asn Gly Thr Val Thr Phe Thr Tyr
1145 1150 1155
Ala Pro Thr Lys Leu Gly Ser Asp Glu l ie Thr Val lie Val Lys
1160 1165 1170
Lys Glu Asn Phe Asn Thr Leu Gl u Lys Thr Phe Gin l ie Thr Val
1175 1180 1185 Ser Glu Pro Glu He Thr Glu Glu Asp l ie Asn Glu Pro Lys Leu
1190 1195 1200
Ala Met Ser Ser Pro Glu Ala Asn Ala Thr l ie Val Ser Val Glu
1205 1210 1215
Met Glu Ser Glu Gl y Gly Val Lys Lys Thr Val Thr Val Glu lie
1220 1225 1230
Thr lie Asn Gly Thr Ala Asn Glu Thr Ala Thr lie Val Val Pro
1235 1240 1245
Val Pro Lys Lys Ala Glu Asn lie Glu Val Ser Gly Asp His Val
1250 1255 1260 l ie Ser Tyr Ser lie Glu Glu Gly Glu Tyr Ala Lys Tyr Val He
1265 1270 1275
He Thr Val Lys Phe Ala Ser Pro Val Thr Val Thr Val Thr Tyr
1280 1285 1290
Thr lie Tyr Ala Gly Pro Arg Val Ser He し eu Thr Leu Asn Phe
1295 1300 1305
Leu Gly Tyr Ser Trp Tyr Arg Leu Tyr Ser Gin lys Phe Asp Glu
1310 1315 1320 し eu Tyr Gin し ys Ala Leu Glu Leu Gly Val Asp Asn Glu Thr Leu
1325 1330 1335
Ala Leu Ala Leu Ser Tyr His Glu Lys Ala Lys Glu Tyr Tyr Glu
1340 1345 1350
Lys Ala Leu Glu Leu Ser Glu Gly Asn lie lie Gin Tyr Leu Gly
1355 1360 1365
Asp lie Arg Leu Leu Pro Pro Leu Arg Gin Ala Tyr lie Asn Glu
1370 1375 1380 Met Lys Ala Val Lys lie Leu Glu Lys Ala H e Glu Glu Leu Glu 1385 1390 1395
Gl y Glu Glu 配列番号： 9
配列の長さ ： 3 5
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA )
配列：
GGWWSDRRTG TTRRllGTHGC DGTDMTYGAC ACBGG 35 配列番号： 1 0
配列の長さ ： 3 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
卜ホロジ一：直鎖状
配列の種類：他の核酸 〔合成 DNA)
配列：
KSTCACGGAA CTCACGTDGC BGGMACDGTT GC 32 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 3 3
配列の型：核酸 一 1ϋ8 - 鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 （台成 DNA)
配列：
ASCMGCAACH GTKCCVGCHA CGTGAGTTCC GTG 33 配列番号 ： 12
配列の長さ ： 34
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 （合成 匪)
配列：
CHCCGSYVAC RTGBGGAGWD GCCATBGAVG TDCC 34 配列番号 ： 13
配列の長さ ： 145
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ：他の核酸 （ P C R断片）
配列 ：
A GTT GCG GTA ATT GAC ACG GGT ATA GAC GCG AAC CAC CCC GAT CTG 46 Val Ala Val lie Asp Thr Gly lie Asp Ala Asn His Pro Asp Leu
δ 10 15 AAG GGC AAG GTC ATA GGC TGG TAC GAC GCC GTC AAC GGC AGG TCG 91
Lys Gly Lys Val lie Gly Trp Tyr Asp Ala Val Asn Gly Arg Ser
20 25 30
ACC CCC TAC GAT GAC CAG GGA CAC GGA ACT CAC GTN GCN GGA ACN 136
Thr Pro Tyr Asp Asp Gin Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr
35 40 45
GTT GCT GGT 145 Val Ala Gly 配列番号： 14
配列の長さ ： 564
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （ P C R断片）
配列：
TCT CAC GGA ACT CAC GTG GCG GGA ACA GTT GCC GGA ACA GGC AGC
Ser His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Gly Thr Gly Ser
5 10 15
GTT AAC TCC CAG TAC ATA GGC GTC GCC CCC GGC GCG AAG CTC GTC 90 Val Asn Ser Gin Tyr lie Gly Val Ala Pro Gly Ala Lys Leu Val
20 25 30
GGT GTC AAG GTT CTC GGT GCC GAC GGT TCG GGA AGC GTC TCC ACC 13;» Gly Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser Val Ser Thr
35 40 45
ATC ATC GCG GGT GTT GAC TGG GTC GTC CAG AAC AAG GAT AAG TAC 180 lie lie Ala Gly Val Asp Trp Val Val Gin Asn し ys Asp Lys Tyr 50 55 60
GGG ATA AGG GTC
Gly lie Arg Val
GAC GGA GCC GAC
Asp Gly Ala Asp
GCC GGT ATA GTA
Ala Gly lie Val
ACC TAC ACC GTC
Thr Tyr Thr Val
GTC GGT GCA GTT
Val Gly Ala Val
AGG GGA CCG ACC
Arg Gly Pro Thr
CCC GGC GTT GAC
Pro Gly Val Asp
GGC ACC CCG ATA
Figure imgf000113_0001
Gly Thr Pro lie Asn Asp Tyr Tyr Thr Lys Ala Ser Gly Thr Ser
170 175 180 ΛΤ(; GCC ACT CCC CAT GTT ACC GGT 564 Met Ala Thr Pro His Val Thr Gly
185 配列番号 ： 1 5
配列の長さ ： 1 8 5 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： Genomic DNA
起源 ： サ一モコッカス ' セラー
株名 ： D S M 2 4 7 6
配列 ：
GAGCTCCGAC GGAACCGACT CCCTCAGTCA GGCCGTCAAC AACGCCTGGG ACGCCGGTAT 60 AGTAGTCTGC GTCGCCGCCG GCAACAGCGG GCCGAACACC TACACCGTCG GCTCACCCGC 120 CGCCGCGAGC AAGGTCATAA CCGTCGGTGC AGTTGACAGC AACGACAACA TCGCCAGCTT 180 CTCCAGCAGG GGACCGACCG CGGACGGAAG GCTCAAGCCG GAAGTCGTCG CCCCCGGCGT 240 TGACATCATA GCCCCGCGCG CCAGCGGAAC CAGCATGGGC ACCCCGATAA ACGACTACTA 300 CACCAAGGCC TCTGGAACCA GCATGGCCAC CCCGCACGTT TCGGGCGTTG GCGCGCTCAT 360 CCTCCAGGCC CACCCGAGCT GGACCCCGGA CAAGGTGAAG ACCGCCCTCA TCGAGACCGC 420 CGACATAGTC GCCCCCAAGG AGATAGCGGA CATCGCCTAC GGTGCGGGTA GGGTGAACGT 480 CTACAAGGCC ATCAAGTACG ACGACTACGC CAAGCTCACC TTCACCGGCT CCGTCGCCGA 540 CAAGGGAAGC GCCACCCACA CCTTCGACGT CAGCGGCGCC ACCTTCGTGA CCGCCACCCT 600 CTACTGGGAC ACGGGCTCGA CCGACATCGA CCTCTACCTC TACGACCCCA ACGGGAACGA 660 GGTTGACTAC TCCTACACCG CCTACTACGG CTTCGAGAAG GTCGGCTACT ACAACCCGAC 720 CGCCGGAACC TGGACGGTCA AGGTCGTCAG CTACAAGGGC GCGGCGAACT ACCAGGTCGA 780
11 9― CGTCGTCAGC GACGGGAGCC TCAGCCAGTC CGGCGGCGGC AACCCGAATC CAAACCCCAA 840
CCCGAACCCA ACCCCGACCA CCGACACCCA GACCTTCACC GGTTCCGTTA ACGACTACTG 900
GGACACCAGC GACACCTTCA CCATGAACGT CAACAGCGGT GCCACCAAGA TAACCGGTGA 960
CCTGACCTTC GATACTTCCT ACAACGACCT CGACCTCTAC CTCTACGACC CCAACGGCAA 1020
CCTCGTTGAC AGGTCCACGT CGAGCAACAG CTACGAGCAC GTCGAGTACG CCAACCCCGC 1080
CCCGGGAACC TGGACGTTCC TCGTCTACGC CTACAGCACC TACGGCTGGG CGGACTACCA 1140
GCTCAAGGCC GTCGTCTACT ACGGGTGAAG GTTTTTAATC CCCTTTTCTT TCCCCTTTTG 1200
AGGTGGTTGG GATGAAGCGG GTTCTTGCGG CGATCCTTGT AATCATGCTC ATCGGATTAT 1260
CATTCCCTGC CGGAAGTGCT AAAATCGAGC CCTACGTTTA CAGCCCCACC GTTCCGGATA 1320
CCGCCTTCGC GGTTCTCACC CTGTACAGGA CCGGGGACTA CGCCCGGGTT CTCGAGGGAT 1380
ACGAGTGGCT CCTCCAGATG AGAACTCCCA TCGATTCGTG GGGGGTTTCC CGCGGGGAAA 1440
CGCACATGGC CAAGTACACG GCAATGGCGA TGCTGGCCCT CATGCGCGGC GAGAACGTGG 1500
CGAGGGGGCG TTACAGGGAT GTTCTCAACG ACGCCGCGTA CTGGTTAATA TACAAACAGA 1560
ACCCGGACGG CTCGTGGGAG GACTACACCG GAACGGCGCT GGCCGTCATC GCGCTCGGGG 1620
AGTTCCTTAA GGGCGGGTAC ATCAACGCGA ACCTGACCGG CTTCAAAAAG CAGGTTAAAG 1680
AGGCCGTAAA CCGCGGGGAA GGCTGGCTGA TGGATGCGGA CCCAAAAACG GACGCGGATA 1740
GAATATTCGG CTACCTCGCC CTCGGTAAAA AGGACGAACT CAAAAAGATG AACCCTTCCG 1800
GTGACCTGAA GGCCTACCGC GCCTTTGCAC TTGCCTACCT CGGGGAGAGG GTCGAGCTC 1859 配列番号： 1 6
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成
配列： TGTAGTAGTC GTTTATCGGG 20 配列番号： 1 7
配列の長さ ： 1 4 6 4
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
配列：
AAGCTTAACA TCGAGCGCTC CACCTCTAAA GTAGGTGAGT GTGGATACGA AGGTTAGGGC 60 CGCTATGACG ACCTTCAGGA TCCCAACGGC TTCTTTTATG GGGAGCCCGG CGAAGGTGAG 120 AATTGAAAGG ATTACCATAC TCCCTCCGCT CATCATGGAG CCTATGAATC CCCCTCCAAA 180
AGAGAGAAGT GCTATAAGGA GCGTCCTCAT GTTCCATGCT ATGTTTTGGT ATTTAATGCT 240
TTTCCGCTTA ATGTTACACC TCCTCATGAC AATTTCGCGT TTAGGGATGG GGTTAATTGG 300
ACCCCTCCGA GCCACGGGTT GATGTCCATT ATGTCGATAT TCACCATCTT ATCCCCAACT 360
TTGTGGGTTT CAAACATTAC CCTACGTTAT ATTTTTATCG TCCTAATTAA CTGCTGAAAC 420
GCGCGCTTAT CGTTCATCGT TGATGGTTTT GGGTGACCGG GCATTAAGGA ATTGTGTCGT 480
TTGCTGAAAT TTATGAAACG GAGTTGGCTT CTTTATGTTA CATAAAGATG TACATTACTG 540
TAATGTATAT AAATGGAAGA AACACTGTTG CGTAAACTTT TTAATGTATC CAATATCAGT 600
ACTTCGATGT CCCGATATGG GACATGTTGG ATAGGAGGGT ACTGGAATGA AGAGGTTAGG 660
TGCTGTGGTG CTGGCACTGG TGCTCGTGGG TCTTCTGGCC GGAACGGCCC TTGCGGCACC 720
CGTAAAACCG GTTGTCAGGA ACAACGCGGT TCAGCAGAAG AACTACGGAC TGCTGACCCC 780
GGGACTGTTC AAGAAAGTCC AGAGGATGAA CTGGAACCAG GAAGTGGACA CCGTCATAAT 840
GTTCGGGAGC TACGGAGACA GGGACAGGGC GGTTAAGGTA CTGAGGCTCA TGGGCGCCCA 900
GGTCAAGTAC TCCTACAAGA TAATCCCTGC TGTCGCGGTT AAAATAAAGG CCAGGGACCT 960
TCTGCTGATC GCGGGCATGA TAGACACGGG TTACTTCGGT AACACAAGGG TCTCGGGCAT 1020 AAAGTTCATA CAGGAGGATT ACAAGGTTCA GGTTGACGAC GCCACTTCCG TCTCCCAGAT 1080
AGGGGCCGAT ACCGTCTGGA ACTCCCTCGG CTACGACGGA AGCGGTGTGG TGGTTGCCAT 1140
CGTCGATACG GGTATAGACG CGAACCACCC CGATCTGAAG GGCAAGGTCA TAGGCTGGTA 1200
CGACTCCGTC AACGGCAGGT CGACCCCCTA CGATGACCAG GGACACGGAA CCCACGTTGC 1260
GGGTATCGTT GCCGGAACCG GGAGCGTTAA CTCCCAGTAC ATAGGCGTCG GCCCCGGCGC 1320
GAAGCTCGTC GGCGTCAAGG TTCTCGGTTC CGACGGTTCG GGAAGCGTCT CCACCATCAT 1380
CGCGGGTGTT GACTGGAACG TCCAGAACTA GGACAAGTAC GGGATAAGGG TCATCAACCT 1440
CTCCCTCGGC TCCTCCCAGA GCTC 1464 - I
5
配列番号： 1 8
配列の長さ ： 3 3
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DM )
配列：
AAAAGAATTC GGATCCATGA AGAGGTTAGG TGC 33 配列番号： 1 9
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列： TTTTATCGAT CAGGCGTCCC AGGCCTTG 配列番号： 2 0
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列：
CATTATAGGT AAGAGAGGAA TG 22 配列番号： 2 1
配列の長さ ： 3 0 2o o 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （台成 DNA)
配列：
GATCCATTCC TCTCTTACCT ATAATGGTAC 30
配列番号： 2 2
配列の長さ ： 1 9
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状 配列の種類： 他の核酸 （台成 DNA)
配列：
TAGCAGTAAT TGACACGGG 19 配列番号： 2 3
配列の長さ ： 1 9
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
卜ポロジ一 ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列：
TAGCAGTAAT TGACACTGG 19 配列番号： 2 4
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列：
CTGTTCCAGC TACGTGAGTT CC 22 配列番号： 2 5
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸 鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 （台成 DNA )
配列：
CTGTTCCAGC TACATGAGTT CC 配列番号 ： 2 6
配列の長さ ： 5 0 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： Genomic DNA
起源 ： ピロコッカス · フ リォサス
9
株名 ： D S M 3 6 3 8
配列 ：
A CTA GTC ATC TCA GGT TTA ACA GGG GGT AAA GCT AAG CTT TCA GGT 46 Leu Val l ie Ser Gly Leu Thr Gly Gly Lys Ala Lys し eu Ser Gly
δ 10 15
GTT AGG TTT ATC CAG GAA GAC TAC AAA GTT ACA GTT TCA GCA GAA 91 Val Arg Phe He Gin Glu Asp Tyr Lys Val Thr Val Ser Ala Glu
20 25 30
TTA GAA GGA CTG GAT GAG TCT GCA GCT CAA GTT ATG GCA ACT TAC 136 し eu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin Val Met Ala Thr Tyr
35 40 45
GTT TGG AAC TTG GGA TAT GAT GGT TCT GGA ATC ACA ATA GGA ATA ；.81 VaJ Γτρ Asn し eu Gly Tyr Asp Gl y Ser Gly l ie Thr l ie Gly lie
50 60
ΛΤΤ GAC ACT GGA ATT GAC GCT TCT CAT CCA GAT CTC CAA GGA AAA
l ie Asp Thr Gly l ie Asp Ala Ser His Pro Asp し eu Gin Gly Lys
65 70 75
GTA ATT GGG TGG GTA GAT TTT GTC AAT GGT AGG AGT TAT CCA TAC
Val l ie Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr
80 85 90
GAT GAC CAT GGA CAT GGA ACT CAT GTA GCT TCA ATA GCA GCT GGT
Asp Asp His Gly Hi s Gly Thr His Val Ala Ser lie Ala Ala Gly
95 100 105
ACT GGA GCA GCA AGT AAT GGC AAG TAC AAG GGA ATG GCT CCA GGA
Thr Gly Ala Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly
110 115 120
GCT AAG CTG GCG GGA ATT AAG GTT CTA GGT GCC GAT GGT TCT GGA
Ala Lys Leu Ala Gly lie し ys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly
125 130 135 6 o 9 o 23 675527196 o 66 o 5 o 65 o 6 - o . _ 657 i 1
AGC ATA TCT ACT ATA ATT AAG GGA GTT GAG TGG GCC GTT GAT AAC
Ser lie Ser Thr He lie Lys Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn
140 145 150
AAA GAT AAG TAC GGA ATT AAG GTC ATT AAT CTT TCT CTT GGT TCA
Lys Asp Lys Tyr Gly lie し ys Val lie Asn し eu Ser し eu Gly Ser
155 160 165
AGC CAG AGC TC
Ser Gin Ser 配列番号 ： 2 7
配列の長さ ： 3 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 （合成 DNA )
配列：
TGACACTGGA ATTGACGCTT CTCATCCAGA 30
配列番号 .. 2 8
配列の長さ ： 3 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 （合成 DNA)
配列：
TCTCCAAGGA AAAGTAATTG GGTGGGTAGA 30
配列番号 ： 2 9
配列の長さ ： 3 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 （合成 DNA)
配列： GTTGCCATAA CTTGAGCTGC AGACTCATCC 30 配列番号 ： 3 0
配列の長さ ： 4 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 （PCR断片）
配列 ：
TTTATTAAGC ATAAAATAGC CATGCAACTT TGATCACTAA TGTGCGGTGG TGCAC ATG 59
Met
AAG GGG CTG AAA GCT CTC ΑΤΛ TTA GTG ATT TTA GTT CTA GGT TTC 104 lys Gly Leu し ys Ala Leu l ie Leu Val l ie し eu Val Leu Gly し eu
10 15
GTA GTA GGG AGC GTA GCG GCA GCT CCA GAG AAG AAA GTT GTT CAA 149
2
3 Val Val Gly Ser Val Ala Ala Ala Pro Glu Lys Lys Val Val Gin 9 20 25 30
GTA AGA AAT GTT GAG AAG AAC TAT GGT CTG CTA ACG CCA GGA CTG 194 Val Arg Asn Val Glu Lys Asn Tyr Gly し eu し eu Thr Pro Gly Leu
35 40 45
TTC AGA AAA ATT CCC AAA TTG GAT CCT AAC GAG GGA ATC AGC ACA
Phe Arg Lys l ie Pro し ys Leu Asp Pro Asn Glu Gly l i e Ser Thr
50 55 60
GTA ATT GTA TTT GTT AAC CAT AGG GGA AAA GAA ATT GCA GTA AGA 284 Val l ie Val Phe Val Asn Hi s Arg Gly し ys Glu l ie Ala Val Arg 一 12 ) 65 70 75
GTT CTT GAG TTA ATG GGT GCC CAA GTT AGG ΤΛΤ GTG TAC CAT ATT 329
Val Leu Glu Leu Met Gly Al a Gin Val Arg Tyr Val Tyr His He
80 85 90
ΑΤΛ CCC CCA ATA GCT GCC GAT CTT AAG GTT AGA GAC TTA CTA GTC 374 l ie Pro Pro lie Ala Ala As し eu Lys Val Arg Asp Leu Leu Val
95 100 105
ATC TCA GGT TTA ACA GGG GGT GAA ACT AAG CTT TCA GGT GTT AGG T 420 lie Ser Gly Leu Thr Gly Gly Glu Thr Lys し eu Ser Gly Val Arg
110 115 120 配列番号： 3 1
配列の長さ ： 4 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （PCR断片）
配列：
GCTCTAGACT CTGGGAGGAG TAGTTATACT TGATGAAGCC TATTCTGAGT TTTCGGGAAA 60 AAGCTTCATA CCAAAAATCA GTGAGTATGA AAATTTAGTA ATTCTAAGGA CGTTTTCAAA 120 GGCGTTTGGA CTTGCTGGAA TTAGATGTGG ATATATGATA GCAAATGAAA AGATTATAGA 180 配列番号： 3 2
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 （合成 DNA)
配列 ：
AGAGGGATCC ATGAAGGGGC TGAAAGCT 28
配列番号： 33
配列の長さ ： 28
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 （台成 DNA)
配列 ：
AGAGGCATGC GCTCTAGACT CTGGGAGAGT 28 配列番号 ： 34
配列の長さ ： 1962
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ：二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： Genomic DNA
起源 ： ピロコッカス . フ リォサス
株名 ： DSM3638
配列 ：
ATGAAGGGGC TGAAAGCTCT CATATTAGTG ATTTTAGTTC TAGGTTTGGT AGTAGGGAGC 60 GTAGCGGCAG CTCCAGAGAA GAAAGTTGAA CAAGTAAGAA ATGTTGAGAA GAACTATGGT 120
Figure imgf000126_0001
r an
ACTCAST C AMTAGC TCCGATCACT ACTACTATGA CAGGAGCGAC ACCTTTACAA TGACCGTTAA CTCTGGGGCT 1740
ACAAAGATTA CTGGAGACCT AGTGTTTGAC ACAAGCTACC ATGATCTTGA CCTTTACCTC 1800
TACGATCCTA ACCAGAAGCT TGTAGATAGA TCGGAGAGTC CCAACAGCTA CGAACACGTA I860
GAATACTTAA CCCCCGCCCC AGGAACCTGG TACTTCCTAG TATATGCCTA CTACACTTAC 1920
GGTTGGGCTT ACTACGAGCT GACGGCTAAA GTTTATTATG GC 1962 配列番号 ： 3 5
配列の長さ ： 6 5 4
配列の型 ： アミ ノ酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列 ：
Met Lys Gly Leu Lys Ala Leu lie Leu Val l ie し eu Val Leu Gly
5 10 15
Leu Val Val Gly Ser Val Ala Ala Ala Pro Glu Lys Lys Val Glu
20 25 30
Gin Val Arg Asn Val Glu Lys Asn Tyr Gly Leu し eu Thr Pro Gly
35 40 45
Leu Phe Arg Lys lie Gin Lys し eu Asn Pro Asn Glu Glu lie Ser
50 55 60
Thr Val lie Val Phe Glu Asn Hi s Arg Glu Lys Glu lie Ala Val
65 70 75
Arg Val Leu Glu Leu Met Gly Ala Lys Val Arg Tyr Val Tyr His
80 85 90
He l ie Pro Ala l ie Ala Ala Asp Leu Lys Val Arg Asp Leu Leu 95 100 105
Val l ie Ser Gl y Leu Thr Gly Gly Lys Al a Lys Leu Ser Gly Val
110 115 120
Arg Phe lie Gin Glu Asp Tyr Lys Val Thr Val Ser Ala Glu Leu
125 130 135
Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin Val Met Ala Thr Tyr Val
140 145 150
Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly lie Thr l ie Gly l ie l ie
155 160 165
Asp Thr Gly lie Asp Ala Ser Hi s Pro Asp Leu Gin Gly Lys Val
170 175 180 lie Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp
185 190 195
Asp His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser lie Ala Ala Gly Thr
200 205 210
Gly Ala Ala Ser Asn Gly し ys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala
215 220 225
Lys Leu Ala Gly lie Lys Val し eu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser
230 235 240 lie Ser Thr lie lie Lys Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys
245 250 255
Asp Lys Tyr Gly lie Lys Val l ie Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser
260 265 270
Gin Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ala Leu Ser Gin Ala Val Asn Ala
275 280 285
Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser 290 295 300
Gly Pro Asn Lys Tyr Thr l ie Gly Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys
305 310 315
Val l ie Thr Val Gly Ala Val Asp Lys Tyr Asp Val He Thr Ser
320 325 330
Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu Lys Pro Glu
335 340 345
Val Val Ala Pro Gly Asn Trp lie lie Ala Ala Arg Ala Ser Gly
350 355 360
Thr Ser Met Gly Gin Pro lie Asn Asp Tyr Tyr Thr Ala Ala Pro
365 370 375
Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly lie Ala Ala Leu
380 385 390
Leu し eu Gin Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys Thr
395 400 405
Ala Leu lie Glu Thr Ala Asp lie Val Lys Pro Asp Glu lie Ala
410 415 420
Asp lie Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr Lys Ala lie
425 430 435
Asn Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gl y Tyr Val Ala
440 445 450
Asn Lys Gly Ser Gin Thr His Gin Phe Val l ie Ser Gly Ala Ser
455 460 465
Phe Val Thr Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn Ser Asp Leu
470 475 480
Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gin Val Asp Tyr Ser 485 490 495
Tyr Thr Ala Tyr Tyr Gl y Phe Glu Lys Val Gl y Tyr Tyr Asn Pro
500 505 510
Thr Asp Gly Thr Trp Thr l ie Lys Val Val Ser Tyr Ser Gly Ser
515 520 525
Ala Asn Tyr Gin Val Asp Val Val Ser Asp Gly Ser し eu Ser Gin
530 535 540
Pro Gly Ser Ser Pro Ser Pro Gin Pro Glu Pro Thr Val Asp Ala
545 550 555
Lys Thr Phe Gin Gly Ser Asp His Tyr Tyr Tyr Asp Arg Ser Asp
560 565 570
Thr Phe Thr Met Thr Val Asn Ser Gly Ala Thr Lys lie Thr Gly
575 580 585
As し eu Val Phe Asp Thr Ser Tyr His Asp Leu As し eu Tyr Leu
590 595 600
Tyr Asp Pro Asn Gin Lys Leu Val Asp Arg Ser Glu Ser Pro Asn
605 610 615
Ser Tyr Glu His Val Glu Tyr Leu Thr Pro Ala Pro Gly Thr Trp
620 625 630
Tyr Phe Leu Val Tyr Ala Tyr Tyr Thr Tyr Gly Trp Ala Tyr Tyr
635 640 645
Glu Leu Thr Ala Lys Val Tyr Tyr Gly
650 配列番号 ： 3 6
配列の長さ ： 2 5 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列：
TCTGAATTCG TTCTTTTCTG TATGG 25 配列番号： 37
配列の長さ ： 2 δ
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列：
TGTACTGCTG GATCCGGCAG 20 配列番号： 38
配列の長さ ： 80
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源： ピロコッカス . フ リオサス
株名 ： D SM3638
配列： GGATCCATCA GATTTTTGAG TGTAGATCAA CCAGTATGCT GCATTTGTAA TTGTGAGATA 60 ATATCTCCCG CGGGTAAGGT 80 配列番号： 3 9
配列の長さ ： 3 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列：
AGAGGCATGC GTATCCATCA GATTTTTGAG 30 配列番号： 4 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 腿)
配列 ：
AGTGAACGGA TACTTGGAAC 20 配列番号： 4 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 （台成 DNA )
配歹 U ：
GTTCCAAGTA TCCGTTCACT 20 配列番号 ： 4 2
配列の長さ ： 1 2
配列の型 ： アミ ノ酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチド
配列 ：
Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin
5 10

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有することを特徴と する超耐熱性プロテア一ゼまたはその機能的同等物。
2 . 請求項 1記載の超耐熱性プロテアーゼまたはその機能的同等物をコ -ドする超耐熱性プロテアーゼ遺伝子。
3 . 配列表の配列番号 2に示される塩基配列を有することを特徴とする 請求項 2記載の超耐熱性プ口テア一ゼ遺伝子。
4 . 請求項 3記載の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子にハイプリダイズする 請求項 2記載の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子。
5 . 配列表の配列番号 3に示されるァミノ酸配列を有することを特徴と する超耐熱性プロテアーゼまたはその機能的同等物。
6. 請求項 5記載の超耐熱性プロテア一ゼまたはその機能的同等物をコ 一ドする超耐熱性プロテアーゼ遺伝子。
7 . 配列表の配列番号 4に示される塩基配列を有することを特徴とする 請求項 6記載の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子。
8 . 請求項 7記載の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子にハイプリダイズする 請求項 6記載の超耐熱性プロテア一ゼ遺伝子。
9 . 配列表の配列番号 5に示されるアミノ酸配列を有することを特徴と する超耐熱性プロテアーゼまたはその機能的同等物。
1 0 . 請求項 9記載の超耐熱性プロテア一ゼまたはその機能的司等物を コードする超耐熱性プロテアーゼ遺伝子。
1 1 . 配列表の配列番号 6に示される塩基配列を有することを恃徴とす る請求項 1 0記載の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子。
1 2 . 請求項 1 1記載の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子にハイプリダイズ する請求項 1 0記載の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子。
1 3. 請求項 2〜4、 6〜8および 1 0〜 1 2いずれか 1項に記載の超 耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含有させた形質転換体を培養し、 該培養物か ら超耐熱性プロテアーゼを採取することを特徴とする超耐熱性プロテア一 ゼの製造方法。
PCT/JP1996/003253 1995-12-12 1996-11-07 Genes de proteases ultrathermostables WO1997021823A1 (fr)

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DE69615055T DE69615055T2 (de) 1995-12-12 1996-11-07 Gene kodierend für ultrathermostabile proteasen
AT96937514T ATE205257T1 (de) 1995-12-12 1996-11-07 Gene kodierend für ultrathermostabile proteasen
US08/894,818 US6261822B1 (en) 1995-12-12 1996-11-07 Ultrathermostable protease genes
CA002238296A CA2238296C (en) 1995-12-12 1996-11-07 Ultrathermostable protease genes
DK96937514T DK0870833T3 (da) 1995-12-12 1996-11-07 Gener for ultrathermostabile proteaser
US10/800,684 US7314744B2 (en) 1995-12-12 2004-03-16 Hyperthermostable protease gene
US11/945,771 US20090029416A1 (en) 1995-12-12 2007-11-27 Hyperthermostable protease gene

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