JPH06197770A - 超耐熱性プロテアーゼ遺伝子 - Google Patents
超耐熱性プロテアーゼ遺伝子Info
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- JPH06197770A JPH06197770A JP5017068A JP1706893A JPH06197770A JP H06197770 A JPH06197770 A JP H06197770A JP 5017068 A JP5017068 A JP 5017068A JP 1706893 A JP1706893 A JP 1706893A JP H06197770 A JPH06197770 A JP H06197770A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
(57)【要約】
【目的】 超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を単離し、該遺
伝子を用いた超耐熱性プロテアーゼの工業的製法を提供
する。 【構成】 図１の制限酵素地図で表される超耐熱性プロ
テアーゼ遺伝子。これにハイブリダイズ可能な超耐熱性
プロテアーゼ遺伝子。これら遺伝子を含有させた組換体
プラスミドを導入させた形質転換体を培養する超耐熱性
プロテアーゼの製法。
伝子を用いた超耐熱性プロテアーゼの工業的製法を提供
する。 【構成】 図１の制限酵素地図で表される超耐熱性プロ
テアーゼ遺伝子。これにハイブリダイズ可能な超耐熱性
プロテアーゼ遺伝子。これら遺伝子を含有させた組換体
プラスミドを導入させた形質転換体を培養する超耐熱性
プロテアーゼの製法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は食品分野、タンパク質工
学等の分野で有用な超耐熱性プロテアーゼをコードする
遺伝子及び該酵素の遺伝子工学的製造方法に関する。
学等の分野で有用な超耐熱性プロテアーゼをコードする
遺伝子及び該酵素の遺伝子工学的製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】食品加工、ペプチド合成等の工業的プロ
セスに利用されるプロテアーゼには物理的、化学的に高
い熱安定性が要求される。従来、中等度好熱菌由来のプ
ロテアーゼがこれらの目的に研究されてきた。更に高い
耐熱性を有するものとして超耐熱菌ピロコッカス フリ
オサス（Pyrococcus furiosus)に数種のプロテアーゼの
存在が知られている〔アプライド アンド エンバイロ
ンメンタル マイクロバイオロジー（Appl. Environ.Mi
crobiol.) 、第５６巻、第１９９２頁（１９９０）、ジ
ャーナル オブ ジェネラル マイクロバイオロジー
（Ｊ．Gen. Microbiol.) 、第１３７巻、第１１９３頁
（１９９１）、ＦＥＭＳ マイクロバイオロジー レタ
ーズ（ FEMS Microbiol. Lett.) 、第７１巻、第１７頁
（１９９０）、アプライド アンド エンバイロンメン
タル マイクロバイオロジー、第５８巻、第１１３４頁
（１９９２）〕が、これらの酵素及び遺伝子が単離され
た例はまだない。
セスに利用されるプロテアーゼには物理的、化学的に高
い熱安定性が要求される。従来、中等度好熱菌由来のプ
ロテアーゼがこれらの目的に研究されてきた。更に高い
耐熱性を有するものとして超耐熱菌ピロコッカス フリ
オサス（Pyrococcus furiosus)に数種のプロテアーゼの
存在が知られている〔アプライド アンド エンバイロ
ンメンタル マイクロバイオロジー（Appl. Environ.Mi
crobiol.) 、第５６巻、第１９９２頁（１９９０）、ジ
ャーナル オブ ジェネラル マイクロバイオロジー
（Ｊ．Gen. Microbiol.) 、第１３７巻、第１１９３頁
（１９９１）、ＦＥＭＳ マイクロバイオロジー レタ
ーズ（ FEMS Microbiol. Lett.) 、第７１巻、第１７頁
（１９９０）、アプライド アンド エンバイロンメン
タル マイクロバイオロジー、第５８巻、第１１３４頁
（１９９２）〕が、これらの酵素及び遺伝子が単離され
た例はまだない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】超耐熱菌からのプロテ
アーゼの取得は高温での微生物の培養を要し、工業的な
製造方法としては問題を有していた。本発明はこの問題
を解決するために超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を単離
し、該遺伝子を用いた超耐熱性酵素の工業的製造方法を
提供するものである。
アーゼの取得は高温での微生物の培養を要し、工業的な
製造方法としては問題を有していた。本発明はこの問題
を解決するために超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を単離
し、該遺伝子を用いた超耐熱性酵素の工業的製造方法を
提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は超耐熱性プロテアーゼ遺伝子に関
し、図面の図１で表されることを特徴とする。また、本
発明の第２の発明は、超耐熱性プロテアーゼ遺伝子に関
し、第１の発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子にハイブ
リダイズ可能であることを特徴とする。更に本発明の第
３の発明は超耐熱性プロテアーゼの製造方法に関し、前
記第１又は第２の発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を
含有させた組換体プラスミドを導入させた形質転換体を
培養し、該培養物から超耐熱性プロテアーゼを採取する
ことを特徴とする。
発明の第１の発明は超耐熱性プロテアーゼ遺伝子に関
し、図面の図１で表されることを特徴とする。また、本
発明の第２の発明は、超耐熱性プロテアーゼ遺伝子に関
し、第１の発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子にハイブ
リダイズ可能であることを特徴とする。更に本発明の第
３の発明は超耐熱性プロテアーゼの製造方法に関し、前
記第１又は第２の発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を
含有させた組換体プラスミドを導入させた形質転換体を
培養し、該培養物から超耐熱性プロテアーゼを採取する
ことを特徴とする。
【０００５】本発明に係る超耐熱性プロテアーゼ遺伝子
は超耐熱菌の遺伝子ライブラリーのスクリーニングによ
り得ることができる。超耐熱菌としてはピロコッカス属
に属する細菌が使用でき、例えばピロコッカス フリオ
サスのゲノムのコスミドライブラリーより、目的の遺伝
子をスクリーニングし、得ることができる。
は超耐熱菌の遺伝子ライブラリーのスクリーニングによ
り得ることができる。超耐熱菌としてはピロコッカス属
に属する細菌が使用でき、例えばピロコッカス フリオ
サスのゲノムのコスミドライブラリーより、目的の遺伝
子をスクリーニングし、得ることができる。
【０００６】ピロコッカス フリオサスとしてはピロコ
ッカス フリオサス ＤＳＭ３６３８が使用でき、該菌
株はドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニ
スメン ウント ツェルクルチュウレン ＧｍｂＨ（De
utsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur
en GmbH ）より入手可能な菌株である。
ッカス フリオサス ＤＳＭ３６３８が使用でき、該菌
株はドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニ
スメン ウント ツェルクルチュウレン ＧｍｂＨ（De
utsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur
en GmbH ）より入手可能な菌株である。
【０００７】ピロコッカス フリオサス ゲノムのコス
ミドライブラリーはピロコッカスフリオサス ゲノムを
制限酵素Sau3AI（宝酒造）で部分消化して得られたフラ
グメントとトリプルヘリックスコスミドベクター（スト
ラテジーン）をライゲーションした後、インビトロパッ
ケージング法によってラムダファージ粒子中にパッケー
ジングし、適当な大腸菌、例えば大腸菌 DH5αMCR(ＢＲ
Ｌ）を形質転換することによって得ることができる。次
にライブラリー中の形質転換体を培養した後、培養物を
熱処理（１００℃，１０分間）、超音波処理、再熱処理
（１００℃，１０分間）し、得られたライゼートのグル
タリル−Ｌ−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリドを
基質としたプロテアーゼ活性をスクリーニングすること
ができる。これにより、１００℃，２０分間の熱処理に
耐性のプロテアーゼを発現する、超耐熱性プロテアーゼ
遺伝子を含むコスミドクローンをいくつか得ることがで
きる。このようにして得られたコスミドクローンの１つ
から調製したコスミドをPstI（宝酒造）消化し、得られ
たＤＮＡ断片をプラスミドベクターpUC118（宝酒造）の
PstＩサイトに導入した組換えプラスミドを得ることが
できる。次にこの組換えプラスミドを導入した大腸菌Ｊ
Ｍ１０９（宝酒造）を培養した後、前述のコスミドの場
合と同様にして培養物処理物中の超耐熱性プロテアーゼ
活性を測定することにより発現したプロテアーゼ遺伝子
を含む組換えプラスミドを得ることができる。該プラス
ミドはプラスミドpPhe２と命名され、このプロテアーゼ
遺伝子を含む組換えプラスミドには約１０kbの PstＩ断
片が含まれている。図２にプラスミドpPhe２の制限酵素
地図を示す。図中、太実線がプラスミドベクターpUC118
への挿入ＤＮＡ断片である。
ミドライブラリーはピロコッカスフリオサス ゲノムを
制限酵素Sau3AI（宝酒造）で部分消化して得られたフラ
グメントとトリプルヘリックスコスミドベクター（スト
ラテジーン）をライゲーションした後、インビトロパッ
ケージング法によってラムダファージ粒子中にパッケー
ジングし、適当な大腸菌、例えば大腸菌 DH5αMCR(ＢＲ
Ｌ）を形質転換することによって得ることができる。次
にライブラリー中の形質転換体を培養した後、培養物を
熱処理（１００℃，１０分間）、超音波処理、再熱処理
（１００℃，１０分間）し、得られたライゼートのグル
タリル−Ｌ−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリドを
基質としたプロテアーゼ活性をスクリーニングすること
ができる。これにより、１００℃，２０分間の熱処理に
耐性のプロテアーゼを発現する、超耐熱性プロテアーゼ
遺伝子を含むコスミドクローンをいくつか得ることがで
きる。このようにして得られたコスミドクローンの１つ
から調製したコスミドをPstI（宝酒造）消化し、得られ
たＤＮＡ断片をプラスミドベクターpUC118（宝酒造）の
PstＩサイトに導入した組換えプラスミドを得ることが
できる。次にこの組換えプラスミドを導入した大腸菌Ｊ
Ｍ１０９（宝酒造）を培養した後、前述のコスミドの場
合と同様にして培養物処理物中の超耐熱性プロテアーゼ
活性を測定することにより発現したプロテアーゼ遺伝子
を含む組換えプラスミドを得ることができる。該プラス
ミドはプラスミドpPhe２と命名され、このプロテアーゼ
遺伝子を含む組換えプラスミドには約１０kbの PstＩ断
片が含まれている。図２にプラスミドpPhe２の制限酵素
地図を示す。図中、太実線がプラスミドベクターpUC118
への挿入ＤＮＡ断片である。
【０００８】更にこの組換えプラスミドについて数種類
の制限酵素を用いて種々の長さのＤＮＡ断片を調製し、
各断片を含む組換えプラスミドを作製することができ
る。次に、該プラスミドを導入した大腸菌ＪＭ１０９を
培養した後、培養物中の超耐熱性プロテアーゼ活性を測
定することにより、目的のプロテアーゼ遺伝子を含む組
換えプラスミドを得ることができる。すなわち、前記プ
ラスミドpPhe２を StuＩ（宝酒造）、BamHＩ（宝酒造）
消化して得られる約５kbのＤＮＡ断片は超耐熱性プロテ
アーゼ遺伝子を含んでおり、これをプラスミドベクター
pUC19 （宝酒造）の Hinc II、BamHＩサイトに導入する
ことができる。
の制限酵素を用いて種々の長さのＤＮＡ断片を調製し、
各断片を含む組換えプラスミドを作製することができ
る。次に、該プラスミドを導入した大腸菌ＪＭ１０９を
培養した後、培養物中の超耐熱性プロテアーゼ活性を測
定することにより、目的のプロテアーゼ遺伝子を含む組
換えプラスミドを得ることができる。すなわち、前記プ
ラスミドpPhe２を StuＩ（宝酒造）、BamHＩ（宝酒造）
消化して得られる約５kbのＤＮＡ断片は超耐熱性プロテ
アーゼ遺伝子を含んでおり、これをプラスミドベクター
pUC19 （宝酒造）の Hinc II、BamHＩサイトに導入する
ことができる。
【０００９】該プラスミドはプラスミドpPheS2と命名さ
れ、これを導入した大腸菌ＪＭ１０９を培養して得られ
る培養物のライゼートは超耐熱性プロテアーゼ活性を示
す。図３にプラスミドpPheS2の制限酵素地図を示す。図
中、太実線がプラスミドベクターpUC19 への挿入ＤＮＡ
断片である。
れ、これを導入した大腸菌ＪＭ１０９を培養して得られ
る培養物のライゼートは超耐熱性プロテアーゼ活性を示
す。図３にプラスミドpPheS2の制限酵素地図を示す。図
中、太実線がプラスミドベクターpUC19 への挿入ＤＮＡ
断片である。
【００１０】更に前記プラスミドpPheS2より超耐熱性プ
ロテアーゼ遺伝子を含まない約１kbのＤＮＡ断片を次の
ように除くことができる。すなわち、前記プラスミドpP
heS2をPstI、Bgl II（宝酒造）消化して得られる約１．
４kbのPst II−Bgl II断片及び約２．６kbのBgl II−Bg
l II断片をPstI、BamHＩ消化したプラスミドベクターpU
C19 に導入し、組換えプラスミドを作製する。該プラス
ミドを導入した大腸菌ＪＭ１０９を培養した後、培養物
中の超耐熱性プロテアーゼ活性を測定し、活性を示した
コロニーよりプラスミドを調製する。
ロテアーゼ遺伝子を含まない約１kbのＤＮＡ断片を次の
ように除くことができる。すなわち、前記プラスミドpP
heS2をPstI、Bgl II（宝酒造）消化して得られる約１．
４kbのPst II−Bgl II断片及び約２．６kbのBgl II−Bg
l II断片をPstI、BamHＩ消化したプラスミドベクターpU
C19 に導入し、組換えプラスミドを作製する。該プラス
ミドを導入した大腸菌ＪＭ１０９を培養した後、培養物
中の超耐熱性プロテアーゼ活性を測定し、活性を示した
コロニーよりプラスミドを調製する。
【００１１】該プラスミドはプラスミドpPheS3と命名さ
れ、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は
Escherichia coli JM109／pPheS3と命名、表示され、工
業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第１３３
４９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３４９）として寄託されて
いる。
れ、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は
Escherichia coli JM109／pPheS3と命名、表示され、工
業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第１３３
４９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３４９）として寄託されて
いる。
【００１２】図４にプラスミドpPheS3の制限酵素地図を
示す。図中、太実線がプラスミドベクターpUC19 への挿
入ＤＮＡ断片である。
示す。図中、太実線がプラスミドベクターpUC19 への挿
入ＤＮＡ断片である。
【００１３】更に前記プラスミドpPheS3より、超耐熱性
プロテアーゼ遺伝子を含まない約１．２kbのＤＮＡ断片
を次のように除くことができる。すなわち、最初に前記
プラスミドpPheS3を PstＩ、 EcoT22I（宝酒造）消化し
て得られる３種のＤＮＡ断片のうち約０．６kbのＤＮＡ
断片のみを取り除いてライゲーションを行い、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９に導入する。得られたコロニーの超耐熱性プロ
テアーゼ活性を測定し、活性を示したコロニーよりプラ
スミドを調製する。
プロテアーゼ遺伝子を含まない約１．２kbのＤＮＡ断片
を次のように除くことができる。すなわち、最初に前記
プラスミドpPheS3を PstＩ、 EcoT22I（宝酒造）消化し
て得られる３種のＤＮＡ断片のうち約０．６kbのＤＮＡ
断片のみを取り除いてライゲーションを行い、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９に導入する。得られたコロニーの超耐熱性プロ
テアーゼ活性を測定し、活性を示したコロニーよりプラ
スミドを調製する。
【００１４】該プラスミドはプラスミドpPheE1と命名さ
れ、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は
Escherichia coli JM109／pPheE1と命名されている。図
５にプラスミドpPheE1の制限酵素地図を示す。図中太実
線がプラスミドベクターpUC19 への挿入ＤＮＡ断片であ
る。
れ、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は
Escherichia coli JM109／pPheE1と命名されている。図
５にプラスミドpPheE1の制限酵素地図を示す。図中太実
線がプラスミドベクターpUC19 への挿入ＤＮＡ断片であ
る。
【００１５】次に該プラスミドpPheE1をEcoRＩ（宝酒
造）消化して得られる３種のＤＮＡ断片のうち約０．６
kbのＤＮＡ断片のみを取り除いてライゲーションを行
い、大腸菌に導入する。得られたコロニーの超耐熱性プ
ロテアーゼ活性を測定し、活性を示したコロニーよりプ
ラスミドを調製する。該プラスミドはプラスミドpPheE2
と命名され、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ
１０９はEscherichia coliJM109／pPheE2と命名されて
いる。図６にプラスミドpPheE2の制限酵素地図を示す。
図中、太実線がプラスミドベクターpUC19 への挿入ＤＮ
Ａ断片である。
造）消化して得られる３種のＤＮＡ断片のうち約０．６
kbのＤＮＡ断片のみを取り除いてライゲーションを行
い、大腸菌に導入する。得られたコロニーの超耐熱性プ
ロテアーゼ活性を測定し、活性を示したコロニーよりプ
ラスミドを調製する。該プラスミドはプラスミドpPheE2
と命名され、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ
１０９はEscherichia coliJM109／pPheE2と命名されて
いる。図６にプラスミドpPheE2の制限酵素地図を示す。
図中、太実線がプラスミドベクターpUC19 への挿入ＤＮ
Ａ断片である。
【００１６】図１にプラスミドpPheE2に挿入されたピロ
コッカス フリオサス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図を
示す。すなわち図１は本発明により得られる超耐熱性プ
ロテアーゼ遺伝子の１例の制限酵素地図を示す図であ
る。
コッカス フリオサス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図を
示す。すなわち図１は本発明により得られる超耐熱性プ
ロテアーゼ遺伝子の１例の制限酵素地図を示す図であ
る。
【００１７】超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含有させた
組換体プラスミドを導入させた形質転換体、例えばEsch
erichia coli JM109／pPheS3、Escherichia coli JM109
／pPheE1、Escherichia coli JM109／pPheE2は、それぞ
れ通常の培養条件、例えば１００μｇ／mlのアンピシリ
ンを含む２×ＴＹ培地（トリプトン１６ｇ／リットル、
酵母エキス１０ｇ／リットル、ＮａＣｌ ５ｇ／リット
ル、ｐＨ７．２）中、３７℃で培養することにより、培
養物中に超耐熱性プロテアーゼを発現させることができ
る。培養終了後、培養菌体を集菌し、得られた菌体の超
音波処理後の遠心上清を粗酵素液とし、該酵素液の１０
０℃、１０分間の熱処理による夾雑タンパク質の変性処
理、除核酸処理、硫安塩析処理、透析処理、イオン交換
クロマトグラフィー、限外ろ過処理、ゲルろ過処理等を
行うことにより、精製酵素標品を得ることができる。
組換体プラスミドを導入させた形質転換体、例えばEsch
erichia coli JM109／pPheS3、Escherichia coli JM109
／pPheE1、Escherichia coli JM109／pPheE2は、それぞ
れ通常の培養条件、例えば１００μｇ／mlのアンピシリ
ンを含む２×ＴＹ培地（トリプトン１６ｇ／リットル、
酵母エキス１０ｇ／リットル、ＮａＣｌ ５ｇ／リット
ル、ｐＨ７．２）中、３７℃で培養することにより、培
養物中に超耐熱性プロテアーゼを発現させることができ
る。培養終了後、培養菌体を集菌し、得られた菌体の超
音波処理後の遠心上清を粗酵素液とし、該酵素液の１０
０℃、１０分間の熱処理による夾雑タンパク質の変性処
理、除核酸処理、硫安塩析処理、透析処理、イオン交換
クロマトグラフィー、限外ろ過処理、ゲルろ過処理等を
行うことにより、精製酵素標品を得ることができる。
【００１８】本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含
有させた組換体プラスミドを導入させた形質転換体、例
えばEscherichia coli JM109／pPheS3が生産する超耐熱
性プロテアーゼの酵素化学的及び理化学的性質は次のと
おりである。
有させた組換体プラスミドを導入させた形質転換体、例
えばEscherichia coli JM109／pPheS3が生産する超耐熱
性プロテアーゼの酵素化学的及び理化学的性質は次のと
おりである。
【００１９】（１）作 用 本発明の酵素は、グルタリル−Ｌ−フェニルアラニン−
ｐ−ニトロアニリドを加水分解し、黄色物質を生成す
る。更にベンゾイル−Ｌ−チロシン−ｐ−ニトロアニリ
ドを加水分解し、黄色物質を生成する。更にまた、酸化
型インシュリンＢ鎖を加水分解し、短鎖ポリペプチドを
生成する。
ｐ−ニトロアニリドを加水分解し、黄色物質を生成す
る。更にベンゾイル−Ｌ−チロシン−ｐ−ニトロアニリ
ドを加水分解し、黄色物質を生成する。更にまた、酸化
型インシュリンＢ鎖を加水分解し、短鎖ポリペプチドを
生成する。
【００２０】（２）酵素活性測定方法 酵素活性の測定は、酵素のグルタリル−Ｌ−フェニルア
ラニン−ｐ−ニトロアニリドを加水分解活性を、加水分
解で生成するｐ−ニトロアリニンを分光学的に追跡する
ことにより測定した。すなわち酵素活性を測定しようと
する酵素標品を適度に希釈し、その試料溶液１０μｌに
５mMグルタリル−Ｌ−フェニルアラニン−ｐ−ニトロア
ニリド溶液（５０mMリン酸カリウム、ｐＨ６．５）４０
μｌを加え９５℃で３０分間反応させた。氷冷して反応
を停止した後、４１０nmにおける吸光度を測定しｐ−ニ
トロアニリンの生成量を求めた。酵素１単位は９５℃に
おいて１分間に１μmol のｐ−ニトロアニリンを生成す
る酵素量とした。本発明で得られる酵素は測定されたｐ
Ｈ６．５、９５℃においてグルタリル−Ｌ−フェニルア
ラニン−ｐ−ニトロアニリド分解活性を有していた。
ラニン−ｐ−ニトロアニリドを加水分解活性を、加水分
解で生成するｐ−ニトロアリニンを分光学的に追跡する
ことにより測定した。すなわち酵素活性を測定しようと
する酵素標品を適度に希釈し、その試料溶液１０μｌに
５mMグルタリル−Ｌ−フェニルアラニン−ｐ−ニトロア
ニリド溶液（５０mMリン酸カリウム、ｐＨ６．５）４０
μｌを加え９５℃で３０分間反応させた。氷冷して反応
を停止した後、４１０nmにおける吸光度を測定しｐ−ニ
トロアニリンの生成量を求めた。酵素１単位は９５℃に
おいて１分間に１μmol のｐ−ニトロアニリンを生成す
る酵素量とした。本発明で得られる酵素は測定されたｐ
Ｈ６．５、９５℃においてグルタリル−Ｌ−フェニルア
ラニン−ｐ−ニトロアニリド分解活性を有していた。
【００２１】また、ベンゾイル−Ｌ−チロシン−ｐ−ニ
トロアニリドを基質としてその分解活性を測定した。す
なわち、酵素標品２μｌを３８μｌの５０mMリン酸カリ
ウム、ｐＨ６．５に加え、５mMのベイゾイル−Ｌ−チロ
シン−ｐ−ニトロアニリドを含むジメチルスルホキシド
溶液１０μｌを加えて９５℃で３０分間反応させた。氷
冷して反応を停止した後、４１０nmにおける吸光度を測
定しｐ−ニトロアニリンの生成量を求めた。本発明によ
り得られる酵素は測定されたｐＨ６．５、９５℃におい
てベンゾイル−Ｌ−チロシン−ｐ−ニトロアニリド分解
活性を有していた。
トロアニリドを基質としてその分解活性を測定した。す
なわち、酵素標品２μｌを３８μｌの５０mMリン酸カリ
ウム、ｐＨ６．５に加え、５mMのベイゾイル−Ｌ−チロ
シン−ｐ−ニトロアニリドを含むジメチルスルホキシド
溶液１０μｌを加えて９５℃で３０分間反応させた。氷
冷して反応を停止した後、４１０nmにおける吸光度を測
定しｐ−ニトロアニリンの生成量を求めた。本発明によ
り得られる酵素は測定されたｐＨ６．５、９５℃におい
てベンゾイル−Ｌ−チロシン−ｐ−ニトロアニリド分解
活性を有していた。
【００２２】更にまた、酸化型インスリンＢ鎖を基質と
して、その分解活性を測定した。すなわち、酵素標品５
μｌを０．３nmolの酸化型インスリンＢ鎖を含む５０mM
トリス（Tris) −ＨＣｌ、ｐＨ７．５溶液１５μｌに加
えて９５℃で６０分間反応させた。氷冷して反応を停止
した後、反応液の一部をデルタパックＣ１８カラム（ウ
ォーターズ）を用いたＨＰＬＣに供し、分解産物を分析
した。本発明により得られる酵素は測定されたｐＨ７．
５、９５℃において、酸化型インスリンＢ鎖分解活性を
有していた。
して、その分解活性を測定した。すなわち、酵素標品５
μｌを０．３nmolの酸化型インスリンＢ鎖を含む５０mM
トリス（Tris) −ＨＣｌ、ｐＨ７．５溶液１５μｌに加
えて９５℃で６０分間反応させた。氷冷して反応を停止
した後、反応液の一部をデルタパックＣ１８カラム（ウ
ォーターズ）を用いたＨＰＬＣに供し、分解産物を分析
した。本発明により得られる酵素は測定されたｐＨ７．
５、９５℃において、酸化型インスリンＢ鎖分解活性を
有していた。
【００２３】なお以下、（３）〜（７）において示す酵
素活性は、上記グルタリル−Ｌ−フェニルアラニン−ｐ
−ニトロアニリドを基質とする上記の活性測定方法で測
定したものである。
素活性は、上記グルタリル−Ｌ−フェニルアラニン−ｐ
−ニトロアニリドを基質とする上記の活性測定方法で測
定したものである。
【００２４】（３）至適温度 測定には１ミリ単位の酵素標品を用い、種々の温度で反
応を行った。試験した酵素は図７に示すごとく、測定さ
れたｐＨ６．５において６０〜１０５℃の範囲で活性が
あり、その至適温度は８０〜１００℃であった。すわな
ち、図７は本発明により得られる酵素の至適温度を示す
図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を
示す。
応を行った。試験した酵素は図７に示すごとく、測定さ
れたｐＨ６．５において６０〜１０５℃の範囲で活性が
あり、その至適温度は８０〜１００℃であった。すわな
ち、図７は本発明により得られる酵素の至適温度を示す
図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を
示す。
【００２５】（４）至適ｐＨ 測定には１ミリ単位の酵素標品を用い、グルタリル−Ｌ
−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド溶液を、ｐＨ
５．０〜６．０においては５０mM酢酸ナトリウム、また
ｐＨ６．０〜８．０においては５０mMリン酸カリウムを
用いて調製し、使用した。試験した酵素は図８に示すご
とくｐＨ６．０〜７．０の間で最大活性を示した。すな
わち、図８は本発明により得られる酵素の至適ｐＨを示
す図であり、縦軸に相対活性（％）、横軸にｐＨを示
す。図中黒丸は５０mM酢酸ナトリウム、図中白丸は５０
mMリン酸カリウムを用いて測定した結果を示す。
−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド溶液を、ｐＨ
５．０〜６．０においては５０mM酢酸ナトリウム、また
ｐＨ６．０〜８．０においては５０mMリン酸カリウムを
用いて調製し、使用した。試験した酵素は図８に示すご
とくｐＨ６．０〜７．０の間で最大活性を示した。すな
わち、図８は本発明により得られる酵素の至適ｐＨを示
す図であり、縦軸に相対活性（％）、横軸にｐＨを示
す。図中黒丸は５０mM酢酸ナトリウム、図中白丸は５０
mMリン酸カリウムを用いて測定した結果を示す。
【００２６】（５）熱安定性 １ミリ単位の酵素標品、及び終濃度０．０１％のトライ
トンＸ−１００を含む５０mM酢酸ナトリウムｐＨ５．５
溶液１０μｌを９５℃で種々の時間処理した後、残存す
る酵素活性を測定した。図９に示すごとく９５℃で１８
０分間処理しても活性の低下は全く見られなかった。す
なわち図９は、本発明により得られる酵素の熱安定性を
示す図であり、縦軸は残存活性（％）、横軸は熱処理時
間（分）を示す。
トンＸ−１００を含む５０mM酢酸ナトリウムｐＨ５．５
溶液１０μｌを９５℃で種々の時間処理した後、残存す
る酵素活性を測定した。図９に示すごとく９５℃で１８
０分間処理しても活性の低下は全く見られなかった。す
なわち図９は、本発明により得られる酵素の熱安定性を
示す図であり、縦軸は残存活性（％）、横軸は熱処理時
間（分）を示す。
【００２７】（６）ｐＨ安定性 ６ミリ単位の酵素標品、及び終濃度０．０１％のトライ
トンＸ−１００を含む２０mMの各ｐＨの緩衝液２０μｌ
を９５℃で６０分間処理した後、４０μｌの５０mMリン
酸カリウムｐＨ６．５、０．０１％トライトンＸ−１０
０を加えた。このうち１０μｌを用い、残存する酵素活
性を測定した。なお、緩衝液としてｐＨ３．５〜６．０
においては酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０におい
てはリン酸カリウム、ｐＨ８．５〜９．５においてはホ
ウ酸ナトリウムをそれぞれ用いた。図１０に示すごと
く、ｐＨ５．０〜８．０の間では９５℃、６０分間の処
理後も７０％以上の活性を保持していた。すなわち、図
１０は本発明により得られる酵素のｐＨ安定性を示す図
であり、縦軸に残存活性（％）、横軸にｐＨを示す。図
中黒丸は２０mM酢酸ナトリウム、白丸は２０mMリン酸カ
リウム、黒三角は２０mMホウ酸ナトリウムを用いて測定
した結果を示す。
トンＸ−１００を含む２０mMの各ｐＨの緩衝液２０μｌ
を９５℃で６０分間処理した後、４０μｌの５０mMリン
酸カリウムｐＨ６．５、０．０１％トライトンＸ−１０
０を加えた。このうち１０μｌを用い、残存する酵素活
性を測定した。なお、緩衝液としてｐＨ３．５〜６．０
においては酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０におい
てはリン酸カリウム、ｐＨ８．５〜９．５においてはホ
ウ酸ナトリウムをそれぞれ用いた。図１０に示すごと
く、ｐＨ５．０〜８．０の間では９５℃、６０分間の処
理後も７０％以上の活性を保持していた。すなわち、図
１０は本発明により得られる酵素のｐＨ安定性を示す図
であり、縦軸に残存活性（％）、横軸にｐＨを示す。図
中黒丸は２０mM酢酸ナトリウム、白丸は２０mMリン酸カ
リウム、黒三角は２０mMホウ酸ナトリウムを用いて測定
した結果を示す。
【００２８】（７）阻害剤の影響 １ミリ単位の酵素標品を用い、終濃度１mMの各阻害剤を
添加し酵素活性の測定を行った。酵素活性はフェニル−
メタン−スルホニル−フルオライド（ＰＭＳＦ）存在下
で顕著に低下したが、ＥＤＴＡ、ヨード酢酸の添加は活
性に影響を与えなかった。
添加し酵素活性の測定を行った。酵素活性はフェニル−
メタン−スルホニル−フルオライド（ＰＭＳＦ）存在下
で顕著に低下したが、ＥＤＴＡ、ヨード酢酸の添加は活
性に影響を与えなかった。
【００２９】以上、詳細に説明した様に、本発明により
超耐熱性プロテアーゼをコードする遺伝子が提供され、
該遺伝子を用いた超耐熱性プロテアーゼの工業的製造方
法が提供される。該酵素は高度の耐熱性を有する新規酵
素であり、高温下での食品加工や、タンパク質工学処理
において特に有用である。また、本発明により単離され
た遺伝子を用いることにより、該遺伝子にハイブリダイ
ズ可能な超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を簡便にクローニ
ングすることができる。
超耐熱性プロテアーゼをコードする遺伝子が提供され、
該遺伝子を用いた超耐熱性プロテアーゼの工業的製造方
法が提供される。該酵素は高度の耐熱性を有する新規酵
素であり、高温下での食品加工や、タンパク質工学処理
において特に有用である。また、本発明により単離され
た遺伝子を用いることにより、該遺伝子にハイブリダイ
ズ可能な超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を簡便にクローニ
ングすることができる。
【００３０】
【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明が以
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
【００３１】実施例１ （ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡの調製）ピ
ロコッカス フリオサス ＤＳＭ３６３８の培養は以下
のとおりに行った。トリプトン１％、酵母エキス０．５
％、可溶性デンプン１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジ
ャマリンラボラトリー）３．５％、ジャマリンＳ・リキ
ッド（ジャマリンラボラトリー）０．５％、ＭｇＳＯ4
０．００３％、ＮａＣｌの０．００１％、ＦｅＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ4 ０．０００１
％、ＣａＣｌ2 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ
4 ０．０００１％、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2 Ｏ ０．１ppm
、ＫＡｌ（ＳＯ4 ）2 ０．１ppm 、Ｈ3 ＢＯ3
０．１ppm 、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．１ppm 、
ＮｉＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ０．２５ppm の組成の培地２リ
ットルを２リットル容のメディウムボトルに入れ、１２
０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹込み溶存酸素
を除去した後、これに上記菌株を接種して９５℃、１６
時間静置培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集
めた。次に集菌体を２５％スクロースを含む０．０５Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４mlに懸濁し、この懸濁
液に０．８mlのリゾチーム〔５mg／ml、０．２５Ｍトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕、２mlの０．２Ｍ ＥＤＴ
Ａを加えて、２０℃で１時間保温した後、２４mlのＳＥ
Ｔ溶液〔１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、２０mM
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕を加え、更に５％ＳＤ
Ｓ、４mlプロティナーゼＫ（１０mg／ml）４００μｌを
加え、３７℃、１時間反応させた。反応終了後、フェノ
ール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行
い、約３．２mgのゲノムＤＮＡを調製した。
ロコッカス フリオサス ＤＳＭ３６３８の培養は以下
のとおりに行った。トリプトン１％、酵母エキス０．５
％、可溶性デンプン１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジ
ャマリンラボラトリー）３．５％、ジャマリンＳ・リキ
ッド（ジャマリンラボラトリー）０．５％、ＭｇＳＯ4
０．００３％、ＮａＣｌの０．００１％、ＦｅＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ4 ０．０００１
％、ＣａＣｌ2 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ
4 ０．０００１％、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2 Ｏ ０．１ppm
、ＫＡｌ（ＳＯ4 ）2 ０．１ppm 、Ｈ3 ＢＯ3
０．１ppm 、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．１ppm 、
ＮｉＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ０．２５ppm の組成の培地２リ
ットルを２リットル容のメディウムボトルに入れ、１２
０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹込み溶存酸素
を除去した後、これに上記菌株を接種して９５℃、１６
時間静置培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集
めた。次に集菌体を２５％スクロースを含む０．０５Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４mlに懸濁し、この懸濁
液に０．８mlのリゾチーム〔５mg／ml、０．２５Ｍトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕、２mlの０．２Ｍ ＥＤＴ
Ａを加えて、２０℃で１時間保温した後、２４mlのＳＥ
Ｔ溶液〔１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、２０mM
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕を加え、更に５％ＳＤ
Ｓ、４mlプロティナーゼＫ（１０mg／ml）４００μｌを
加え、３７℃、１時間反応させた。反応終了後、フェノ
ール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行
い、約３．２mgのゲノムＤＮＡを調製した。
【００３２】（コスミドプロテインライブラリーの作
製）ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡ４００μ
ｇをSau3AIで部分消化し、密度勾配超遠心法により、３
５〜５０kbにサイズ分画した。次に、トリプルヘリック
スコスミドベクター１μｇを BamHI消化し、上記分画さ
れた３５〜５０kbのＤＮＡ１４０μｇと混合してライゲ
ーションを行い、ガイガーパック ゴールド（ストラテ
ジーン）を用いたイン ビトロ パッケージング法によ
ってピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡのフラグ
メントをラムダファージ粒子中にパッケージングした。
得られたファージ溶液の一部を用いて大腸菌 DH5αMCR
を形質転換し、ライブラリーを調製した。得られたコロ
ニーのうち数個を選んでコスミドを調製し、適当な大き
さの挿入断片があることを確認したのち、調製した５０
０個のコロニーから個別に形質転換体を１００μｇ／ml
のアンピシリンを含む１５０mlのＬＢ培地（トリプトン
１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣ
ｌの５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中で培養した。該培
養物を遠心し、回収した菌体を２０mMトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ８．０ １mlに懸濁し、１００℃で１０分間熱処理
した。続いて超音波処理を行い、更にもう一度１００
℃、１０分間熱処理した。遠心後の上清として得られる
ライゼートをコスミドプロテインライブラリーとした。
製）ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡ４００μ
ｇをSau3AIで部分消化し、密度勾配超遠心法により、３
５〜５０kbにサイズ分画した。次に、トリプルヘリック
スコスミドベクター１μｇを BamHI消化し、上記分画さ
れた３５〜５０kbのＤＮＡ１４０μｇと混合してライゲ
ーションを行い、ガイガーパック ゴールド（ストラテ
ジーン）を用いたイン ビトロ パッケージング法によ
ってピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡのフラグ
メントをラムダファージ粒子中にパッケージングした。
得られたファージ溶液の一部を用いて大腸菌 DH5αMCR
を形質転換し、ライブラリーを調製した。得られたコロ
ニーのうち数個を選んでコスミドを調製し、適当な大き
さの挿入断片があることを確認したのち、調製した５０
０個のコロニーから個別に形質転換体を１００μｇ／ml
のアンピシリンを含む１５０mlのＬＢ培地（トリプトン
１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣ
ｌの５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中で培養した。該培
養物を遠心し、回収した菌体を２０mMトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ８．０ １mlに懸濁し、１００℃で１０分間熱処理
した。続いて超音波処理を行い、更にもう一度１００
℃、１０分間熱処理した。遠心後の上清として得られる
ライゼートをコスミドプロテインライブラリーとした。
【００３３】（超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むコス
ミドの選択）プロテアーゼ活性は、グルタリル−Ｌ−フ
ェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド加水分解活性を、
加水分解で生成するｐ−ニトロアニリンを分光学的に追
跡することにより測定した。すなわち、上記コスミドプ
ロテインライブラリーからライゼート２０mlずつをと
り、１mMのグルタリル−Ｌ−フェニルアラニン−ｐ−ニ
トロアニリド溶液（５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．
５）１５０μｌを加え、９５℃で６０分間反応させた。
氷冷して反応を停止した後、４１０nmにおける吸光度を
測定し、ｐ−ニトロアニリンの生成量を求めた。コスミ
ドプロテインライブラリーよりプロテアーゼ活性を持つ
４個のコスミドクローンを得た。
ミドの選択）プロテアーゼ活性は、グルタリル−Ｌ−フ
ェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド加水分解活性を、
加水分解で生成するｐ−ニトロアニリンを分光学的に追
跡することにより測定した。すなわち、上記コスミドプ
ロテインライブラリーからライゼート２０mlずつをと
り、１mMのグルタリル−Ｌ−フェニルアラニン−ｐ−ニ
トロアニリド溶液（５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．
５）１５０μｌを加え、９５℃で６０分間反応させた。
氷冷して反応を停止した後、４１０nmにおける吸光度を
測定し、ｐ−ニトロアニリンの生成量を求めた。コスミ
ドプロテインライブラリーよりプロテアーゼ活性を持つ
４個のコスミドクローンを得た。
【００３４】（超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むプラ
スミドpPhe２の調製）プロテアーゼ活性を持つ４個のコ
スミドクローンより１個を選びコスミドを調製し、 Pst
Ｉ消化した後、pUC118の PstＩサイトにライゲーション
した。この組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入
した後、アンピシリン（１００μｇ／ml）を含むＬＢプ
レート上にまき、出現したコロニーについて１００μｇ
／mlのアンピシリンを含む５mlのＬＢ培地中で培養を行
った。該培養物を遠心し回収した菌体を５０mMトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ７．５の１００μｌに懸濁し、１００℃、
１０分間熱処理を行った後、超音波処理により菌体を破
砕した。更にもう一度１００℃、１０分間熱処理を行
い、遠心してライゼートを得た。このライゼートについ
てプロテアーゼ活性を測定した。すなわち１０μｌのラ
イゼートに５mMグルタリル−Ｌ−フェニルアラニン−ｐ
−ニトロアニリド溶液（５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５）４０μｌを加え、９５℃で３０分間反応させ
た。氷冷して反応を停止した後、４１０nmにおける吸光
度を測定し、ｐ−ニトロアニリンの生成量を求めた。プ
ロテアーゼ活性を有するコロニーよりプラスミドを調製
し、これをプラスミドpPhe２と命名した。
スミドpPhe２の調製）プロテアーゼ活性を持つ４個のコ
スミドクローンより１個を選びコスミドを調製し、 Pst
Ｉ消化した後、pUC118の PstＩサイトにライゲーション
した。この組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入
した後、アンピシリン（１００μｇ／ml）を含むＬＢプ
レート上にまき、出現したコロニーについて１００μｇ
／mlのアンピシリンを含む５mlのＬＢ培地中で培養を行
った。該培養物を遠心し回収した菌体を５０mMトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ７．５の１００μｌに懸濁し、１００℃、
１０分間熱処理を行った後、超音波処理により菌体を破
砕した。更にもう一度１００℃、１０分間熱処理を行
い、遠心してライゼートを得た。このライゼートについ
てプロテアーゼ活性を測定した。すなわち１０μｌのラ
イゼートに５mMグルタリル−Ｌ−フェニルアラニン−ｐ
−ニトロアニリド溶液（５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５）４０μｌを加え、９５℃で３０分間反応させ
た。氷冷して反応を停止した後、４１０nmにおける吸光
度を測定し、ｐ−ニトロアニリンの生成量を求めた。プ
ロテアーゼ活性を有するコロニーよりプラスミドを調製
し、これをプラスミドpPhe２と命名した。
【００３５】（超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むプラ
スミドpPheS2の調製）上記プラスミドpPhe２について数
種類の制限酵素を用いて図２に示す、制限酵素地図を作
製した。この制限酵素地図を基にpPhe２由来の種々のＤ
ＮＡ断片をプラスミドpUC19 にライゲーションして大腸
菌ＪＭ１０９に導入し、前述の方法によりコロニーのプ
ロテアーゼ活性を調べた。 StuＩ、BamHＩ消化によって
得られる約５kbのＤＮＡ断片をpUC19 の Hinc II、BamH
Ｉサイト間に挿入した組換えプラスミドを導入したコロ
ニーに超耐熱性プロテアーゼ活性が見られた。このコロ
ニーよりプラスミドを調製し、これをプラスミドpPheS2
と命名した。図３にプラスミドpPheS2の制限酵素地図を
示す。
スミドpPheS2の調製）上記プラスミドpPhe２について数
種類の制限酵素を用いて図２に示す、制限酵素地図を作
製した。この制限酵素地図を基にpPhe２由来の種々のＤ
ＮＡ断片をプラスミドpUC19 にライゲーションして大腸
菌ＪＭ１０９に導入し、前述の方法によりコロニーのプ
ロテアーゼ活性を調べた。 StuＩ、BamHＩ消化によって
得られる約５kbのＤＮＡ断片をpUC19 の Hinc II、BamH
Ｉサイト間に挿入した組換えプラスミドを導入したコロ
ニーに超耐熱性プロテアーゼ活性が見られた。このコロ
ニーよりプラスミドを調製し、これをプラスミドpPheS2
と命名した。図３にプラスミドpPheS2の制限酵素地図を
示す。
【００３６】（超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むプラ
スミドpPheS3の調製）上記プラスミドpPheS2を PstＩ、
Bgl II、で同時に消化した後、アガロースゲル電気泳動
を行い、約１．４kbの PstＩ−Bgl II断片、及び約２．
６kbのBgl II−Bgl II断片をアガロースゲルより回収し
た。この２つのＤＮＡ断片とBamHＩ、Pst I 消化したpU
C19 との間でライゲーションを行って大腸菌ＪＭ１０９
に導入し、前述の方法によりコロニーのプロテアーゼ活
性を調べた。超耐熱性プロテアーゼ活性を示したコロニ
ーよりプラスミドを調製し、インサートされたＤＮＡ断
片を調べたところpPheS2より約１kbのBgl II−BamHＩ断
片が除かれた構成となっていた。このプラスミドをプラ
スミドpPheS3と命名した。次に該プラスミドを保有する
大腸菌ＪＭ１０９をEscherichia coli JM109／pPheS3と
命名した。図４にプラスミドpPheS3の制限酵素地図を示
す。
スミドpPheS3の調製）上記プラスミドpPheS2を PstＩ、
Bgl II、で同時に消化した後、アガロースゲル電気泳動
を行い、約１．４kbの PstＩ−Bgl II断片、及び約２．
６kbのBgl II−Bgl II断片をアガロースゲルより回収し
た。この２つのＤＮＡ断片とBamHＩ、Pst I 消化したpU
C19 との間でライゲーションを行って大腸菌ＪＭ１０９
に導入し、前述の方法によりコロニーのプロテアーゼ活
性を調べた。超耐熱性プロテアーゼ活性を示したコロニ
ーよりプラスミドを調製し、インサートされたＤＮＡ断
片を調べたところpPheS2より約１kbのBgl II−BamHＩ断
片が除かれた構成となっていた。このプラスミドをプラ
スミドpPheS3と命名した。次に該プラスミドを保有する
大腸菌ＪＭ１０９をEscherichia coli JM109／pPheS3と
命名した。図４にプラスミドpPheS3の制限酵素地図を示
す。
【００３７】（超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むプラ
スミドpPheE1の調製）上記プラスミドpPheS3を PstＩ、
EcoT22Ｉ消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、
分離された約０．６kb、約２kb、約４．１kbのＤＮＡ断
片のうち、約２kb、約４．１kbの２つの断片を回収し
た。約４．１kbのＤＮＡ断片をアルカリホスファターゼ
（宝酒造）を用いて脱リン酸した後、約２kbのＤＮＡ断
片と混合してライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９
に導入した。出現したコロニーの超耐熱性プロテアーゼ
活性を測定し、活性を示したコロニーからプラスミドを
調製し、該プラスミドをプラスミドpPheE1と命名し、該
プラスミドを保有する大腸菌ＪＭ１０９をEscherichia
coli JM109／pPheE1と命名した。図５にプラスミドpPhe
E1の制限酵素地図を示す。
スミドpPheE1の調製）上記プラスミドpPheS3を PstＩ、
EcoT22Ｉ消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、
分離された約０．６kb、約２kb、約４．１kbのＤＮＡ断
片のうち、約２kb、約４．１kbの２つの断片を回収し
た。約４．１kbのＤＮＡ断片をアルカリホスファターゼ
（宝酒造）を用いて脱リン酸した後、約２kbのＤＮＡ断
片と混合してライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９
に導入した。出現したコロニーの超耐熱性プロテアーゼ
活性を測定し、活性を示したコロニーからプラスミドを
調製し、該プラスミドをプラスミドpPheE1と命名し、該
プラスミドを保有する大腸菌ＪＭ１０９をEscherichia
coli JM109／pPheE1と命名した。図５にプラスミドpPhe
E1の制限酵素地図を示す。
【００３８】（超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むプラ
スミドpPheE2の調製）上記プラスミドpPheE1をEcoRＩ消
化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、分離された
約０．６kb、約０．９kb、約４．６kbのＤＮＡ断片のう
ち約０．９kb、約４．６kbの２つの断片を回収した。約
４．６kbのＤＮＡ断片をアルカリホスファターゼを用い
て脱リン酸した後、約０．９kbのＤＮＡ断片と混合して
ライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。
出現したコロニーの超耐熱性プロテアーゼ活性を測定
し、活性を示したコロニーからプラスミドを調製し、プ
ラスミドpPheE2と命名し、該プラスミドを保有する大腸
菌ＪＭ１０９をEscherichia coli JM109／pPheE2と命名
した。図６にプラスミドpPheE2の制限酵素地図を示す。
また図１にプラスミドpPheE2に挿入されたピロコッカス
フリオサス由来の、本発明により得られた約２．８kb
の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す。
スミドpPheE2の調製）上記プラスミドpPheE1をEcoRＩ消
化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、分離された
約０．６kb、約０．９kb、約４．６kbのＤＮＡ断片のう
ち約０．９kb、約４．６kbの２つの断片を回収した。約
４．６kbのＤＮＡ断片をアルカリホスファターゼを用い
て脱リン酸した後、約０．９kbのＤＮＡ断片と混合して
ライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。
出現したコロニーの超耐熱性プロテアーゼ活性を測定
し、活性を示したコロニーからプラスミドを調製し、プ
ラスミドpPheE2と命名し、該プラスミドを保有する大腸
菌ＪＭ１０９をEscherichia coli JM109／pPheE2と命名
した。図６にプラスミドpPheE2の制限酵素地図を示す。
また図１にプラスミドpPheE2に挿入されたピロコッカス
フリオサス由来の、本発明により得られた約２．８kb
の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す。
【００３９】実施例２ （酵素標品の調製）実施例１で得られた、本発明の超耐
熱性プロテアーゼ遺伝子を含有するプラスミドpPhe３を
導入した大腸菌ＪＭ１０９、Escherichia coli JM109／
pPhe３(FERM P-13349)を１００μｇ／mlのアンピシリン
を含む２×ＴＹ培地（トリプトン１６ｇ／リットル、酵
母エキス１０ｇ／リットル、ＮａＣｌの５ｇ／リット
ル、ｐＨ７．２）５ml中で、３７℃、９時間振とう培養
した。２リットル容の三角フラスコ２本に同様の培地６
００mlずつを準備し、それぞれに前述の培養液１mlずつ
を接種し、３７℃で１５時間振とう培養した。培養液を
遠心分離して得られた湿重量４．８ｇの菌体を５０mlの
２０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に懸濁した後、超音
波処理にて菌体を破砕し、遠心分離して得た上清を粗抽
出液とした。この粗抽出液を１００℃、１０分間熱処理
した後、遠心分離して得た上清に終濃度１％となるよう
に硫酸ストレプトマイシンを加えた。この試料を再び遠
心分離して得た上清に７５％飽和となるよう硫酸アンモ
ニウムを加え、沈殿物を遠心分離にて回収した。得られ
た沈殿物を８mlの２０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に
溶解し、同緩衝液に対して一夜透析した。次に透析内液
をあらかじめ２０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡
化した１５mlのＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー）カラム
に通し、吸着したプロテアーゼ活性を０〜０．５ＭのＫ
Ｃｌ直線濃度勾配により溶出した。得られたプロテアー
ゼ活性画分を集め、限外ろ過膜を用いて濃縮した後、２
０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＫＣｌで
平衡化した１７０mlのセファデックスＧ−１００（ファ
ルマシア）カラムによるゲルろ過を行い、溶出された活
性画分を集めた。続いてこの活性画分を２０mMトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化した１mlのヒドロキシルア
パタイト（バイオ・ラッド）カラムに通し、カラムを２
０mMリン酸カリウムｐＨ７．５で洗浄した後、２０〜５
００mMのリン酸カリウム直線濃度勾配により溶出した。
得られたプロテアーゼ活性画分を集め、精製酵素標品を
得た。以上の精製操作により該酵素標品の比活性は粗抽
出液の約２５００倍に上昇した。
熱性プロテアーゼ遺伝子を含有するプラスミドpPhe３を
導入した大腸菌ＪＭ１０９、Escherichia coli JM109／
pPhe３(FERM P-13349)を１００μｇ／mlのアンピシリン
を含む２×ＴＹ培地（トリプトン１６ｇ／リットル、酵
母エキス１０ｇ／リットル、ＮａＣｌの５ｇ／リット
ル、ｐＨ７．２）５ml中で、３７℃、９時間振とう培養
した。２リットル容の三角フラスコ２本に同様の培地６
００mlずつを準備し、それぞれに前述の培養液１mlずつ
を接種し、３７℃で１５時間振とう培養した。培養液を
遠心分離して得られた湿重量４．８ｇの菌体を５０mlの
２０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に懸濁した後、超音
波処理にて菌体を破砕し、遠心分離して得た上清を粗抽
出液とした。この粗抽出液を１００℃、１０分間熱処理
した後、遠心分離して得た上清に終濃度１％となるよう
に硫酸ストレプトマイシンを加えた。この試料を再び遠
心分離して得た上清に７５％飽和となるよう硫酸アンモ
ニウムを加え、沈殿物を遠心分離にて回収した。得られ
た沈殿物を８mlの２０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に
溶解し、同緩衝液に対して一夜透析した。次に透析内液
をあらかじめ２０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡
化した１５mlのＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー）カラム
に通し、吸着したプロテアーゼ活性を０〜０．５ＭのＫ
Ｃｌ直線濃度勾配により溶出した。得られたプロテアー
ゼ活性画分を集め、限外ろ過膜を用いて濃縮した後、２
０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＫＣｌで
平衡化した１７０mlのセファデックスＧ−１００（ファ
ルマシア）カラムによるゲルろ過を行い、溶出された活
性画分を集めた。続いてこの活性画分を２０mMトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化した１mlのヒドロキシルア
パタイト（バイオ・ラッド）カラムに通し、カラムを２
０mMリン酸カリウムｐＨ７．５で洗浄した後、２０〜５
００mMのリン酸カリウム直線濃度勾配により溶出した。
得られたプロテアーゼ活性画分を集め、精製酵素標品を
得た。以上の精製操作により該酵素標品の比活性は粗抽
出液の約２５００倍に上昇した。
【００４０】同様に、本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺
伝子を含有するプラスミドpPheE1、プラスミドpPheE2を
それぞれ導入した大腸菌ＪＭ１０９、Escherichia coli
JM109／pPheE1、Escherichia coli JM109／pPheE2をそ
れぞれ上記と同様に培養し、培養物中より超耐熱性プロ
テアーゼ活性画分を精製し、超耐熱性プロテアーゼ標品
を得た。
伝子を含有するプラスミドpPheE1、プラスミドpPheE2を
それぞれ導入した大腸菌ＪＭ１０９、Escherichia coli
JM109／pPheE1、Escherichia coli JM109／pPheE2をそ
れぞれ上記と同様に培養し、培養物中より超耐熱性プロ
テアーゼ活性画分を精製し、超耐熱性プロテアーゼ標品
を得た。
【００４１】
【発明の効果】本発明により極めて高い耐熱性を有する
プロテアーゼをコードする遺伝子が得られた。該遺伝子
を用い超耐熱性プロテアーゼが高純度で大量に供給でき
る。
プロテアーゼをコードする遺伝子が得られた。該遺伝子
を用い超耐熱性プロテアーゼが高純度で大量に供給でき
る。
【図１】本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の１例の
制限酵素地図を示す図である。
制限酵素地図を示す図である。
【図２】プラスミドpPhe２の制限酵素地図を示す図であ
る。
る。
【図３】プラスミドpPheS2の制限酵素地図を示す図であ
る。
る。
【図４】プラスミドpPheS3の制限酵素地図を示す図であ
る。
る。
【図５】プラスミドpPheE1の制限酵素地図を示す図であ
る。
る。
【図６】プラスミドpPheE2の制限酵素地図を示す図であ
る。
る。
【図７】超耐熱性プロテアーゼの至適温度を示す図であ
る。
る。
【図８】超耐熱性プロテアーゼの至適ｐＨを示す図であ
る。
る。
【図９】超耐熱性プロテアーゼの熱安定性を示す図であ
る。
る。
【図１０】超耐熱性プロテアーゼのｐＨ安定性を示す図
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 三田 正範 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 浅田 起代蔵 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】 図面の図１で表される超耐熱性プロテア
ーゼ遺伝子。 - 【請求項２】 請求項１記載の超耐熱性プロテアーゼ遺
伝子にハイブリダイズ可能な超耐熱性プロテアーゼ遺伝
子。 - 【請求項３】 請求項１、又は請求項２記載の超耐熱性
プロテアーゼ遺伝子を含有させた組換体プラスミドを導
入させた形質転換体を培養し、該培養物から超耐熱性プ
ロテアーゼを採取することを特徴とする超耐熱性プロテ
アーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01706893A JP3341915B2 (ja) | 1993-01-07 | 1993-01-07 | 超耐熱性プロテアーゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01706893A JP3341915B2 (ja) | 1993-01-07 | 1993-01-07 | 超耐熱性プロテアーゼ遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06197770A true JPH06197770A (ja) | 1994-07-19 |
| JP3341915B2 JP3341915B2 (ja) | 2002-11-05 |
Family
ID=11933676
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01706893A Expired - Fee Related JP3341915B2 (ja) | 1993-01-07 | 1993-01-07 | 超耐熱性プロテアーゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3341915B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995034645A1 (fr) * | 1994-06-13 | 1995-12-21 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Gene de protease hyperthermostable |
| WO1997021823A1 (fr) * | 1995-12-12 | 1997-06-19 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Genes de proteases ultrathermostables |
| JP2013132288A (ja) * | 2011-12-27 | 2013-07-08 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | 細菌、有機物分解用複合菌、有機性廃棄物処理方法、有機肥料、有機肥料製造方法、及び菌床 |
-
1993
- 1993-01-07 JP JP01706893A patent/JP3341915B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995034645A1 (fr) * | 1994-06-13 | 1995-12-21 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Gene de protease hyperthermostable |
| US5756339A (en) * | 1994-06-13 | 1998-05-26 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Hyperthermostable protease gene |
| CN1086737C (zh) * | 1994-06-13 | 2002-06-26 | 宝酒造株式会社 | 超热稳定蛋白酶基因 |
| WO1997021823A1 (fr) * | 1995-12-12 | 1997-06-19 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Genes de proteases ultrathermostables |
| EP0870833A4 (ja) * | 1995-12-12 | 1998-10-14 | ||
| US6261822B1 (en) | 1995-12-12 | 2001-07-17 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Ultrathermostable protease genes |
| US7314744B2 (en) | 1995-12-12 | 2008-01-01 | Takara Bio Inc. | Hyperthermostable protease gene |
| JP2013132288A (ja) * | 2011-12-27 | 2013-07-08 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | 細菌、有機物分解用複合菌、有機性廃棄物処理方法、有機肥料、有機肥料製造方法、及び菌床 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3341915B2 (ja) | 2002-11-05 |
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