JP5339543B2 - 新規なプロテアーゼおよびその利用 - Google Patents

Description

本発明は、新規なプロテアーゼおよびその利用に関するものであり、詳細には、高温かつ高アルカリ条件下で高い活性を有する新規なプロテアーゼおよびそのプロ体、それらをコードするポリヌクレオチド、並びに、これらの利用に関するものである。

プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素の総称であり、微生物、動物および植物に広く分布している。また、プロテアーゼは、洗剤、皮革加工、食品加工、機能性ペプチド生産において幅広く利用されている代表的な産業用酵素である。特に医療器具の二次感染予防の観点から、感染性タンパク質汚れのプロテアーゼによる分解は、代替の難しい技術となっている。産業用酵素としての実用面で一番重用視されるのは、酵素の安定性および利用条件下での活性の高さである。特に、物理的・化学的に高い熱安定性が要求される場合が多く、それゆえ、産業用プロテアーゼには耐熱性プロテアーゼが広く使用されている。現在、産業用プロテアーゼとして、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｃａｒｌｓｂｅｒｇやＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫなどのサチライシンファミリープロテアーゼ（subtilisin family protease）が知られている。なかでも米国Ｇｅｎｅｎｃｏｒｅ社が発売しているＰｒｉｏｎｚｙｍｅは、実用化されているプロテアーゼ中、最も高い安定性を示す酵素として、ＣＪＤ（クロイツフェルトヤコブ病）等のプリオン病の原因物質である異常型プリオンの感染予防を目的とした器具洗浄用途に用いられている。しかし、その至適作用条件は４０〜６０℃、ｐＨ８〜１０とされており、より高温で利用できるプロテアーゼの実用化が望まれている。そのため、高温かつ高アルカリ条件下で利用可能な新規プロテアーゼを見出すために、多数の試みがなされている。

例えば本発明者らは、超好熱菌の１つであるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株由来のサチライシンファミリーに属するプロテアーゼ（以下「Ｔｋ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ」という）を見出し、Ｔｋ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎがｐＨ９．５、温度８０℃〜１００℃で最も高い活性を示すこと、公知のプロテアーゼのなかで最も高い熱安定性を有することを報告している（非特許文献１および２参照）。また、特許文献１には、同じＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株由来の耐熱性プロテアーゼが開示され、この耐熱性プロテアーゼは、至適温度が８０℃付近にあり、耐熱性は、１２０分間インキュベートした後も７０℃で約７５％、８０℃で約５０％の残存活性が認められ、耐アルカリ性は、１２０分間インキュベートした後もｐＨ１１で９０％以上、ｐＨ１１．５で約８５％の残存活性が認められたことが記載されている。

特開２００７−６８４６号公報

Kannan, Y., Koga, Y., Inoue, Y., Haruki, M., Takagi, M., Imanaka, T. et al. Active subtilisin-like protease from a hyperthermophilic archaeon in a form with a putative prosequence. Appl. Environ. Microbiol. 67, 2445-2552. (2001). Pulido, M., Saito, K., Tanaka, S., Koga, Y., Takano, K. & Kanaya, S. Ca2+-dependent maturation of Tksubtilisin from a hyperthermophilic archaeon: propeptide is a potent inhibitor of the mature domain but is not required for its folding. Appl. Environ. Microbiol. 72, 4154-4162. (2006).

上記非特許文献１および２に記載のプロテアーゼや特許文献１に記載の耐熱性プロテアーゼのように、高温かつ高アルカリ条件下で利用可能な新規プロテアーゼが見出されているものの、これらは未だ実用化に至っていない。また、産業用プロテアーゼは、洗剤に添加して使用される場合が多く、界面活性剤の存在下においても安定であり、かつ、活性を発揮できることが要求される。したがって、さらに新規なプロテアーゼを見出し、その機能を明らかにして、産業用プロテアーゼとして実用化すべく、研究・開発を行うことは、現在も当該技術分野の大きな課題となっている。

そこで、本発明は、高温かつ高アルカリ条件下で高い活性を有し、タンパク質変性剤や界面活性剤に対する安定性が高く、洗剤用プロテアーゼとして高い有用性を有する新規なプロテアーゼを提供することを目的とする。

本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
［２］アゾカゼインを基質としてｐＨ７で２０分間反応させたときの反応至適温度が１００℃以上である前記［１］に記載のプロテアーゼ。
［３］５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）中、１００℃で９０分間処理したときに４０％以上の残存活性を有する前記［１］に記載のプロテアーゼ。
［４］５％ドデシル硫酸ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、５５℃で６０分間処理したときに８０％以上の残存活性を有する前記［１］に記載のプロテアーゼ。
［５］反応温度８０℃でＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを基質としたときにＫｍ値が０．１〜１ｍＭである前記［１］に記載のプロテアーゼ。
［６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のプロテアーゼのプロ体であって、以下の（ｅ）または（ｆ）に記載のアミノ酸配列からなるプロ体。
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号５に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
［７］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド。
［８］配列番号２もしくは４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号２もしくは４に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドである前記［７］に記載のポリヌクレオチド。
［９］前記［６］に記載のプロ体をコードするポリヌクレオチド。
［１０］配列番号６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号６に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロ体をコードするポリヌクレオチドである前記［９］に記載のポリヌクレオチド。
［１１］前記［７］〜［１０］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［１２］前記［１１］の発現ベクターが導入された形質転換体。
［１３］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のプロテアーゼに特異的に結合する抗体。
［１４］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のプロテアーゼを含有する洗剤。

本発明によれば、従来に比べて高温かつ高アルカリ条件下で高い活性を有し、タンパク質変性剤や界面活性剤に対する安定性が高く、低濃度の基質を分解可能なプロテアーゼを提供することができる。当該プロテアーゼは、高温かつ高アルカリ条件下で使用される種々の洗剤に配合して使用するプロテアーゼとして非常に有用である。

（ａ）は本発明のプロ体（ｐｒｏＴｋ−ＳＰ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す画像であり、（ｂ）はｐｒｏＴｋ−ＳＰを８０℃で１２０分間インキュベートして得られた本発明のプロテアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す画像である。 本発明のプロテアーゼ（Ｔｋ−ＳＰ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる分子量分析結果を示すチャートである。 本発明のプロテアーゼ（Ｔｋ−ＳＰ）のＮ末端分析結果を示す図である。 本発明のプロテアーゼ（Ｔｋ−ＳＰ）のｐＨ依存性およびバッファー依存性を検討した結果を示すグラフである。 本発明のプロテアーゼ（Ｔｋ−ＳＰ）の温度依存性を検討した結果を示すグラフである。 本発明のプロテアーゼ（Ｔｋ−ＳＰ）の熱安定性を検討した結果を示すグラフである。 本発明のプロテアーゼ（Ｔｋ−ＳＰ）の尿素（Ｕｒｅａ）に対する安定性を検討した結果を示すグラフである。 本発明のプロテアーゼ（Ｔｋ−ＳＰ）の塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）に対する安定性を検討した結果を示すグラフである。 本発明のプロテアーゼ（Ｔｋ−ＳＰ）のＴｒｉｔｏｎＸ−１００に対する安定性を検討した結果を示すグラフである。 本発明の耐熱性プロテアーゼ（Ｔｋ−ＳＰ）のＴｗｅｅｎ２０に対する安定性を検討した結果を示すグラフである。 本発明のプロテアーゼ（Ｔｋ−ＳＰ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に対する安定性を検討した結果を示すグラフである。 本発明のプロテアーゼ（Ｔｋ−ＳＰ）のＥＤＴＡに対する安定性を検討した結果を示すグラフである。 本発明のプロテアーゼ（Ｔｋ−ＳＰ）の安定性に及ぼすカルシウムイオンの効果を検討した結果を示すグラフである。 本発明のプロテアーゼ（Ｔｋ−ＳＰ）の構造形成におけるカルシウムイオン要求性を検討した結果を示すグラフである。

〔プロテアーゼおよびそのプロ体〕
（１）プロテアーゼの取得
本発明のプロテアーゼは、超好熱菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株（Morikawa M et al. Appl Environ Microbiol, 1994 Dec;60(12):4559-66、以下「ＫＯＤ１株」という）由来の新規なプロテアーゼである。ＫＯＤ１株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターに寄託されており、その受託番号はＪＣＭ１２３８０である。ＫＯＤ１株の全ゲノム情報は既に解析されており、２０３６個のタンパク質コード領域（ＣＤＳ）が特定され、そのうち約半数（１１６５個）のＣＤＳに注釈が付与されている（Fukui T et al., Genome Res, 2005 Mar;15(3):352-63）。なお、ＫＯＤ１株の全ゲノム２０８８７３７塩基の配列はＤＤＢＪ／ＥＭＢL／ＧｅｎＢａｎｋに登録されており、そのアクセッション番号はＡＰ００６８７８である。

本発明者らは、ＫＯＤ１株のゲノム情報から、サチライシン様セリンプロテアーゼ前駆体をコードすると予想される塩基配列（ACCESSION AP006878 REGION:1484233..1486224、配列番号８）に着目し、当該塩基配列にコードされる全長タンパク質中にプロテアーゼ活性を有する成熟タンパク質を構成する部分配列を特定した。一般に、サチライシンファミリーのプロテアーゼは、長いプレプロ配列を有している。プレ配列（シグナル配列とも称する）は、酵素の菌体外への分泌に必要な配列であり、プロ配列は酵素の活性型立体構造を形成する際に必要な配列であるとされている。そこで、本発明者らは、当該塩基配列（配列番号８）に基づいてプロ配列および成熟配列を含みプレ配列（シグナル配列）が除かれたプロテアーゼ前駆体（プロ体）をコードすると予想される領域のＤＮＡを増幅した。得られたＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを大腸菌に導入してタンパク質（プロ体）を発現させた。得られたプロ体をインキュベート（例えば、ｐＨ９、温度８０℃で１２０分間）してプロセシング（成熟化）させることにより、プロテアーゼ活性を有する成熟タンパク質、すなわち本発明のプロテアーゼを取得した。

本発明のプロテアーゼは、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるものであればよい。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、上記サチライシン様セリンプロテアーゼ前駆体をコードすると予想される塩基配列（ACCESSION AP006878 REGION: 1484233..1486224、配列番号８）に基づく推定アミノ酸配列（ACCESSION BAD85878、配列番号７）の第１３７位〜第５６２位に該当する。また、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、上記サチライシン様セリンプロテアーゼ前駆体をコードすると予想される塩基配列（配列番号８）に基づく推定アミノ酸配列（配列番号７）の第１３７位〜第５６３位に該当する。

また、本発明のプロ体は、上記本発明のプロテアーゼのプロ体であって、以下の（ｅ）または（ｆ）に記載のアミノ酸配列からなるものであればよい。
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号５に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
なお、本明細書において「プロ体」とは、プレ配列がなくプロ配列および成熟配列を含むプロテアーゼ前駆体を意味する。
配列番号５に示されるアミノ酸配列は、上記サチライシン様セリンプロテアーゼ前駆体をコードすると予想される塩基配列（配列番号８）に基づく推定アミノ酸配列（配列番号７）の第２４位〜第６６３位に該当する。当該プロ体のアミノ酸配列（配列番号５）の第１位〜第１１３位および第５４０位〜第６４０位が除かれたものが配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼであり、第１位〜第１１３位および第５４１位〜第６４０位が除かれたものが配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼである。

「１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異タンパク質は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。

好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。好ましくは、サイレント置換、欠失、および付加であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。

本発明のプロテアーゼおよびプロ体は付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドとしては、例えば、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）やＭｙｃ、ＦＬＡＧ等のエピトープ標識ペプチドが挙げられる。

本発明のプロテアーゼおよびプロ体は、(I) 当該プロテアーゼを産生する細菌を培養し、分離および精製することにより製造することができる。または、(II) 公知の遺伝子工学的手法により細菌から本発明のプロテアーゼまたはプロ体をコードする遺伝子を単離して組み換え発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞に導入して組み換えタンパク質として発現させることにより製造することができる。または、(III) ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系によって製造することができる。本発明のプロテアーゼの製造に利用可能な細菌は、本発明のプロテアーゼを産生し得るものであれば特に限定されない。好ましい細菌としては、上記ＫＯＤ１株が挙げられる。

上記(I)の方法をＫＯＤ１株を用いて行う場合、ＫＯＤ１株の培養は、例えば、Morikawa. et al. Appl. Environ. Microbiol. 60: 4559-4566. (1994) に記載の培養条件で行うことができる。数日間培養した後、菌体を分離した残りの培養液から公知の方法で分離・精製すればよい。具体的には、例えば、塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の精製手段、これらの組み合わせ、などが挙げられる。
上記(II)の方法については、後段の〔ポリヌクレオチド〕、〔発現ベクター〕および〔形質転換体〕で詳細に説明する。
上記(III)の方法で行う場合は、本発明のプロテアーゼまたはプロ体をコードするＤＮＡ断片と、公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（例えば、大腸菌、小麦胚芽細胞、ウサギ網膜細胞の無細胞抽出液を用いる系）を用いることができる。
得られたプロテアーゼまたはプロ体の同定は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、得られたプロテアーゼを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜にトランスファーし、膜をクマシーブリリアントブルーで染色した後、目的タンパク質のバンドを切り出す。切り出したバンドのトリプシン消化物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、ペプチドマスフィンガープリント解析により同定することができる。また、例えば、自動ペプチドシーケンサを用いてアミノ酸配列を決定することができる。

（２）プロテアーゼの生化学的特性
(i) 至適ｐＨ（実施例２参照）
Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを基質とし、２０℃で１０分間インキュベートしたときの至適ｐＨは少なくともｐＨ６〜１１．５の範囲であり、ｐＨ１１．５を超える範囲においても高い活性を示すことが予想される。したがって、本発明のプロテアーゼはｐＨ６以上の多様なｐＨ環境での利用に適している。

(ii) 至適温度（実施例３参照）
アゾカゼインを基質としてｐＨ７で２０分間反応させたときの至適温度が１００℃以上である。したがって、本発明のプロテアーゼは高温環境での使用に適しており、例えば感染性タンパク質の分解を目的とした医療器具用洗剤等に配合すれば、優れた効果を発揮することが期待される。

(iii) 熱安定性（実施例４参照）
溶液中、１００℃で９０分間処理したときに４０％以上の残存活性を有し、９０℃で１８０分間処理したときに８０％以上の残存活性を有する。８０℃で１８０分間処理した場合には、活性は低下しない。このように、本発明のプロテアーゼは、極めて熱安定性が高いため、高温環境で使用に適している。

(iv) タンパク質変性剤、界面活性剤およびキレート剤に対する安定性（実施例５参照）
８Ｍの尿素を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、５５℃で６０分間処理したときに８０％以上の残存活性を有する。
２Ｍの塩酸グアニジンを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、５５℃で６０分間処理したときに６０％以上の残存活性を有する。
１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、５５℃で６０分間処理したときに９５％以上の残存活性を有する。
１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、５５℃で６０分間処理したときに９５％以上の残存活性を有する。
５％ドデシル硫酸ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、５５℃で６０分間処理したときに８０％以上の残存活性を有する。
１０ｍＭＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、５５℃で６０分間処理したときに活性が低下しない。
したがって、本発明のプロテアーゼは、各種のタンパク質変性剤、界面活性剤、キレート剤に対し高い安定性を有しているため、タンパク質変性剤、界面活性剤、キレート剤を含む組成物に添加して使用することが可能であり、産業用プロテアーゼとして幅広い用途に使用することができるという利点を有している。

(v) Ｋｍ値（実施例７参照）
反応温度８０℃でＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを基質としたときにＫｍ値が０．１〜１ｍＭである。この値は、上述のＴｋ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ（非特許文献１および２参照）のＫｍ値の約１／１０であり、Ｔｋ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎと比較した場合、低濃度の基質を効率よく分解できることを示している。したがって、感染性タンパク質の二次感染が問題となる医療器具用洗剤などの用途に好適に用いることができる。

(vi) 構造形成におけるカルシウムイオン非要求性（実施例８参照）
本発明のプロテアーゼは、構造形成にカルシウムイオンを必要とせず、カルシウムイオンが存在しない状態でも安定にプロテアーゼ活性を発揮することができる。同じＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株由来のプロテアーゼであるＴｋ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎはカルシウム要求性が非常に強いことと対照をなし、本発明のプロテアーゼに特徴的な特性である。したがって、本発明のプロテアーゼは、例えばキレート剤を添加剤として含む洗剤中でも安定に機能を発揮することができるという極めて優れた利点を有している。

なお、本発明のプロテアーゼの活性測定は、後段の実施例の記載に準じて行うことができる。すなわち、Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡやアゾカゼイン等を基質として、ペプチド結合の分解反応を行い、その際遊離した色素量を吸光度から定量する。これにより、酵素によって切断されたペプチド結合の量を計算し酵素活性を測ることができる。

〔ポリヌクレオチド〕
本発明のポリヌクレオチドは、上記本発明のプロテアーゼをコードするものであればよい。具体的には以下の（Ａ）〜（Ｄ）のポリヌクレオチドが挙げられる。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド

また、本発明のポリヌクレオチドは、上記本発明のプロ体をコードするポリヌクレオチドであればよい。具体的には以下の（Ｅ）または（Ｆ）のポリヌクレオチドが挙げられる。
（Ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるプロ体をコードするポリヌクレオチド
（Ｆ）配列番号５に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるプロ体をコードするポリヌクレオチド

本明細書において「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用される。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在することができる。ＤＮＡは、二本鎖でもよく一本鎖でもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）、または、非コード鎖（アンチセンス鎖）のいずれであってもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、その５’側または３’側でタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合されていてもよい。

本発明のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号２もしくは４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
また、本発明のプロ体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロ体をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
配列番号２に示される塩基配列は、上記サチライシン様セリンプロテアーゼ前駆体をコードすると予想される塩基配列（ACCESSION AP006878 REGION: 1484233..1486224、配列番号８）の第４０９位〜第１６８６位に該当し、配列番号４に示される塩基配列は、第４０９位〜第１６８９位に該当する。また、配列番号２に示される塩基配列は、配列番号８の、第７０位〜第１９９２位に該当する。

ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高く（ハイブリダイズし難く）なり、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。

「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」とは、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。

本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号２または４に示される塩基配列に相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが好ましい。また、本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号６に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、プロ体をコードするポリヌクレオチドが好ましい。

任意の特定のポリヌクレオチドが、例えば、配列番号２に示される塩基配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）を使用して決定することができる。

本発明のポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。また、本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。

本発明のポリヌクレオチドを取得する方法としては、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、配列番号２に示される塩基配列の５’側および３’側の配列（またはその相補配列）に基づいてそれぞれプライマーを設計し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。

〔発現ベクター〕
本発明は、本発明のプロテアーゼを製造するために使用される発現ベクターを提供する。本発明に係る発現ベクターは、上述した本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を有するプラスミドベクター（ｐＳＰ６４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）が好ましい。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択することができる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
本発明の発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、本発明のプロテアーゼまたはプロ体を回収、精製することができる。

発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。

上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）などが挙げられる。上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。

〔形質転換体〕
本発明は、上記本発明の発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。本明細書において「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含む。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞として例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。
本発明の形質転換体は、上記本発明のプロテアーゼまたはプロ体が発現されていることを特徴とする。本発明に係る形質転換体は、上記本発明のプロテアーゼまたはプロ体が安定的に発現することが好ましいが、一過性に発現してもよい。

〔抗体〕
本発明は、上記本発明のプロテアーゼに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明のプロテアーゼに結合するがその前駆体には結合しない抗体であることが好ましい。本発明の抗体は、本発明のプロテアーゼの検出や分離に使用することができる。
本明細書において「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのフラグメント（Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメントなど））を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体などが挙げられるがこれらに限定されない。抗体は、種々の公知の方法（例えば、HarLowら、「Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York（1988）」、岩崎ら、「単クローン抗体 ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（1991）」）に従えば作製することができる。

〔プロテアーゼの用途〕
本発明のプロテアーゼは、公知の産業用プロテアーゼに比べて高温かつ高アルカリ条件下で高い活性を有し、タンパク質変性剤や界面活性剤に対しても高い安定性を有するので、高温で使用される洗剤に配合して洗浄力の増強を図ることができる。また、低濃度の基質を分解可能であるため、二次感染が問題となる医療器具の感染性タンパク質汚れの分解・洗浄に高い有用性を有している。すなわち、本発明のプロテアーゼは、医療器具用洗剤、食器洗浄機用洗剤、洗濯用洗剤等の各種洗剤に好適に用いることができる。また、洗剤以外にも、飼料加工、食品加工（魚油加工、食肉加工等）、繊維加工、羊毛加工、皮革加工、コンタクトレンズ洗浄、配管洗浄等に利用することができ、入浴剤や脱毛剤に配合してもよい。さらに、組織や細胞からＤＮＡ等の核酸を調製する際に、試料を前処理するためのプロテアーゼとして利用することができる。

本発明により、本発明のプロテアーゼを含有する洗剤（洗浄用組成物）が提供される。洗剤中のプロテアーゼの含有量は特に限定されないが、活性が高く界面活性剤に安定であることから、少量の添加で高い洗浄力を発揮することができる。好ましい含有量として、例えば０．１〜１０重量％が挙げられる。含有量が少なすぎると十分な洗浄効果が得られず、また逆に多すぎる場合には含有量に比した洗浄効果の向上が得られないため、経済性の点で好ましくない。本発明のプロテアーゼは、公知の任意の洗剤に対して、その洗剤の組成を何ら変更することなく配合することができる。また、本発明のプロテアーゼを含有する洗剤の成分については特に限定はない。そのような洗剤の代表的例としては、洗剤重量当たり１０〜５０重量％の界面活性剤、０〜５０重量％のビルダー、１〜５０重量％のアルカリ剤あるいは無機電解質、０．１〜５重量％の再汚染防止剤、酵素、漂白剤、蛍光染料、ケーキング防止剤および酸化防止剤からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の配合成分からなる洗剤が挙げられる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例においては、本発明のプロテアーゼを「Ｔｋ−ＳＰ」という場合があり、そのプロ体を「ｐｒｏＴｋ−ＳＰ」という場合がある。

〔実施例１：新規プロテアーゼ（Ｔｋ−ＳＰ）の取得〕
１−１．プロ体（ｐｒｏＴｋ−ＳＰ）の発現および精製
Thermococcus Kodakaraensis ＫＯＤ１株のゲノム情報（ACCESSION：AP006878）から、サチライシン様セリンプロテアーゼ前駆体をコードすると予想される塩基配列（ACCESSION AP006878 REGION:1484233..1486224、配列番号８）の推定アミノ酸配列（ACCESSION BAD85878、配列番号７）のうち、シグナル配列（プレ配列）と予想されるアミノ酸配列を除き、プロ配列および成熟配列と予想される部分を含むプロ体を発現させるために、当該プロ体をコードすると予想されるＤＮＡ部分を増幅するためのプライマーペアを設計した。すなわち、ＮｄｅＩサイトを含むフォワードプライマー（5'-GGCCTTTATCATATGGCCCCCCAGAAG-3'（配列番号９））と、ＢａｍＨＩサイトを含むリバースプライマー（5'-GGCCTTGGATCCTCACCCGTAGTAAAC-3'（配列番号１０））である。ＫＯＤ１株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーペアを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られた１．９ｋｂのＤＮＡ断片をｐＥＴ２５ｂ（Novagen社製）のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩサイトにライゲーションし、ｐＥＴ２５ｂ−ｐｒｏＴｋ−ＳＰを構築した。このプラスミド（ｐＥＴ２５ｂ−ｐｒｏＴｋ−ＳＰ）を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓを形質転換し、ｐｒｏＴｋ−ＳＰを大量発現する菌株を得た。

５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地を用いて３７℃で培養した。ＯＤ₆₀₀が０．８に達した段階で、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養を続けた。集菌し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離（30,000×g、30min）を行った。上清に３０％硫酸アンモニウムを添加し、遠心分離（30,000×g、30min）により沈殿を得た。この沈澱を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に溶解し、硫酸アンモニウムを除去するために、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して透析を行った。透析後の上清を用いて、陰イオン交換カラムＨｉｔｒａｐ Ｑ（GE Healthcare社）により精製を行った。

１−２．成熟タンパク質（Ｔｋ−ＳＰ）の取得、分子量分析およびＮ末端分析
(i) ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるプロセシングの確認
精製したｐｒｏＴｋ−ＳＰを１ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）に溶解し（タンパク質濃度：0.013 mg/ml）８０℃で１２０分間インキュベートした。ＴＣＡで沈殿させ、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。結果を図１（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）は８０℃で１２０分間インキュベートする前のｐｒｏＴｋ−ＳＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す画像であり、（ｂ）はｐｒｏＴｋ−ＳＰを８０℃で１２０分間インキュベートした後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す画像である。（ａ）のｐｒｏＴｋ−ＳＰのバンドは、予想されるアミノ酸配列（配列番号５）の理論分子量６８．６ｋＤａ付近に出現した。一方、８０℃で１２０分間インキュベートした後の（ｂ）のバンドは約４４ｋＤａ付近に位置していた。この結果から、ｐｒｏＴｋ−ＳＰは８０℃で１２０分間インキュベートすることによりプロセシングを受けていることが確認された。

(ii) ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる分子量分析
精製したｐｒｏＴｋ−ＳＰを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）に溶解し（タンパク質濃度：1 mg/ml）８０℃で１２０分間インキュベートした。インキュベーション後のタンパク質溶液を１μｌ取り、１μｌのマトリクス溶液（10mg sinapinic acid in 1ml of 0.1%TFA and acetonitrile in a volume ratio 2:1）と混和し、この１μｌを試料としてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（Bruker Daltonics社製）に供した。キャリブレーションスタンダードとして、ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ＩＩを使用した。図２にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのチャートを示した。図２から明らかなように、このタンパク質の分子量は、４４２７１Ｄａと決定された。

(iii) Ｎ末端分析
プロセシング後のタンパク質（10μg）を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、泳動後のゲルからＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写させるためにブロッティングを行った。目的のバンドが転写されたＰＶＤＦ膜を切り取り、プロテインシーケンサー（Procise automated sequencer，ABI model 491）に供してＮ末端分析を行った。結果を図３に示した。図３に示したように、このタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列はＶＥＴＥであることが明らかとなった。
Ｎ末端分析結果と分子量分析結果から、プロセシング後のタンパク質は配列番号５の第１１４位〜第５３９位のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号１、理論分子量：４４２０７Ｄａ）、または配列番号５の第１１４位〜第５４０位のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号３、理論分子量：４４３２２Ｄａ）であると考えられた。得られた分子量約４４ｋＤａのタンパク質（Ｔｋ−ＳＰ）を以下の実験に使用した。

〔実施例２：Ｔｋ−ＳＰのｐＨ依存性およびバッファー依存性〕
Ｔｋ−ＳＰのｐＨ依存性およびバッファー依存性を検討するために、アセテートバッファー（pH 4.5, 5.0, 5.2, 5.4 および 5.6）、ＭＥＳバッファー（pH 5.5, 6.0, 6.5 および 7.0）、ＨＥＰＥＳバッファー（pH 7.0 および 7.5）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 および 9.0）、ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨバッファー（pH 8.5, 9.0, 9.5 および 10.0）、並びにＣＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（pH 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0 および 11.5）を用いて以下の手順で酵素反応を行った。すなわち、５０ｍＭのバッファーおよび２ｍＭの合成基質Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを含む反応液１００μｌを２０℃で５分間インキュベートし、これに０．１μｇのＴｋ−ＳＰを添加してさらに２０℃で１０分間インキュベートした。１０μｌの酢酸を添加して反応を止め、合成基質Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡから生成されるパラニトロアニリン（p-nitroaniline）の量を、紫外分光光度計（Beckman model DU640）により、８９００Ｍ^-1ｃｍ^-1の吸光係数を用いた波長４１０ｎｍの吸収から定量した。１分間に１μｍｏｌのパラニトロアニリンを生成する酵素量を「１単位」と定義した。特異的活性は、タンパク質１ｍｇ当たりの酵素活性と定義した。
結果を図４に示した。図４からわかるように、Ｔｋ−ＳＰの反応至適ｐＨ範囲はｐＨ６〜１１．５と広く、したがって、Ｔｋ−ＳＰはｐＨ６以上の多様なｐＨ環境での利用に適した酵素であることが明らかになった。

〔実施例３：Ｔｋ−ＳＰの温度依存性〕
Ｔｋ−ＳＰの温度依存性を検討するために、２０℃〜１００℃の範囲で基質にアゾカゼイン（Azocasein）を用い、以下の手順で酵素反応を行った。すなわち、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）および２％のアゾカゼインを含む反応液２７０μｌをそれぞれの温度で５分間インキュベートし、これに３．３μｇのＴｋ−ＳＰを３０μｌ（約０．１μｇ）添加してさらに２０分間インキュベートした。２００μｌの１５％トリクロロ酢酸（終濃度６％）を添加して反応を止めた。遠心分離（15,000×g、15min）して上清１６０μｌを取り、４０μｌの２Ｍ ＮａＯＨと混和して、波長４４０ｎｍの吸光値（Ａ₄₄₀）を測定した。３００μｌの反応液のＡ₄₄₀を１分間に１上昇させるのに必要な酵素量を「１単位」と定義した。
結果を図５に示した。図５に示した結果からＴｋ−ＳＰの活性至適温度は１００℃以上と推定され、Ｔｋ−ＳＰは高温環境で高いペプチド分解活性を示す事が明らかになった。

〔実施例４：Ｔｋ−ＳＰの熱安定性〕
Ｔｋ−ＳＰ溶液（Ｔｋ−ＳＰ３．３μｇ/ｍｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７））を８０、９０および１００℃で処理することにより、不可逆的な熱失活に対するＴｋ−ＳＰの安定性を検討した。熱処理後のＴｋ−ＳＰ溶液の３０μｌを取り、基質にアゾカゼインを用いて８０℃で残存活性を測定した。測定の手順は実施例３と同様とし、反応温度は５５℃とした。残存活性は、熱処理後の活性値を熱処理前の活性値で除することにより算出した。
結果を図６に示した。図６から明らかなように、Ｔｋ−ＳＰは、９０℃以下の温度で１８０分間処理しても失活せず、また、１００℃では９０分間の処理によっても活性を半分維持していた。この結果から、Ｔｋ−ＳＰは熱安定性が極めて高い酵素である事が明らかになった。

〔実施例５：Ｔｋ−ＳＰのタンパク質変性剤、界面活性剤およびキレート剤に対する安定性〕
タンパク質変性剤として尿素（Ｕｒｅａ）および塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）を用いた。界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いた。キレート剤としてＥＤＴＡを用いた。０．０５ｍｇ／ｍｌのＴｋ−ＳＰを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を５５℃で上記タンパク質変性剤、界面活性剤またはキレート剤とインキュベートした。タンパク質変性剤および界面活性剤の濃度は３〜４段階を設定した。ＥＤＴＡは１段階（１０ｍＭ）のみを設定した。時間は０、２、５、１０、１５、３０および６０分を設定した。インキュベーション後のＴｋ−ＳＰについて、基質にＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを用いて２０℃で活性を測定した。測定の手順は実施例２と同様とし、ｐＨは８とした。

尿素（Ｕｒｅａ）の結果を図７に示した。図７から明らかなように、最高濃度の８Ｍで６０分間処理しても、Ｔｋ−ＳＰは約９０％の残存活性を有していた。
塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）の結果を図８に示した。図８から明らかなように、４Ｍで用いた場合、Ｔｋ−ＳＰは３０分以内で失活したが、２Ｍで用いた場合は６０分処理しても約６５％の活性を維持した。
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の結果を図９に示した。図９から明らかなように、最高濃度の１０％で６０分間処理しても、Ｔｋ−ＳＰの活性は低下しなかった。
Ｔｗｅｅｎ２０の結果を図１０に示した。図１０から明らかなように、最高濃度の１０％で６０分間処理しても、Ｔｋ−ＳＰの活性は低下しなかった。
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、最高濃度の５％で６０分間処理しても、Ｔｋ−ＳＰは約９０％の残存活性を有していた。
ＥＤＴＡの結果を図１２に示した。図１２から明らかなように、１０ｍＭのＥＤＴＡで６０分間処理しても、Ｔｋ−ＳＰの活性は低下しなかった。つまり、Ｔｋ−ＳＰの活性発現には、カルシウムイオンが必須でないことが明らかとなった。
以上の結果から、Ｔｋ−ＳＰは各種のタンパク質変性剤、界面活性剤、キレート剤に対し高い安定性を有しており、産業用プロテアーゼとして有用性が高いことが示された。

〔実施例６：Ｔｋ−ＳＰの安定性に及ぼすカルシウムイオンの効果〕
Ｔｋ−ＳＰを１０ｍＭのＥＤＴＡと８０℃で３０分間インキュベートし、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ含有５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で透析した。その後、Ｔｋ−ＳＰ溶液を８０、９０および１００℃で処理し、Ｔｋ−ＳＰの安定性を検討した。基質にはアゾカゼインを用いて８０℃で残存活性を測定した。測定の手順は実施例３と同様とし、反応温度は５５℃とした。
結果を図１３に示した。図１３に示した結果から、カルシウムイオンを除いたＴｋ−ＳＰは耐熱性が低下することが明らかとなった。したがって、Ｔｋ−ＳＰを効率的に熱失活させる際には、ＥＤＴＡの添加が有効であることが示唆された。

〔実施例７：Ｔｋ−ＳＰの速度パラメーター〕
基質にＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを用い、基質濃度を０．０１〜２ｍＭの範囲で種々の濃度を設定して２０℃および８０℃でＴｋ−ＳＰの特異的活性を測定した。測定の手順は実施例２と同様に行った。得られたデータをミカエリス−メンテン式に当てはめて速度パラメーターを算出した。比較のために、公知の耐熱性プロテアーゼであるＴｋ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ（非特許文献１参照）についても同様に特異的活性を測定し、速度パラメーターを算出した。
結果を表１に示した。表１からわかるように、いずれの温度においてもＴｋ−ＳＰのＫｍはＴｋ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ（表中、Ｔｋ−ｓｕｂ）のＫｍよりも小さかった。したがって、Ｔｋ−ＳＰは、Ｔｋ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎと比較して、低濃度の基質を効率よく分解できることが明らかとなった。

〔実施例８：構造形成におけるカルシウムイオン要求性の検討〕
ｐｒｏＴｋ−ＳＰのアミノ酸配列（配列番号５）の第３５９位のセリンをアラニンに置換することでプロテアーゼ活性を失わせた変異体（以下「ｐｒｏＳ３５９Ａ」という）を用いた。ｐｒｏＳ３５９Ａは、実施例１で構築したｐＥＴ２５ｂ−ｐｒｏＴｋ−ＳＰに公知の変異誘導法を適用して、ｐｒｏＳ３５９Ａ発現ベクターを作製し、このベクターを実施例１と同様の方法で大腸菌に導入し、発現させ、精製することにより取得した。
二次構造形成の確認は円偏光二色性測定（ＣＤスペクトル測定）により行った。測定時のタンパク質濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ、バッファーは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、温度は２５℃とした。

以下の４種類の試料について二次構造形成を確認した。
試料１：精製したｐｒｏＳ３５９Ａを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で透析したもの。
試料２：精製したｐｒｏＳ３５９Ａを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で透析した後、ＥＤＴＡ（濃度１ｍＭ）および塩酸グアニジン（濃度６Ｍ）を添加し、８０℃で一夜保温したもの。
試料３：試料２を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５倍に希釈し、氷上で３０分間インキュベートしたもの。
試料４：試料２を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で一夜透析したもの。

結果を図１４に示した。図１４に示したように、正常に二次構造を形成している試料１のスペクトルを示す曲線と比較して、塩酸グアニジンを添加して変性させ、ＥＤＴＡを添加してカルシウムイオンを含まない状態にした試料２は、曲線が浅くなっていることから二次構造が壊れて変性していることがわかる。変性した試料２をバッファーで５倍に希釈した試料３は、２００〜２１０ｎｍの範囲を除いて試料１の曲線とほぼ同じ形状を示した。また、変性した試料２をバッファーで一夜透析した試料４は、完全に試料１と同じ曲線を示した。このように、試料３および試料４が二次構造を回復したことから、Ｔｋ−ＳＰは、カルシウムイオンに依存せずに構造形成していることが明らかとなった。
この結果から、Ｔｋ−ＳＰは、活性化するためにカルシウムイオンを必要とせず、キレート剤を添加剤として含む洗剤中でも安定に機能を発揮することができ、極めて有用であることが示された。

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (13)

1. 以下の（ａ）または（ｃ）に記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ。
   （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
   （ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列
2. アゾカゼインを基質としてｐＨ７で２０分間反応させたときの至適温度が１００℃以上である請求項１に記載のプロテアーゼ。
3. ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）中、１００℃で９０分間処理したときに４０％以上の残存活性を有する請求項１に記載のプロテアーゼ。
4. ５％ドデシル硫酸ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、５５℃で６０分間処理したときに８０％以上の残存活性を有する請求項１に記載のプロテアーゼ。
5. 反応温度８０℃でＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを基質としたときにＫｍ値が０．１〜１ｍＭである請求項１に記載のプロテアーゼ。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載のプロテアーゼのプロ体であって、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるプロ体。
7. 請求項１〜５のいずれかに記載のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド。
8. 配列番号２もしくは４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである請求項７に記載のポリヌクレオチド。
9. 請求項６に記載のプロ体をコードするポリヌクレオチド。
10. 配列番号６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである請求項９に記載のポリヌクレオチド。
11. 請求項７〜１０のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
12. 請求項１１の発現ベクターが導入された形質転換体。
13. 請求項１〜５のいずれかに記載のプロテアーゼを含有する洗剤。