ES2547118T3 - Catalasa termoestable - Google Patents

Abstract

Una proteína seleccionada del grupo que consiste en: (i) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1-692 de la SEC ID Nº: 2; (ii) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se eliminaron, sustituyeron o añadieron de 1 a 50 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1-692 de la SEC ID Nº: 2, y que tiene una actividad catalasa termoestable; y (iii) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 80 % o más con la que consiste en los aminoácidos 1-692 de la SEC ID Nº: 2, y que tiene una actividad catalasa termoestable.

Description

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de nucleótidos con la de las catalasas conocidas, y las secuencias intrónicas conservadas, se dedujo que el gen incluía cuatro intrones con secuencias de nucleótidos que consistían en los nucleótidos 322-372, 599-651, 10681113 y 1279-1326 de la SEC ID Nº: 1. La secuencia de aminoácidos de la catalasa termoestable, deducida a partir de la secuencia de nucleótidos, era la de la SEC ID Nº.: 2. La secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1-31 de la SEC ID Nº.: 2 era completamente idéntica a la secuencia de aminoácidos N-terminal (mostrada en el ejemplo 2) de la catalasa termoestable purificada a partir de Penicillium pinophilum y, por tanto, se dedujo que la secuencia de aminoácidos que consistía en -1 a -42 de la SEC ID Nº.: 2 era una secuencia señal y que la secuencia de nucleótidos que consistía en los nucleótidos 1-126 (que codifica los aminoácidos 1-a -42) de la SEC ID Nº.: 2) de la SEC ID Nº.: 1 era una secuencia de nucleótidos que codificaba la secuencia señal.

Ejemplo 4: medida de la actividad catalasa (termoestabilidad) en líquido de cultivo de Humicola grisea

Se preparó un sobrenadante de cultivo de Humicola grisea de manera sustancialmente similar a la descrita en el ejemplo 1. Se midió la actividad catalasa (termoestabilidad) de la catalasa contenida en el sobrenadante de cultivo resultante por el procedimiento descrito en el ejemplo 1. El porcentaje de actividad restante después de la incubación a 70 °C durante 30 minutos fue del 57 %. A partir del resultado se llegó a la conclusión de que Humicola grisea producía catalasa termoestable.

Ejemplo 5 (ejemplo de referencia): aislamiento y purificación de catalasa termoestable en líquido de cultivo de

Humicola grisea

Se disolvió sulfato de amonio en el sobrenadante de cultivo de Humicola grisea obtenido en el procedimiento descrito en el ejemplo 4 a una concentración final de 1 mol/l. Se sometió y se adsorbió la solución resultante en una columna hidrófoba de fenilsefarosa HP 26/10 (fabricada por GE Healthcare bioScience) que se había equilibrado previamente con un tampón fosfato 50 mmol/l (pH 7,0) que contenía 1 mol/l de sulfato de amonio. Se eluyeron las proteínas adsorbidas en la columna hidrófoba y se fraccionaron con un procedimiento de elución en gradiente lineal desde un tampón fosfato 50 mmol/l (pH 7,0) que contenía 1 mol/l de sulfato de amonio a un tampón fosfato 50 mmol/l (pH 7,0). Se midió la actividad catalasa de cada eluato fraccionado por el procedimiento descrito en el ejemplo 1 y se recogieron las fracciones que tenían actividad. Se añadió sulfato de amonio a la fracción activa recogida a una concentración final de 1 mol/l y se repitió el procedimiento anterior para llevar a cabo una nueva cromatografía con la columna hidrófoba. Se concentró la fracción activa resultante, se desaló por ultrafiltración y se ajustó a una concentración final de 50 mmol/l con un tampón acetato (pH 4,0). Se sometió esta solución a una columna de intercambio catiónico MonoS (fabricada por GE healthcare Bioscience), que se había equilibrado previamente con un tampón acetato 50 mmol/l (pH 4,0). Se detectó la actividad catalasa en la fracción no adsorbida y, por tanto, se recogió la fracción no adsorbida como la fracción activa. Se analizó la fracción activa recogida por SDS-PAGE para detectar una única banda de aproximadamente 80 kDa y se consideró que la proteína detectada como la banda era una catalasa termoestable. Se separó la catalasa termoestable por SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de PVDF. Se analizó la secuencia de aminoácidos N-terminal para obtener la siguiente secuencia:

QDTTSGQSPLAAYEVDDSTG (SEC ID Nº.: 10)

Ejemplo 6 (ejemplo de referencia): clonación del gen de catalasa termoestable HCN de Humicola grisea

6-1) Preparación de la colección de ADN genómico

Se preparó una colección de ADN genómico de Humicola grisea por el procedimiento descrito en el ejemplo 3-1.

6-2) Preparación de la sonda

Se prepararon los siguientes cebadores en base a las secuencias conservadas entre las catalasas derivadas de hongos filamentosos y levaduras:

F de catalasa H: GTNCGNTTYTCNACTGT (SEC ID Nº.: 11)

R de catalasa H: AARAANACNGGNTTRTTGTT (SEC ID Nº.: 12)

[La abreviatura subrayada "N" en la 12ª posición de la SEC ID Nº.: 12 significa desoxiinosina.]

Se usaron los cebadores F de catalasa H y R de catalasa H y el ADN genómico como cebadores y molde, respectivamente, para llevar a cabo una PCR. En la PCR se usó la polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Bio). En la PCR, se repitió 30 veces un ciclo compuesto por una reacción a 98 °C durante 10 segundos, alineación a 55 °C durante 30 segundos y una reacción de elongación a 72 °C durante 15 segundos. Se insertó el fragmento de ADN amplificado de 300 pb en un vector plasmídico pCR2.1-TOPO, utilizando un kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen) según un protocolo adjunto al kit, para obtener el plásmido TOPO-catalasa H.

Se secuenció el fragmento de ADN clonado insertado en el plásmido TOPO-catalasa H y se usó la secuencia de nucleótidos determinada para llevar a cabo una búsqueda de homología. Como consecuencia, la secuencia de nucleótidos mostró una identidad del 97 % con la de una catalasa derivada de Sclerotinia sclerotiorum y, por tanto, se consideró que el fragmento de ADN formaba parte de un gen de catalasa. Se amplificó el fragmento de ADN por

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PCR usando el plásmido TOPO-catalasa H de manera sustancialmente similar a la descrita anteriormente y se marcó el producto de PCR obtenido con un sistema ECL Direct (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech) como sonda.

6-3) Exploración por hibridación en placa

Se cribó la colección de ADN genómico según el procedimiento descrito en el ejemplo 3-3 y se obtuvo un clon positivo. El clon positivo obtenido se analizó por transferencia de bandas de Southern. Como consecuencia, un fragmento XhoI de aproximadamente 7 kb y un fragmento BamHI de aproximadamente 4 kb mostraron patrones de hibridación comunes con los del ADN cromosómico. El fragmento XhoI y el fragmento BamHI se clonaron por separado en pUC118 para obtener el plásmido pUC-HCN-XhoI y el plásmido pUC-HCN-BamH1, respectivamente. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de estos plásmidos. Como consecuencia, el fragmento XhoI contenía la secuencia desde el nucleótido 616 hasta el extremo 3’ de la SEC ID Nº.: 3 y el fragmento BamHI contenía la secuencia desde el extremo 5’ hasta el nucleótido 1675 de la SEC ID Nº.: 3 y, por tanto, estos fragmentos contenían fragmentos de genes de catalasa termoestable. Se unieron estas secuencias de nucleótidos para determinar la de un gen de catalasa termoestable de longitud completa. Para subclonar el gen de catalasa HCN derivado de Humicola grisea, se llevó a cabo una PCR con ADN genómico de Humicola grisea como molde y el siguiente juego de cebadores (HCNF y HCNR) para amplificar el gen HCN.

HCNF: ATGAACAGAGTCACGAATCTC (SEC ID Nº.: 13)

HCNR: TCAAAAAACAAAGGCACCAAG (SEC ID Nº.: 14)

Se insertó el ADN amplificado en un vector plasmídico pCR2.1-TOPO con un kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen) para obtener el plásmido pHCN. Se transformó una cepa TOP10 de Escherichia coli (Invitrogen) con plásmido pHCN para obtener Escherichia coli TOP10/pHCN.

6-4) Deducción de la secuencia de aminoácidos de la catalasa termoestable

El gen de catalasa termoestable de longitud completa HCN, que se aisló a partir del ADN genómico de Humicola grisea por el procedimiento descrito anteriormente, consistía en la secuencia de nucleótidos de 2749 pb de la SEC ID Nº.: 3. Sobre la base de la comparación de la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleótidos con la de las catalasas conocidas, y las secuencias intrónicas conservadas, se dedujo que el gen incluía seis intrones con secuencias de nucleótidos que consistían en los nucleótidos 283-463, 667-747, 771-846, 10081160, 1218-1270 y 1842-1895 de la SEC ID Nº: 3. La secuencia de aminoácidos de la catalasa termoestable, deducida a partir de la secuencia de nucleótidos, era la de la SEC ID Nº.: 4. La secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1-20 de la SEC ID Nº.: 4 era completamente idéntica a la secuencia de aminoácidos Nterminal (mostrada en el ejemplo 5) de la catalasa termoestable purificada a partir de Humicola grisea y, por tanto, se dedujo que la secuencia de aminoácidos que consistía en -1 a -32 de la SEC ID Nº.: 4 era una secuencia señal y que la secuencia de nucleótidos que consistía en los nucleótidos 1-96 (que codifica los aminoácidos -1 a -32) de la SEC ID Nº.: 4) de la SEC ID Nº.: 3 era una secuencia de nucleótidos que codificaba la secuencia señal.

Ejemplo 7: Preparación de un vector de expresión para PCN recombinante

Se llevó a cabo la expresión de PCN recombinante con Aspergillus niger var. macrosporus como huésped usando un vector de expresión en el que se insertó el gen PCN entre el promotor y el terminador de un gen de proctasa B, que se expresó considerablemente en Aspergillus niger var. macrosporus. El vector de expresión se preparó según los siguientes procedimientos.

7-1) Preparación de la colección de ADN genómico

Se aisló y se purificó ADN genómico a partir de células de Aspergillus niger var. macrosporus según el procedimiento de Horiuchi et al. [H. Horiuchi y col., J. Bacteriol., 170, 272-278, (1988)]. Se digirió parcialmente el ADN genómico aislado con la enzima de restricción Sau3AI. Se ligaron loa fragmentos de ADN resultantes con brazos BamHI de un kit de clonación de fago vector λEMBL3 (fabricado por Stratagene) con un kit de ligación Ver. 2 (fabricación por Takara Bio). Se precipitó la mezcla con etanol y se disolvió en un tampón TE. Se usó toda la cantidad de mezcla ligada y un kit de envasado MaxPlaxλ (fabricado por Epicenter Technologies) para formar partículas de fago y se infectó una cepa de Escherichia coli XL1-blue MRA (P2) con las partículas de fago. Como consecuencia, se obtuvo una colección de ADN genómico compuesta por 1,25 x 105 fagos.

7-2) Preparación de la sonda

Con respecto a la colección de ADN genómico de Aspergillus niger var. macrosporus, se llevó a cabo la transferencia de bandas de Southern usando la región codificante del gen de proctasa B como sonda para aislar un clon que contuviera las regiones promotora y terminadora del gen de proctasa B. Se amplificó la región codificante de la proctasa B por PCR usando un ADN genómico de Aspergillus niger var. macrosporus como molde y los siguientes cebadores (proctasaB-N y proctasaB-C), que se diseñaron en base a los extremos 5’ y 3’ de la región codificante de la proctasa B desvelada en la publicación de patente japonesa pendiente de examen (kokai) N.º 568570.

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proctasaB-N: ATGGTCGTCTTCAGCAAAACC (SEC ID Nº.: 15)

proctasaB-C: CTAAGCCTGAGCGGCGAATCC (SEC ID Nº.: 16)

Se llevó a cabo la PCR usando un kit LA PCR™ KIT Ver2.1 (fabricado por Takara Bio). En la PCR, después de una incubación a 94 °C durante 1 minuto, se repitió 30 veces un ciclo compuesto por una reacción a 94 °C durante 30 segundos, una reacción a 52 °C durante 30 segundos y una reacción a 72 °C durante 90 segundos y se llevó a cabo una reacción a 72 °C durante 7 minutos para completar la PCR. Como consecuencia, se amplificó un ADN de aproximadamente 1,2 kb. Se insertó el fragmento de ADN amplificado de 1,2 kb en un vector plasmídico pCR2.1-TOPO, utilizando un kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen) según un protocolo adjunto al kit, para obtener el plásmido TOPO-ProB. El fragmento de ADN clonado insertado en el plásmido TOPO-ProB se secuenció con el kit BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (fabricado por Applied Biosystems) y un analizador genético ABI PRISM (fabricado por Applied Biosystems) según los protocolos adjuntos a los mismos. La secuencia de nucleótidos determinada concordaba con la del gen de proctasa B desvelada en la publicación de patente japonesa pendiente de examen (kokai) N.º 5-68570 y, por tanto, se consideró que el fragmento de ADN era la región codificante del gen de proctasa B. Se marcó el fragmento de ADN usando un sistema ECL Direct (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech) como sonda.

7-3) Exploración de clones que contienen las regiones promotora y terminadora del gen de proctasa por hibridación en placa

Se transfirieron placas de fagos preparadas en el ejemplo 7-1 a una membrana de transferencia de nailon Hybond N+ (fabricada por Amersham). Se desnaturalizó la membrana con álcali, se lavó con SSC 5x (SSC: 15 mmol/l de citrato trisódico y 150 mmol/l de cloruro de sodio) y se secó para inmovilizar los ADN. Después de una prehibridación a 42 °C durante 1 hora, se añadió la sonda preparada por el procedimiento descrito en el ejemplo 7-2 y se llevó a cabo una hibridación a 42 °C durante 20 horas. Se lavó la sonda dos veces con SSC 0,5x que contenía 6 mol/l de urea y SDS al 0,4 % y se lavó dos veces con SSC 2x. Después de lavar la sonda, se sumergió la membrana de nailon en una solución de detección durante 1 minuto y se expuso a Hyperfilm ECL (fabricado por Amersham) para obtener ocho clones positivos.

La preparación de ADN a partir de cada uno de los clones positivos se llevó a cabo usando LE392 como huésped de Escherichia coli según el procedimiento de Maniatis y col. (J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989). Se cultivó LE392 en un medio LB-MM (peptona al 1 %, extracto de levadura al 0,5 %, cloruro de sodio al 0,5 %, 10 mmol/l de sulfato de magnesio y maltosa al 0,2 %) durante la noche. Se infectó el cultivo con una solución de fago derivada de una sola placa y se cultivó en medio LB-MM durante la noche. Se añadieron cloruro de sodio y cloroformo al cultivo a concentraciones finales de 1 mol/l y 0,8 %, respectivamente, para promover la lisis de Escherichia coli. Se retiraron los desechos de células de Escherichia coli por centrifugación y se recogieron las partículas de fago de un precipitado de polietilenglicol (PEG) (PEG6000 al 10 %). Se digirieron las partículas de fago con proteinasa K en presencia de SDS, se trataron con fenol y se precipitaron con etanol para recoger el ADN de fago.

Se usó el ADN obtenido y el sistema ECL Direct para llevar a cabo la transferencia de bandas de Southern. Se llevó a cabo una hibridación con la sonda preparada por el procedimiento descrito en el ejemplo 7-2. Como consecuencia, el fragmento XhoI-EcoRI de aproximadamente 5,5 kb mostró patrones de hibridación comunes a los del ADN cromosómico. Se consideró que el fragmento de ADN contenía el gen de proctasa B y después se llevó a cabo la subclonación del fragmento de ADN. Se insertó el fragmento XhoI-EcoRI escindido del ADN de fago entre los sitios SalI y EcoRI del pUC119 para obtener el plásmido pPROB/119E.X. Se secuenció la secuencia de nucleótidos del plásmido obtenido para determinar las de las regiones promotora y terminadora del gen de proctasa B.

7-4) Construcción del vector recombinante pPTB-EX para expresión génica

Un vector en el que se escindió la región codificante del gen de proctasa B del plásmido pPROB/119E.X preparado por el procedimiento descrito en el ejemplo 7-3 y el extremo 3’ de la región promotora del gen se ligó en el extremo 5’ de la región terminadora del gen a través de la secuencia de reconocimiento de Xbal, se denominó vector de expresión pPTB-EX. El vector de expresión pPTB-EX se preparó por una PCR inversa usando pPROB/119E.X como molde y los siguientes cebadores (proctasaBNxba y proctasaBCxba) diseñados en base al extremo 3’ del promotor y el extremo 5’ del terminador del gen de proctasa B, respectivamente.

proctasaBNxba: GGTCTAGAATGTCAAGCAAGAGAGT (SEC ID Nº.: 17)

proctasaBCxba: GGTCTAGAATCAACCACTGAAGTGGA (SEC ID Nº.: 18)

A este respecto, se añadió la secuencia de reconocimiento de XbaI al extremo 5’ de cada cebador. En la PCR inversa, en la que se usó POLIMERASA de ADN Primestar MAX (fabricada por Takara Bio), se repitió 30 veces un ciclo compuesto por una reacción a 98 °C durante 10 segundos, alineación a 55 °C durante 5 segundos y una reacción de elongación a 72 °C durante 60 segundos. Como consecuencia, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 7 kb. Para purificar el fragmento de ADN se usaron el líquido de la reacción de PCR resultante y un kit de purificación de PCR QIAQUICK (fabricado por Qiagen). Se disolvió el fragmento de ADN en 50 µl de un tampón TE, se digirió con la enzima de restricción XbaI y se ligó de nuevo con un kit de ligación Ver. 2 (fabricación

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contenía las regiones promotora y terminadora del gen niaD.

8-3) Introducción del gen PCN en la cepa Nia2 de Aspergillus niger var. macrosporus

Se cultivó la cepa Nia2 de Aspergillus niger var. macrosporus en un medio S (glucosa al 3,0 %, polipeptona al 0,1 %, extracto de levadura 1 %, sulfato de amonio al 0,14 %, fosfato de potasio al 0,2 %, sulfato de magnesio al 0,03 %, a pH 6,8) a 30 °C durante 24 horas y se centrifugó a 3500 rpm durante 10 minutos para recoger las células. Se lavaron las células recogidas con sacarosa 0,5 mol/l y se suspendieron en una solución de enzima para preparar protoplastos (10 mg/ml de β-glucuronidasa, 3 mg/ml de quitinasa, 3 mg/ml de zimoliasa, 0,5 mol/l de sacarosa), que se había filtrado a través de un filtro de 0,45 µm. Se incubaron los micelios suspendidos a 30 °C durante 60 minutos con agitación para preparar protoplastos. Se filtró la suspensión a través de algodón absorbente y se centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos para recoger los protoplastos. Se lavaron los protoplastos con un tampón SUTC (sacarosa al 17,1 %, 10 mmol/l de Tris-HCl a pH 7,5, 10 mmol/l de CaCl2) y se resuspendieron en 100 µl del tampón SUTC. A la suspensión de protoplastos, se le añadieron 7,5 µl de pPTPCN (1 µg/µl) y 2,5 µl de pPTnia118 (1 µg/µl) y se dejó reposar la mezcla en hielo durante 5 minutos. Además, se añadieron 400 µl de una solución de PEG (PEG4000 al 60 %, 10 mmol/l de Tris-HCl a pH 7,5, 10 mmol/l de CaCl2) y se dejó reposar en hielo durante 20 minutos. Después de añadir otros 10 ml de tampón SUTC se centrifugó el conjunto a 2500 rpm durante 10 minutos. Se suspendieron los protoplastos centrifugados en 1 ml del tampón SUTC, se centrifugaron a 4000 rpm durante 5 minutos y, por último, se suspendieron en 100 µl del tampón SUTC.

Se cubrieron los protoplastos resultantes con agar blando sobre un medio de Czapek modificado (NaNO3 al 0,085 %, K2HPO4 al 0,1 %, MgSO4·7H2O al 0,05 %, KCl al 0,05 %, FeSO4·2H2O al 0,001 %, sacarosa al 17,1 %, agar purificado al 1,5 %, a pH 5,5-6,0) y se incubaron a 30 °C durante de 5 a 7 días. Las colonias formadas después de la incubación se consideraron transformantes.

8-4) Expresión de PCN y medida de la actividad enzimática en transformantes de la cepa Nia2 de Aspergillus niger var. macrosporus

Se cultivaron los transformantes obtenidos en un medio P (almidón al 1,0 %, harina de soja al 6,0 %, licor de maíz fermentado al 1,0 %, sulfato de amonio al 0,3 % y carbonato de calcio al 1 %) a 28 °C durante 6 días. Se analizó el sobrenadante de cada cultivo por SDS-PAGE para obtener una cepa (N.º 16) en la que se observó la banda con un peso molecular de aproximadamente 80 kDa, correspondiente a PCN recombinante. Con respecto al sobrenadante de cultivo de la cepa N.º 16, y a un sobrenadante obtenido por el cultivo de forma similar de la cepa Nia2, se midió la actividad catalasa por el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Como se muestra en la tabla 1, la actividad de la cepa N.º 16 era 77 veces o más la de la natural y se confirmó que se expresaba PCN recombinante en la cepa N.º

16.

Tabla 1

Actividad catalasa (u/ml)

Natural

menos de 300 u/ml

Cepa N.º 16

23300 u/ml

A este respecto, se consideró "1 unidad" de actividad catalasa como la cantidad de la enzima capaz de descomponer 1 mmol de peróxido de hidrógeno por minuto. Además, la actividad catalasa del sobrenadante de cultivo de Penicillium pinophilum preparado por el procedimiento descrito en el ejemplo 1 fue de 385 U/ml. Este resultado demuestra que la productividad de PCN aumenta considerablemente al expresar PCN en Aspergillus niger var. macrosporus como huésped.

8-5) Análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal

Se sometió el sobrenadante de cultivo de la cepa transformante N.º 16 obtenida en el ejemplo 8-4 a SDS-PAGE y se transfirieron las proteínas separadas a una membrana de PVDF Immobilon-PSQ (fabricada por Millipore). Se tiñó la membrana de PVDF con azul brillante de Coomassie. Se cortó de la membrana una porción en la que se transfirió la proteína de aproximadamente 80 kDa y se sometió a un secuenciador de aminoácidos modelo 492 para determinar la secuencia de aminoácidos de 11 restos del extremo aminoterminal. La secuencia aminoácidos era la siguiente:

DDSNASSETEA (aminoácidos 1-11 de la SEC ID Nº.: 5)

Esta secuencia de aminoácidos era idéntica a los aminoácidos N-terminales de PCN derivada de Penicillium pinophilum y, por tanto, se confirmó que la proteína de aproximadamente 80 kDa era la PCN recombinante.

8-6) Evaluación de la termoestabilidad en PCN recombinante

Como se describe en el ejemplo 1, la termoestabilidad de PCN natural producida por Penicillium pinophilum fue del 50 %. La termoestabilidad de PCN recombinante obtenida por el procedimiento descrito en el ejemplo 8-4 se evaluó por el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Como consecuencia, la termoestabilidad fue del 71,3 %. Este

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