CN102559714A - 一种编码过氧化氢酶的基因及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种编码过氧化氢酶的基因及其制备方法和应用。本发明的一种编码过氧化氢酶的基因，该基因的核苷酸序列如SEQNO.1所示。本发明从人肝脏细胞中克隆的CAT-TAT的编码序列。首先提取人肝脏细胞L-02的总RNA，通过RT-PCR和PCR的方法克隆到编码CAT的全长序列以及CAT-TAT融合基因。通过使用该基因表达得到了CAT-TAT蛋白，实现CAT-TAT的生产产业化，获得具有良好稳定性的CAT-TAT产品，用于提高细胞内的过氧化氢酶活性。

Description

一种编码过氧化氢酶的基因及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种编码过氧化氢酶的基因及其制备方法和应用。

背景技术

过氧化氢酶（CAT）是一种蛋白类清除剂，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它能促使H₂O₂分解为分子氧和水而清除体内的过氧化氢，从而使细胞免受H₂O₂的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。氧自由基的清除可以分为两步：第一步是作为有害物质的超氧阴离子在SOD的作用下和氢离子反应，生成H₂O₂；第二步是H₂O₂在过氧化氢酶的作用下和氢离子反应，最终将H₂O₂降解成H₂O和O₂。事实上，SOD、GSH、维生素E、CAT等是一个相互保护的防御群。当自由基代谢出现紊乱时，抗氧化酶含量降低而引起机体受损。适当补充外源性的抗氧化剂能提高机体的抗氧化能力，以免机体受到自由基的损伤。

近年来，大量研究发现自由基与衰老、癌症、肺心病、肾病等多种疾病有关，主要在几个病理过程的启动中起重要作用。机体主要通过去自由基酶（如SOD、CAT等）来清除体内自由基，使机体免受自由基损伤。彭志英和蒋黎(1995)的研究表明：过氧化氢酶正是能够迅速分解H₂O₂生成H₂O和O₂，使超氧化物酶水解反应顺利进行，同时使H₂O₂不至于与O₂ ^- 在铁鳌合物的作用下反应生成OH^-自由基，而防止自由基的损伤。去自由基酶在健康和疾病中的作用正在被人们关注，检测该类酶对研究自由基代谢平衡、抗衰老及肿瘤发病机理，以及急性胰腺炎、肝炎、心血管疾病、各种贫血与Zieve综合症等的诊断与鉴别诊断具有重要意义(Southern and Powis, 1988; Cohen, 1989)。此外，过氧化氢酶还可充当Hb和其它含巯基蛋白质的保护剂。过氧化氢酶主要与细胞内线粒体及过氧化物酶体结合，同D-氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联并快速分解细胞代谢过程中产生的毒性物质H₂O₂，从而起到解毒、保护巯基酶和膜蛋白等作用(王坤等，1989)。

从发现至今，对过氧化氢酶的研究已愈百年，对该酶的理论与应用研究均有一定的深度。近几年随着工农业生产技术的进步及需求，过氧化氢酶获得广泛的应用，其主要应用领域主要有：①在食品工业中的应用；②在制浆造纸和纺织印染工业中的应用；③在医药中的应用。在医药领域，CAT的应用已经获得进展。如：含有过氧化氢酶的滴眼液和隐形眼镜护理液可以有效的去除晶状体内的H₂O₂，有效的预防和延缓白内障的发生；补充过氧化氢酶可以有效的抑制刺激部位平滑肌细胞的异常增殖的现象；近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。由于几乎所有的疾病的发生和发展都与自由基的积累有关系，所以研究人员已经在尝试将过氧化氢酶用于动物活体细胞的功能研究，如血管上皮细胞，肌细胞，晶体细胞等，并取得了一定的进展。

一些蛋白质能以非传统的内化方式跨膜进入细胞，而且这些蛋白还能将更大的分子带入到细胞内部，甚至逾越血脑屏障。研究发现，这类蛋白都有共同特性的能介导蛋白跨膜转运的结构域——蛋白转导结构域(Protein transduction domain，PTD)。具有跨膜递送活性的PTD蛋白核心序列（YGRKKRRQRRR）的多肽片段即被确定为TAT蛋白转导域，简称PTD-TAT。PTD-TAT区段(protein transduction domain)能够高效地将多种不同结合形式的大分子颗粒带进体外培养的细胞，并不会导致携带物生物学活性的丧失。

CAT现已经成为一种疗效广泛的药用酶，但仍有一些缺陷，如天然酶分子量大且难透过细胞膜、稳定性较差、体内半衰期短、且具有免疫原性、功能相对单一等, 使其在临床上的应用仍有一定的困难，从而限制了其应用。对于CAT-TAT融合蛋白研究有利于进一步拓宽其应用范围。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种编码过氧化氢酶的基因及其制备方法和应用。通过使用该基因表达得到了CAT-TAT蛋白，实现CAT-TAT的生产产业化，获得具有良好稳定性的CAT-TAT产品，用于提高细胞内的过氧化氢酶活性。

本发明首先提供了一种编码过氧化氢酶的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。其编码的蛋白质的氨基酸序列如 SEQ NO.2所示。

其次提供了一种载体，包含所述的编码过氧化氢酶的基因。

还提供了一种细胞，包含上述的载体。所述细胞为大肠杆菌细胞或酵母细胞。

本发明另外提供了一种编码过氧化氢酶的基因的制备方法，包括以下步骤：从人肝脏细胞中分离提取总RNA，将mRNA反转录为cDNA，再进行PCR扩增，根据NCBI发表的人CAT基因序列设计引物P1和P2，分别含有NdeI和HindⅢ酶切位点，用于大肠杆菌质粒的构建；或设计引物P3和P4分别含有SnaBI和NotⅠ酶切位点，用于酵母质粒的构建；其中引物P2或P4含有编码蛋白转导域TAT的9个氨基酸RKKRRQRRR的基因序列；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因；制备好的双链cDNA进行亚克隆：将所得目的基因进行DNA序列测定，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到CAT-TAT基因。

所述引物P1 、P2 、P3、 P4的序列如SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.5、SEQ NO.6所示。

本发明还提供了所述编码过氧化氢酶的基因的应用，所述基因分泌的CAT-TAT蛋白能以体外给药的方式提高细胞内的过氧化氢酶活力。

本发明详述如下：

本发明涉及从人肝脏细胞中克隆的CAT基因。

本发明涉及从人肝脏细胞中克隆的CAT-TAT的编码序列。实施方式之一，本发明提取人肝脏细胞L-02的总RNA，通过RT-PCR和PCR的方法克隆到编码CAT的全长序列以及CAT-TAT融合基因。实施方式之一中，所述编码序列包含如SEQ NO.1所示的核酸序列，称之为CAT-TAT。实施方式之一中，所述编码序列是SEQ NO.1 中的核苷酸1至1608bp所示的核苷酸序列。

本发明还涉及包含所述CAT-TAT编码序列的重组载体，例如由各种本领域常用的表达载体制备的重组载体，其中，所述编码序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序列。实施方式之一中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明CAT-TAT编码序列经NdeI和HindⅢ双酶切后与NdeI和HindⅢ双酶切的pET21a(+)载体连接，得到大肠重组表达载pET21a(+)-CAT-TAT。另一实施方式中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明CAT-TAT编码序列经SnaBI和 NotI双酶切后与SnaBI和NotI双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-CAT-TAT。

本发明还制备包含本发明CAT-TAT编码序列的细胞。实施方式之一中，所述细胞是用上述本发明重组载体转化来构建的。所述细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的实施方式之一中，选用大肠杆菌Rosetta2(DE3)和毕赤酵母GS115 构建表达CAT-TAT的重组细胞。

本发明还提供了表达CAT-TAT的方法，包括：培养前述包含CAT-TAT编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物，还可以可行性地包括纯化表达产物的步骤。实施方式之一中，本发明通过包含本发明CAT-TAT编码序列的酵母(例如毕赤酵母GS115)发酵来生产CAT-TAT，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

本发明利用基因工程手段制备了能够高效表达并分泌CAT-TAT融合蛋白，实现了CAT-TAT的生产产业化，并获得了优质的CAT-TAT产品。本发明通过融合蛋白酶学性质鉴定进行了酶的最适作用温度、最适作用pH 值、金属离子稳定性等理化性质的分析，证明本发明的CAT-TAT重组蛋白最适反应温度为40℃，最适反应pH为6.5；CAT-TAT融合蛋白通过体外给药实验，表明TAT蛋白转导域融合的CAT蛋白能明显提高细胞内的过氧化氢酶活性。

附图说明

图1人源CAT-TAT在质粒pET21a(+)（A）和pPIC9k（B）上的重组子结构图。

图2人源CAT和CAT-TAT在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE。

图3 毕赤酵母表达人源CAT-TAT发酵过程中的酶活力。

图4 毕赤酵母表达人源CAT-TAT发酵过程中样品的SDS-PAGE。

图5 毕赤酵母表达人源CAT-TAT的分子量。

图6 毕赤酵母表达人源CAT-TAT的最适反应pH。

图7 毕赤酵母表达人源CAT-TAT的最适反应温度。

图8毕赤酵母表达人源CAT对对细胞内CAT活性影响。

具体实施方式

以下根据具体的实施例充分说明本发明。

实施例

实验材料和试剂

1.菌株和载体：

大肠杆菌Rosetta2(DE3)、JDH5α及表达载体pET21a(+)购自Novagen公司；pMD-18T Vector购自Takara公司；毕赤酵母GS115及表达载体pPIC9k均购自Invitrogen公司（Carlsbad，CA，USA）。

2.酶类及其他生化试剂：

限制性内切酶、DNA Maker、蛋白质Maker均购自Fermentas（MBI），CAT检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，其他常规试剂为上海生工或进口。

3.培养基：

使用的培养基：LB培养基，YPD，YPAD，BMDY，BMMY，MM，MD培养基均参照Invitrogen毕氏酵母操作手册。

4.本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括：[美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用（第二版）；朱检等，生物化学实验[M]。

5.本发明中所有相关的酶活、酶活力、酶活性均是指CAT酶活性，均采用CAT检测试剂盒（购自南京建成生物工程研究所），并按照其说明书中所述的方法进行测定及计算。

实施例1 CAT及CAT-TAT基因的克隆

（1）总RNA的分离提取：

（2）cDNA第一链的合成：

反转录成第一链cDNA：参照（First-straind cDNA Synthesis KIT）产品说明，在20ul体系中，加入1ug总RNA、1ul Oligo dT18 （500ug/ml）和Rnase-free水，在70℃水浴温育10min后，立即置于冰浴冷却；继续向冷却的管中加入4ul 5×Buffer、2ul 0.1M的DTT和1ul 10mM的dNTPs，混匀后于42℃水浴保温2min；再加入1ul（200U）反转录酶，42℃继续保温50min；最后，置于70℃水浴保温15min，灭活反转录酶，获得第一链cDNA。实验过程中设置不加RNA的阴性对照。

（3）PCR获取目的基因

根据NCBI发表的人CAT基因序列设计引物：P1（SEQ NO.3）和P2（SEQ NO.4），分别含有NdeI和HindⅢ酶切位点，用于pET21(a+)质粒的构建；P3（SEQ NO.5）和P4（SEQ NO.6），分别含有SnaBI和NotⅠ酶切位点，用于pPIC9k质粒的构建；P2和P4均含有编码蛋白转导域TAT的9个氨基酸RKKRRQRRR的基因序列。所述引物均由上海生工合成，引物序列如下： 

P1 ：5’ CATATG GCTGACAGCCGGGATCCCG 3’，

P2 ：5’ GGAAGCTTTCATCTTCTTCTTTGTCTTCTCTTCTTTCTCAGATTTGCCTTCTCCCTTG 3’；

P3 ：5’ TACGTAGCTGACAGCCGGGATCCCG 3’，

P4 ：5’ GCGGCCGCTTATCTTCTTCTTTGTCTTCTCTTCTTTCTCAGATTTGCCTTCTCCCTTG 3’。

本实施例PCR程序为： 94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增30次；最后72℃延伸10min。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因。得到产物P1-P2和产物P3-P4.

制备好的双链cDNA P1-P2和P3-P4插入到载体系统pMD-18T vector上，分别将连接物转入制备好的DH5ɑ感受态细胞，涂LB平板(含100ug/ml氨苄青霉素)，37℃培养箱培养过夜，挑取在抗性平板上生长的阳性克隆子接入2ml LB培养基中(含100ug/ml氨苄青霉素)，37℃培养过夜；收集培养液，10000rpm室温离心1min收集菌体，用质粒提取试剂盒(上海生工)提取质粒；质粒分别经限制性内切酶NdeI和HindⅢ/SnaBⅠ和NotⅠ进行酶切，酶切产物经核酸电泳检测；挑取阳性克隆pMD-18T-CAT-TAT1和pMD-18T-CAT-TAT2用M13F(5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’)和M13R(5’AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3’)引物进行测序（上海英俊公司），测序采用Sanger测序方法。

pMD-18T-CAT-TAT1和pMD-18T-CAT-TAT2的测序结果是，CAT-TAT的编码序列共有1608bp（SEQ ID NO.1）,编码人源过氧化氢酶与蛋白转导TAT的融合蛋白（SEQ NO.2）。其中第1606-1608位为终止密码子TAA；第1-1578位编码不含信号肽的成熟人过氧化氢酶蛋白，共526个氨基酸；与黑猩猩等来源的过氧化氢酶有较高的同源性；第1579-1606为蛋白转导域TAT的9个氨基酸RKKRRQRRR的基因序列。

 

实施例2 CAT-TAT编码基因在大肠杆菌中的表达

将实施例1-(4)中所得到的质粒pMD-18T-CAT-TAT1经NdeI和HindⅢ双酶切得到CAT-TAT片段，与经过NdeI和HindⅢ双酶切的pET21a(+)质粒连接，将连接物转入制备好的感受态细胞DH5ɑ中，经蓝白斑筛选，提质粒鉴定（方法同实施例1），得到重组质粒pET21a(+)-CAT-TAT（如图1A所示）。

取1ul构建好的重组质粒pET21a(+)-CAT-TAT，加入到100ul制备好的感受态细胞（大肠杆菌Rosetta2(DE3)）中，涂LB平板(含100ug/ml氨苄青霉素)，37℃培养箱培养过夜，挑取在抗性平板上生长的阳性克隆子接入2ml LB培养基中(含100ug/ml氨苄青霉素)，37℃ 250rpm振荡培养过夜，次日按1%转接至50ml LB培养液中（含100ug/ml Amp）培养1.5-2h至OD₆₀₀=0.6，加入IPTG诱导（终浓度为2umol/ml），30℃ 250rpm再振荡培养3-3.5h。取培养液10000rpm离心10min，收集菌体，再加入等体积的无菌水重新悬浮菌体，12000rpm离心10min，取沉淀用1/5体积pH6.0，50mM的PBS悬浮菌体，进行超声波破碎，破碎条件为：60%功率，间隔5s破碎10min，停止10min，再破碎10min。12000rpm离心，收集上清液分析CAT-TAT活力，并通过SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量，结果表明CAT-TAT的编码基因所编码的CAT-TAT可在大肠杆菌中表达，且有一定的CAT活性。(图2)

实施例3 CAT-TAT编码基因酵母重组表达载体的构建

将实施例1-(4)中所得到的质粒pMD-18T-CAT-TAT2，用SnaB I 和NotI进行酶切，酶切样品经核酸电泳检测并用胶回收试剂盒（上海生工）回收目的基因。与经SnaB I 和NotI双酶切的pPIC9k质粒经T4连接酶16℃水浴连接3h，连接物转入DH5α（方法同实施例1）。挑取抗性菌株培养，并提取质粒，质粒经SnaB I 和NotI进行酶切，核酸电泳检测，得到重组质粒pPIC9k-CAT-TAT（如图1B所示）。

以所得pPIC9k-CAT-TAT重组质粒为模板，以CAT-TAT的特异性引物P3和P4，进行PCR扩增，扩增程序同实施例1。扩增产物经核酸电泳检测可见一条约1600bp的条带，与目的片段的大小一致。并将该重组质粒pPIC9k-CAT-TAT行测序，测序引物为α-factor Primer和3’AOX1 Primer。

α-factor Primer：5’TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’

3’AOX1 Primer：5’ GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’

测序结果与SEQ NO.1一致，表明CAT-TAT在pPIC9k中插入位点、方向、序列和阅读框均正确，即pPIC9k-CAT-TAT表达质粒构建成功。

实施例4 毕赤酵母发酵制备重组CAT-TAT

大量提取实施例3的重组质粒pPIC9k-CAT-TAT约5ug，用SalⅠ酶切，得到线性化的pPIC9k-CAT-TAT质粒。

提取毕赤酵母GS115单菌落于YPD培养基中28℃培养箱中，培养至菌密度达到OD₆₀₀=1.3。取1ml的该菌液于1.5ml无菌离心管中冰浴10min后，于1500g，4℃离心机离心5min；弃上清，加入1ml冰浴的无菌水，轻轻将细胞悬起，后置1500g，4℃离心机离心5min；重复一次；弃上清，加入1ml冰浴的Sorbital（1 M），轻轻将细胞悬起，后置1500g，4℃离心机离心5min；重复两次；弃上清，加入100 ul冰Sorbital（1 M）。

将上述细胞转入0.2cm的电转杯中，加入线性化的pPIC9k-CAT-TAT质粒，混匀，置于冰上5min，用电转仪（Bio-Rad MicroPulser^TM）进行电击（电击电压：2.0kV;时间常数：5.8ms），电击后迅速加入1ml Sorbital （1 M），混匀取菌液200ul涂布RD板，30℃培养箱倒置培养3-4天，长出his+重组子。

挑出长出来的单菌落，于YPD液体培养基28℃培养过夜，按OD₆₀₀=1.0转接于小摇瓶（10ml BMMY培养基），以甲醇为诱导剂诱导AOX基因表达，每24hr取样，取样同时补加甲醇至终浓度1%.诱导168hr样品离心，取上清，测定CAT活性，并进行SDS-PAGE电泳分析，结果分别如图3和图4所示。发酵达72hr时，样品的CAT活性最高达到280U/ml，相应菌密度达到OD₆₀₀=35.这说明重组CAT-TAT融合蛋白在毕氏酵母中得到了表达和积累。

实施例5 重组CAT-TAT的纯化

将实施例4所制备的发酵培养液10000rpm离心10min去除菌体，取上清液作为粗酶液，将粗酶液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至50％，13000rpm离心15min，取沉淀，用缓冲液(Tris-HCl，pH8.0，50mM)重新溶解。

将以上溶解后的样品，经13000rpm离心15min，取上清上脱盐柱HW-55s(Φ1.6×100cm)，先用50mM Tris-HCl 缓冲液pH8.0平衡柱子，然后上样，流速为1.0 ml/min，用部分收集器收集样品，然后对收集的样品测定CAT活性，并进行蛋白质电泳分析。

取上述的目的蛋白峰样品，用于SuperQ 650C阴离子交换色谱，先用50mM pH8.0， Tris-HCl缓冲液平衡柱子，然后样品上样，再用平衡液冲平，流速为1ml/min。待冲平后，再用相同缓冲液配置的0-1mol/L NaCl梯度洗脱5个柱体积，分布收集样品，测定CAT活性，并进行蛋白质电泳分析。

取离子交换色谱后的目的蛋白峰样品，上Tsk-G3000SW凝胶过滤柱。先用50mM pH8.0， Tris-HCl平衡柱子，然后上样，流速为1.0 ml/min，用部分收集器收集样品，然后对收集的样品测定CAT活性，并进行蛋白质电泳分析。

SDS-PAGE结果(图5)表明，重组人源CAT-TAT融合蛋白经纯化后，以达到电泳纯，其分子量约为66kDa。CAT活性从粗酶液的280U/mg提高到纯酶的6400U/mg，纯化倍数为34.9倍。

实施例6 重组CAT-TAT的酶学性质分析

将实施例5所制备的CAT-TAT纯融合蛋白在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液的pH范围为5.0-9.0(pH4.0-6.0范围内采用50mM Gly-HCl缓冲液，pH6.5-9.0采用50mM Tris-HCl缓冲液)。CAT-TAT纯融合蛋白在不同的pH的缓冲液中，37℃下测定pH的适性结果，表明人源CAT-TAT融合蛋白从pH5.0至6.5酶活力迅速升高，在中偏酸性的pH具有较高的酶活，在pH为6.5是酶活力达到最高（100%），pH在6.5-9.0之间酶活力缓慢降低，在pH9.0时仍能保持70%以上的酶活力（图6）。

最适反应温度的测定在Tris-HCl (pH6.5，50mM)缓冲体系及不同温度下(4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃进行酶促反应。热稳定性研究为在不同温度下处理60min，再进行酶活性测定。酶促反应最适温度测定结果(图7)表明，CAT-TAT过氧化氢酶融合蛋白在4-25°C之间相对酶活平缓，从30-40°C之间相对酶活迅速上升，之后又开始迅速下降，65℃时仅保留不到20%的酶活力，最适反应温度为45-55℃。

在Tris-HCl (pH6.5，50mM)缓冲液中加入终浓度为1mM的金属盐溶液和抑制剂（Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Mg²⁺、K⁺、 Cu²⁺、 Hg⁺、2-Mercaptoethanol、EDTA），在40℃的水浴中保温30min后，在37℃下测定残留的CAT活性。由表1可知，Mn²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Mg²⁺等对CAT-TAT融合蛋白的过氧化氢酶活力有一定的促进作用； Al³⁺、2-Mercaptoethanol、EDTA等对CAT-TAT融合蛋白的过氧化氢酶活力有明显的抑制作用。

 

表1 金属离子及其他抑制剂对CAT-TAT酶活性的影响

实施例7 重组CAT-TAT促细胞内过氧化氢酶活力实验

艾滋病病毒的一个富含精氨酸的PTD-TAT多肽具有穿膜转导蛋白功能并能介导多种外源性物质进入细胞甚至细胞核。PTD-TAT多肽中具有细胞渗透功能的转导结构域，其转运功能局限于一小段碱性氨基酸内，共有9个氨基酸，其序列为：RKKRRQRRR。随着各种发现的报道，对PTD-TAT多肽黏附和穿透细胞质膜的机制的探讨，已成为学术界的一个热门话题。本发明利用PTD-TAT短肽将CAT分子导入细胞内。

实验方法：

①将L-02细胞以10⁵/mL接种到6孔板中(约1.6mL/孔)，5%CO₂、37℃培养12h，离心去培养基，加入不含小牛血清的培养基；

②以PBS为空白对照，分别加入CAT和CAT- TAT温育、去上清；

③加入0.8mL胰酶（0.25%）消化、收集细胞，再加入0.8mLPBS，离心取上清，测细胞膜上的CAT酶活；

④将③的细胞加入0.8mL的高纯水、混匀，加入95%乙醇0.4mL，振荡30s，再加入三氯甲烷0.4mL，混匀1min后离心8min（3500r/min）取上清液，测胞内CAT酶活。

细胞实验结果（图8）如下：

①  细胞膜：对照组膜上没有测到明显的过氧化氢酶活性；CAT组在膜上有一定残余的过氧化氢酶活性；但CAT-TAT组膜上的过氧化氢酶活性明显的高于CAT组，说明PTD-TAT短肽能促进CAT粘附到细胞膜上。

② 细胞内：细胞内本身也有过氧化氢酶，对照组也能够测到过氧化氢酶活性；CAT组与对照组测得的酶活相差不多；而CAT-TAT组胞内过氧化氢酶活性明显增强，表明PTD-TAT短肽是能促进CAT分子跨膜运送进入细胞内。

<110>  福州大学

<120>  一种编码过氧化氢酶的基因及其制备方法和应用

<160>  6    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1608

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<223>  第1606-1608位为终止密码子TAA、第1-1605位编码不含信号肽的成熟蛋白，该成熟蛋白含有535个氨基酸

<400>  1

gctgacagcc gggatcccgc cagcgaccag atgcagcact ggaaggagca gcgggccgcg 60

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cgagtggcca actaccagcg tgatggcccg atgtgcatgc aggacaatca gggtggtgct 1200

ccaaattact accccaacag ctttggtgct ccggaacaac agccttctgc cctggagcac 1260

agcatccaat attctggaga agtgcggaga ttcaacactg ccaatgatga taacgttact 1320

caggtgcggg cattctatgt gaacgtgctg aatgaggaac agaggaaacg tctgtgtgag 1380

aacattgccg gccacctgaa ggatgcacaa attttcatcc agaagaaagc ggtcaagaac 1440

ttcactgagg tccaccctga ctacgggagc cacatccagg ctcttctgga caagtacaat 1500

gctgagaagc ctaagaatgc gattcacacc tttgtgcagt ccggatctca cttggcggca 1560

agggagaagg caaatctgag aaagaagaga agacaaagaa gaagataa 1608

 

 

<210>  2

<211>  535

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  2

Ala Asp Ser Arg Asp Pro Ala Ser Asp Gln Met Gln His Trp Lys Glu

1               5                   10                  15     

Gln Arg Ala Ala Gln Lys Ala Asp Val Leu Thr Thr Gly Ala Gly Asn

            20                  25                  30         

Pro Val Gly Asp Lys Leu Asn Val Ile Thr Val Gly Pro Arg Gly Pro

        35                  40                  45             

Leu Leu Val Gln Asp Val Val Phe Thr Asp Glu Met Ala His Phe Asp

    50                  55                  60                 

Arg Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val His Ala Lys Gly Ala Gly Ala

65                  70                  75                  80 

Phe Gly Tyr Phe Glu Val Thr His Asp Ile Thr Lys Tyr Ser Lys Ala

                85                  90                  95     

Lys Val Phe Glu His Ile Gly Lys Lys Thr Pro Ile Ala Val Arg Phe

            100                 105                 110        

Ser Thr Val Ala Gly Glu Ser Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp Pro

        115                 120                 125            

Arg Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr Glu Asp Gly Asn Trp Asp Leu

    130                 135                 140                

Val Gly Asn Asn Thr Pro Ile Phe Phe Ile Arg Asp Pro Ile Leu Phe

145                 150                 155                 160

Pro Ser Phe Ile His Ser Gln Lys Arg Asn Pro Gln Thr His Leu Lys

                165                 170                 175    

Asp Pro Asp Met Val Trp Asp Phe Trp Ser Leu Arg Pro Glu Ser Leu

            180                 185                 190        

His Gln Val Ser Phe Leu Phe Ser Asp Arg Gly Ile Pro Asp Gly His

        195                 200                 205            

Arg His Met Asn Gly Tyr Gly Ser His Thr Phe Lys Leu Val Asn Ala

    210                 215                 220                

Asn Gly Glu Ala Val Tyr Cys Lys Phe His Tyr Lys Thr Asp Gln Gly

225                 230                 235                 240

Ile Lys Asn Leu Ser Val Glu Asp Ala Ala Arg Leu Ser Gln Glu Asp

                245                 250                 255    

Pro Asp Tyr Gly Ile Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ile Ala Thr Gly Lys

            260                 265                 270        

Tyr Pro Ser Trp Thr Phe Tyr Ile Gln Val Met Thr Phe Asn Gln Ala

        275                 280                 285            

Glu Thr Phe Pro Phe Asn Pro Phe Asp Leu Thr Lys Val Trp Pro His

    290                 295                 300                

Lys Asp Tyr Pro Leu Ile Pro Val Gly Lys Leu Val Leu Asn Arg Asn

305                 310                 315                 320

Pro Val Asn Tyr Phe Ala Glu Val Glu Gln Ile Ala Phe Asp Pro Ser

                325                 330                 335    

Asn Met Pro Pro Gly Ile Glu Ala Ser Pro Asp Lys Met Leu Gln Gly

            340                 345                 350        

Arg Leu Phe Ala Tyr Pro Asp Thr His Arg His Arg Leu Gly Pro Asn

        355                 360                 365            

Tyr Leu His Ile Pro Val Asn Cys Pro Tyr Arg Ala Arg Val Ala Asn

    370                 375                 380                

Tyr Gln Arg Asp Gly Pro Met Cys Met Gln Asp Asn Gln Gly Gly Ala

385                 390                 395                 400

Pro Asn Tyr Tyr Pro Asn Ser Phe Gly Ala Pro Glu Gln Gln Pro Ser

                405                 410                 415    

Ala Leu Glu His Ser Ile Gln Tyr Ser Gly Glu Val Arg Arg Phe Asn

            420                 425                 430        

Thr Ala Asn Asp Asp Asn Val Thr Gln Val Arg Ala Phe Tyr Val Asn

        435                 440                 445            

Val Leu Asn Glu Glu Gln Arg Lys Arg Leu Cys Glu Asn Ile Ala Gly

    450                 455                 460                

His Leu Lys Asp Ala Gln Ile Phe Ile Gln Lys Lys Ala Val Lys Asn

465                 470                 475                 480

Phe Thr Glu Val His Pro Asp Tyr Gly Ser His Ile Gln Ala Leu Leu

                485                 490                 495    

Asp Lys Tyr Asn Ala Glu Lys Pro Lys Asn Ala Ile His Thr Phe Val

            500                 505                 510        

Gln Ser Gly Ser His Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ala Asn Leu Arg Lys

        515                 520                 525            

Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

    530                 535                   

 

 

<210>  3

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

catatggctg acagccggga tcccg 25

 

 

<210>  4

<211>  58

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

ggaagctttc atcttcttct ttgtcttctc ttctttctca gatttgcctt ctcccttg 58

 

 

<210>  5

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

tacgtagctg acagccggga tcccg 25

 

 

<210>  6

<211>  58

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

gcggccgctt atcttcttct ttgtcttctc ttctttctca gatttgcctt ctcccttg 58

 

Claims (8)

1.一种编码过氧化氢酶的基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的编码过氧化氢酶的基因，其特征在于：其编码的蛋白质的氨基酸序列如 SEQ NO.2所示。

3.一种载体，包含权利要求1或2所述的编码过氧化氢酶的基因。

4.一种细胞，包含权利要求3所述的载体。

5.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于：所述细胞为大肠杆菌细胞或酵母细胞。

6.一种如权利要求1或2所述的编码过氧化氢酶的基因的制备方法，其特征在于：从人肝脏细胞中分离提取总RNA，将mRNA反转录为cDNA，再进行PCR扩增，根据NCBI发表的人CAT基因序列设计引物P1和P2，分别含有NdeI和HindⅢ酶切位点，用于大肠杆菌质粒的构建；或设计引物P3和P4分别含有SnaBI和NotⅠ酶切位点，用于酵母质粒的构建；其中引物P2或P4含有编码蛋白转导域TAT的9个氨基酸RKKRRQRRR的基因序列；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因；制备好的双链cDNA进行亚克隆：将所得目的基因进行DNA序列测定，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到CAT-TAT基因。

7.根据权利要求6所述的编码过氧化氢酶的基因的制备方法，其特征在于：所述引物P1 、P2 、P3、 P4的序列如SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.5、SEQ NO.6所示。

8.一种如权利要求1或2所述的编码过氧化氢酶的基因的应用，其特征在于：所述基因分泌的CAT-TAT蛋白能以体外给药的方式提高细胞内的过氧化氢酶活力。

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