CN103305480A - 一种来源于牛血液细胞的超氧化物歧化酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种来源于牛血液细胞的超氧化物歧化酶及其制备方法，该超氧化物歧化酶的核苷酸序列如图1所示；超氧化物歧化酶的氨基酸序列如图2所示；核苷酸分子的载体是酵母质粒；核苷酸分子的细胞由所述载体转化而得；所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子细胞是包含所述核酸分子或用所述载体转化的毕赤酵母。本发明制备出能够高效表达并分泌Cu，Zn-SOD的重组生产株，实现Cu，Zn-SOD的生产产业化，获得具有很好的pH稳定性，良好的热稳定性以及蛋白酶水解能力的Cu，Zn-SOD产品。

Description

一种来源于牛血液细胞的超氧化物歧化酶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来源于牛血液细胞的超氧化物歧化酶及其制备方法。

背景技术

1938年，Mann和Keilin首次从牛红细胞中分离出一种蓝色铜蛋白(血铜蛋白，Hemocuprein)。1969年，MeCord和Fridovich发现这种从红细胞纯化而来的含铜蛋白具有清除超氧阴离子自由基(O₂ ^-.)的功能，将其命名为超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，EC1.15.1.1，简称SOD)。

SOD是广泛存在于生物体中的一类金属酶，按金属辅基的不同主要可分为Cu，Zn-SOD，Mn-SOD，Fe-SOD和Ni-SOD。它通过催化下列反应

将生物体内多余的并对细胞破坏力极强的超氧阴离子自由基岐化产生过氧化氢和氧气，过氧化氢随后被体内的过氧化氢酶(CAT)或过氧化物酶(POD)分解掉，从而解除O₂ ^-.所造成的氧化胁迫，因此在维持生物体内超氧阴离子自由基的产生与消除的动态平衡中起着重要作用。人们己对它进行了广泛的研究，它是目前2000多种酶中研究报道最多的一种，也是当今生物学前沿研究课题之一。对它的研究在自由基生物学方面具有十分重要的作用，受到生物化学界、医(药)学界、化工界的高度重视。在临床应用中，SOD具有抗衰老、抗辐射、防治肿瘤、细胞信号传导、治疗心肌缺血与缺血再灌注综合征、治疗自身免疫性疾病及某些心血管疾病等方面的作用。此外，SOD作为保健食品及化妆品的有效成分也展示出广泛的应用前景。

目前，SOD的制备来源主要有动物、植物和微生物。目前市场上的SOD产品大部分是从动物血液中提取的。由于原材料有限、纯化困难等原因，导致SOD的纯度低、产量少，特别是随着世界各地疯牛病、禽流感、口蹄疫以及由动物传播的SARS等恶性传染病不时报道，生产动物源血液制品的风险加大，此外，对产品纯度要求的增高也增加了生产成本。天然微生物和植物来源的SOD也因其种类少、表达量低、酶分子量大、与动物及人体内SOD的同源性低，从而也难以得到广泛的应用。因此，寻找优质的动物来源的SOD外源基因，对其进行合理的改造，构建廉价、高效的表达系统，是突破传统制备方法的有效途径之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于牛血液细胞的超氧化物歧化酶及其制备方法；具体是一种动物来源的SOD基因，以及将其在酵母细胞中克隆表达的方法；解决上述现有技术的不足之处，构建出能高效表达并分泌Cu，Zn-SOD的重组生产株，实现Cu，Zn-SOD的生产产业化，获得具有很好的pH稳定性，良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力的Cu，Zn-SOD产品。

本发明提供了一种超氧化物歧化酶，该超氧化物歧化酶为铜锌超氧化物歧化酶（Cu，Zn-SOD），该超氧化物歧化酶的核苷酸序列如图1所示；该超氧化物歧化酶的氨基酸序列如图2所示。

本发明提供了所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体，该重组载体是酵母质粒（优选为pPIC9k-SOD）。

本发明提供了所述的超氧化物歧化酶的编码序列的宿主细胞，该宿主细胞选酵母细胞；所述编码序列的细胞由所述载体转化而得。所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的细胞是包含所述核苷酸分子或用所述载体转化的毕赤酵母。

本发明提供了所述的超氧化物歧化酶的制备方法，该方法步骤如下：Cu，Zn-SOD基因的获得：从牛血液中分离提取mRNA，将mRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的Cu，Zn-SOD目标基因；制备好的cDNA进行亚克隆：将所得目的基因进行DNA测序，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到Cu，Zn-SOD基因。

本发明提供了所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体的构建方法，该构建方法为：采用所述的Cu，Zn-SOD编码序列经XhoⅠ和NotⅠ双酶切后与同样经XhoⅠ和NotⅠ双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-SOD。

本发明提供了所述的超氧化物歧化酶的编码序列的宿主细胞的构建，该宿主细胞的构建方法是用所述重组载体转化来构建的；所述宿主细胞选酵母细胞（优选为毕赤酵母），选用毕赤酵母构建重组细胞表达Cu，Zn-SOD。

本发明提供了所述的超氧化物歧化酶的表达，培养包含Cu，Zn-SOD编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物。通过包含Cu，Zn-SOD编码序列的酵母发酵来生产Cu，Zn-SOD，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

详述：

本发明涉及从牛血液细胞中克隆的Cu，Zn-SOD基因。

本发明涉及从牛血液中克隆Cu，Zn-SOD的编码序列。实施方式之一，本发明提取牛血液细胞的基因组DNA，通过基因组文库构建好活性筛选的方法克隆到编码Cu，Zn-SOD的全长序列。实施方式之一中，所述编码序列包含如图1所示的核酸序列，称之为Cu，Zn-SOD。实施方式之一中，所述编码序列是图1中的核苷酸1至459所示的核苷酸序列。

本发明还涉及包含所述Cu，Zn-SOD编码序列的重组载体，例如由各种本领域常用的表达载体制备的重组载体，其中，所述编码序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序列。实施方式之一中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明Cu，Zn-SOD编码序列经XhoⅠ和NotⅠ双酶切后与XhoⅠ和NotⅠ双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-SOD。

本发明还制备包含本发明Cu，Zn-SOD编码序列的细胞。实施方式之一中，所述细胞是用上述发明重组载体转化来构建的。所述细胞优选各种利于基因产物发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如酵母细胞。在本发明的实施方式之一中，选用毕赤酵母GS115构建表达Cu，Zn-SOD的重组细胞。

本发明还提供了表达Cu，Zn-SOD的方法，包括：培养前文所述本发明包含Cu，Zn-SOD编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物，还可以可行性地包括纯化表达产物的步骤。实施方式之一中，本发明通过包含本发明Cu，Zn-SOD编码序列的酵母（例如毕赤酵母GS115）发酵来生产Cu，Zn-SOD，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到纯酶形式的目的蛋白。

本发明利用基因工程手段制备了能高效表达并分泌Cu，Zn-SOD的重组生产株，实现了Cu，Zn-SOD的生产产业化，并获得了优质的Cu，Zn-SOD产品。本发明通过酶学性质鉴定，进行了酶的最适作用温度、最适作用pH值、pH稳定性、热稳定性及比活力等理化性质的分析，证明本发明的Cu，Zn-SOD具有很好的pH稳定性，良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力。

附图说明

图1来源于牛血液细胞的SOD的核苷酸序列；

图2来源于牛血液细胞的SOD的氨基酸序列；

图3牛血液细胞的SOD在质粒pPIC9k上的重组子结构图；

图4毕赤酵母表达牛血液细胞的SOD的最适反应温度；

图5毕赤酵母表达牛血液细胞的SOD的最适反应pH；

图6毕赤酵母表达牛血液细胞的SOD的热稳定性；

图7毕赤酵母表达牛血液细胞的SOD的pH稳定性；

图8毕赤酵母表达牛血液细胞的SOD的发酵工程中的酶活力；

图9毕赤酵母表达牛血液细胞的SOD的分子量；

图10毕赤酵母表达牛血液细胞的SOD对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例

实验材料和试剂

1、菌体和载体

毕赤酵母GS115及表达载体pPIC9k均购自Invitrogen公司（Carlsbad，CA，USA）。

2、酶类及其他生化试剂

DEPC、限制性内切酶、DNAMaker、蛋白质Maker均购自Fermentas（MBI），SOD检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，其他常规试剂为上海生工或进口，皆为分析纯。

3、培养基

使用的培养基：LB培养基，YPD，YPAD，BMDY，BNNY，MM，MD培养基均参照Invitrogen毕赤酵母操作手册。

4、本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括：[美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用（第二版）；朱检等，生物化学实验[M]。

5、本发明中所有相关的酶活、酶活力、酶活性均是指SOD酶活性，均采用SOD检测试剂盒（购自南京建成生物工程研究所），并按照其说明书中所述的方法进行测定及计算。

实施例1Cu，Zn-SOD基因的获得

（1）mRNA的分离提取

取正常牛新鲜血液5ml，加入0.4ml浓度为15g/L的EDTA溶液，防止血液凝固，用微量移液器吸取0.25ml，按照1:1的比例用DEPC处理水进行稀释，取0.25ml稀释后的新鲜血液于1.5ml离心管中，加入1mlTRIzol溶液（TRIzol

Reagent，Invitrogen^TMCat NO.15596-026），并按说明书方法操作提取总RNA。

取1μl稀释100倍并进行定量检测，取必要的量用于反转录（RT），剩余的量加入三倍体积的乙醇混合，于-80℃贮存。

（2）cDNA的第一链的合成

RT-PCR是先将mRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增。cDNA是指以mRNA为模板，在反转录酶的作用下形成的互补DNA（complementaryDNA，简称cDNA）。cDNA第一链的合成有两个关键因素，一是模板mRNA，二是反转录酶。本cDNA第一链的合成应用申能博彩逆转录试剂盒，并按说明进行操作。

（3）PCR获取目的基因

根据NCBI发表的牛SOD序列设计上、下游引物P1和P2。上、下游引物分别含有XhoⅠ和NotⅠ酶切位点，由上海生工合成，引物序列如下：

P1：5’-CGGAATTCATGTCTTCATTTCAATTGCC-3’

P2：5’-GTCGGTACCTGTTTTTGTGATTGAATTGC-3’

本研究PCR程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增30次；最后72℃延伸10min。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目标基因。

（4）cDNA亚克隆

制备好的双链cDNA插入到载体系统pPIC9k上，得到重组质粒pPIC9k-SOD（如图3所示），用感受态细胞转化法转化受体菌GS115，在含有100mg/ml Amp和0.5%X-gal的LB平板上37℃培养过夜。挑取蓝色的单克隆（蓝色斑筛选）菌落接种到2ml含有100mg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃200rpm培养3-6h，10000rpm离心10min收集菌体，提取质粒，酶切回收目的基因备用（质粒提取和胶回收分别用OMEGA公司的E.Z.N.A.Plasmid Mini KitⅠ和E.Z.N.A.Gel Extraction Kit试剂盒）。将所得目的基因进行DNA序列测定（Invitrogen公司），由此所得到的SOD的编码序列共有459bp（图1），其中第457-459位为终止密码子TAA，第1-456位编码不含信号肽的成熟蛋白，该成熟蛋白含有152个氨基酸（图2）。根据在NCBI数据库里同源性比对的结果初步确定所得到的SOD为Cu，Zn-SOD，并且从DNA水平上验证了外源基因的插入位点、方向和序列正确。

实施例2毕赤酵母发酵生产重组SOD

将实施例1中所得到的pPIC9k-SOD经SacⅠ酶切，得到线性化质粒pPIC9k-SOD1。

取构建好的线性重组质粒DNA50μg，直接加入到仍在零度以下的感受态细胞中（毕赤酵母GS115）；加入1.0ml含5μg/ml的鲑鱼精DNA的溶液Ⅱ（40%（w/v）聚乙二醇1000，0.2M N，N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35）；30℃水浴保温1h以上，每隔15min轻轻的混匀一次；42℃保温10min；室温3000×g离心5min，弃去上清，用1.0ml的溶液Ⅲ（0.15M NaCl，10mMN,N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35）重新悬浮菌体；室温3000×g离心5min，移去800μl上清，用剩余的200μl上清重新悬浮菌体；将200μl菌液涂YPD平板（YP和20%D单独灭菌，倒平板之前按1：9向YP中加入20%D；筛选抗性为80μg/ml Amp），30℃倒置培养3-4天，在抗性平板上生长的为含量有重组质粒的阳性克隆子，并进行重组子鉴定。

取重组质粒pPIC9k-SOD1转化的毕赤酵母GS115菌株阳性克隆子，接种于150ml YPD培养液中，30℃250rpm震荡培养至OD600nm=0.3-0.5（约20h），然后接种于3L发酵基本培养基（26.2ml/磷酸，0.80g/L硫酸钙，18.7g/L硫酸钾，15.5g/L硫酸镁，4.17g/L氢氧化钾，Glucose40g/L）中，于5L发酵罐中进行发酵。

在起始阶段—菌体生长阶段，发酵过程中用25%的氨水调节pH，使其维持在6.5，并且以4.0ml/h的速度流加PTM1（30mM硫酸铜，0.54mM硫酸亚铁，1.6mM生物素，0.19M硫酸），进行连续流加补料。搅拌并通气培养20-24h，在菌体生长过程中溶氧逐渐下降至低于100%，直至碳源耗尽，溶氧又逐渐上升至高于80%，此时菌湿重可达到70g/L。

进入碳源饲喂阶段，以25ml/h的流速流加用蒸馏水配置的含有25%（w/v）的葡萄糖和12ml/L PTM1的溶液，持续流加4-6h,并调节通气量，使溶氧维持在20%上下，到该阶段的末期，菌湿重可达到200g/L。

在诱导阶段，以20-30ml/h的流速流加含有12ml/L PTM1的甲醇，使培养基中甲醇的终浓度最高不要超过0.3%（v/v），并调节通气量，使溶氧维持在20%上下。在诱导阶段的发酵过程中每隔8-16h取样10ml，10000rpm离心5min，收集上清液测定SOD活力，结果如图8所示。发酵160h时，湿菌重可达到335g/L，SOD的表达水平（以发酵液上清的酶活力表示）可达到3700U/ml，说明牛血液细胞来源的SOD基因均在毕赤酵母中得到了表达和积累。

实施例3重组SOD的纯化

将实施例2所制备的发酵培养液10000rpm离心10min去除菌体，取上清液作为粗酶液，用截留分子量为8000Da的外压式中空纤维超滤膜进行超滤，以去除粗酶液中小分子的杂质，并将其浓缩3-5倍。

将上面所得粗酶液的浓缩液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至85%，13000rpm离心15min，取沉淀，用缓冲液重新溶解，置于截留分子量为8000Da的透析袋中，以pH8.0，10mM Tris-HCl为透析外液，透析外液与内液的体积比大于50，4℃透析12-16h，中间每隔4h更换透析外液一次，透析完后，取透析内液用真空旋转蒸发仪进行浓缩，再进行冷冻干燥后，置于-20℃的低温冰箱中保存待用。

取20mg上面所得到的冻干粉末于离心管中，加入2ml pH8.0，10mMTris-HCl缓冲液，使其充分溶解后，上DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱。先用pH8.0，10mM Tris-HCl缓冲液平衡柱子，然后流加样品，再用相同缓冲液配置的0-0.5M NaCl梯度洗脱5个柱体积，流速为1ml/min，用部分收集器收集，每管3ml。然后对收集管中的溶液测定SOD活力及蛋白电泳分析。

收集离子交换分离后的活性峰，浓缩、脱盐、冻干后，再用pH7.0，20mM PBS缓冲液洗脱1.5个柱体积，流速为0.25ml/min，按峰收集，然后对收集的样品测定SOD活力及进行蛋白质电泳分析。

纯化完成后，牛血液基因来源的SOD比活性从粗酶液的256U/mg提高到纯酶3869U/mg，纯化倍数为15.1，得率为14.5。SDS-PAGE结果（图9）表明，牛血液基因来源的SOD纯化后的SOD蛋白仅有单一的条带，分子量均约为18kDa。

实施例4重组SOD的酶学性质分析

将实施例3所制备的SOD在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.0-10.0的广泛缓冲液（柠檬酸、磷酸二氢钾、硼酸、氢氧化钠、巴比妥）。SOD在不同的pH的缓冲液中，40℃下测定pH的适应性结果，表明牛血液基因来源SOD的最适pH为7.0-8.0（图5）。将SOD酶液在不同pH值的缓冲液中于室温下处理60min，再测定残余酶活性以研究SOD的pH稳定性。结果表明（图7），在pH4.0-10.0之间，SOD的残余活性均在88%以上。这说明牛血液基因来源SOD有很好的pH稳定性。

最适反应温度的测定在磷酸盐（pH7.0）缓冲体系及不同温度下（30℃-80℃）进行酶促反应。热稳定性研究为在不同温度下处理10-60min，再进行酶活性测定。酶促反应最适温度测定结果（图4）表明，SOD的最适反应温度为37℃。在30℃-50℃的范围内保温60min，残余酶活力均可维持在90%以上（图6）。在60℃保温60min，残余酶活力为87%左右，在70℃保温60min，残余酶活力为75%左右，在80℃保温60min，残余酶活力仍可达到49%左右。说明牛血液基因来源SOD有较好的热稳定性。

分别在牛血液基因来源SOD酶溶液中加入0.05ml胰蛋白酶（0.1mg/ml，用pH7.0PBS缓冲液配制）和胃蛋白酶（0.1mg/ml，用pH2.0甘氨酸-HCl缓冲液配制）于37℃处理30-240min，稀释后再测定SOD活性。经胰蛋白酶处理240min后，SOD的残余酶活力仍维持在95%，无明显的损失；经胃蛋白酶处理240min后，SOD残余酶活力在68%左右（图10），说明牛血液基因来源SOD具有较好的抗蛋白酶水解能力。

Claims (10)

1.一种来源于牛血液细胞的超氧化物歧化酶，其特征在于：该超氧化物歧化酶为铜锌超氧化物歧化酶Cu，Zn-SOD，该超氧化物歧化酶具有图1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的超氧化物歧化酶，其特征在于：所述超氧化物歧化酶具有图2所示的氨基酸序列。

3.一种权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体，其特征在于：该重组载体是酵母质粒。

4.根据权利要求3所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体，其特征在于：所述的重组载体为pPIC9k-SOD。

5.一种权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的编码序列的宿主细胞，其特征在于：该宿主细胞由重组载体转化得到，所述宿主细胞为酵母细胞。

6.根据权利要求5所述的超氧化物歧化酶的编码序列的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为毕赤酵母。

7.一种权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：该方法步骤为：

从牛血液中分离提取mRNA，将mRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的Cu，Zn-SOD目标基因；将所得目标基因进行DNA测序，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到Cu，Zn-SOD基因。

8.一种权利要求3所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体的构建方法，其特征在于：该构建方法为：采用所述的Cu，Zn-SOD编码序列经XhoⅠ和NotⅠ双酶切后与同样经XhoⅠ和NotⅠ双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-SOD。

9.一种权利要求5所述的超氧化物歧化酶的编码序列的宿主细胞的构建，其特征在于：该构建方法是用所述重组载体转化来构建的；所述宿主细胞选酵母细胞，选用毕赤酵母构建重组细胞表达Cu，Zn-SOD。

10.一种权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的表达，其特征在于：培养包含Cu，Zn-SOD编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物；具体为通过包含Cu，Zn-SOD编码序列的酵母发酵来生产Cu，Zn-SOD，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

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