CN101633916A - 一种超氧化物歧化酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种动物来源的SOD基因，以及将其在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，所述氧化物歧化酶的核苷酸序列的如SEQ NO.1所示；氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQNO.2所示；核苷酸分子的载体是大肠杆菌质粒或酵母质粒；核苷酸分子的细胞由所述载体转化而得；所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的细胞是包含所述核苷酸分子或用所述载体转化的大肠杆菌或包含所述核酸分子或用所述载体转化的毕氏酵母。本发明制备出能够高效表达并分泌Cu/Zn－SOD的重组生产株，实现Cu/Zn－SOD的生产产业化，获得具有很好的pH稳定性，良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力的Cu/Zn－SOD产品。

Description

一种超氧化物歧化酶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种超氧化物歧化酶、其编码序列、含有该序列的重组质粒和菌株，以及由所述序列编码的超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的表达和在酵母细胞中的发酵生产。

技术背景

SOD(超氧化物歧化酶)是广泛存在于生物体中的一类金属酶，至今为止人们已从细菌、真菌、藻类、鱼类、昆虫、植物和哺乳动物等各种生物体内分离得到了多种SOD，按照结合的金属离子的种类不同，可分为三种类型，即Cu/Zn-SOD、Mn-SOD利Fe-SOD。第一种类型含Cu和Zn，呈蓝绿色，主要存在于真核细胞的细胞浆内。第二种类型含Mn，呈粉红色，目前已从真核细胞的线粒体及原核细胞浆分离得到。第三种类型含Fe，呈黄色，只存在于原核细胞内。此外在1979年，Lilia等人还在牛肝中发现一种Co/Zn-SOD。不同生物体含有SOD的种类和数量是不相同的。已有研究表明，在生物体内存在着两种类型的铜锌超氧化物歧化酶：一种是细胞内形式，叫细胞内铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)；另一种是细胞外形式，称之为细胞外铜锌超氧化物歧化酶(EC-SOD)，二者在催化歧化反应时有着相同的速率和相似的动力学常数。

SOD是机体活性氧清除反应过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，对防止氧自由基破坏细胞的组成、结构和功能，保护细胞免受氧化损伤具有十分重要的作用。作为生物体细胞中最主要的抗氧化酶，SOD是通过催化下列反应：起作用的，即：将生物体内多余的并对细胞破坏力极强的超氧阴离子自由基通过歧化反应而生成过氧化氢和氧气，过氧化氢随后被体内的抗坏血酸和过氧化氢酶(CAT)分解为H₂O和O₂，从而解除O₂ ^-.所造成的氧化胁迫。这在维持生物体内超氧阴离子自由基的产生与消除的动态平衡中起着重要作用。

EC-SOD在体内有着重要的生理作用和生物学功能，研究表明，EC-SOD主要在NO信号传导、心脑血管疾病、糖尿病及抗衰老方面发挥着重要作用。自由基在体内的积累会引起蛋白质氧化，细胞膜结构破坏，酶功能丧失等机体损伤。EC-SOD可以清除体内多余的O₂ ^-.，保护NO的生物活性，维持O₂ ^-.和NO的平衡。在人体血管中，NO作为生物小分子可以舒张动脉，改变血管的基础张力，调节血压和组织血流量，以及抑制血小板的粘附聚集，减少巨噬细胞的堆积，保持血流畅通。

SOD在医学上有广泛的应用：①可预防和治疗如老年痴呆症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和帕金森综合症等许多神经性疾病，最近的研究表明，大脑中EC-SOD的表达量和调控与认知能力有密切联系。②可预防和治疗由肺组织中嗜中性粒细胞分泌出的活性氧自由基(ROS)所引发的继发性急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合症(ARDS)。③EC-SOD的过表达最近一项研究表明，人体关节中含有大量的EC-SOD，它们结合在关节软骨中的I型胶原蛋白上，并且可以有效地清除ROS保护胶原蛋白。可以设想，在不久的将来EC-SOD可能会成为预防和治疗关节炎的有效药物。④SOD也可用作治疗自身免疫性疾病、某些心血管疾病以及抗衰老。⑤此外，SOD还可作为辐射防护剂，用于治疗白内障，应用于肾、肝、心脏等器官的保存和移植，断肢再植和整形美容等手术过程。

SOD在食品工业中可主要用于以下几个方面：①作为保健食品的功效因子或食品营养强化剂，添加到食品中。②作为食品的天然抗氧化剂。③作为水果和蔬菜的保鲜剂。④制成多种剂型的SOD或复合型食品。⑤以富含SOD的原料加工成保健食品。此外，SOD添加到化妆品中可起到防晒、防止皮肤衰老、祛斑、抗皱、抗炎以及防治斑痕形成等作用。

SOD作为自由基清除剂，是一种可以增进人体健康的重要活性物质。现代医学已经证明，胎儿未出生时体内就含有大量EC-SOD，以备出生时接触高氧环境，新生儿一岁后体内EC-SOD含量达到最高；而在后来的20年内EC-SOD含量则以每年2％的速度下降。随着时间的推移，体内抗氧化酶的含量越来越少，到达一定程度就会引起机体疾病的发生。在适当的基质和稳定剂存在下，补充外源SOD能有效的调节机体的代谢、提高人体的免疫功能，对防治某些疾病和延缓衰老具有一定的效果。

Cu/Zn-SOD现已经成为一种疗效广泛的药用酶，但仍有一些缺陷，如天然酶分子量大且难透过细胞膜、稳定性较差、体内半衰期短、且具有免疫原性、功能相对单一等，使其在临床上的应用仍有一定的困难，从而限制了其应用。为了改变这种情况，近些年来国内外学者在Cu/Zn-SOD的化学修饰、酶的模拟等方面进行了大量研究。经化学修饰后的Cu/Zn-SOD，其耐热、耐酸碱、抗蛋白酶水解的能力均有显著提高。Cu/Zn-SOD模拟物具有无免疫损伤、组织渗透性好、在体内具有更高的稳定性、易于生产和便于产业化等优点，自Lippard等率先开展SOD模拟化合物的研究工作以来，国内外已有许多学者亦开始了此项研究工作。随着对SOD研究的日益深入，SOD作为一种新型酶制剂，在医药、农业、保健品、食品等方面必将得到广泛的应用。

目前，SOD的制备来源主要有动物、植物和微生物。目前市场上的SOD产品大部分是从动物血液中提取的。由于原材料有限、纯化困难等原因，导致SOD的纯度低、产量少，特别是随着世界各地疯牛病、禽流感、口蹄疫以及由动物传播的SARS等恶性传染病不时报道，生产动物源血液制品的风险加大，此外，对产品纯度要求的增高也增加了生产成本。天然微生物和植物来源的SOD也因其种类少、表达量低、酶分子量大、与动物及人体内SOD的同源性低，从而也难以得到广泛的应用。因此，寻找优质的动物来源的SOD外源基因，对其进行合理的改造，构建廉价、高效的表达系统，是突破传统制备方法的有效途径之一。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种动物来源的SOD基因，以及将其在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，解决上述现有技术的不足之处，制备出能够高效表达并分泌Cu/Zn-SOD的重组生产株，实现Cu/Zn-SOD的生产产业化，获得具有很好的pH稳定性，良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力的Cu/Zn-SOD产品。

本发明的超氧化物歧化酶为铜锌超氧化物歧化酶，所述述氧化物歧化酶的核苷酸序列的如SEQ NO.1所示；氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。

本发明的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的载体是大肠杆菌质粒或酵母质粒；所述的载体为pGEM-TEasy-SOD、pET21a(+)-SOD或pPIC9k-SOD。

本发明的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的细胞选大肠杆菌细胞或酵母细胞；所述核苷酸分子的细胞由所述载体转化而得；所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的细胞是包含所述核苷酸分子或用所述载体转化的大肠杆菌或包含所述核酸分子或用所述载体转化的毕氏酵母。

详述

本发明涉及从梅花鹿肝脏细胞中克隆的Cu/Zn-SOD基因。

本发明涉及从梅花鹿肝脏细胞中克隆的Cu/Zn-SOD的编码序列。实施方式之一，本发明提取梅花鹿肝脏细胞的基因组DNA，通过基因组文库构建好活性筛选的方法克隆到编码Cu/Zn-SOD的全长序列。实施方式之一中，所述编码序列包含如SEQ NO.1所示的核酸序列，称之为Cu/Zn-SOD。实施方式之一中，所述编码序列是SEQ NO.1中的核苷酸1至456所示的核苷酸序列。

本发明还涉及包含所述Cu/Zn-SOD编码序列的重组载体，例如由各种本领域常用的表达载体制备的重组载体，其中，所述编码序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序列。实施方式之一中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明Cu/Zn-SOD编码序列经EcoRI和NotI双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pET21a(+)载体连接，得到大肠重组表达载pET21a(+)-SOD。另一实施方式中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明Cu/Zn-SOD编码序列经XhoI和NotI双酶切后与XhoI和NotI双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-SOD。

本发明还制备包含本发明Cu/Zn-SOD编码序列的细胞。实施方式之一中，所述细胞是用上述本发明重组载体转化来构建的。所述细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的实施方式之一中，选用大肠杆菌Rosetta2(DE3)和的毕氏酵母GS115构建表达Cu/Zn-SOD的重组细胞。

本发明还提供了表达Cu/Zn-SOD的方法，包括：培养前文所述本发明包含Cu/Zn-SOD编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物，还可以可行性地包括纯化表达产物的步骤。实施方式之一中，本发明通过包含本发明Cu/Zn-SOD编码序列的酵母(例如毕氏酵母GS115)发酵来生产Cu/Zn-SOD，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

SEQ NO.1为本发明的氧化物歧化酶的核苷酸序列；

SEQ NO.2为本发明的氧化物歧化酶的氨基酸序列；

SEQ NO.3为其他来源SOD的氨基酸序列；

SEQ NO.4为其他来源SOD的氨基酸序列；

本发明利用基因工程手段制备了能够高效表达并分泌Cu/Zn-SOD的重组生产株，实现了Cu/Zn-SOD的生产产业化，并获得了优质的Cu/Zn-SOD产品。本发明通过酶学性质鉴定进行了酶的最适作用温度、最适作用pH值、pH稳定性、热稳定性及比活力等理化性质的分析，证明本发明的Cu/Zn-SOD具有很好的pH稳定性，良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力。

附图说明

图1来源于梅花鹿肝脏细胞的SOD的核苷酸序列和氨基酸序列。

图2梅花鹿肝脏来源SOD与其他来源SOD(序列表中SEQ NO.3，SEQ NO.4)氨基酸序列的比较。

图3梅花鹿肝脏来源SOD在质粒pGEM-T Easy、pET21a(+)和pPIC9k上的重组子结构图。

图4毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD的最适反应温度。

图5毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD的最适反应pH。

图6毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD的热稳定性。

图7毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD的pH稳定性。

图8毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD的发酵过程中的酶活力。

图9毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD发酵过程中样品的SDS-PAGE。

图10毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD的分子量。

图11毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性。

具体实施方式

以下根据具体的实施例充分说明本发明。

实施例

实验材料和试剂

1.菌株和载体：

大肠杆菌Rosetta2(DE3)、JM109、DH5α、XL1-Blue及表达载体pET21a(+)、

购自Novagen公司，

Easy Vector systems购自promega公司，毕氏酵母GS115及表达载体pPIC9k均购自Invitrogen公司(Carlsbad，CA，USA)。

2.酶类及其他生化试剂：

限制性内切酶、DNAMaker、蛋白质Maker均购自Fermentas(MBI)，SOD检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，其他常规试剂为上海生工或进口。

3.培养基：

使用的培养基：LB培养基，YPD，YPAD，BMDY，BNNY，MM，MD培养基均参照Invitrogen毕氏酵母操作手册。

4.本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括：[美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)；朱检等，生物化学实验[M]。

5.本发明中所有相关的酶活、酶活力、酶活性均是指SOD酶活性，均采用SOD检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)，并按照其说明书中所述的方法进行测定及计算。

实施例1Cu/Zn-SOD基因的获得

(1)总RNA的分离提取：

取梅花鹿肝脏小片，用液氮冻结后在研钵中粉碎，取约100mg粉末于1.5ml离心管中，加入1mL TRIzol溶液(Reagent，Invitrogen^TM Cat No.15596-026)，并按说明书方法操作提取总RNA。

取1uL稀释100倍并进行定量检测，取必要的量用于反转录(RT)，剩余的量加入三倍体积的乙醇混合，于-80℃贮存。

(2)cDNA第一链的合成：

RT-PCR是先将mRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增。cDNA是指以mRNA为模板，在反转录酶的作用下形成的互补DNA(complementary DNA，简称cDNA)。cDNA第一链的合成有两个关键因素，一是模板mRNA，二是反转录酶。本cDNA第一链的合成应用申能博彩逆转录试剂盒，按其说明进行操作。

(3)PCR获取目的基因

根据NCBI发表的马鹿SOD序列设计上、下游引物P1和P2。上、下游引物分别含有EcoRI和Not I酶切位点，由上海生工合成，引物序列如下：

P1：5’-GAATTCGCGACGAAGGCCGTCTG-3’

P2：5’-GCGGCCGCTTACTGGGCAATTCCAATTACACC-3’

本研究PCR程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增30次；最后72℃延伸10min。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目标基因。

(4)cDNA亚克隆：

制备好的双链cDNA插入到载体系统

Easy上，得到重组质粒Easy-SOD(如图3所示)，用化学转化法转化受体菌XL1-Blue，在含有100mg/ml Amp和0.5％X-gal的LB平板上37℃培养过夜。挑取蓝色的单克隆(蓝白斑筛选)菌落接种到2ml含有100mg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃200rpm培养3-6h，10000rpm离心10min收集菌体，提取质粒，酶切回收目的基因备用(质粒提取和胶回收分别用OMEGA公司的E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I和E.Z.N.A.Gel Extraction Kit试剂盒)。将所得目的基因进行DNA序列测定(Invitrogen公司)，并在NCBI数据库中进行比对分析，结果分别如图1和图2所示。

由此所得到的SOD的编码序列共有456bp(图1，SEQ ID NO：1)，其中第454-456位为终止密码子TAA、第1-453位编码不含信号肽的成熟蛋白(图2)，该成熟蛋白含有151个氨基酸(SEQ ID NO：2)。根据在NCBI数据库里同源性比对的结果初步确定所得到的SOD为Cu/Zn-SOD。

实施例2Cu/Zn-SOD编码基因在大肠杆菌中的表达和扩增

将实施例1-(4)中所得到的目的基因，与经过到EcoR I和NotI双酶切的pET21a(+)质粒连接，得到重组质粒pET21a(+)-SOD(如图3所示)。

取10ul构建好的质粒DNA，加入到100ul制备好的感受态细胞(大肠杆菌Rosetta2(DE3)和JM109)中，摇匀置于冰上，冰浴30min；置于42℃水浴中热击90s；将离心管快速移至冰水混合物中冰浴2min；每管加入400ul SOC培养基(2％蛋白胨，0.5％酵母粉，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖，pH7.0～7.2)，用移液器轻吸打散后于37℃摇床上复苏1h(80rpm～200rpm)；离心，4000rpm×5min，除去400ul上清，剩余部分混匀；涂平板(LB-agar平板，含100ug/ml Amp)，37℃正置1h后，倒置培养过夜，在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。

取重组大肠杆菌菌株Rosetta2(DE3)，接种于50ml LB培养液中(250ml三角瓶，含100ug/ml Amp)，37℃250rpm振荡培养1-1.5h，加入IPTG诱导(终浓度为2umol/ml)，37℃250rpm再振荡培养3-3.5h。取培养液10000rpm离心10min，收集菌体，再加入等体积的无菌水重新悬浮菌体，12000rpm离心10min，取沉淀用1/5体积pH6.0，50mM的PBS悬浮菌体，进行超声波破碎，破碎条件为：60％功率，间隔5s破碎10min，停止10min，再破碎10min。12000rpm离心，收集上清液分析SOD活力，并通过SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量，结果表明SOD的编码基因所编码的SOD可在大肠杆菌中表达，且有一定的SOD活性，测得酶活力为2050U/ml。

取重组大肠杆菌菌株JM109，接种于50ml LB培养液中(250ml三角瓶，含100ug/ml Amp)，37℃250rpm振荡培养2-2.5h，取培养液10000rpm离心10min，收集菌体，提取质粒，酶切回收目的基因备用(质粒提取和胶回收分别用OMEGA公司的E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I和E.Z.N.A.Gel Extraction Kit试剂盒)。

实施例3酵母重组表达载体的构建

将实施例2中所得到的目的基因，与经过到EcoR I和NotI双酶切的pPIC9k质粒连接，得到重组质粒pPIC9k-SOD(如图3所示)。

以所得pPIC9k重组质粒为模板，以引物P1和引物P2构成的引物对进行PCR，同时，以实施例2制备的pET21a(+)重组质粒与引物P1和引物P2所构成的引物对做PCR，从DNA水平上验证外源基因插入是否正确。PCR所得到的2种产物序列长度均为456bp，与实施例1中从梅花鹿肝脏细胞中所得到的SOD原始基因的序列以及其他特征一致，由此可知目的基因的插入位点、方向和序列正确。

实施例4毕氏酵母发酵生产重组SOD

将实施例3 制备的重组质粒pPIC9k-SOD经SacI或者BglII酶切，得到线性化质粒pPIC9k-SOD1。

取构建好的线性重组质粒DNA 50ug，直接加入到仍在零度以下的感受态细胞中(毕氏酵母GS115)；加入1.0ml含5ug/ml的鲑鱼精DNA的溶液II(40％(w/v)聚乙二醇1000，0.2M N，N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35)，或先加入1.0ml的溶液II，然后加入5ul 1mg/ml的鲑鱼精DNA并尽量的将两者完全混匀；30℃水浴保温1h以上，每隔15min轻轻的混匀一次；42℃保温10min；室温3000×g离心5min，弃去上清，用1.0ml的溶液III(0.15M NaCl，10mM N，N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35)重新悬浮菌体；室温3000×g离心5min，移去800ul上清，用剩余的200ul上清重新悬浮菌体；将200ul菌液涂YPD平板(YP和20％D单独灭菌，倒平板之前按1∶9向YP中加入20％D；筛选抗性为80ug/ml Amp)，30℃倒置培养3-4天，在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。

取重组质粒pPIC9k-SOD1转化的毕氏酵母GS115菌株阳性克隆子，接种于150ml YPD培养液中，30℃250rpm振荡培养至OD600nm＝0.3～0.5(约20hr)，然后接种于3L发酵基本培养基(26.2ml/L磷酸，0.80g/L硫酸钙，18.7g/L硫酸钾，15.5g/L硫酸镁，4.17g/L氢氧化钾，Glucose 40g/L葡萄糖)中，于5L发酵罐中进行发酵。

在起始阶段——菌体生长阶段，发酵过程中用25％的氨水调节pH，使其维持在6.5，并且以4.0ml/hr的速度流加PTM1(30mM硫酸铜，0.54mM碘化钠，17.6mM硫酸锰，0.80mM钼酸钠，0.32mM硼酸，2.4mM氯化钴，0.18mM氯化锌，0.24mM硫酸亚铁，1.6mM生物素，0.19M硫酸)，进行连续流加补料。搅拌并通气培养20-24hr，在菌体生长过程中溶氧逐渐下降至低于100％，直至碳源耗尽，溶氧又逐渐上升至高于80％，此时菌湿重可达到90g/L。

进入碳源饲喂阶段，以25ml/hr的速度流加用蒸馏水配置的含有25％(w/v)葡萄糖和12ml/L PTM1的溶液，持续流加4-6hr，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下，到代该阶段的末期，菌湿重可达到160g/L。

在诱导阶段，以20-30ml/hr的速度流加含有12ml/L PTM1的甲醇，使培养基中甲醇的终浓度最高不要超过0.3％(v/v)，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下。在诱导阶段的发酵过程中每隔8-16hr取样10ml，10000rpm离心5min，收集上清液测定SOD活力并进行SDS-PAGE分析，结果分别如图8和图9所示。发酵达161hr时，菌湿重可达到330g/L，SOD的表达水平(以发酵液上清的酶活力表示)可达到3500U/ml，这说明梅花鹿肝脏细胞来源的SOD基因均在毕氏酵母中得到了表达和积累。

实施例5重组SOD的纯化

将实施例4所制备的发酵培养液10000rpm离心10min去除菌体，取上清液作为粗酶液，用截留分子量为6000Da的外压式中空纤维超滤膜进行超滤，以去除粗酶液中小分子的杂质，并将其浓缩3-5倍。

将上面所得粗酶液的浓缩液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至85％，13000rpm离心15min，取沉淀，用缓冲液重新溶解，置于截留分子量为6000Da的透析袋中，以pH8.0，20mM Tris-HCl为透析外液，透析外液与内液的体积比大于50，4℃透析12-16h，中间每隔4h更换透析外液一次，透析完后，取透析内液用真空旋转蒸发仪进行浓缩，再进行冷冻干燥后，置于-20℃的低温冰箱中保存待用。

取20mg上面所得到的冻干粉末于离心管中，加入2ml pH8.0，50mM Tris-HCl缓冲液，使其充分溶解后，上TOSOH Toyopearl EDAE-650C阴离子柱。先用pH8.0，50mM Tris-HCl缓冲液平衡柱子，然后流加样品，再用相同缓冲液配置的0-0.8mol/L NaCl梯度洗脱5个柱体积，流速为1ml/min，用部分收集器收集，每管3ml。然后对收集管中的溶液测定SOD活力及蛋白电泳分析。

收集离子交换分离后的活性峰，浓缩、脱盐、冻干后，再用pH7.0，20mM PBS缓冲液溶解，上Superdex75HPLC柱。先用pH7.0，20mM PBS缓冲液平衡柱子，然后上样，用pH7.0，20mM PBS缓冲液洗脱1.5个柱体积，流速为0.25ml/min，按峰收集，然后对收集的样品测定SOD活力及进行蛋白质电泳分析。

纯化完成后，梅花鹿肝脏基因来源的SOD比活性从粗酶液的237U/mg提高到纯酶的3447U/mg，纯化倍数为14.5，得率为13.8。SDS-PAGE结果(图10)表明，梅花鹿肝脏基因来源的SOD纯化后的SOD蛋白仅有单一的条带，分子量均约为16kDa。

实施例6重组SOD的酶学性质分析

将实施例4所制备的SOD在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.0-10.0的广泛缓冲液(柠檬酸、磷酸二氢钾、硼酸、氢氧化钠、巴比妥)。SOD在不同的pH的缓冲液中，40℃下测定pH的适性结果，表明梅花鹿肝脏基因来源SOD的最适pH为7.0-8.0(图5)。将SOD酶液在不同pH值的缓冲液中于室温下处理60min，再测定残余酶活性以研究SOD的pH稳定性。结果表明(图7)，在pH4.0-9.0之间，SOD的残余活性均在90％以上。这说明梅花鹿肝脏基因来源SOD有很好的pH稳定性。

最适反应温度的测定在磷酸盐(pH7.0)缓冲体系及不同温度下(30℃-80℃)进行酶促反应。热稳定性研究为在不同温度下处理10-60min，再进行酶活性测定。酶促反应最适温度测定结果(图4)表明，SOD的最适反应温度为40℃。在30℃-50℃的范围内保温60min，残余酶活力均可维持在85％以上(图6)。在60℃下保温30min，残余酶活力为80％左右。说明梅花鹿肝脏基因来源SOD有较好的热稳定性。

分别在梅花鹿肝脏基因来源SOD酶溶液中加入0.05ml胰蛋白酶(0.1mg/ml，用pH7.0PBS缓冲液配置)和胃蛋白酶(0.1mg/ml，用pH2.0甘氨酸-HCL缓冲液配置)于37℃处理30-240min，稀释后再测定SOD活性。经胰蛋白酶处理240min后，SOD的残余酶活力仍维持在100％，无明显的损失；经胃蛋白酶处理240min后，SOD残余酶活力在65％左右(图11)，说明梅花鹿肝脏基因来源SOD具有较好的抗蛋白酶水解能力。

功能及用途试验

实施例7重组SOD对小鼠的抗疲劳实验

超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内超氧化物阴离子自由基的清除剂，能够增强机体内代谢废物的清除能力，从而消除疲劳。普通的SOD多由动植物中提取，但是由于其是非人源的，不可避免某些异源SOD的过敏反应，基因组动物源SOD可以弥补这一缺点。但是，目前关于动物源SOD的抗疲劳作用的研究较少，本专利中通过小鼠的负重游泳实验探讨基因重组动物源SOD的抗疲劳作用。

1材料

昆明小鼠，共40只，雌雄各半，体重(20±2)g，福建医大实验动物中心提供。基因重组动物源SOD由实施例4所制备。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、SOD、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)检测试剂盒由南京建成生物技术公司提供，具体测定方法采用试剂盒中所提供的方法进行。

2给药方法

昆明小鼠随机分成四组，每组10只，雌雄各半。小鼠经口灌胃给药，剂量分别为500、1 500、6 000U/kg；另设生理盐水对照组。各组动物每天固定时间给药1次，连续给药1w。末次给药后，将小鼠放入游泳箱中进行负重游泳实验(负重10％体重)，游泳箱规格为50cm×50cm×40cm，水温为25℃～27℃，直至沉入水中不再浮起时将其捞出，分别记录游泳时间，所得结果如表1所示。

3检测指标

末次给药后，将小鼠放入游泳箱中游泳1h后捞出擦干，脱臼处死，取肝脏组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，将组织放入青霉素瓶中，加入生理盐水研磨，3 500r/min离心10min，取上清，制成10％的组织匀浆液。用分光光度法测定小鼠组织中GSH-PX、SOD、T-AOC和MDA的水平，所得结果见表2。

4统计学处理

采用spss统计软件，统计结果以x±s表示，进行组间t检验。

表1小鼠游泳实验结果

分组	游泳时间(s)
		对照组	403.5±101.4
500U/kg SOD组	631.0±219.8
		1 500U/kg SOD组	663.5±247.2
6000U/kg SOD组	855.4±188.9

由表1可以看出，给药三组的均明显高于对照组(p＜0.05)，这说明SOD可显著延长游泳时间，提高运动耐力。

表2实验后小鼠的生化指标

分组	肝脏组织SODU/mg蛋白质	GSH-PXU/mg蛋白质	T-AOCU/mg蛋白质	MDAmmol/mg蛋白质
					对照组	141.14±18.06	1289.3±144.43	2.70±0.93	22.13±5.44
500U/kg SOD组	143.22±16.55	1421.2±201.55	2.81±0.79	20.06±4.67
					1500U/kg SOD组	323.13±18.89	1314.5±129.88	6.06±2.33	11.88±1.51
6000U/kg SOD组	341.74±27.45	1295.4±138.11	2.86±1.25	12.46±2.09

由表2中的结果可知，给予小鼠SOD后，提高了其肝脏组织SOD、GSH-PX和T-AOC活力，降低了MDA含量。其中低浓度组GSH-PX的水平显著提高(p＜0.05)；中浓度组SOD和T-AOC的水平显著提高(p＜0.05)，MDA显著降低(p＜0.05)；高浓度组SOD的水平显著提高(p＜0.05)，MDA显著降低(p＜0.05)。

据报道，竭力运动后体内的自由基生成增多，同时运动后其防御系统也得到了加强，但运动后即刻抗氧化酶活性的增强不足以清除增多的自由基，导致自由基在体内的堆积，组织内SOD和GSH-PX等抗氧化酶的活性降低。由于自由基非常活泼，化学反应性极强，它可以参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏膜的结构和功能，从而使机体疲劳。

自由基还能引起蛋白质变性和交联，使体内的许多酶及激素失去生物活性。SOD作为一种蛋白质，在运动后自由基增多的情况下很容易失活而起不到抗氧化的作用。本实验结果表明，外源性给予SOD后，组织内SOD的活性明显升高，尤以中、高剂量组升高最为明显，由此推测SOD具有增强组织清除自由基的能力。

谷胱甘肽是一种小分子肽，其在GSH-PX的催化下具有还原过氧化物的作用。近来的研究证明，其能使维生素e(Ve)恢复到还原状态，而脂质过氧化物的毒性作用可被Ve对抗，其能阻断脂质过氧化作用，维护生物膜的结构和功能；而且谷胱甘肽的结构中含有一个活泼的巯基，易被氧化脱氧，这一特异结构使其成为体内主要的自由基清除剂。因此，GSH-PX可以使组织细胞的脂质过氧化物生成减少，从而降低细胞的损伤程度。本实验结果表明，SOD提高了GSH-PX的活性，尤以低浓度组效果最明显，这说明SOD可能有效地阻断了脂质过氧化的发生。

T-AOC是综合反映组织对抗自由基对脂质膜损害、清除活性氧能力的良好指标，它克服了单一的抗氧化指标难以全面反映机体抗氧化能力的不足，能够对各抗氧化系统协同完整的抗氧化能力做出综合全面评价。T-AOC用于运动性疲劳研究，有利于更全面评价机体抗氧化系统的综合作用。本实验结果显示，口服SOD后T-AOC的水平明显提高，这说明SOD提高了组织对抗自由基对脂质膜损害、清除活性氧的能力。

细胞膜富含不饱和脂肪酸，最易受到氧自由基的攻击而发生脂质过氧化反应，其分解产物之一是MDA，MDA的含量能直接反映细胞膜被氧化的程度。本实验的结果显示，口服SOD后，小鼠体内MDA的水平显著降低，中、高剂量组的效果尤其显著，这说明SOD能够显著增加组织对自由基的清除能力。

因此，综合本实验的结果可知，SOD对于降低运动引起的自由基增加的状况和延缓运动性疲劳的发生是十分有利的，可作为生物体内有效的抗氧化剂加以补充。但是对于不同的指标，抗氧化作用的最佳剂量有些不一致，可能是因为疲劳时不同的抗氧化酶代谢速率不同，所以对于提高不同的酶的活性，给予的外源性抗氧化剂的剂量也不同。

序列表

SEQ NO.1

<110>福州大学

<120>一种超氧化物歧化酶及其制备方法

<160>4

<210>1

<211>序列的长度

<212>DNA

<213>梅花鹿肝脏细胞

<220>

<223>该DNA序列共有456bp，其中第454-456位为终止密码子TAA、第1-453位编码不含信号肽的成熟

蛋白，该成熟蛋白含有151个氨基酸。

<400>1

gcgacgaagg ccgtctgcgt gctgaagggc gacggcccgg tgcaaggcac catccgcttc     60

gaggcaaagg gacatacagt cgtcgtaact ggatccatta caggattgac tgaaggtgat    120

catggattcc acgtccatca gtttggagac gatacgcaag gctgtaccag tgcaggtcct    180

cactttaatc ctctgtccaa aaaacacggt gggccaaaag atgatgagag gcatgttgga    240

gacctgggca acgtgacggc tgacaaaaac ggtgttgcca aagtggatat tgtagattct    300

ctgatctcac tgtcaggaga acattccatc attggccgca cgatggtggt ccatgaaaaa    360

ccggatgact tgggcagagg tggaaatgaa gaaagtacaa agactggaaa cgctggaaat    420

cgtttggcct gtggtgtaat tggaattgcc cagtaa                              456

SEQ NO.2

<210>2

<211>151

<212>PRT

<213>梅花鹿肝脏细胞

<220>

<400>2

Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln

1               5                   10                  20

Gly Thr Ile Arg Phe Glu Ala Lys Gly His Thr Val Val Val Thr

                20                  25                  30

Gly Ser Ile Thr Gly Leu Thr Glu Gly Asp His Gly Phe His Vis

                35                  40                  45

His Gln Phe Gly Asp Asp Thr Gln Gky Cys Thr Ser Ala Gly Pro

                50                  55                  60

His Phe Asn Pro Leu Ser Lys Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Asp

                65                  70                  75

Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asn

                80                  85                  90

Gly Val Ala Lys Val Asp Ile Val Asp Ser Leu Ile Ser Leu Ser

                95                  100                 105

Gly Glu His Ser Ile Ile Gly Arg Thr Met Val Val His Glu Lys

                110                 115                 120

Pro Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr

                125                 130                 135

Gly Asn Ala Gly Asn Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala

                140                 145                 150

Gln

SEQ NO.3

<210>3

<211>152

<212>PRT

<213>马鹿(北美)

<220>

<400>3

Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val

1               5                   10                  15

Gln Gly Thr Ile Arg Phe Glu Ala Lys Gly His Thr Val Val Val

                20                  25                  30

Thr Gly Ser Ile Thr Gly Leu Thr Glu Gly Asp His Gly Phe His

                35                  40                  45

Val His Gln Phe Gly Asp Asn Thr Gln Gly Cys Thr Ser Ala Gly

                50                  55                  60

Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Lys Lys His Gly Gly Pro Lys Asp

                65                  70                  75

Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys

                80                  85                  90

Asn Gly Val Ala Lys Val Asp Ile Val Asp Ser Leu Ile Ser Leu

                95                  100                 105

Ser Gly Glu His Ser Ile Ile Gly Arg Thr Met Val Val His Glu

                110                 115                 120

Lys Pro Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys

                125                 130                 135

Thr Gly Asn Ala Arg Asn Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile

                140                 145                 150

Ala Gln

SEQ NO.4

<210>4

<211>152

<212>PRT

<213>马鹿(欧洲)

<220>

<400>4

Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Met Lys Gly Asp Gly Pro Val

1               5                   10                  15

Gln Gly Thr Ile Arg Phe Glu Ala Lys Gly Asn Thr Val Val Val

                20                  25                  30

Thr Gly Ser Ile Thr Gly Leu Thr Glu Gly Asp His Gly Phe His

                35                  40                  45

Val His Gln Phe Gly Asp Asn Thr Gln Gly Cys Thr Ser Ala Gly

                50                  55                  60

Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Lys Lys His Gly Gly Pro Lys Asp

                65                  70                  75

Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys

                80                  85                  90

Asn Gly Val Ala Lys Val Asp Ile Val Asp Ser Leu Ile Ser Leu

                95                  100                 105

Ser Gly Glu His Ser Ile Ile Gly Arg Thr Met Val Val His Glu

                110                 115                 120

Lys Pro Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys

                125                 130                 135

Thr Gly Asn Ala Arg Asn Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile

                140                 145                 150

Ala Gln

Claims (10)

1.一种超氧化物歧化酶，其特征在于：所述的超氧化物歧化酶为铜锌超氧化物歧化酶，所述述氧化物歧化酶的核苷酸序列的如SEQ NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的超氧化物歧化酶，其特征在于：所述氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。

3.一种如权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体，其特征在于：所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的载体是大肠杆菌质粒或酵母质粒。

4.根据权利要求3所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体，其特征在于：所述的载体为pGEM-T Easy-SOD、pET21a(+)-SOD或pPIC9k-SOD。

5.一种如权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的编码序列的细胞，其特征在于：所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的细胞选大肠杆菌细胞或酵母细胞；所述核苷酸分子的细胞由所述载体转化而得。

6.根据权利要求5所述的的超氧化物歧化酶的编码序列的细胞，其特征在于：所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的细胞是包含所述核苷酸分子或用所述载体转化的大肠杆菌或包含所述核酸分子或用所述载体转化的毕氏酵母。

7.一种如权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：所述超氧化物歧化酶的制备步骤包括：Cu/Zn-SOD基因的获得：从梅花鹿肝脏中分离提取总RNA，将mRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目标基因；制备好的双链cDNA进行亚克隆：将所得目的基因进行DNA序列测定，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到Cu/Zn-SOD基因。

8.一种如权利要求3所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体的制备方法，其特征在于：所述Cu/Zn-SOD基因的重组载体的制备为：采用所述Cu/Zn-SOD编码序列经EcoRI和NotI双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pET21a(+)载体连接，得到大肠重组表达载pET21a(+)-SOD或采用所述的Cu/Zn-SOD编码序列经XhoI和NotI双酶切后与XhoI和NotI双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-SOD。

9.一种如权利要求5所述的的超氧化物歧化酶的编码序列的细胞的构建，其特征在于：所述细胞是用所述重组载体转化来构建的；所述细胞选大肠杆菌细胞和酵母细胞，选用大肠杆菌和毕氏酵母构建表达Cu/Zn-SOD的重组细胞。

10.一种如权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的表达，其特征在于：培养所述包含Cu/Zn-SOD编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物：通过包含本发明Cu/Zn-SOD编码序列的酵母发酵来生产Cu/Zn-SOD，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

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