CN103773742A - 梯度溶氧发酵提高酿酒酵母超氧化物歧化酶产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了梯度溶氧发酵提高酿酒酵母超氧化物歧化酶产量的方法，包括如下步骤：1）菌种活化糖液准备；2）发酵基础培养基和补料液准备；3）菌种复水与活化；4）发酵培养和溶氧定向诱导：将复水与活化后的菌液接种于发酵基础培养基发酵，在发酵3小时，开始流加补料液，补料与溶氧量联动；5）超氧化物歧化酶粗酶液提取。本发明的方法定向地诱导细胞生产SOD，使天然酵母SOD产量显著提高，降低生产成本，使SOD产品能够成为普通人群所能接受的健康食品、医药或美容护肤品。为实现酿酒酵母SOD的产业化提供了强有利的技术支持。

Description

梯度溶氧发酵提高酿酒酵母超氧化物歧化酶产量的方法
技术领域
本发明所属微生物发酵工程技术领域，涉及一种提高酿酒酵母超氧化物歧化酶产量的发酵方法。 
背景技术
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，简称SOD）是一类广泛分布于各种生物体内的金属酶，可以把有害的超氧阴离子自由基转化为过氧化氢和分子氧。根据SOD活性中心所结合金属的不同，主要有Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，和Fe-SOD，其中以Cu/Zn-SOD最为常见，呈蓝绿色，主要存在于真核细胞的细胞浆内。由于对超氧阴离子自由基的清除作用，SOD在临床医药、食品工业、日化工业和农业上均有应有。 
SOD是目前生物学、医学和生命科学领域中世界级的高、尖、精课题，目前世界范围内的开发，大都从动物血里提取，多为Cu/Zn-SOD。典型的制备工艺是先经溶血，然后采用热变性和有机溶剂处理提取，最后用柱层析纯化【1】。动物血SOD的生产存在原料分散不易储藏、动物疾病或动物血病毒的潜在风险，制约动物血SOD的生产。从植物中提取SOD是最近研究的热点，植物SOD易被消费者接受，且植物原材料来源丰富，将成为SOD产品的主要来源。但是，植物SOD的生产必然会受到植物生长季节、气候等因素的制约，且植物生长的周期性也会成为植物SOD生产的限制因素，加之植物的栽培管理，也会使得植物SOD的生产成本提高，迄今为止，国内市场上尚未见产业化大量生产的植物SOD，而市面流行的小量植物SOD样品，纯度低，色泽差，稳定性差，所以植物SOD的成功开发和利用还需要相当一段时间。 
相比之下，由于微生物具有原料易得，易于大规模培养的优势，微生物发酵法生产SOD比动植物SOD的生产具有原料富足易储备，不受生长季节限制等优势。直到上世纪80年代，美国和日本才先后开发了发酵生产SOD的方法。目前，国内外都致力于微生物生产SOD的研究，并且在菌种选育、发酵工艺、分离提纯、生理学研究、基因克隆表达及SOD应用等方面都取得了一定的研究进展【2】。对各种微生物SOD含量的研究结果显示，真核微生物的SOD含量一般高于原核微生物。微生物SOD的提取经破壁、盐析、透析、DEAE-纤维素层析纯化几个步骤进行。破壁方法有传统的超声波破壁法和工业上可行的氯仿破壁法【1】。但是，由于微生物发酵生产SOD最大的限制因素是SOD产量偏低，使得成本居高不下，难以实现工业化大生产，目前市面上流通的SOD仍然主要为动物血SOD产品，微生物发酵生产的重组人源SOD价格昂贵，不是普通人群所能消费。 
现有的微生物发酵生产SOD的研究，多数集中在诱变选育高产菌株或通过基因重组手段让微生物大量表达外源SOD。诱变筛选菌株时间漫长、工作量大，基因工程的发酵产品涉及 到基因产品的安全性评价等方面，难以获得批号进行工业化生产。而且不管是诱变菌株，还是基因工程菌株，最终要经过合适的发酵过程才能满足高产SOD的需要。SOD是生物防御活性氧的酶，好氧微生物的SOD含量多于厌氧微生物SOD含量。对植物和藻类的研究表明，氧气是诱导SOD形成的一个重要因子【3】。在微生物发酵过程中，人们往往更多注意培养基的营养成分、pH值和发酵温度等因素对细胞生长和产量的影响，而忽略了发酵液氧气含量对于微生物生产SOD的重要作用。因此，虽然发酵过程中养分充足，pH值和适宜温度，但SOD的产量依然不能达到工业化生产的要求，因此不能将生产成本显著降低，难以满足普通人群的低价位需求。 
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种梯度溶氧发酵提高酿酒酵母超氧化物歧化酶产量的方法。 
本发明的技术方案概述如下： 
梯度溶氧发酵提高酿酒酵母超氧化物歧化酶产量的方法，包括如下步骤： 
1）菌种活化糖液准备：将浓度为15-25g/L葡萄糖水溶液，高压灭菌15-25min，冷却至室温； 
2）发酵基础培养基和补料液准备，其中：发酵基础培养基：葡萄糖20-50g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母膏10-20g/L，KH2PO40.3-1.0g/L，CuSO4·5H2O0.3-1.0g/L，ZnSO4·7H2O0.3-1.0g/L，MgSO4·7H2O2-10g/L，余量为水，自然pH，121℃灭菌20-25min；补料液是20-50g/L葡萄糖水溶液； 
3）菌种复水与活化：酿酒高活性干酵母按质量1%接种于所述菌种活化糖液中，置于摇床，于30-34℃，150-200rpm，复水与活化1-2小时； 
4）发酵培养和溶氧定向诱导：将复水与活化后的菌液按体积30%-60%接种于发酵基础培养基，在转速300-700rpm，30-32℃起始发酵，在发酵3小时，开始流加补料液，补料与溶氧量联动，在发酵3-40小时，控制溶氧量在10%以下，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.1-0.2g；在发酵40.01-45小时，控制溶氧量在10%-25%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.05-0.1g；在发酵45.01-55小时，控制溶氧量在25%-35%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.02-0.04g；发酵55.01-65小时，控制溶氧量35%-45%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.004-0.02g；65.01-70小时，控制溶氧量在50%以上； 
5）超氧化物歧化酶粗酶液提取： 
将步骤4）获得的发酵液以7000-10000rpm室温离心10-20分钟，收集细胞；按细胞与水之比为1g:3-5ml的比例，将细胞重悬于水中，超声破壁；将破壁液在7000-10000rpm室温离心10-20分钟，收集上清，得到超氧化物歧化酶粗提液。 
本发明的优点： 
本发明的方法定向地诱导细胞生产SOD，使天然酵母SOD产量显著提高，降低生产成本，使SOD产品能够成为普通人群所能接受的健康食品、医药或美容护肤品。为实现酿酒酵母SOD 的产业化提供了强有利的技术支持。 
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。 
酿酒高活性干酵母,购于北京大卫京狮啤酒有限公司。 
实施例1 
梯度溶氧发酵提高酿酒酵母超氧化物歧化酶产量的方法，包括如下步骤： 
1）菌种活化糖液准备：将浓度为20g/L葡萄糖水溶液，高压灭菌20min，冷却至室温； 
2）发酵基础培养基和补料液准备，其中：发酵基础培养基：葡萄糖35g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏15g/L，KH2PO40.7g/L，CuSO4·5H2O0.7g/L，ZnSO4·7H2O0.7g/L，MgSO4·7H2O6g/L，余量为水，自然pH，121℃灭菌22min；补料液是35g/L葡萄糖水溶液； 
3）菌种复水与活化：酿酒高活性干酵母按质量1%接种于所述菌种活化糖液中，置于摇床，于32℃，180rpm，复水与活化1.5小时； 
4）发酵培养和溶氧定向诱导：将复水与活化后的菌液按体积45%接种于发酵基础培养基，在转速500rpm，31℃起始发酵，在发酵3小时，开始流加补料液，补料与溶氧量联动，在发酵3-40小时，控制溶氧量在10%以下，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.15g；在发酵40.01-45小时，控制溶氧量在10%-25%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.07g；在发酵45.01-55小时，控制溶氧量在25%-35%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.03g；发酵55.01-65小时，控制溶氧量35%-45%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.01g；65.01-70小时，控制溶氧量在50%以上； 
5）超氧化物歧化酶粗酶液提取： 
将步骤4）获得的发酵液以8000rpm室温离心15分钟，收集细胞；按细胞与水之比为1g:4ml的比例，将细胞重悬于水中，超声破壁；将破壁液在8000rpm室温离心15分钟，收集上清，得到超氧化物歧化酶粗提液，经检测超氧化物歧化酶产量为5660.9U/g湿细胞。实施例2 
梯度溶氧发酵提高酿酒酵母超氧化物歧化酶产量的方法，包括如下步骤： 
1）菌种活化糖液准备：将浓度为15g/L葡萄糖水溶液，高压灭菌15min，冷却至室温； 
2）发酵基础培养基和补料液准备，其中：发酵基础培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏10g/L，KH2PO41.0g/L，CuSO4·5H2O0.3g/L，ZnSO4·7H2O1.0g/L，MgSO4·7H2O2g/L，余量为水，自然pH，121℃灭菌20min；补料液是20g/L葡萄糖水溶液； 
3）菌种复水与活化：酿酒高活性干酵母按质量1%接种于所述菌种活化糖液中，置于摇床，于30℃，150rpm，复水与活化2小时； 
4）发酵培养和溶氧定向诱导：将复水与活化后的菌液按体积30%接种于发酵基础培养基，在转速700rpm，30℃起始发酵，在发酵3小时，开始流加补料液，补料与溶氧量联动，在发酵3-40小时，控制溶氧量在10%以下，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟 补葡萄糖0.1g；在发酵40.01-45小时，控制溶氧量在10%-25%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.05g；在发酵45.01-55小时，控制溶氧量在25%-35%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.02g；发酵55.01-65小时，控制溶氧量35%-45%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.004g；65.01-70小时，控制溶氧量在50%以上； 
5）超氧化物歧化酶粗酶液提取： 
将步骤4）获得的发酵液以7000rpm室温离心20分钟，收集细胞；按细胞与水之比为1g:3ml的比例，将细胞重悬于水中，超声破壁；将破壁液在7000rpm室温离心20分钟，收集上清，得到超氧化物歧化酶粗提液，经检测超氧化物歧化酶产量为5332.7U/g湿细胞。 
实施例3 
梯度溶氧发酵提高酿酒酵母超氧化物歧化酶产量的方法，包括如下步骤： 
1）菌种活化糖液准备：将浓度为25g/L葡萄糖水溶液，高压灭菌25min，冷却至室温； 
2）发酵基础培养基和补料液准备，其中：发酵基础培养基：葡萄糖50g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏20g/L，KH2PO40.3g/L，CuSO4·5H2O1.0g/L，ZnSO4·7H2O0.3g/L，MgSO4·7H2O10g/L，余量为水，自然pH，121℃灭菌25min；补料液是50g/L葡萄糖水溶液； 
3）菌种复水与活化：酿酒高活性干酵母按质量1%接种于所述菌种活化糖液中，置于摇床，于34℃，200rpm，复水与活化1小时； 
4）发酵培养和溶氧定向诱导：将复水与活化后的菌液按体积60%接种于发酵基础培养基，在转速300rpm，32℃起始发酵，在发酵3小时，开始流加补料液，补料与溶氧量联动，在发酵3-40小时，控制溶氧量在10%以下，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.2g；在发酵40.01-45小时，控制溶氧量在10%-25%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.1g；在发酵45.01-55小时，控制溶氧量在25%-35%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.04g；发酵55.01-65小时，控制溶氧量35%-45%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.02g；65.01-70小时，控制溶氧量在50%以上； 
5）超氧化物歧化酶粗酶液提取： 
将步骤4）获得的发酵液以10000rpm室温离心10分钟，收集细胞；按细胞与水之比为1g:5ml的比例，将细胞重悬于水中，超声破壁；将破壁液在10000rpm室温离心10分钟，收集上清，得到超氧化物歧化酶粗提液，经检测超氧化物歧化酶产量为5999.1U/g湿细胞。 
现有的微生物发酵法生产SOD，偏重于微生物的常规发酵，优化培养基，间歇或连续流加补料，但是忽略了氧气对SOD的诱导表达作用。本发明在微生物常规发酵法的基础上，通过氧气定向诱导SOD的表达，增加SOD产量。活性干酵母在优化培养条件下，SOD产量达1948U/g湿细胞【4】。本发明以该发酵方式为对照，在不增加成本的前提下，通过增加溶氧量定向诱导SOD的产量，使得SOD产量达到5000-6000U/g湿细胞，显著地提高了SOD产量。 
邻苯三酚自氧化法检测SOD活性。 
本发明的方法SOD产量在5000-6000U/g湿细胞之间，对照的常规发酵法SOD产量为 2200-2500U/g湿细胞之间。 
参考文献： 
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Claims (1)

1.梯度溶氧发酵提高酿酒酵母超氧化物歧化酶产量的方法，其特征包括如下步骤：
1）菌种活化糖液准备：将浓度为15-25g/L葡萄糖水溶液，高压灭菌15-25min，冷却至室温；
2）发酵基础培养基和补料液准备，其中：发酵基础培养基：葡萄糖20-50g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母膏10-20g/L，KH2PO40.3-1.0g/L，CuSO4·5H2O0.3-1.0g/L，ZnSO4·7H2O0.3-1.0g/L，MgSO4·7H2O2-10g/L，余量为水，自然pH，121℃灭菌20-25min；补料液是20-50g/L葡萄糖水溶液；
3）菌种复水与活化：酿酒高活性干酵母按质量1%接种于所述菌种活化糖液中，置于摇床，于30-34℃，150-200rpm，复水与活化1-2小时；
4）发酵培养和溶氧定向诱导：将复水与活化后的菌液按体积30%-60%接种于发酵基础培养基，在转速300-700rpm，30-32℃起始发酵，在发酵3小时，开始流加补料液，补料与溶氧量联动，在发酵3-40小时，控制溶氧量在10%以下，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.1-0.2g；在发酵40.01-45小时，控制溶氧量在10%-25%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.05-0.1g；在发酵45.01-55小时，控制溶氧量在25%-35%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.02-0.04g；发酵55.01-65小时，控制溶氧量35%-45%，补料液流加速度相当于每升发酵基础培养基每分钟补葡萄糖0.004-0.02g；65.01-70小时，控制溶氧量在50%以上；
5）超氧化物歧化酶粗酶液提取：
将步骤4）获得的发酵液以7000-10000rpm室温离心10-20分钟，收集细胞；按细胞与水之比为1g:3-5ml的比例，将细胞重悬于水中，超声破壁；将破壁液在7000-10000rpm室温离心10-20分钟，收集上清，得到超氧化物歧化酶粗提液。
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