CN103333913B - 可以分泌表达超氧化物歧化酶的工程酿酒酵母及其构建方法与其在制备活性美容产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了可以分泌表达超氧化物歧化酶的工程酿酒酵母及其构建方法与其在制备活性美容产品中的应用。本发明利用酿酒酵母交配因子（MF）α的分泌信号肽序列与铜锌超氧化物歧化酶（hCu/Zn-SOD）cDNA融合构建了分泌表达载体，实现hCu/Zn-SOD在酿酒酵母中的克隆和分泌表达，所构建的工程菌可以在人体温范围内直接分泌表达有活性的外源性hCu/Zn-SOD，表达产物可直接应用于化妆品等领域，发挥其抗氧化、抗衰老等功能。本发明酵母工程菌株的成功构建为开发hCu/Zn-SOD的基因工程产品奠定了良好的基础，应用前景广阔。

Description

可以分泌表达超氧化物歧化酶的工程酿酒酵母及其构建方法与其在制备活性美容产品中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及可以分泌表达超氧化物歧化酶的工程酿酒酵母及其构建方法与其在制备活性美容产品中的应用。

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶，按其结合的金属离子可分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三种，它们主要催化超氧化物阴离子自由基发生歧化反应，生成氧和过氧化氢。超氧化物歧化酶可以防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，还可预防衰老，对一些疾病如肿瘤、炎症及自身免疫疾病等具有良好的疗效。通过研究寄生虫及宿主体内SOD的含量、结构及功能有助于确立寄生虫免疫诊断指标和寻找特异性抑制虫体相关酶的药物。其中，Cu/Zn-SOD(SOD1)分布最广，占总SOD的90％以上，它是一种普遍存在的酶，在家族性肌萎缩性侧索硬化症(FALS)、帕金森病(PD)、登革热、癌症、Down’s综合症、白内障和多种神经紊乱综合症中具有重要的生理学意义和治疗潜力（HartPJ,LiuH,PellegriniM,etal.Subunitasymmetryinthethree-dimentialstructureofahumanCu,Zn-SODmutantfoundinfamilialamyotrophiclateralsclerosis[J].ProteinSci,1998,7:545-555）。

天然SOD来源有限，且具有异体蛋白免疫原性，外源SOD不易被人体接受等，使其在应用方面受到很大限制，用基因工程技术制备的SOD是广开酶源、降低成本和获得无抗原性的人源SOD的有效途径。目前，国外对SOD进行了一系列的基础研究、应用开发和临床试验，主要包括SOD的纯化、理化性质、临床疗效等方面的研究（1.BondCJ,HuangJ,HajdukR,etal.Cloning,sequenceandcrystallographicstructureofrecombinantironsuperoxidedismutasefromPseudomonasovalis[J].ActaCrystallogrDBiolCrystallogr,2000,56(11):1359-1366.2.KimTS,JungY,NaBK,etal.MolecularcloningandexpressionofCu/ZnsuperoxidedismutasefromFasciolahepatica[J].InfectImmun,2000,68(7):3941-3948.3.周潮,方允中,蒋德席.冻干精制人红细胞超氧化物歧化酶注射剂研制报告[J].见:方允中,郑荣梁,沈文梅主编,自由基生命科学进展第4集.北京:原子能出版社,1996:80-84）。国内主要集中在与应用有关的基础理论的研究上，如分离纯化及性质等方面的研究（周潮,李培峰,方允中.人红细胞铜锌超氧化物歧化酶的纯化[J].见:方允中,郑荣梁,沈文梅主编,自由基生命科学进展第2集.北京:原子能出版社,1994:147-151），而有关SOD基因克隆和表达方面的研究报道较少。利用大肠杆菌表达系统来生产SOD的生物技术研究已比较成熟，并已达到医学临床试验阶段（吕星,陈吉中,隋建丽,等.人铜锌超氧化物歧化酶的大规模生产工艺[J].生物技术,1994,6:34-36）。目前，大肠杆菌表达的SOD经过纯化主要用于一些药品中，如果将其应用在美容产品中，SOD产品存在不易保存、容易失活或者活性较低的问题。据检索，还没有将可表达SOD的酿酒酵母直接应用于化妆品的报道。

发明内容

本发明的其中一个目的是提供一种适于在酿酒酵母中分泌表达超氧化物歧化酶的SOD-酿酒酵母重组表达载体。

所述重组表达载体为携带酿酒酵母MF-α信号肽基因和hCu/Zn-SOD基因的重组酿酒酵母分泌表达载体。

用于构建重组酿酒酵母分泌表达载体的出发载体可为任意一种可在酿酒酵母中分泌表达外源基因的真核表达载体，如pJK3、pMD18-Ｔ、pUC19、pET22b(+)等，优选为pJK3。

以pJK3为出发载体构建的重组酿酒酵母分泌表达载体命名为pJK3-MS。其核苷酸序列如序列表中序列4所示。

所述重组酿酒酵母分泌表达载体pJK3-MS的构建方法，可包括以下步骤：

1）扩增酿酒酵母MF-α信号肽基因:以酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）菌株INVSC1的菌体裂解液为模板，在引物T1：5'

-GGGGTACCATGAGATTTCCTTCTATTTTTACTGC-3'(含KpnI酶切位点)和T2：

5'-CGGGATCCTCTTTTATCCAAAGAAACACCT-3'(含BamHI酶切位点)的引导下PCR扩增MF-α信号肽基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；

2）扩增hCu/Zn-SOD基因：提取人胃组织总mRNA，然后RT-PCR扩增出其总cDNA作为PCR模板，在引物I1：5'-CGGGATCCGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGCT-3'(含BamHI酶切位点)和I2：5'-GCTCTAGAGAATGTTTATTGGGCGATCC-3'（含XbaI酶切位点）的引导下PCR扩增hCu/Zn-SOD基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示；

3）构建克隆载体pJK-MS：将酿酒酵母MF-α信号肽基因和hCu/Zn-SOD基因连接入克隆载体pJK19中，得到携带酿酒酵母MF-α信号肽基因和hCu/Zn-SOD基因的克隆载体pJK-MS，hCu/Zn-SOD融合基因（由酿酒酵母MF-α信号肽基因和hCu/Zn-SOD基因构成）的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

3）构建重组酿酒酵母分泌表达载体：将克隆载体pJK-MS与载体pJK3经KpnI和XbaI进行双酶切后，将酿酒酵母MF-α信号肽基因和hCu/Zn-SOD基因连接入酿酒酵母分泌型表达载体pJK3中，得到用于分泌表达hCu/Zn-SOD的重组酿酒酵母分泌表达载体pJK3-MS，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。

本发明另一目的，在于提供所述SOD-酿酒酵母重组表达载体在制备活性美容产品中的应用。该应用为用所述SOD-酿酒酵母重组表达载体转化酿酒酵母，并将转化菌作为活性成分加入美容产品中制备得到活性美容产品。

本发明的另一个目的是提供一种可分泌表达超氧化物歧化酶的工程酿酒酵母，是转化有SOD-酿酒酵母重组表达载体的SOD重组酿酒酵母。

所述酿酒酵母为适于蛋白表达的酿酒酵母菌株，如INVSC1。

将酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母的方法可为生物工程领域中常用的转化方法，如醋酸锂法、热激法、电转化法、接合转化法PEG介导的原生质体转化法等。

以INVSC1为出发菌株，构建的转化有重组酿酒酵母分泌表达载体pJK3-MS的工程酿酒酵母命名为pJK3-MS/INVSC1。

本发明还提供了一种在酿酒酵母中分泌表达超氧化物歧化酶的方法，包括在培养基（例如YPD培养基）中发酵上述转化有重组酿酒酵母分泌表达载体（例如pJK3-MS/INVSC1），得到高活性的超氧化物歧化酶的过程。

发酵重组酿酒酵母时需加入诱导剂半乳糖，所加入诱导剂半乳糖的浓度为20g/L，诱导温度为30℃，诱导时间为24-48小时。

本发明另一目的，在于提供所述工程酿酒酵母在制备活性美容产品中的应用。该应用时将所述工程酿酒酵母（也称“SOD重组酿酒酵母”）作为活性成分加入美容产品中制备得到活性美容产品。

所述活性美容产品中，所述SOD重组酿酒酵母分泌产生的SOD活性基质也为其中的活性成分。美容产品可以为面膜、沐浴液等。

以上所述工程酿酒酵母（例如，重组酿酒酵母pJK3-MS/INVSC1）在制备用于美容产品中的SOD活性基质中的应用也属于本发明内容。

所述SOD活性基质，是将所述工程酿酒酵母（例如pJK3-MS/INVSC1）在YPD半乳糖诱导培养基里进行30℃培养，在该酿酒酵母生长至对数期（约16-18h，OD:1.3-1.5)，经Westernblot验证SOD表达，得到SOD活性基质；所述YPD半乳糖诱导培养基为由以下组分组成的水溶液：按重量1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖；半乳糖的浓度为20g/L。

本发明还提供一种将生物活性因子（例如SOD）通过生物工程方法让其在酿酒酵母表达并直接作用于人体的化妆品制作方法，生物活性因子通过生物工程的方式在酿酒酵母里表达并应用于面膜等化妆品，并通过以下几个步骤应用于人的皮肤：用前活化、体温孵育、即时表达、直接作用。

本发明首次利用酿酒酵母交配因子（MF）α的分泌信号肽序列与铜锌超氧化物歧化酶（hCu/Zn-SOD）cDNA融合构建了分泌表达载体，实现hCu/Zn-SOD在酿酒酵母中的克隆和分泌表达，通过蛋白质免疫印迹分析结果证明，酿酒酵母工程菌株均表达了具有天然免疫原性的hCu/Zn-SOD；采用负染色定位法测定SOD活性，通过比较活性胶发现，所构建的工程菌除表达其自身的SOD外，还可以在人体温范围内直接分泌表达有活性的外源性hCu/Zn-SOD，表达产物可直接应用于化妆品等领域，发挥其抗氧化、抗衰老等功能，本发明酵母工程菌株的成功构建为开发hCu/Zn-SOD的基因工程产品奠定了良好的基础，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为重组酿酒酵母分泌表达载体pJK3-MS构建方法的示意图

图2为PCR扩增的酿酒酵母MF-α信号肽基因（泳道1）和hCu/Zn-SOD基因（泳道2）的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图3为重组酿酒酵母分泌表达载体pJK3-MS的KpnI和XbaI双酶切鉴定结果

图4A为实施例3中培养上清SDS-PAGE结果：M为蛋白分子量标准；泳道1为未诱导的pJK3-MS/INVSC1培养上清蛋白；泳道2为诱导的pJK3-MS/INVSC1培养上清蛋白。

图4B为实施例3中培养上清Western-blot结果：M为蛋白分子量标准；泳道1为未诱导的pJK3-MS/INVSC1培养上清蛋白；泳道2为诱导的pJK3-MS/INVSC1培养上清蛋白。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》（Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor）。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：SOD-酿酒酵母重组表达载体的构建

以构建重组酿酒酵母分泌表达载体pJK3-MS为例说明SOD-酿酒酵母重组表达载体的构建过程。

如图1所示，以pJK3为出发载体构建重组酿酒酵母分泌表达载体pJK3-MS，具体构建方法可包括以下步骤：

1）扩增酿酒酵母MF-α信号肽基因:以酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）菌株INVSC1（购自Invitrogen公司）的菌体裂解液为模板，在引物T1：5'

-GGGGTACCATGAGATTTCCTTCTATTTTTACTGC-3'(含KpnI酶切位点)和T2：

5'-CGGGATCCTCTTTTATCCAAAGAAACACCT-3'(含BamHI酶切位点)的引导下PCR扩增MF-α信号肽基因，PCR反应体系为：模板1-100ng，引物1（10uM）0.5uM，引物2（10uM）0.5uM，dNTP(10mM)1mM，聚合酶5-10U，聚合酶缓冲液(10*)10倍稀释，25微升体系，不足用水补足所需体积。PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸40s,35个循环；最后72℃延长10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2（泳道M．DNAMarkerIII；泳道1.PCR扩增的酿酒酵母MF-α信号肽基因）所示，经PCR扩增获得了255bp的酿酒酵母MF-α信号肽基因，与预期结果相符。

将255bp的酿酒酵母MF-α信号肽基因连接入pMD18-Ｔ载体（载体的构建详见《分子克隆》）中，将重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对重组菌株进行序列测定，测序结果表明经PCR扩增获得了序列正确的酿酒酵母MF-α信号肽基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。

2）扩增hCu/Zn-SOD基因：

用QIAGEN公司的RneasyMinikit提取人胃组织总mRNA，然后用CASsuperTWO-STEPRT-PCRkit（购自天根生化科技（北京）有限公司）扩增出其总cDNA，再以总cDNA作为PCR模板，在引物I1：5'-CGGGATCCGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGCT-3'(含BamHI酶切位点)和引物I2：5'-GCTCTAGAGAATGTTTATTGGGCGATCC-3'（含HindⅢ酶切位点）的引导下PCR扩增hCu/Zn-SOD基因，PCR反应体系为：模板1-100ng，引物1（10uM）0.5uM，引物2（10uM）0.5uM，dNTP(10mM)1mM，聚合酶5-10U，聚合酶缓冲液(10*)10倍稀释，25微升体系，不足用水补足所需体积。PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延长10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2（泳道M．DNAMarkerIII；泳道1.PCR扩增的MF-α信号肽基因；泳道2.PCR扩增的hCu/Zn-SOD基因）所示，经PCR扩增获得了465bp的hCu/Zn-SOD基因，与预期结果相符。再将465bp的hCu/Zn-SOD基因连接入pMD18-Ｔ载体（购自Invitrogen公司）中，将重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对重组菌株进行序列测定，测序结果表明经PCR扩增获得了序列正确的hCu/Zn-SOD基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。

3）构建克隆载体pJK-MS：将酿酒酵母MF-α信号肽基因和hCu/Zn-SOD基因连接入克隆载体pJK19（购自Invitrogen公司）中，得到携带酿酒酵母MF-α信号肽基因和hCu/Zn-SOD基因的克隆载体，命名为pJK-MS。连接体系为：载体pJK19、MF-α信号肽基因和hCu/Zn-SOD基因共10.0μL，ddH₂O7.0μL，10×缓冲液2.0μL，T4连接酶1.0μL，总体积20.0μL。连接条件为37℃反应2h。

4）构建重组酿酒酵母分泌表达载体：将克隆载体pJK-MS与载体pJK3（购自Invitrogen公司）经KpnI和XbaI进行双酶切后，将酿酒酵母MF-α信号肽基因和hCu/Zn-SOD基因连接入酿酒酵母分泌型表达载体pJK3中，将重组载体用KpnI和XbaI进行双酶切鉴定，鉴定结果如图3（泳道M．DNAMarkerIV；泳道1．pJK3-MS/KpnI+XbaI）所示，经酶切获得了741bp和5900bp的DNA片段，与预期结果相符，再对重组表达载体进行测序，酿酒酵母MF-α信号肽和hCu/Zn-SOD融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示，重组表达载体的核苷酸序列如序列表中序列4所示，表明获得了序列及插入位置均正确的用于分泌表达hCu/Zn-SOD的重组酿酒酵母分泌表达载体，命名为pJK3-MS。

用于构建重组酿酒酵母分泌表达载体的出发载体可为任意一种可在酿酒酵母中分泌表达外源基因的真核表达载体，除pJK3外，还可以为pMD18-Ｔ、pUC19、pET22b(+)等，本领域技术人员可参考以上步骤过程得到多种SOD-酿酒酵母重组表达载体，在此不一一赘述。

实施例2：SOD重组酿酒酵母的构建

以构建可分泌表达超氧化物歧化酶的工程酿酒酵母pJK3-MS/INVSC1为例说明SOD重组酿酒酵母的构建过程。

以INVSC1（购自Invitrogen公司）为出发菌株，构建转化有重组酿酒酵母分泌表达载体pJK3-MS的工程酿酒酵母，转化方法为醋酸锂法，具体操作可为：

1.挑一环酵母菌（以INVSC1为例）接种于5mLYPD培养基(由以下组分组成的水溶液：按重量，1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖。)中，30℃、200rpm培养过夜，得到一级种子；

2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约5h(OD:0.5-0.8)，得菌液；

3.将两瓶菌液合并，于4℃、5000rpm、5min离心收集得菌体；

4.25mL冰无菌水洗涤菌体两次，离心条件与步骤3相同；

5.向洗涤后菌体中加入1mL0.1M醋酸锂悬浮，再离心收集菌体；

6.再用0.5mL0.1M醋酸锂悬浮菌体（菌体为感受态细胞），以50μl/管分装于EP管中，置于冰上备用；

7.依次向上述50μl感受态细胞中加入50wt％的PEG3350溶液240μl、1MLiCl溶液36μl、转化DNA（5-10μg，即构建好的质粒pJK3-MS）溶液50μl；剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；

8.将混匀菌体在30℃水浴孵育30min；再在42℃水浴热休克20-25min；

9.13000rpm离心30s收集沉淀得到菌体，将其重悬于1mlYPD培养基，30℃摇床孵育4h；

10.再次离心收集沉淀菌体，去除约800μl上清液，然后按每100μl/板进行涨涂板。得到了可分泌表达超氧化物歧化酶的工程酿酒酵母，命名为pJK3-MS/INVSC1。

可用同样方法转化其它酿酒酵母菌株，如酵母菌株pYES-MS/INV，同样可以得到其它SOD重组酿酒酵母，在此不一一赘述。

实施例3：在酿酒酵母中分泌表达超氧化物歧化酶及其活性检测

将工程酿酒酵母pJK3-MS/INVSC1接种于两个5mLYPD培养基中，一个加入诱导剂半乳糖的浓度为20g/L，诱导温度为30℃，诱导时间为24-48小时；另一个为阴性对照不添加诱导剂半乳糖，培养温度为30℃，培养时间为24-48小时。培养结束后，取各培养上清进行15％SDS-PAGE电泳、蛋白质免疫印迹（Western-blot）。结果分别如图4A–图4B（M为蛋白分子量标准；泳道1为未诱导的pJK3-MS/INVSC1培养上清蛋白；泳道2为诱导的pJK3-MS/INVSC1培养上清蛋白。）所示，培养上清蛋白电泳可以见到泳道2在19kD处有一明显的表达条带；蛋白质免疫印迹分析结果（图4B）表明，本发明菌株表达了具有天然免疫原性的hCu/Zn-SOD，表明成功构建了具有生物活性的hCu/Zn-SOD表达酿酒酵母。

实施例4：SOD重组酿酒酵母胞外表达超氧化物歧化酶的应用条件优化

1、用于美容面膜培养基的组成

用于美容面膜的培养基确定为YPD半乳糖诱导培养基，其为含有以下成份的水溶液：按重量，1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖；半乳糖的浓度为20g/L。

2、用于美容面膜中SOD重组酿酒酵母生长时间的选择

为了保证用于美容面膜培养基营养成份的充分利用，选择在酿酒酵母生长至对数期，也就是约生长16-18h后用于面膜的制作，此时酿酒酵母生长状态较好，同时也有足够的营养成份，可以保证在用于面膜时能够充分发挥所表达SOD的活性。

3、用于美容面膜中SOD重组酿酒酵母浓度的选择

一般酿酒酵母生长16-18h后其OD值可以达到1.3-1.5，这个浓度确定为用于美容面膜中SOD重组酿酒酵母的浓度，在使用时其OD值需要达到1.3-1.5。

4、美容面膜辅料的选择

酿酒酵母在培养基中生长至OD值1.3-1.5后，成为SOD活性基质，此时选择蜂蜜为辅料制成美容面膜，蜂蜜用量不限，以能涂抹为标准，通常用量可为5wt%-15wt％。

实施例5：SOD重组酿酒酵母的应用

1、美容面膜：

1）将SOD重组酿酒酵母（例如pJK3-MS/INVSC1）在YPD半乳糖诱导培养基（由以下组分组成的水溶液：按重量1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖；半乳糖的浓度为20g/L）里进行30℃培养，在该酿酒酵母生长至对数期（约16-18h，用Westernblot验证SOD表达OD:1.3-1.5)，得到SOD活性基质；

2）向该SOD活性基质中添加蜂蜜使其(蜂蜜)浓度为10wt％，搅匀后-20℃冷冻保存，成为美容面膜。

使用时将该美容面膜于室温复苏半小时，然后将其直接涂布于面部，可保持0.5-1小时。保持过程中在面部的体温（32-36℃）条件下，美容面膜中重组酿酒酵母在皮肤表面进行SOD表达，此时分泌于面部的SOD具有100％的活性，并能充分发挥其的生物功能。

2、其它美容产品：用上述美容面膜的方法也可以制作沐浴产品，比如沐浴液。制作方法如上，与上述步骤1）相同的方法得到SOD活性基质，然后将其加入美容产品（如沐浴液）的常规原料当中，-20℃冷冻保存，成为活性SOD美容产品。

使用时同样在室温下复苏半小时，然后按常规美容产品使用。

本发明以该实施例提供了一种活性美容产品的制作及使用方法。制作方法包括：通过生物工程的方式使生物活性因子（例如SOD）在酿酒酵母里表达，将其添加至美容产品中形成活性美容产品；使用方法包括：将该活性美容产品用前活化，涂于人体皮肤利用体温孵育、即时表达，表达得到的生物活性因子直接作用于人体皮肤。

Claims (7)

1.一种SOD活性基质，将工程酿酒酵母pJK3-MS/INVSC1在YPD半乳糖诱导培养基里进行30℃培养，在该酿酒酵母生长至对数期即16-18h，OD:1.3-1.5，经Westernblot验证SOD表达，得到SOD活性基质；

所述YPD半乳糖诱导培养基为由以下组分组成的水溶液：按重量1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖；半乳糖的浓度为20g/L；

所述工程酿酒酵母pJK3-MS/INVSC1是以INVSC1为出发菌株构建的转化有序列表中序列4表示的重组酿酒酵母分泌表达载体pJK3-MS的重组酿酒酵母。

2.权利要求1所述SOD活性基质在制备活性美容产品中的应用，制备包括将SOD活性基质添加至常规美容产品中，并在-20℃冷冻保存。

3.一种活性美容产品，由权利要求1所述SOD活性基质与常规美容产品原料组成，且在-20℃冷冻保存。

4.根据权利要求3所述的活性美容产品，特征在于其为活性美容面膜，由所述SOD活性基质和蜂蜜组成，其中蜂蜜在活性美容面膜中含量为5wt％-15wt％。

5.根据权利要求4所述的活性美容产品，其特征在于，蜂蜜在活性美容面膜中含量为10wt％。

6.权利要求3或4或5所述活性美容产品的使用方法，包括通过以下几个步骤应用于人的皮肤：用前活化、体温孵育、即时表达、直接作用。

7.根据权利要求6所述活性美容产品的使用方法，其特征在于，包括：将该活性美容产品用前活化，涂于人体皮肤利用体温孵育、即时表达，表达得到的SOD直接作用于人体皮肤。