CN104673802A - 一种编码irisin蛋白的核酸分子以及利用该核酸分子高效表达irisin蛋白的方法 - Google Patents
一种编码irisin蛋白的核酸分子以及利用该核酸分子高效表达irisin蛋白的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种编码irisin蛋白的核酸分子以及利用该核酸分子高效表达irisin蛋白的方法，属于生物工程技术领域，对目的基因进行优化；根据irisin氨基酸序列，首次合成高表达该蛋白的基因序列；构建表达载体；构建含有irisin基因的重组受体细胞；验证；表达；获得irisin蛋白。利用基因工程技术，优化基因序列设计，改良RNA二级结构，成功地构建了高效表达菌株，实现irisin在真核系统中的表达。通过基因工程菌的代谢发酵分泌irisin蛋白，对于肥胖症和糖尿病的治疗具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体地说是一种编码irisin蛋白的核酸分子以及利用该核酸分子高效表达irisin蛋白的方法。
背景技术
Irisin（鸢尾素）是2012年初由Pontus Bostrom团队发现的一种新的激素。研究发现，运动首先诱导骨骼肌表达PGC-1α，后者可促进FNDC-5基因的表达，随后FNDC5在体内被剪切转变为一种新的形势—irisin。其从骨骼肌合成分泌后，通过血液循环作用于白色脂肪细胞，使其转化为具有分解代谢脂肪特征的棕色脂肪细胞，脂肪分解代谢产生的能量以热的形式散发。
Moreno - Navarrete 研究标明，Irisin可诱导人体脂肪组织棕色化，从而改善脂肪组织的功能并增加FNDC-5基因的表达，因而irisin在脂肪组织的生成形成了正反馈。另外，还发现irisin可促进糖脂代谢，以增加能量消耗、降低体质量。Irisin促进白色脂肪组织棕色化，并产生致热作用，可以靶向治疗肥胖及肥胖相关代谢疾病，从而减低Ⅱ型糖尿病（T2DM）的危险因素。
胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损是导致T2DM发生、发展的主要因素。Irisin可能通过以下方面来增强外周组织(骨骼肌、脂肪组织)及肝脏对胰岛素作用的敏感性，同时对胰岛β细胞也可能具有保护作用。
研究表明irisin作为AMPK激活后PGC-1α的表达产物，可能参与了BCL2所调控的骨骼肌细胞内自噬作用，从而增加骨骼肌的胰岛素敏感性。
研究表明irisin很可能通过抑制FSP27的表达来改善脂肪组织对胰岛素的敏感性。
研究表明irisin可能通过上调肝内纤维母细胞生长因子21（FGF21）来改善肝脏的胰岛素敏感性。
Irisin具有明显减肥和改善胰岛素抵抗作用，而且小鼠和人体irisin的同源性为100%，这些研究为体外合成irisin重组蛋白做为运动激素，去发挥运动产生的功能、减肥降糖提供了可能。重要的是，肥胖、T2DM患者体内irisin水平都较低，提示这种由PGC-1α促分泌的激素irisin将可能成为人类治疗肥胖、T2DM等相关代谢性疾病的有效蛋白质类药物。
如何制得编码irisin的核酸分子和获得该编码irisin的核酸分子的高效表达产物是现代化生物医学亟待解决的一项重要课题。
发明内容
本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种编码irisin蛋白的核酸分子以及利用该核酸分子高效表达irisin蛋白的方法。
本发明的技术方案是按以下方式实现的，一种编码irisin蛋白的核酸分子，其序列为以下核苷酸序列之一：
（1）SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；
（2）SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或多个核苷酸的具有至少40%序列一致性的同源序列；
（3）在严格条件下，与（1）或（2）的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
（4）由于遗传密码子的简并性区别于（3）的核苷酸序列的核苷酸序列。
一种irisin蛋白，其序列为以下氨基酸序列之一：
（1）SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；
（2）SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或多个氨基酸的具有至少40%序列一致性的同源序列。
一种扩增irisin蛋白的核酸分子的核苷酸序列所设计的引物，上游引物和下游引物的序列分别为以下核苷酸序列：
上游引物 EcoRI-F: SEQ ID NO. 3；
下游引物 XbaI-R: SEQ ID NO. 4。
上游引物 EcoRI-F 的序列中包含有EcoRI限制性酶切位点；
下游引物 XbaI-R的序列中包含有 XbaI限制性酶切位点。
一种重组质粒，该重组质粒的核苷酸序列包含有SEQ ID NO. 1。
一种重组受体细胞，该重组受体细胞中包含有上述的重组质粒。
该重组受体细胞中含有的重组质粒能够表达SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白。
一种利用编码irisin蛋白的核酸分子高效表达irisin蛋白的方法，其方法步骤是：
（一）优化：
根据最终所表达选取的是受体细胞的类型，则对目的基因进行优化；
密码子优化：
由于宿主中可能包含抑制目的蛋白表达的因子，缺乏识别常用的密码子tRNA，故在外源宿主中很难高表达，通过保持密码子的使用频率与同源tRNA之间的平衡、将目的基因低利用率密码子替换为宿主受体细胞常用密码子、去除低利用率的密码子或者容易被误读为终止信号的密码子优化基因设计，获得能够在受体细胞中具有较高蛋白表达量的基因序列；
获得优化的irisin基因序列 SEQ ID NO. 1 ；
RNA二级结构优化：
由于N端核苷酸序列的蛋白表达对于低利用率密码子和接近起始位点的密码子AUG非常敏感，翻译与mRNA的稳定性间也存在着相互的影响，稳定mRNA二级结构和接近5'端的分子也对基因表达有重要的影响，通过对RNA二级结构、翻译起始位点的优化，消除RNA的发卡的结构，平衡GC和AT的分布，最终获得高表达量的基因重组受体细胞菌株；
（二）构建表达载体：
Irisin基因的DNA和pfu聚合酶用于PCR反应中，根据irisin基因的5，和3，的序列设计引物，
上游引物 EcoRI-F: SEQ ID NO. 3；
下游引物 XbaI-R: SEQ ID NO. 4；
上游引物、下游引物中还分别含有EcoRI和XbaI限制性酶切位点，将irisin基因的PCR产物克隆到pPICZαA载体中，得到重组质粒pPICZ-Iri；
（三）构建含有irisin基因的重组受体细胞：
将具有irisin基因的重组质粒pPICZ-Iri转化到受体细胞中，从重组受体细胞转化子中提取质粒验证重组受体细胞中表达的irisin蛋白为SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列：
（四）验证：
验证重组受体细胞所表达的irisin蛋白序列；
（五）表达：
被转化的重组受体细胞在30℃±5℃环境，在含有质量浓度0.1%～5%的甲醇的细胞培养基中培养，离心，收集上清液，获得irisin蛋白。
所述的受体细胞采用毕赤酵母。
所述的验证步骤是：
提取重组受体细胞中的质粒，可以通过以下两方面中的任一或共同验证重组受体细胞中表达的irisin蛋白为SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列：
（1）一方面：以所提质粒为模板, 特异性引物EcoRI-F, XbaI-R扩增irisin基因，进行测序，确定和验证目的基因的序列；
（2）另一方面：用所提质粒转化大肠杆菌DH5α中，提取质粒，通过EcoRI和 XbaI双酶切，同时将提取的质粒进行测序，确定和验证目的基因的序列。
所述irisin蛋白在制备防治肥胖症的药物中应用
所述irisin蛋白在制备防治Ⅱ型糖尿病相关代谢性疾病的药物中应用。
本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：
一种编码irisin蛋白的核酸分子以及利用该核酸分子高效表达irisin蛋白的方法，利用基因工程技术，优化基因序列设计，改良RNA二级结构，成功地构建了高效表达菌株，首次实现irisin在真核系统中的表达。通过基因工程菌的代谢发酵分泌irisin蛋白。Irisin蛋白是由111个氨基酸残基组成的N-糖基化蛋白质激素，分子量约为32KDa，去糖基化后分子量约为12KDa。Irisin必将是一个很有前景的活性因子，并成为代谢性疾病及其伴发症防治的新靶点。对于肥胖症和糖尿病的治疗具有重要的意义。
附图说明
附图1是本发明的技术路线示意图；
附图2是本发明的irisin蛋白进行纯化，SDS-PAGE电泳结果示意图；
附图3是本发明的发酵过程中，不同浓度的甲醇诱导irisin蛋白表达量的变化坐标示意图。
具体实施方式
下面对本发明的一种编码irisin蛋白的核酸分子以及利用该核酸分子高效表达irisin蛋白的方法作以下详细说明。
本发明的一种编码irisin蛋白的核酸分子以及利用该核酸分子高效表达irisin蛋白的方法：
优化：由于最终所表达选取的是受体细胞采用毕赤酵母，则对目的基因进行优化。
密码子优化：
由于宿主中可能包含抑制目的蛋白表达的因子，缺乏识别人体常用的密码子tRNA，故在外源宿主中很难高表达。通过保持密码子的使用频率与同源tRNA之间的平衡、将目的基因低利用率密码子替换为宿主毕赤酵母常用密码子、去除低利用率的密码子或者容易被误读为终止信号的密码子等优化基因设计方法，获得了在毕赤酵母中具有较高蛋白表达量的基因序列。
RNA二级结构优化：
由于N端核苷酸序列的蛋白表达对于低利用率密码子和接近起始位点的密码子AUG非常敏感。翻译与mRNA的稳定性间也存在着相互的影响，稳定mRNA二级结构和接近5'端的分子也对基因表达有重要的影响。通过对RNA二级结构、翻译起始位点的优化，消除RNA的发卡的结构，平衡GC和AT的分布，最终获得高表达量的基因重组毕赤酵母菌株。另外，研发人员发现，RNA的二级结构对蛋白量的表达具有决定的作用。
通过密码子优化，RNA二级结构优化，获得新的irisin基因序列（SEQ ID NO.1），Irisin氨基酸序列（SEQ ID NO.2）。
构建酵母表达载体：
Irisin的DNA和pfu聚合酶用于PCR反应中。用irisin基因的5，和3，的序列设计引物，还含有EcoRI和XbaI限制性酶切位点。PCR产物被重组到pPICZαA载体中，得到重组质粒pPICZ-Iri。
构建含有irisin基因的重组毕赤酵母：
将具有irisin基因的质粒pPICZ-Iri转化到毕赤酵母中。从重组毕赤酵母转化子中提取质粒验证重组细胞中表达的irisin为SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列：
采用试剂盒提取重组酵母菌中质粒，可以通过两方面验证重组细胞中表达的irisin为SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列：（1）以所提质粒为模板, 特异性引物EcoRI-F, XbaI-R（附件1）扩增irisin基因,（2）用所提质粒转化大肠杆菌DH5α中，提取质粒，EcoRI和 XbaI双酶切。同时将提取的质粒进行测序，确定目的基因的序列。
结果：
从重组毕赤酵母中提取的质粒测序结果表明：目的基因序列与SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列一致，该质粒PCR及酶切验证的结果也表明：SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列已被转入到毕赤酵母中，即重组细胞中表达的irisin为SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
表达：
Irisin蛋白胞外分泌，不需要细胞破碎。被转化的毕赤酵母细胞在30℃±5℃环境，在含有甲醇的酵母培养基中培养。离心，收集上清。SDS-PAGE电泳结果（见附图2）。
发酵条件的优化：
将含有irisin基因的重组毕赤酵母分别在甲醇浓度为0.5%、0.75%、1%、1.25%的毕赤酵母培养中发酵，取不同时间点的发酵液，SDS-PAGE电泳结果（见附图3）。结果表明：甲醇浓度为0.5%时，目的蛋白的表达量最多，以此甲醇浓度指导发酵过程中的补料。且在此浓度下，发酵时间144h时，目的蛋白表达量达到最多。甲醇质量百分比浓度范围为0.1%～5%，优选0.5%～1.25%。
在发酵液中添加甲醇，诱导目的蛋白irisin的表达。通过添加不同浓度的甲醇，测定目的蛋白的表达量的变化。以此，确定最佳的发酵条件。
Sequence Listing
<110>山东大学第二医院
<120>一种编码irisin蛋白的核酸分子以及利用该核酸分子高效表达irisin蛋白的方法
<160> 4
<170> PatentIn Version 3.3
<210> 1
<211> 336
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<221>
<222>
<223> Irisin基因
<400> 1
tctccatccg ctccagttaa cgttactgtt agacacttga aggctaactc cgctgttgtt 60
tcctgggatg ttttggagga cgaggttgtt atcggtttcg ctatctccca gcagaaaaag 120
gacgttagaa tgttgagatt catccaagag gttaacacta ctactagatc ctgtgctttg 180
tgggacttgg aagaggacac tgagtacatc gttcacgttc aggctatttc cattcagggt 240
caatctccag cttccgagcc agttttgttc aagactccaa gagaagctga gaagatggct 300
tccaagaaca aggacgaagt tactatgaag gaatag 336
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221>
<222>
<223> Irisin蛋白
<400> 2
Ser Pho Ser Ala Pho Val Asn Val Thr Val
1 5 10
Arg His Leu Lys Ala Asn Ser Ala Val Val
15 20
Ser Trp Asp Val Leu Glu Asp Glu Val Val
25 30
Ile Gly Phe Ala Ile Ser Gln Gln Lys Lys
35 40
Asp Val Arg Met Leu Arg Phe Ile Gln Glu
45 50
Val Asn Thr Thr Thr Arg Ser Cys Ala Leu
55 60
Trp Asp Leu Glu Glu Asp Thr Glu Tyr Ile
65 70
Val His Val Gln Ala Ile Ser Ile Gln Gly
75 80
Gln Ser Pho Ala Ser Glu Pho Val Leu Phe
85 90
Lys Thr Pho Arg Glu Ala Glu Lys Met Ala
95 100
Ser Lys Asn Lys Asp Glu Val Thr Met Lys
105 110
Glu
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<221>
<222>
<223>上游引物 EcoRI-F
<400> 3
atatggaatt ctctccatcc gctcca 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<221>
<222>
<223>下游引物 XbaI-R
<400> 4
acgttctaga ctattccttc atagta 26
Claims (10)
1.一种编码irisin蛋白的核酸分子，其特征在于其序列为以下核苷酸序列之一：
（1）SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；
（2）SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或多个核苷酸的具有至少40%序列一致性的同源序列；
（3）在严格条件下，与（1）或（2）的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
（4）由于遗传密码子的简并性区别于（3）的核苷酸序列的核苷酸序列。
2.一种irisin蛋白，其特征在于其序列为以下氨基酸序列之一：
（1）SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；
（2）SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或多个氨基酸的具有至少40%序列一致性的同源序列。
3.一种扩增irisin蛋白的核酸分子的核苷酸序列所设计的引物，其特征在于上游引物和下游引物的序列分别为以下核苷酸序列：
上游引物 EcoRI-F: SEQ ID NO. 3；
下游引物 XbaI-R: SEQ ID NO. 4。
4.根据权利要求3所述的一种扩增Irisin蛋白的核酸分子的核苷酸序列所设计的引物，其特征在于：
上游引物 EcoRI-F 的序列中包含有EcoRI限制性酶切位点；
下游引物 XbaI-R的序列中包含有 XbaI限制性酶切位点。
5.一种重组质粒，其特征在于该重组质粒的核苷酸序列包含有SEQ ID NO. 1。
6.一种重组受体细胞，其特征在于该重组受体细胞中包含有权利要求5所述的重组质粒。
7.根据权利要求6所述的一种重组受体细胞，其特征在于该重组受体细胞中含有的权利要求5所述的重组质粒能够表达SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白。
8.一种利用权利要求1所述的编码irisin蛋白的核酸分子高效表达irisin蛋白的方法，其特征在于该方法的步骤是：
（一）优化：
根据最终所表达选取的是受体细胞的类型，则对目的基因进行优化；
密码子优化：
由于宿主中可能包含抑制目的蛋白表达的因子，缺乏识别常用的密码子tRNA，故在外源宿主中很难高表达，通过保持密码子的使用频率与同源tRNA之间的平衡、将目的基因低利用率密码子替换为宿主受体细胞常用密码子、去除低利用率的密码子或者容易被误读为终止信号的密码子优化基因设计，获得能够在受体细胞中具有较高蛋白表达量的基因序列；
获得优化的irisin基因序列 SEQ ID NO. 1 ；
RNA二级结构优化：
由于N端核苷酸序列的蛋白表达对于低利用率密码子和接近起始位点的密码子AUG非常敏感，翻译与mRNA的稳定性间也存在着相互的影响，稳定mRNA二级结构和接近5'端的分子也对基因表达有重要的影响，通过对RNA二级结构、翻译起始位点的优化，消除RNA的发卡的结构，平衡GC和AT的分布，最终获得高表达量的基因重组受体细胞菌株；
（二）构建表达载体：
Irisin基因的DNA和pfu聚合酶用于PCR反应中，根据irisin基因的5，和3，的序列设计引物，
上游引物 EcoRI-F: SEQ ID NO. 3；
下游引物 XbaI-R: SEQ ID NO. 4；
上游引物、下游引物中还分别含有EcoRI和XbaI限制性酶切位点，将irisin基因的PCR产物克隆到pPICZαA载体中，得到重组质粒pPICZ-Iri；
（三）构建含有irisin基因的重组受体细胞：
将具有irisin基因的重组质粒pPICZ-Iri转化到受体细胞中，从重组受体细胞转化子中提取质粒验证重组受体细胞中表达的irisin蛋白为SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列：
（四）验证：
验证重组受体细胞所表达的irisin蛋白序列；
（五）表达：
被转化的重组受体细胞在30℃±5℃环境，在含有质量浓度0.1%～5%的甲醇的细胞培养基中培养，离心，收集上清液，获得irisin蛋白。
9.根据权利要求8所述的一种利用权利要求1所述的编码irisin蛋白的核酸分子高效表达irisin蛋白的方法，其特征在于：所述的受体细胞采用毕赤酵母。
10.如权利要求2所述的一种irisin蛋白在制备防治肥胖症的药物中或在制备防治Ⅱ型糖尿病相关代谢性疾病的药物中的应用。
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