CN101851620B - 利用食药用菌生产FGFs的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用食药用菌菌丝体生产FGFs的方法，以hFGFs基因为模板，并引入了Kpn I、Bgl II及凝血酶酶切位点，构建了FGFs食用菌表达载体p1390-35S-PIM-FGFs；用农杆菌介导的方法进行侵染食药用菌，生产的FGFs蛋白活性高于野生FGFs。该方法操作简单，遗传稳定，生产周期短、成本低、设备投资少，利于产业化生产。含FGFs的食用菌菌丝体或子实体，可直接用于保健品、化妆品、药品的生产，其营养、药用价值高，且无毒副作用。含FGFs的食用菌冻干粉水溶液加热后，呈胶体状，在创面上形成保护膜；加快皮肤粘膜损伤的恢复。

Description

利用食药用菌生产FGFs的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及利用无选择标记的食药用菌表达载体生产FGFs的方法。

背景技术

FGFs，在细胞的增值、变异和正常的生长上都是有效的调节剂，它参与病理中肿瘤的处理和转移，FGFs具有广泛的生物学活性，它来源于神经组织、垂体、肾上腺皮质、视网膜、黄体和胎盘等，能刺激所有源自中胚层的细胞以及许多源自神经外胚层和内胚层细胞的增生。在体内，FGFs对内皮细胞有趋化和促有丝分裂作用，促进血管形成；参与细胞过度增生和血管过度形成所引起的多种病理损害。FGFs被认为是刺激血管细胞增殖、迁移和分化的第一分子，是典型的血管生长因子。FGFs具有广泛的生物学效应。研究发现，FGFs对体外培养的成纤维细胞有促有丝分裂作用。FGFs参与创伤修复，可能是诱发毛细血管内皮细胞增殖，刺激内皮细胞迁移，诱发新毛细血管生长，增加毛细血管网络.使损伤组织血管化。FGFs还可促进成纤维细胞生长、增殖，促进皮肤再生。正常情况下，由于FGFs含量很低，伤口的自身修复是一个缓慢但非常协调的过程。目前，进行的重组人成纤维细胞因子开发，但均是用重组大肠杆菌或酵母发酵，每升发酵液最多达10-50mg FGFs纯品，加上发酵和纯化成本较高，致使FGFs价格依然很昂贵。所以，非常有必要再寻找一条新的、能够降低FGFs生产成本的途径。但目前FGF家族的成员大多是通过原核系统或部分真核系统表达出来的。

目前，对于外源蛋白的生产主要还是应用传统的原核生物反应器，及宿菌为原核生物主要是大肠杆菌。利用原核生物作为生物反应器具有成本高，表达产物在原核细胞中由于未能及时的正确折叠，在宿主胞浆内形成包涵体，即生物学活性的不溶性聚合体。虽然形成的包涵体的优点是可保护被表达的蛋白质免于遭受宿主细胞中蛋白酶的降解，并能够用离心方法很容易地将包涵体分离出来。但是为了得到有生物学活性的蛋白质产物，必须对包涵体进行变性-溶解-复性处理。这个过程一般要在反复试验的基础上完成，而且常常不能得到令人满足的产物回收率。为了解决这一难题，人们试图采用真核植物来表达药用蛋白，使蛋白质正确折叠和糖基化，以此维持蛋白质的生物学活性。

由于原核生物自身特点的限制，不能进行真核蛋白的加工，因而影响了蛋白的生物学活性。再加上成本高、分离纯化复杂、生产设备投资高等缺点，因此利用微生物作为反应器来生产外源蛋白并不能满足生产上的需要。因此，目前研究的热点集中在植物和动物反应器上。

利用转基因植物生产医用蛋白，近年越来越受到人们的关注，尽管利用转基因植物作为生物反应器生产外源蛋白克服了传统上以原核生物为反应器的一些缺点，例如，生产成本低，外源蛋白易表达，植物的安全性好等优点，但是利用植物作为反应器还存在着一些无法解决的难题，比如外源基因转化难、蛋白的表达量低，下游蛋白处理过程复杂，植物组织培养周期长、受体植物再生体系建立困难及环境安全释放等问题。

由于微生物、植物反应器具有以上的缺点，自上世纪八十年代末九十年代初提出以动物作为生物反应器生产医用蛋白以来，动物反应器一度取得了很大的进展。但是在目的基因的分离和改造，乳腺特异表达载体的构建及转基因关键技术上仍然存在缺陷，因此转基因动物常常出现繁殖力下降、胚胎早期死亡等各种生理缺陷。产品加工方面动物体内虽然可以对外源蛋白进行翻译后修饰，但由于牛、羊等家畜存在自身机体保护系统可对所有外源性物质产生排斥反应，如出现蛋白质水解等问题。伦理道德方面目前公众还不能完全接受基因在种间的转移的观念，很多人拒绝使用或食用转基因产品，加之转基因动物会给现有物种造成威胁的忧虑都将在不同程度上制约动物反应器的发展。

发明内容

本发明目的是提供一种含FGFs的食药用菌，它是通过以下方法获得的：

1)以hFGFs基因为模板，按照植物偏好的密码子将hFGFs碱基序列重新改造，并在引物中分别引入了Kpn I、Bgl II及凝血酶酶切位点，采用PCR搭桥法合成FGFs全长基因，酶切后插入pUC19载体，得植物偏好型质粒pUC19FGFs；

2)FGFs全长基因插入到含有CaMV35S启动子和甘露糖选择标记PIM的质粒pCABIM1390中，获得食药用菌表达载体p1390-35S-PIM-FGFs；

3)利用冻融法将质粒p1390-35S-PIM-FGFs转入农杆菌中；

4)用农杆菌介导的方法进行侵染食用菌丝体，获得含FGFs的食药用菌；

所述的食药用菌为金针菇、猴头或灵芝；

所述的引物为：

P1：5′CGGAATTCATTGAGGGAAGAGCTAACTACAAGAAGCCAAAG3′

P2：5′GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG3′

或

P3：5’-cggaattccttgttccacgtggatctccagctttgccagaggatgg-3’

P4：5’-ggaagatctttaagacttagcagacattggc-3’

或

P5：CGGGATCCGAATTCCCATGGATTGAGGGAAGGTGCAAC

P6：GCGGTACCACTAGTAGATCTTTAAGTAATAGCCATTGG；

所述的FGFs全长基因为植物偏好型FGFs，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，或植物偏好型bFGF其碱基序列如SEQ ID NO.3所示，或植物偏好型FGF-7其碱基序列如SEQ ID NO.5所示；

本发明又一个目的是提供利用食药用菌生产FGFs的方法，它是用上述制得的含FGFs的食药用菌，提取、分离FGFs融合蛋白，经凝血酶酶切、纯化。

本发明又一个目的是所述的一种含FGFs的食药用菌在化妆品生产和饲料添加剂以及制备治疗人和动物机体损伤药物中的应用；

本发明又一个目的是提供一种治疗皮肤粘膜损伤的药物，它是将上述含FGFs的食药用菌菌丝体或子实体的冻干粉和蒸溜水，按重量1∶1比例，研磨匀浆后，煮沸3min，制成胶体状食用菌冻干粉水溶液。

所述的含FGFs的食药用菌优选含FGFs的金针菇。

原核生物、酵母菌生物反应器所具有的优点，在植物和动物生物反应器中不具备，相反地，植物和动物生物反应器所具有的优点恰是原核生物、酵母菌生物反应器所没有的。而以食药用菌作为反应器恰恰同时具备了上述四种生物反应器的优点。

本发明利用食用菌菌丝体生产FGFs的方法，以hFGFs基因为模板，并引入了Kpn I、Bgl II及凝血酶酶切位点，构建了食用菌表达载体p1390-35S-PIM-FGFs；用农杆菌介导的方法进行侵染食用菌菌丝体，生产的FGFs蛋白活性高于野生FGFs。该方法表达载体的构建、遗传转化操作简单、容易，遗传稳定，由于采用农杆菌介导法，将含有外源蛋白基因的表达载体转化进经过液体培养后的菌球中，利用菌丝体在液体培养中繁殖快的特点可获得大量的转化子，因此蛋白的提取和纯化均采取类似与植物反应器表达蛋白的方法，明显提高了FGFs的表达量，并缩短生产周期，菌丝体培养所用培养基成分简单，生长速度快，可快速获得转化子，可以大规模进行人工栽培，生产周期短、成本低、设备投资少。

本发明一种含FGFs的食用药菌菌丝体，可直接用于保建品、化妆品、药品的生产，其营养、药用价值高，它既可大规模进行人工栽培生产子实体，也可应用发酵技术培养芽孢营养体，不论是菌丝体、子实体，还是芽孢都是可以直接食用或药用且无毒副作用。

本发明一种治疗皮肤粘膜损伤的药物，由于食用菌自身的特点，食用菌菌丝体冻干粉水溶液加热后，呈胶体状，在创面上形成保护膜，并提供损伤修复所需营养，FGFs融合蛋白对内皮细胞、成纤维细胞有趋化和促有丝分裂作用，促进毛细血管形成；加快皮肤粘膜损伤的恢复。

附图说明

图1本发明FGFs目的基因合成图。

图2重组质粒p1390-35s-FGFs部分酶切鉴定电泳图。

图3菌丝体液体培养图。

图4转化后的菌丝体在抗性培养基上的培养图。

图5抗性培养基上筛选出的转化子图。

图6抗性菌株的PCR检测图。

图7转基因阳性菌株的SDS-PAGE电泳图。

图8FGFs目的蛋白的Western检测图。

具体实施方式

实施例1 haFGF目的基因的获得

以haFGF基因为蓝图(模板)，首先按照植物偏好的密码子将haFGF碱基序列重新改造，设计合成了引物BFP1和BFP2，采用PCR搭桥法合成aFGF全长基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，酶切后插入pUC19载体，得植物偏好型质粒pUC19aFGF，测序正确后保存；

根据aFGF基因的序列，通过生物信息学分析软件Primier 5.0设计人工寡核苷酸扩增引物，在引物中分别引入了Kpn I、Bgl II及凝血酶酶切位点：

引物1(BFP1)：

5′CGGAATTCATTGAGGGAAGAGCTAACTACAAGAAGCCAAAG3′

引物2(BFP2)：

5′GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG3′

交由上海生工生物工程有限公司合成；以植物偏好型质粒pUC19aFGF，为模板，aFGF基因的PCR反应体系：

5×buffer        10μl

dNTP             4μl

引物1(BFP1)      1μl

引物2(BFP2)      1μl

模板             1μl

Star             0.5μl

水               32.5μl

总量             50μl

反应参数；

94℃             4min

94℃             10s

68℃             15s

72℃             40s

4℃              保存

25个循环

反应产物即包含有酶切位点的aFGF基因编码序列。用DNA胶回收试剂盒(北京bioteke公司)纯化回收，回收产物即为aFGF编码的全长基因(见附图1)。

将回收的PCR产物aFGF经Kpn I和Bgl II  酶切后连接到pUC19上，得到pUCaFGF；重组质粒pUCaFGF的DNA序列测序结果表明，本发明设计合成的aFGF核苷酸序列正确，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2 无选择标记的食药用菌表达载体的构建

实验室保存的质粒pCABIM1390含有CaMV35S启动子和甘露糖选择标记PIM，分别以Kpn I及Bgl II酶切后纯化回收，获得载体大片段，将得到的aFGF编码基因与其连接，构建食药用菌表达载体p1390-35S-PIM-aFGF，反应体系如下：

pCABIM1390载体大片段(Kpn I/Bgl II)    0.5μl

aFGF片段(Kpn I/Bgl II)                4.5μl

Solution I(DNA Ligation Kit Ver.2)    5μl

总体积                                10μl

16℃进行连接反应1小时。将10μl连接反应液加入到预先制备好的100μl感受态大肠杆菌DH5α中，将EP管置于冰浴中静置30min，然后将EP管转至42℃水浴中进行热击90s(此时静置，勿动)，立即将热击后的EP管置冰上静置5min，立即加入500μl新鲜LB培养液，37℃，150～180rpm摇床培养45～60min，然后取50～100μl培养液涂布于含50μg/ml kan的LB平板上，37℃过夜培养，挑取平板上长出的单菌落接种于含50μg/ml kan的5ml LB培养液中，37℃200rpm振荡培养过夜。用Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0试剂盒提取质粒，用Kpn I及Bgl II双酶切鉴定，将重组质粒命名为p1390-35S-PIM-aFGF(见附图2)。

实施例3 利用冻融法将目的基因转化进农杆菌

将p1390-35S-PIM-aFGF质粒DNA各1μl分别加入感受态农杆菌中；在液氮中冻藏5min；37℃水浴热击5min；加1ml LB培养液至离心管中于28℃摇床上，180rpm摇菌2～4小时；取50μl～100μl转化菌液涂布于含50μg/ml Kan、50μg/ml Str和100μg/ml Rif的LB平板上，于28℃培养2～3天，筛选转化子。利用冻融法将质粒p1390-35S-PIM-aFGF分别转化入农杆菌菌株LBA4404中；用PCR对转化菌落进行初步鉴定，并用酶切作进一步确定，经鉴定所得到阳性菌落即为含目的基因的转化菌株。

实施例4 菌丝体的培养及转化

将金针菇、猴头或灵芝菌丝体用PDA培养基固体培养，待菌丝体长满板后，转移至PDA液体培养基中培养(见附图3)，获得一定大小的菌球后用农杆菌介导的方法进行侵染，于含有抗性培养基上培养(见附图4)，筛选转化子(见附图5)；

菌丝体固体培养配方：

马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂25g，蒸馏水1000mL。

菌丝体液体培养条件：

马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。于全温摇瓶柜中220rpm，25℃培养。

实施例5 抗性菌丝体DNA的提取及检测

取一定量液体培养的菌球，用滤纸吸干液体培养基，用植物基因组试剂盒(北京bioteke公司)提取DNA，分别以aFGF基因的一对引物aFP1、aFP2，扩增目的基因aFGF基因，扩增aFGF基因的PCR反应条件为：94℃ 5分钟；98℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s，25个循环，72℃延伸7分钟，分别扩增出预期的(470bp)aFGF基因，重组表达载体经过测序鉴定，证实菌丝体中插入基因序列全部正确(见附图6)。

实施例6 aFGF融合蛋白的提取与分离

取新鲜的菌丝体或子实体，加液氮研成粉末，再加入提取缓冲液[50mmol/LTris·HCl(pH 7.5)，50mmol/L NaCl，400mmol/L蔗糖，5EDTA，1mmol/L DTT]研成匀浆，每0.5g菌丝体加入0.5mL蛋白提取缓冲液，煮沸3min，10000r/min离心10min(4℃)后，取上清液备用。

将aFGF融合蛋白溶于无菌水中，加入0.2U凝血酶，37℃酶切过夜。将酶切反应液上Harpin9-Sepharose CL-6B亲和层析柱，用平衡缓冲液(10mmol/LPBS，PH7.0，0.2mol/L NaCI)洗至基线，用含0.6mol/L NaCI的PBS缓冲液进行洗脱，收集活性峰，经SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色，BandScan软件分析得到FGFs纯品，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，纯度达98％。

实施例7 菌丝体或子实体中aFGF基因目的蛋白的Western检测及生物活性检测

Western检测

取实施例6制得的aFGF纯品，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后(见附图7)，经Western blot检测，说明aFGF已经在转基因菌丝体中表达，并具有FGFs蛋白的免疫原性。Western结果见附图8。

FGFs的生物活性检测

用MTT法测定纯化后aFGF蛋白和野生型aFGF对Balb/c3T3细胞的促分裂活性。结果表明，菌丝体表达aFGF蛋白与野生型活性相当，比野生型活性稍有提高。

实施例8

以hbFGF基因为蓝图(模板)，首先按照植物偏好的密码子将hbFGF碱基序列重新改造，设计合成了引物，采用PCR搭桥法合成bFGF全长基因，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示，酶切后插入pUC19载体，得植物偏好型质粒pUC19bFGF，测序正确后保存；

根据bFGF基因的序列，通过生物信息学分析软件Primier 5.0设计人工寡核苷酸扩增引物，在引物中分别引入了Kpn I、Bgl II及凝血酶酶切位点：

引物1(BFP3)：5’-cggaattccttgttccacgtggatctccagctttgccagaggatgg-3’

引物2(BFP4)：5’-ggaagatctttaagacttagcagacattggc-3’

其他重复实施例1、2、3、4、5和6。

实施例9

以hFGF-7基因为蓝图(模板)，首先按照植物偏好的密码子将hFGF-7碱基序列重新改造，设计合成了引物BFP5和BFP6，采用PCR搭桥法合成bFGF全长基因，其碱基序列如SEQ ID NO.5所示，酶切后插入pUC19载体，得植物偏好型质粒pUC19FGF-7，测序正确后保存；

根据FGF-7基因的序列，通过生物信息学分析软件Primier 5.0设计人工寡核苷酸扩增引物，在引物中分别引入了Kpn I、Bgl II及凝血酶酶切位点：

引物1(BFP5)：CGGGATCCGAATTCCCATGGATTGAGGGAAGGTGCAAC

引物2(BFP6)：GCGGTACCACTAGTAGATCTTTAAGTAATAGCCATTGG

其他重复实施例1、2、3、4、5和6。

取实施例8、9制得的提纯的目的蛋白的进行Western检测及生物活性检测，结果表明，与野生型活性相当，比野生型活性稍有提高。

实施例10

取实施例6、8或9制得的新鲜含FGFs的菌丝体或子实体，加液氮制成冻干粉末，冻干粉和蒸馏水按重量1∶1比例，研磨匀浆，煮沸3min制成胶体状含FGFs的食用菌冻干粉水溶液。

取健康家兔三只，乙醚麻醉后，剃净背部毛后，再用脱毛剂脱毛；十八小时后，割掉表皮和真皮，制作4处直径5mm，间隔50mm，呈正方形排列的伤口，压迫止血后，每只家兔选三处伤口，分别涂抹上述制得的含aFGF的金针菇、猴头或灵芝菌糊，含bFGF的金针菇、猴头或灵芝菌糊，含FGF-7的金针菇、猴头或灵芝菌糊，每天四次；每只家兔留一处伤口不给药，做对照。其结果见下表：

SEQUENCE LISTING

<110>吉林农业大学

<120>利用食药用菌生产FGFs的方法

<160>6

<210>1

<211>444

<212>DNA

<213>人工

<400>1

GAATTCATTG AGGGAAGAGC TAACTACAAG AAGCCAAAGT TGTTGTACTG CTCTAACGGA     60

GGACATTTCT TGAGAATTTT GCCAGATGGA ACTGTTGATG GAACTAGAGA TAGATCAGAT    120

CAACATATTC AATTGCAATT GTCTGCTGAG TCTGTTGGAG AGGTTTACAT TAAGTCTACT    180

GAGACTGGAC AATACTTGGC TATGGATACT GATGGATTGT TGTACGGATC TCAAACTCCA    240

AACGAGGAGT GCTTGTTCTT GGAGAGATTG GAGGAGAACC ATTACAACAC TTACATTTCT    300

AAGAAGCATG CTGAGAAGAA CTGGTTCGTT GGATTGAAGA AGAACGGATC TTGCAAGAGA    360

GGACCAAGAA CTCATTACGG ACAAAAGGCT ATTTTGTTCT TGCCATTGCC AGTTTCTTCT    420

GATTAAAGAT CTACTAGTGG TACC                                           444

<210>2

<211>408

<212>DNA

<213>人工

<400>2

ATGGCTAACT ACAAGAAGCC AAAGTTGTTG TACTGCTCTA ACGGAGGACA TTTCTTGAGA     60

ATTTTGCCAG ATGGAACTGT TGATGGAACT AGAGATAGAT CAGATCAACA TATTCAATTG    120

CAATTGTCTG CTGAGTCTGT TGGAGAGGTT TACATTAAGT CTACTGAGAC TGGACAATAC    180

TTGGCTATGG ATACTGATGG ATTGTTGTAC GGATCTCAAA CTCCAAACGA GGAGTGCTTG    240

TTCTTGGAGA GATTGGAGGA GAACCATTAC AACACTTACA TTTCTAAGAA GCATGCTGAG    300

AAGAACTGGT TCGTTGGATT GAAGAAGAAC GGATCTTGCA AGAGAGGACC AAGAACTCAT    360

TACGGACAAA AGGCTATTTT GTTCTTGCCA TTGCCAGTTT CTTCTGAT                 408

<210>3

<211>438

<212>DNA

<213>人工

<400>3

CCAGCTTTGC CAGAGGATGG AGGATCTGGA GCTTTCCCAC CAGGACATTT CAAGGACCCA     60

AAGAGATTGT ACTGCAAGAA CGGAGGATTC TTCTTGAGAA TCCATCCAGA TGGAAGAGTT    120

GATGGAGTTA GAGAGAAGTC TGATCCACAT ATTAAGTTGC AATTGCAAGC TGAGGAGAGA    180

GGAGTTGTTT CTATTAAGGG AGTTTGCGCT AACAGATACT TGGCTATGAA GGAGGATGGA    240

AGATTGTTGG CTTCTAAGTG CGTTACTGAT GAGTGCTTCT TCTTCGAGAG ATTGGAGTCT    300

AACAACTACA ACACTTACAG ATCAAGAAAG TACACTTCTT GGTACGTTGC TTTGAAGAGA    360

ACTGGACAAT ACAAGTTGGG ATCTAAGACT GGACCAGGAC AAAAGGCTAT TTTGTTCTTG    420

CCAATGTCTG CTAAGTCT                                                  438v

<210>4

<211>441

<212>DNA

<213>人工

<400>4

ATGCCAGCTT TGCCCGAGGA TGGTGGTAGC GGCGCCTTCC CGCCCGGCCA CTTCAAGGAC     60

CCCAAGCGGC TGTACTGCAA AAACGGGGGC TTCTTCCTGC GCATCCACCC CGACGGCCGA    120

GTTGACGGGG TCCGGGAGAA GAGCGACCCT CATATAAAGC TACAACTTCA AGCAGAAGAG    180

AGAGGAGTTG TGTCTATCAA AGGAGTGTGT GCTAACCGTT ACCTGGCTAT GAAGGAAGAT    240

GGAAGATTAC TGGCTTCTAA ATGTGTTACG GATGAGTGTT TCTTTTTTGA ACGATTGGAA    300

TCTAATAACT ACAATACTTA CCGGTCAAGG AAATACACCA GTTGGTATGT GGCACTGAAA    360

CGAACTGGGC AGTATAAGCT TGGATCCAAA ACAGGACCTG GGCAGAAAGC TATACTTTTT    420

CTTCCAATGT CTGCTAAGAG C                                              441

<210>5

<211>492

<212>DNA

<213>人工

<400>5

TGCAACGATA TGACTCCAGA ACAGATGGCT ACCAACGTGA ACTGCTCTTC TCCAGAGAGA     60

CATACTAGGT CTTACGATTA CATGGAAGGA GGAGATATTA GAGTTAGAAG ATTGTTCTGT    120

AGGACTCAAT GGTATCTTAG AATTGATAAG AGAGGAAAGG TTAAGGGAAC TCAAGAGATG    180

AAGAACAACT ACAACATTAT GGAGATTAGA ACTGTTGCTG TTGGAATTGT TGCTATTAAG    240

GGAGTTGAGT CTGAGTTCTA CCTTGCTATG AACAAGGAGG GAAAGTTGTA CGCTAAGAAG    300

GAGTGCAACG AGGACTGTAA CTTCAAGGAG CTTATTCTTG AGAACCATTA CAACACCTAC    360

GCTTCTGCTA AGTGGACTCA TAACGGAGGA GAGATGTTCG TTGCTCTTAA CCAAAAGGGT    420

ATTCCAGTTA GAGGAAAGAA GACTAAGAAG GAGCAAAAGA CTGCTCATTT CCTTCCAATG    480

GCTATTACTT AA                                                        492

<210>6

<211>495

<212>DNA

<213>人工

<400>6

ATGTGTAACG ATATGACTCC AGAGCAAATG GCTACTAACG TTAACTGTTC TTCTCCAGAG     60

AGACACACTA GATCTTACGA TTACATGGAA GGTGGTGATA TTAGAGTTAG AAGATTGTTC    120

TGTAGAACTC AATGGTACTT GAGAATTGAT AAGAGAGGTA AGGTTAAGGG TACTCAAGAG    180

ATGAAGAACA ACTACAACAT TATGGAAATT AGAACTGTTG CTGTTGGTAT TGTTGCTATC    240

AAGGGTGTTG AATCTGAATT CTACTTGGCT ATGAACAAGG AAGGTAAGTT GTACGCTAAG    300

AAGGAATGTA ACGAAGATTG TAACTTCAAG GAGTTGATCT TGGAGAACCA CTACAACACT    360

TACGCTTCTG CTAAGTGGAC TCACAACGGT GGTGAGATGT TCGTTGCTTT GAACCAGAAG    420

GGTATCCCAG TTAGAGGTAA GAAGACTAAG AAGGAACAGA AGACTGCTCA CTTCTTGCCA    480

ATGGCTATCA CTTAA                                                     495

Claims (5)

1.一种含FGFs的食药用菌，其特征在于，它是通过以下方法获得的：

1)以hFGFs基因为模板，按照植物偏好的密码子将hFGFs碱基序列重新改造，并在人工合成的引物中分别引入了Kpn I、Bgl II及凝血酶酶切位点，采用PCR搭桥法合成FGFs全长基因，酶切后插入pUC19载体，得植物偏好型质粒pUC19FGFs；

2)FGFs全长基因插入到含有CaMV35S启动子和甘露糖选择标记PIM的质粒pCABIM1390中，获得食药用菌表达载体p1390-35S-PIM-FGFs；

3)利用冻融法将质粒p1390-35S-PIM-FGFs转入农杆菌中；

4)用农杆菌介导的方法进行侵染食药用菌丝体，获得含FGFs的食药用菌；

所述的植物偏好型FGFs基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述的食药用菌为金针菇的菌丝体或子实体。

2.根据权利要求1所述的一种含FGFs的食药用菌，其特征在于：所述的人工合成的引物为：

P1：CGGAATTCATTGAGGGAAGAGCTAACTACAAGAAGCCAAAG

P2：GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG。

3.利用食药用菌生产FGFs的方法，其特征在于：将权利要求1或2所述的一种含FGFs的食药用菌，经提取、分离FGFs融合蛋白，并用凝血酶酶切、纯化。

4.权利要求1所述的一种含FGFs的食药用菌在制备治疗皮肤粘膜损伤药物中的应用。

5.一种治疗皮肤粘膜损伤的药物，其特征在于：是权利要求1或2所述的一种含FGFs的食药用菌的冻干粉和蒸溜水，按重量1∶1比例，研磨匀浆后，煮沸3min制成胶体状食药用菌冻干粉水溶液。

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