CN101768597A - 一种融合基因片段rolB-FGFs及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根据植物密码子的偏好性设计的FGFs基因组成；引入无抗生素标记的PIM基因、人分泌型碱性磷酸酶信号肽(SEAP)基因，构建了无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体，转化至发根农杆菌中，以植物作为宿主，采用发状根系统来表达FGFs，从发状根和培养液中分别纯化出具有活泩的FGFs，可产业化生产FGFs，提高了发状根诱导率、蛋白表达量、产率和稳定性，无抗生素标记，保护了环境；采用人参作为宿主生产的含FGFs人参发状根，具有人参和FGFs双重的药理作用，是一种较佳保健品及药品，用于功能性食品和药品的开发与应用具有广阔的前景。

Description

一种融合基因片段rolB-FGFs及应用

技术领域

本发明涉及生物领域，确切地说一种融合基因片段rolB-FGFs及应用。

背景技术

FGFs(fibroblast growth factors)，在细胞的增值、变异和正常的生长上都是有效的调节剂，它参与病理中肿瘤的处理和转移(Gaizie，et al，Biochem，Cell Biol，1997，75：669)。FGFs具有广泛的生物学活性，它来源于神经组织、垂体、肾上腺皮质、视网膜、黄体和胎盘等，能刺激所有源自中胚层的细胞以及许多源自神经外胚层和内胚层细胞的增生。在体内，FGFs对内皮细胞有趋化和促有丝分裂作用，促进血管形成；参与细胞过度增生和血管过度形成所引起的多种病理损害。FGFs被认为是刺激血管细胞增殖、迁移和分化的第一分子，是典型的血管生长因子。FGFs具有广泛的生物学效应。研究发现，FGFs对体外培养的成纤维细胞有促有丝分裂作用。FGFs参与创伤修复，可能是诱发毛细血管内皮细胞增殖，刺激内皮细胞迁移，诱发新毛细血管生长，增加毛细血管网络.使损伤组织血管化。FGFs还可促进成纤维细胞生长、增殖，促进皮肤再生。迄今为止，至少已经知道23个FGF家族的成员，其中aFGF和bFGF是FGF家族的典型成员，研究的比较成熟，但目前FGF家族的成员大多是通过原核系统或部分真核系统表达出来的，几乎很少通过植物系统表达，尤其是植物发状根系统。

近几年来，利用植物生物反应器表达生产具有临床应用价值的药用蛋白(包括疫苗、抗体)已成为生物制药产业的热点领域，具有极大的市场前景和商业价值，日益引起人们的关注.但植物生物反应器在研究的过程中，逐步发现许多问题，如蛋白产量低、下游加工(目的蛋白的提取纯化)困难以及由此而引起的高成本等.因此，结合植物自身结构特点，发展植物发状根表达系统，不但可以提高植物本身的次生代谢产物含量，同时可以省略下游加工过程，利于产业化开发，因此本发明采用植物发状根系统生产FGFs蛋白，这将结合医药与食品领域，开发出功能性食品与药品的一条重要途径。

利用分泌途径可以有效地提高外源蛋白的表达量。一般真核生物分泌蛋白N端都有信号肽序列，引导蛋白定位于内质网膜，经高尔基体加工后，运送到细胞的各个部位。在利用生物反应器表达外源蛋白的时候，外源蛋白可以在信号肽的引导下到达细胞的特定部位，或分泌到细胞外，这样可以避免宿主细胞把外源蛋白视为异己蛋白而降解，从而提高了外源蛋白的表达量。应用信号肽引导外源蛋白分泌表达也是近年来的研究热点。

转基因植物中标记基因的安全性从一开始就受到了广泛争论。人们担心在转基因作物的商品化种植过程中，除草剂基因可能经自然杂交，抗生素基因可能通过转染肠道细菌，从而造成自然界的非转基因作物对除草剂、人类对抗生素产生抗性。近年来，人们开始采用一种新型的正筛选方法——甘露糖筛选体系。该体系以大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因为标记基因，甘露糖为筛选剂进行筛选。目前，PMI/甘露糖筛选体系已成功用于甜菜、拟南芥、玉米、小麦、水稻、木薯等植物。

实验证明，发状根具有细胞培养和一般器官培养所不能兼备的特点，几乎所有双子叶植物中由根部合成的次生代谢物质都可以通过发状根来生产，这一生物技术为植物有用成分的大量生产提供了新的途径，日益引起人们的关注。发状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术，它将发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri质粒中的T-DNA整合到植物细胞的DNA上，诱导植物细胞产生发状根。发状根培养是获得有用次生代谢产物的重要途径。

对于任何一种类型的发根农杆菌而言，其菌体内部存在着大小各异的3种质体，例如：在A4菌株的菌体内，存在着pRiA4a、pRiA4b和pRiA4c3中质粒，其中pRiA4b质粒与发状根的诱发有关，它的物理结构见图1。从图1可以看出，农杆碱型Ri质粒有两个T-DNA区，即T_L-DNA和T_R-DNA，这两段T-DNA之间隔着一段15kb的非转移DNA。T_L-DNA大小为19～20kb，包括4个与发状根形态发生有关的位点：rolA、B、C、D，rolA基因在营养阶段和生殖阶段表达强烈，而在种子中不表达。rolB基因是形成毛状根的关键基因，其表达引起植株产生大量的毛状根。rolB基因主要限于在分生组织的原始细胞和韧皮部的薄壁组织细胞表达。rolC基因在烟草中表达导致植株变矮、顶端优势减弱、叶片色素含量下降、雄性不育。

自1973年Ackemann首次报道了发根农杆菌转化高等植物以来，迄今为止已经有160多种植物成功地利用Ri质粒进行了转化。90年代以来，培养珍贵药用植物发状根以获取次生代谢产物成为研究热点。由于发状根能够合成其他培养细胞或组织难于合成的植物次生代谢物，人们已将发状根培养系统用于药用植物次生代谢产物生产的研究。周立刚对露水草诱导发状根并获得发状根培养物，这是发状根诱导在单子叶植物中的一个成功先例(植物研究，1996，18(3)：336)。据报道，目前利用发状根农杆菌浸染获得转化植株或发状根的植物，主要集中在双子叶植物30余科40个属中(植物生理学通讯，2004(6)：29)。迄今为止，利用发状根农杆菌的遗传转化已在多种植物中取得成功。如康乃馨(Dianthuscaryophyllus L.)、长春(Catharanthus roseusL)、矮牵牛(Petunia)、金鱼草(A nti rrhinum maj us L)、亚美尼亚壶花(Muscari armeniacum)等的遗传转化系统已经建立并(或)获得了其转化再生植株(Bio Technology，1986，4：533O536)。目前，除利用发状根来生产药用植物的次生代谢物外，更多的研究集中在进行次生代谢物的生物转化和生产有价值的物质等。这一技术必将成为次生代谢产物生产的可靠有效途径，是大规模生产有用蛋白的重要途径之一(农业与技术，2007，27(3)：31)。尽管用培养发状根生产药物还有许多困难，但可以预见，随着发状根基础研究工作的深入和代谢工程的应用及培养技术的不断发展和完善，用发状根生产药物的时代即将来临，并最终可能导致传统的植物药生产方式发生重大的变革，为人类的医药保健事业提供取之不尽、用之不竭的资源。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根据植物密码子的偏好性设计的FGFs基因组成；

其碱基序列如SEQ ID NO.8(rolB-FGF1)或SEQ ID NO：9(rolB-FGF2)或SEQ IDNO.10(rolB-FGF7)所示。

本发明第二个目的是提供无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体，包含无抗生素标记的PIM基因、分泌型表达的信号肽基因SEAP和上述融合基因片段rolB-FGFs的pCAMBIA1390，表达载体名称pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs。

本发明第三个目的是提供一种发根农杆菌，它转化了无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs。

本发明第四个目的是提供含有FGFs植物发状根，它是下述方法生产的：

1)人工设计合成下述引物：

R1：GAATTCTTGAAGGAAAACTCTCCACC

R2：TTCTTGTAGTTAGCCATTTGTAGTCG

Fp1：CTTGTAGTTAGCCATGTAGTCGCA

Fp2：GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG

2)以发根农杆菌A4中的Ri质粒为模板，用引物R1、R2进行PCR扩增，获得rolB基因；以质粒PUC-FGFs为模板，用引物Fp1、Fp2，经PCR扩增，获得FGFs基因；

3)以获得的rolB基因和FGFs基因为模板，利用引物R1和Fp2，通过PCR搭桥法，将rolB基因与FGFs基因进行融合，获得融合基因rolB-FGFs；

4)SEAP信号肽分泌表达载体的构建，人工合成SEAP信号肽基因，两端引入kpn I、Nco I和BstB I、EcoR I酶切位点，与经kpn I和EcoR I双酶切的pCAMBIA1390-PIM载体进行连接；

5)将融合基因rolB-FGFs和经EcoR I和Bgl II双酶切，rolB-FGFs融合基因片段与pCAMBIA1390-PIM-SEAP经EcoR I和Bgl II双酶切后的载体大片段进行连接，构建重组的无选择标记的植物双元表达载体pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs；

6)无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs转化发根农杆菌A4中，活化含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒发根农杆菌A4；

7)含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒发根农杆菌感染植物，培养发状根；所述的植物为双子叶；

8)获得的含有FGFs的发状根进行大规模培养。

所述的植物优选人参、西洋参或丹参。

用步骤8)植物发状根及其培养液，分离纯化，生产FGFs。

所述的FGFs为FGF1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示或FGF2，其氨基酸序列如SEQID NO.5所示或FGF7，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述的rolB基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述的植物密码子的偏好性设计的FGFs基因为FGF1，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示，或FGF2，其碱基序列如SEQ ID NO.4所示，或FGF7，其碱基序列如SEQ ID NO.6所示；

本发明一种融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根据植物密码子的偏好性设计的FGFs基因组成；引入无抗生素标记的PIM基因、人分泌型碱性磷酸酶信号肽(SEAP)基因，构建了无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体，转化至发根农杆菌中，以植物作为宿主，采用发状根系统来表达FGFs，从发状根和培养液中分别纯化出具有活泩的FGFs，可产业化生产FGFs，提高了发状根诱导率、蛋白表达量、产率和稳定性，无抗生素标记，保护了环境；采用人参作为宿主生产的含FGFs人参发状根，具有人参和FGFs双重的药理作用，是一种较佳保健品及药品，用于功能性食品和药品的开发与应用具有广阔的前景。

附图说明

图1是农杆碱型发根农杆菌的Ri质粒物理结构图

图2是含有FGFs的发状根培养图

图3是含有FGFs的发状根鉴定图

图4是FGFs家族部分基因的western检测图

具体实施方式

实施例1：无抗生素标记的植物分泌型表达载体pCAMBIA1390-PMI-SEAP的构建

(1)SEAP信号肽寡核苷酸链的退火

对人工合成的SEAP信号肽基因序列(北京三博远志生物有限公司合成)进行了必要的修饰，即在SEAP信号肽基因编码序列正链和负链的5’和3’端分别加入了有利于后继序列连接的kpn I、Nco I和BstB I、EcoR I酶切位点。

正链：

5’-CATGTTGGGACCATGCATGCTTCTTCTCTTGCTTTTGCTCGGACTCCGTCTCCAACTCTCCCTAGGATCACTGTCAGACTAGTT-3’

负链：

5’-CGAACTAGTCTGACAGTGATCCTAGGGAGAGTTGGAGACGGAGTCCGAGCAAAAGCAAGAGAAGAAGCATGCATGGTCCCAA-3’

分别将合成的两条寡核苷酸链溶解于TE，使其终浓度为25μmol/L。

退火反应体系：正链 2.0μl

              负链 2.0μl

              NaCl(0.5mol/L) 6.0μl

              灭菌超纯水加至终体积 30μl

              85℃水浴3min，自然冷却至室温。

(2)SEAP信号肽基因片段与载体的连接

退火后的SEAP信号肽基因片段5’和3’端，分别有能与kpn I和EcoR I酶切位点，用kpn I和EcoR I双酶切载体pCAMBIA1390-PIM，酶切后的载体大片段用琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒回收，并用碱性磷酸酶去磷酸化，琼脂糖凝胶电泳定量后，16℃连接过夜。

连接反应体系如下：退火后的SEAP信号肽 DNA0.1～0.3pmol

                  去磷酸化的载体pCAMBIA1390-PIM 0.03pmol

                  10×连接缓冲液 1μl

                  T4DNA连接酶 1μl

                  灭菌超纯水加至终体积 10μl

(3)重组载体转化

①取一份冻存的感受态细胞冰上融化，加入上述步骤的连接产物，轻轻混匀。

②冰浴30min。

③将反应管放入预热至42℃的循环水浴中，放置90s，不要摇动。

④快速取出反应管并移置冰上1～2min。

⑤加入800μl YEB培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床中，振荡培养(220rpm)1h。

⑥取200μl已转化的感受态细胞涂布于含Kan(100μg/ml)的YEB琼脂平板上，37℃培养箱倒置培养12～16h。

实施例2：无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs的构建

在Genebank中查到rolB基因cDNA序列，利用在线软件Primer5.0和DNAStar设计引物，在上游引物R1中引入了EcoR I酶切位点，下游引物R2含有FGFs基因5’端的部分碱基；人工合成引物(由北京远志生物公司合成)

R1：GAATTCTTGAAGGAAAACTCTCCACC

R2：TTCTTGTAGTTAGCCATTTGTAGTCG

以发根农杆菌A4中的Ri质粒(由中国科学院长春左家特产研究所提供)为模板，经过PCR反应扩增出rolB基因的全长序列，PCR反应条件和体系如下(表1、表2)：

以FGFs的cDNA序列设计引物，上游引物Fp1含有rolB基因3’端的部分碱基，下游引物Fp2含有Bg1II酶切位点，人工合成引物(由北京远志生物公司合成)：

Fp1：CTTGTAGTTAGCCATGTAGTCGCA

Fp2：GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG

以质粒PUC-FGFs(本实验室构建保存，PUC空载体购自宝泰克公司)为模板，建立PCR反应体系(表3、表4)，经PCR扩增获得FGFs基因；

以rolB基因和FGFs基因为模板，利用R1和Fp2引物，通过PCR搭桥法，将rolB基因与FGFs基因进行融合，获得rolB-FGFs的融合基因，PCR反应条件如表5、表6，将rolB-FGFs融合基因和pCAMBIA1390-PIM-SEAP载体(本实验室保存，由东北师范大学王兴智老师赠予)经kpn I和Bgl II双酶切，将酶切后得到的rolB-FGFs融合基因片段与pCAMBIA1390-PIM-SEAP载体大片段进行连接，构建重组的无选择标记的植物双元表达载体pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs，见附图2。

实施例3：发根农杆菌A4介导人参遗传转化

无抗性标记的pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒DNA转入发根农杆菌A4：

取1μlpCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒DNA加入到100μl发根农杆菌A4感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴放置5min；置于液氮中冷冻5min；迅速转至37℃水浴锅中温育5min；加入1mlYEB培养基中，在28℃摇床上180rpm振荡培养4h；取适量菌液涂于含有链霉素50mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB固体培养基中，置于28℃培养24-48h，经抗性筛选、PCR检测和酶切检测获得带有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒DNA的发根农杆菌A4单菌落；含pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒发根农杆菌A4的活化：

从平板上挑取含pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒的发根农杆菌A4单菌落，接种到5mlYEB液体培养基中(含卡那霉素50～100mg/L，链霉素50～100mg/L)，振荡培养过夜，取100μl菌液接种到50mlYEB液体培养基中(含卡那霉素50～100mg/L，链霉素50～-100mg/L)，28℃，180rpm振荡培养至OD₆₀₀＝1，12000～18000rpm离心10min，菌体用YEB液体培养基重悬，使OD＝0.1～0.6；

人参的遗传转化：

将取生长健壮的2年生的人参(Panax ginseng C.A.Mey.)根用肥皂水洗净，70％酒精及0.1％氯化汞消毒，无菌水冲洗3次，将参根切成2～3mm的薄片，置于无激素的MS固体培养基上预培养1～2d。然后使用滴加法进行侵染，将菌液活化至OD600＝0.2～0.6，再将其稀释100倍后，用注射器滴加在外植体上5～8滴，或使用划刀法，待菌液活化至OD600＝0.2～0.6，再将其稀释5倍左右，用刀片在人参根片上轻微划几刀；置于无激素的MS固体培养基上共培养2～5d，25℃下暗培养诱导发根。然后转到含有20g/L浓度的PIM和抑菌抗生素的培养基上进行抑菌和筛选培养，待40～60d后，长出发状根，将小发根切下，转入新的液体培养基中继续培养，含有FGFs的发根见附图2。

以人参无菌苗的茎叶为外植体，先将其用0.1％的氯化汞进行表面消毒，无菌水冲洗3次，每次2min，将叶片上下两端边缘切掉，茎段切成1cm左右，置于无激素的MS固体培养基上预培养1～2d。使其在活化好的菌液中浸泡2～15min，或者将菌液稀释5倍后，用刀在茎段或叶片上轻微划几刀，但不要划破，置于无激素的MS固体培养基上共培养2～5d，25℃下暗培养诱导发根。

西洋参的遗传转化：

取两年生新鲜西洋参根，用肥皂水反复冲洗多次，放入0.1％氯化汞溶液中浸泡5～10min，无菌水冲洗3～5次。在超净工作台上，用接种刀将其切成2～3mm厚的薄片，用镊子平放入装有培养基的三角瓶中，每个三角瓶放置2～3个根外植体，放入恒温恒湿培养箱中，25℃预培养2～3天。与人参一样采用滴加法或划刀法进行侵染转化。具体方法同上。

丹参的遗传转化：

将丹参种子流水冲洗24h后，用0.1％的氯化汞表面消毒5min，经灭菌后的蒸馏水漂洗3次，播撒到灭菌后的湿滤纸上发芽。发芽后的种子移到无激素的MS固体培养基中，待长出无菌苗后，用离体叶柄或幼茎都可以直接按上述方法诱导出发状根。

实施例4：含FGFs植物发根的鉴定

转基因FGFs发状根的PCR鉴定：

提取转基因的发状根基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别以FGFs、rolB的上下游引物对基因组DNA进行扩增，扩增的PCR反应条件和体系(表7、表8)，分别扩增出单独的目的基因及融合后的目的基因。

转基因药用植物发状根的Southern-blot鉴定：

用CTAB法提取PCR检测呈阳性的发状根基因组DNA，选用Bgl II酶切过夜。将酶切好的基因组样品用0.8％琼脂糖凝胶电泳使各片段按照分子大小依次分开，用碱变性方法处理凝胶，利用毛细转移法将酶切片段由凝胶转移到固相硝酸纤维素膜上。探针标记，杂交等按照地高辛标记试剂盒操作方法操作。FGF1Southern-blot结果见附图3。

实施例5：转基因发根中FGFs蛋白的检测

取1g转基因人参发状根，在液氮中研磨；加入蛋白提取缓冲液(PBS)0.5ml，4℃ 12000rpm离心5min；取上清液备用，上清液为发状根中的可溶性总蛋白。

将发状根中的可溶性总蛋白，经肝素亲和层析、离子交换，分离纯化得到FGFs纯品蛋白，CM柱层析：将CM、Sepharose 2F凝胶装柱(5.0cm×50cm)，用2～3倍体积的缓冲液A平衡，将人参发状根可溶性总蛋白缓慢上柱，流速40ml/min，继续用缓冲液A平衡至A280接近0，用缓冲液B进行洗脱，收集蛋白峰。将Heparin Sepharose CL-6B凝胶装柱(5.0cm×50cm)，用2～3倍体积的缓冲液B平衡，将经CM柱层析收取蛋白峰上样。流速40ml/min，分别用含0.6、1.2、2.0mol/L NaCl的20mmol/L PB pH7.0进行分段洗脱，收集aFGF蛋白峰，经SDS-PAGE电泳后，转膜用抗兔的多克隆抗体进行Western-blot杂交，表达产物与预期结果相符。FGF1结果见附图4。

实施例6：转基因发根中的FGFs蛋白的活性测定

用MTT法测定纯化后的FGFs蛋白和野生型FGFs对Balb/c3T3细胞的促分裂活性。结果表明，纯品蛋白的ED50值与野生型蛋白的ED50值相当。

实施例7：转基因人参发根的开发应用

将含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒的人参发状根，冻干成粉，保存，用于功能性食品和药品的开发与应用。

SEQUENCE LISTING

<110>吉林农业大学

<120>一种融合基因片段rolB-FGFs及应用

 

<160>10

 

<210>1

<211>540

<212>DNA

<213>人工

 

<400>1

ttgaaggaaa actctccacc gatatatata cttaaacaac tagctgagct cttgaagaac     60

aaagtctgct atcatcctcc tatgtttgtt agtcagccgg atctggctcg agaaaacgac    120

caacatgtat ttgtctatct ttctcgcgag aagatgcaga aagtgctgaa ggaacaatcc    180

attacatttg gaatggaggc cgtgctggcg acaacgattc aaccatatcg gagcgagctc    240

gccctccagg agatgctccg tgttcacaac cttgcttggc cgcacagccg cacggaggaa    300

cctgatttag aatgcttcat cgccattttc gcaagttcct tgttcattca cttgctggag    360

ttaaaagtga ccaacgttta cgggagagag gtagcttgca ccttctttct gcggcgaggg    420

actgaaaacc gcccctatga tgttgtagct tgcggcacca cacaattcac caaaaatgcc    480

ctcgggatat cacgtccggc cgcctcctca ccggagccag acctaaccct gcgactacaa    540

 

<210>2

<211>411

<212>DNA

<213>人工

 

<400>2

atggctaact acaagaagcc aaagttgttg tactgctcta acggaggaca tttcttgaga     60

attttgccag atggaactgt tgatggaact agagatagat cagatcaaca tattcaattg    120

caattgtctg ctgagtctgt tggagaggtt tacattaagt ctactgagac tggacaatac    180

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ttcttggaga gattggagga gaaccattac aacacttaca tttctaagaa gcatgctgag    300

aagaactggt tcgttggatt gaagaagaac ggatcttgca agagaggacc aagaactcat    360

tacggacaaa aggctatttt gttcttgcca ttgccagttt cttctgatta a             411

 

<210>3

<211>135

<212>PRT

<213>人工

<400>3

 

Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Eys Ser Asn Gly Gly His

 1               5                   10                  15

Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg

             20                  25                  30

Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu

         35                  40                  45

Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr

     50                  55                  60

Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Eys Leu Phe

65                   70                  75                  80

Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys

                 85                  90                  95

His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Eys

            100                 105                 110

Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu

        115                 120                 125

Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp

    130                 135

 

<210>4

<211>447

<212>DNA

<213>人工

 

<400>4

atgccagctt tgccagagga tggaggatct ggagctttcc caccaggaca tttcaaggac    60

ccaaagagat tgtactgcaa gaacggagga ttcttcttga gaatccatcc agatggaaga   120

gttgatggag ttagagagaa gtctgatcca catattaagt tgcaattgca agctgaggag   180

agaggagttg tttctattaa gggagtttgc gctaacagat acttggctat gaaggaggat   240

ggaagattgt tggcttctaa gtgcgttact gatgagtgct tcttcttcga gagattggag   300

tctaacaact acaacactta cagatcaaga aagtacactt cttggtacgt tgctttgaag   360

agaactggac aatacaagtt gggatctaag actggaccag gacaaaaggc tattttgttc   420

ttgccaatgt ctgctaagag ctcttaa                                       447

 

<210>5

<211>148

<212>PRT

<213>人工

 

<400>5

Met Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly

  1               5                  10                  15

His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Eys Lys Asn Gly Gly Phe Phe

             20                  25                  30

Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser

         35                  40                  45

Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val

     50                  55                  60

Ser Ile Lys Gly Val Eys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp

 65                  70                  75                  80

Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Eys Val Thr Asp Glu Eys Phe Phe Phe

                 85                  90                  95

Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr

            100                 105                 110

Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly

        115                 120                 125

Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser

    130                 135                 140

Ala Lys Ser Ser

145         148

 

<210>6

<211>495

<212>DNA

<213>人工

 

<400>6

atgtgcaacg atatgactcc agaacagatg gctaccaacg tgaactgctc ttctccagag   60

agacatacta ggtcttacga ttacatggaa ggaggagata ttagagttag aagattgttc  120

tgtaggactc aatggtatct tagaattgat aagagaggaa aggttaaggg aactcaagag  180

atgaagaaca actacaacat tatggagatt agaactgttg ctgttggaat tgttgctatt  240

aagggagttg agtctgagtt ctaccttgct atgaacaagg agggaaagtt gtacgctaag  300

aaggagtgca acgaggactg taacttcaag gagcttattc ttgagaacca ttacaacacc  360

tacgcttctg ctaagtggac tcataacgga ggagagatgt tcgttgctct taaccaaaag  420

ggtattccag ttagaggaaa gaagactaag aaggagcaaa agactgctca tttccttcca  480

atggctatta cttaa                                                   495

 

<210>7

<211>164

<212>PRT

<213>人工

<400>7

 

Met Eys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Eys

1                 5                  10                  15

Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

             20                  25                  30

Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Eys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg

         35                  40                  45

Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn

     50                  55                  60

Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile

65                   70                  75                  80

Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys

                 85                  90                  95

Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Eys Asn Glu Asp Eys Asn Phe Lys Glu Leu

            100                 105                 110

Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His

        115                 120                 125

Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val

    130                 135                 140

Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro

145                 150                 155                 160

Met Ala Ile Thr

            164

 

<210>8

<211>954

<212>DNA

<213>人工

 

<400>8

atgttgaagg aaaactctcc accgatatat atacttaaac aactagctga gctcttgaag    60

aacaaagtct gctatcatcc tcctatgttt gttagtcagc cggatctggc tcgagaaaac   120

gaccaacatg tatttgtcta tctttctcgc gagaagatgc agaaagtgct gaaggaacaa   180

tccattacat ttggaatgga ggccgtgctg gcgacaacga ttcaaccata tcggagcgag   240

ctcgccctcc aggagatgct ccgtgttcac aaccttgctt ggccgcacag ccgcacggag   300

gaacctgatt tagaatgctt catcgccatt ttcgcaagtt ccttgttcat tcacttgctg   360

gagttaaaag tgaccaacgt ttacgggaga gaggtagctt gcaccttctt tctgcggcga   420

gggactgaaa accgccccta tgatgttgta gcttgcggca ccacacaatt caccaaaaat   480

gccctcggga tatcacgtcc ggccgcctcc tcaccggagc cagacctaac cctgcgacta   540

caaatggcta actacaagaa gccaaagttg ttgtactgct ctaacggagg acatttcttg   600

agaattttgc cagatggaac tgttgatgga actagagata gatcagatca acatattcaa   660

ttgcaattgt ctgctgagtc tgttggagag gtttacatta agtctactga gactggacaa   720

tacttggcta tggatactga tggattgttg tacggatctc aaactccaaa cgaggagtgc   780

ttgttcttgg agagattgga ggagaaccat tacaacactt acatttctaa gaagcatgct   840

gagaagaact ggttcgttgg attgaagaag aacggatctt gcaagagagg accaagaact   900

cattacggac aaaaggctat tttgttcttg ccattgccag tttcttctga ttaa         954

 

<210>9

<211>990

<212>DNA

<213>人工

 

<400>9

atgttgaagg aaaactctcc accgatatat atacttaaac aactagctga gctcttgaag    60

aacaaagtct gctatcatcc tcctatgttt gttagtcagc cggatctggc tcgagaaaac   120

gaccaacatg tatttgtcta tctttctcgc gagaagatgc agaaagtgct gaaggaacaa   180

tccattacat ttggaatgga ggccgtgctg gcgacaacga ttcaaccata tcggagcgag   240

ctcgccctcc aggagatgct ccgtgttcac aaccttgctt ggccgcacag ccgcacggag   300

gaacctgatt tagaatgctt catcgccatt ttcgcaagtt ccttgttcat tcacttgctg   360

gagttaaaag tgaccaacgt ttacgggaga gaggtagctt gcaccttctt tctgcggcga   420

gggactgaaa accgccccta tgatgttgta gcttgcggca ccacacaatt caccaaaaat   480

gccctcggga tatcacgtcc ggccgcctcc tcaccggagc cagacctaac cctgcgacta   540

caaatgccag ctttgccaga ggatggagga tctggagctt tcccaccagg acatttcaag   600

gacccaaaga gattgtactg caagaacgga ggattcttct tgagaatcca tccagatgga   660

agagttgatg gagttagaga gaagtctgat ccacatatta agttgcaatt gcaagctgag   720

gagagaggag ttgtttctat taagggagtt tgcgctaaca gatacttggc tatgaaggag   780

gatggaagat tgttggcttc taagtgcgtt actgatgagt gcttcttctt cgagagattg   840

gagtctaaca actacaacac ttacagatca agaaagtaca cttcttggta cgttgctttg   900

aagagaactg gacaatacaa gttgggatct aagactggac caggacaaaa ggctattttg   960

ttcttgccaa tgtctgctaa gagctcttaa                                    990

<210>10

<211>1038

<212>DNA

<213>人工

 

<400>10

atgttgaagg aaaactctcc accgatatat atacttaaac aactagctga gctcttgaag   60

aacaaagtct gctatcatcc tcctatgttt gttagtcagc cggatctggc tcgagaaaac  120

gaccaacatg tatttgtcta tctttctcgc gagaagatgc agaaagtgct gaaggaacaa  180

tccattacat ttggaatgga ggccgtgctg gcgacaacga ttcaaccata tcggagcgag  240

ctcgccctcc aggagatgct ccgtgttcac aaccttgctt ggccgcacag ccgcacggag  300

gaacctgatt tagaatgctt catcgccatt ttcgcaagtt ccttgttcat tcacttgctg  360

gagttaaaag tgaccaacgt ttacgggaga gaggtagctt gcaccttctt tctgcggcga  420

gggactgaaa accgccccta tgatgttgta gcttgcggca ccacacaatt caccaaaaat  480

gccctcggga tatcacgtcc ggccgcctcc tcaccggagc cagacctaac cctgcgacta  540

caaatgtgca acgatatgac tccagaacag atggctacca acgtgaactg ctcttctcca  600

gagagacata ctaggtctta cgattacatg gaaggaggag atattagagt tagaagattg  660

ttctgtagga ctcaatggta tcttagaatt gataagagag gaaaggttaa gggaactcaa  720

gagatgaaga acaactacaa cattatggag attagaactg ttgctgttgg aattgttgct  780

attaagggag ttgagtctga gttctacctt gctatgaaca aggagggaaa gttgtacgct  840

aagaaggagt gcaacgagga ctgtaacttc aaggagctta ttcttgagaa ccattacaac  900

acctacgctt ctgctaagtg gactcataac ggaggagaga tgttcgttgc tcttaaccaa  960

aagggtattc cagttagagg aaagaagact aagaaggagc aaaagactgc tcatttcctt 1020

ccaatggcta ttacttaa                                               1038

Claims (9)

1.一种融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根据植物密码子的偏好性设计的FGFs基因组成。

2.根据权利要求1所述的一种融合基因片段rolB-FGFs，其特征在于：其碱基序列如SEQID NO.8或9或10所示。

3.无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体，包含无抗生素标记的PIM基因、分泌型表达的信号肽基因SEAP和权利要求1或2所述的一种融合基因片段rolB-FGFs的pCAMBIA1390，即：pCAMBIA 1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs。

4.一种发根农杆菌，它转化了权利要求3所述的无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体pCAMBIA 1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs。

5.含有FGFs植物发状根，它是下述方法生产的：

1)人工设计合成下述引物：

R1：GAATTCTTGAAGGAAAACTCTCCACC

R2：TTCTTGTAGTTAGCCATTTGTAGTCG

Fp1：CTTGTAGTTAGCCATGTAGTCGCA

Fp2：GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG

2)以发根农杆菌A4中的Ri质粒为模板，用引物R1、R2进行PCR扩增，获得rolB基因；以质粒PUC-FGFs为模板，用引物Fp1、Fp2，经PCR扩增，获得FGFs基因；

3)以获得的rolB基因和FGFs基因为模板，利用引物R1和Fp2，通过PCR搭桥法，将rolB基因与FGFs基因进行融合，获得融合基因rolB-FGFs；

4)SEAP信号肽分泌表达载体的构建，人工合成SEAP信号肽基因，两端引入kpn I、Nco I和BstB I、EcoR I酶切位点，与经kpn I和EcoR I双酶切的pCAMBIA1390-PIM载体进行连接；

5)将融合基因rolB-FGFs和经EcoR I和Bgl II双酶切，rolB-FGFs融合基因片段与pCAMBIA1390-PIM-SEAP经EcoR I和Bgl II双酶切后的载体大片段进行连接，构建重组的无抗生素标记的植物双元表达载体pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs；

6)无抗生素标记的植物双元表达载体pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs转化发根农杆菌A4中，活化含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒发根农杆菌A4；

7)含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒发根农杆菌感染植物，培养发状根；

8)获得的含有FGFs的发状根进行大规模培养。

6.根据权利要求5所述的含有FGFs植物发状根，其特征在于：所述的植物为人参、西洋参或丹参，融合基因rolB-FGFs其碱基序列如SEQ ID NO.8或9或10所示。

7.根据权利要求6所述的含有FGFs植物发状根，其特征在于：所述的FGFs为FGF1。

8.根据权利要求5、6或7所述的含有FGFs植物发状根及其培养液，经分离纯化，生产FGFs的应用。

9.根据权利要求6或7所述的含有FGFs植物发状根，用于制备保健品的应用。

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