CN101705230B - 真菌免疫调节蛋白基因启动子、重组载体及宿主细胞 - Google Patents

Abstract

一种基因工程技术领域的真菌免疫调节蛋白基因启动子、重组载体及宿主细胞；本发明涉及的基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；本发明还涉及一中扩增所述基因启动子的引物对；本发明还涉及一种含有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的重组载体；本发明还涉及一种含有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的宿主细胞；本发明还涉及一种分离的核苷酸，其序列与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列至少有85％的同源性。本发明的金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子，可启动报告基因GUS-GFP融合蛋白基因在烟草的根及叶表皮毛中高效表达，本发明的基因启动子在植物组织特异型表达中有重要作用。

Description

真菌免疫调节蛋白基因启动子、重组载体及宿主细胞

技术领域

本发明涉及一种基因工程技术领域的基因启动子、重组载体及宿主细胞，具体是一种真菌免疫调节蛋白基因启动子、重组载体及宿主细胞。

背景技术

金针菇(Flammulina velutipes)，学名毛柄金钱菌，属伞菌目(Agaricales)，口蘑科(Tricholomataceae)，金针菇属(Flammulina)。金针菇(Flammulina velutipes)分布广泛。金针菇除了味道鲜美，具有极高的营养价值外，还含有多种药用成分，是一种重要的药用资源。金针菇中含有多种生物活性物质，如火菇素(Flammulin)，溶细胞素(Flammutoxin)，真菌免疫调节蛋白(FIP-fve)，抗病毒蛋白，跨上皮电抗性蛋白(TEER-TDP)和金针菇多糖(FVP)(金湘，娄恺，毛培宏.金针菇生物活性物质结构与功能的研究进展.中草药.2007，38(10)：1596，I0001，I0002)。其中，真菌免疫调节蛋白是近年来研究的比较多的一种重要的生物活性物质。

真菌免疫调节蛋白是从一些高等担子菌(蘑菇类)子实体中提取的与植物凝集素和免疫球蛋白的结构和免疫功能相似的一类小分子蛋白质。自1989年日本学者Kino等从赤灵芝(Ganoderma lucidium)子实体中分离提取出第一个真菌免疫调节蛋白(LZ-8)以来，已分别从松杉灵芝(G.tsugae)，金针菇(Flammulina velutipes)，草菇(Volvariellavolvacea)，紫芝(G.japoncium)，小孢灵芝(G.microsporum)及紫芝(G.sinense)分离得到了七种FIP，即LZ-8(FIP-glu)，FIP-gts，FIP-fve，FIP-vvo，FIP-gja，FIP-gmi，FIP-gsi，形成了一个新的蛋白质家族朏IPs。在真菌免疫调节蛋白家族中，其一级结构有着60～70％的同源性。该家族的蛋白也同样具有相似的生理功能，对机体具有重要的免疫调节功能。FIP能够促进人外周血淋巴细胞和小鼠脾细胞的有丝分裂；诱导淋巴细胞产生细胞因子；减少抗原诱导型抗体的形成以及抑制非胖糖尿病小鼠的自身免疫。不同的真菌免疫调节蛋白家族成员不仅在氨基酸序列上存在差异，在体内与体外也具有不同程度的免疫调节功能。

Ko，J.L等在《European Journal of Biochemistry》(欧洲生化杂志)1995年第2期244～249页发表了题为《A New Fungal Immunomodulatory Protein，FIP-fve Isolatedfrom the Edible Mushroom，Flammulina velutipes and its Complete Amino AcidSequence》(从食用真菌金针菇中分离得到了一种新的真菌免疫调节蛋白，FIP-fve，及其完整的氨基酸序列)一文，文中评述，金针菇真菌免疫调节蛋白(FIP-Fve)在体外具有凝集人红细胞的作用，能提高IL-2与干扰素γ的转录表达，可激活人外周血淋巴细胞，在体内也能抑制过敏反应。利用基因工程重组表达的FIP-fve同样也具有相同的免疫调节功能。

在基因工程中常用的启动子按照其功能分为：组成型启动子，组织特异型启动子和诱导型启动子。组成型启动子是指在该类启动子调控下，结构基因的表达基本恒定在一定水平上，并且在不同时期、不同组织及不同部位的表达水平没有明显差异。组织特异启动子是指在这类启动子调控下，基因只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。诱导型启动子是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该启动子可以大幅度地提高基因的转录表达水平。选择组织特异型启动子或诱导型启动子，对于利用基因工程手段改良物种等方面具有重要意义。利用特异型或诱导型的启动子，可以使转化的目的基因在特异的部位及特异的时期表达，从而达到真正的可控。对降低病虫害，减少转基因物种的危害性都具有指导意义。

经对现有技术的文献检索发现，尚没有与本发明的真菌免疫调节蛋白基因启动子重、组载体及宿主细胞有关的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种真菌免疫调节蛋白基因启动子、重组载体及宿主细胞。本发明的金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子，可启动报告基因GUS-GFP融合蛋白基因在烟草的根及叶表皮毛中高效表达。

本发明是通过以下技术方案实现的，

本发明涉及一种真菌免疫调节蛋白基因启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的启动子的引物对具体为：

上游引物：TAGCTGCTTGGGGTACCACGGCC；

下游引物：AAGGTGAGCGACGTGGCGGACAT。

本发明还涉及一种重组载体，该载体含有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

所述重组载体使用的载体为pCAMBIA 1304。

本发明还涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

所述宿主细胞为烟草叶片细胞。

本发明还涉及一种分离的核苷酸，其序列与SEQID NO：1所示核苷酸序列至少有85％的同源性。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明的金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子，可启动报告基因GUS-GFP融合蛋白基因在烟草的根及叶表皮毛中高效表达，本发明的基因启动子在植物组织特异型表达中有重要作用。

本发明涉及的菌株大肠杆菌DH5α已在《汪玲玲，杨辑，黄诚之，王海洪；大肠杆菌holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成，微生物学报，2008，48(7)：963-969》中公开；可通过公开市售的商业渠道取得，如上海天根生物公司，公司地址：上海市漕溪路258弄27号航星商务楼1号楼606室。

本发明中涉及的根癌农杆菌EHA105已在《王丹王丕武付永平厉志；大豆根部特异性启动子的克隆及功能分析，大豆科学，2009，28(2)：195-199》中公开；可通过公开市售的商业渠道取得，如中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

附图说明

图1金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子序列分析图；

图2转基因烟草根GUS染色结果图；

图3转基因烟草叶表皮毛荧光检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子的克隆

步骤一，金针菇菌丝的培养

将在斜面中培养的金针菇菌株(已在《孔祥辉 张介驰 张丕奇 于德水 杨志兴；金针菇免疫调节蛋白基因表达及活性初步研究，中国生化药物杂志，2007，28(5)：304～308》文献中公开)28℃活化24h，挑取斜面试管菌种的菌丝接至马铃薯综合培养基(Potato DextroseAgar，PDA)平板上，28℃恒温培养7天。将1cm²左右的平板菌种接至PDA液体培养基，在28℃、120rpm条件下培养5天。

步骤二，金针菇基因组DNA的分离

采用高盐低pH法提取基因组DNA，包括以下步骤：

(1)将1g左右经液氮研磨的样品放入65℃预热的提取缓冲液中，放入65℃水浴锅保温30min，缓慢振摇，室温下10,000×g离心10min；

(2)在上清液中加入2/3体积的2.5mol/L的KAc高盐溶液，混匀后置于0℃保持30min沉淀蛋白质；

(3)在4℃下10,000×g离心10min，弃蛋白质沉淀。上清液加入由氯仿和异戊醇按照24∶1的体积比配成的等体积的氯仿和异戊醇的混合物抽提，在6,000×g离心10min，取出水相转入另一离心管，如果中间层仍有白色沉淀，则再用由氯仿和异戊醇按照24∶1的体积比配成的氯仿和异戊醇的混合物抽提一次；

(4)在上清液中加入三分之二体积的预冷异丙醇，混匀后置于-20℃静置30min，以沉淀核酸，用体积比为70％乙醇清洗沉淀，在空气中干燥5min，将DNA沉淀溶解在TE缓冲液中，分装存放于-20℃或4℃冰箱中保存。

步骤三，金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子的克隆

利用基因组步移技术，通过采用TaKaRa LA PCR^TM in vitro Cloning Kit克隆金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子序列。

选取限制性内切酶EcoR I，Hind III，Pst I，Sal I以及Xba I分别对步骤二中提取的金针菇基因组DNA进行酶切。将酶切产物分别与对应的试剂盒所提供的EcoR I Cassette，Hind III Cassette，Pst I Cassette，Sal I Cassette，Xba I cassette连接。根据金针菇真菌免疫调节蛋白基因的序列，设计合成两条引物：

S 1：TAGCTGCTTGGGGTACCACGGCC(SEQ ID NO：2)；

S2：AAGGTGAGCGACGTGGCGGACAT(SEQ ID NO：3)。

分别以连接产物为模板，以S1和试剂盒提供的Primer C1为引物，进行第一轮的PCR扩增。PCR反应条件为：按照94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min进行30个循环。之后再进行第二轮PCR扩增。分别以第一轮PCR产物稀释100倍后的溶液做模板，以S2和试剂盒提供的Primer C2为引物进行第二轮PCR扩增。PCR反应条件为：按照94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min进行30个循环。利用琼脂糖凝胶电泳检测。将第一轮PCR的产物和第二轮PCR的产物相邻检测。理想的情况是，在第一轮PCR产物出现条带的位置，第二轮PCR产物也有相同的条带。将第二轮PCR产物的条带回收，测序。

步骤四，金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子序列分析

将金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子序列利用

CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行生物信息学分析，结果显示，该序列含有多种基序。其中主要含有7个TATA-box，7个CAAT-box，1个G-box，1个ABRE，3个CGTCA-motif，6个Skn-1 motif。其中，ABRE是与抗逆相关的顺式作用元件，受ABA诱导表达；CGTCA-motif是甲基茉莉酸诱导元件；G-box是光诱导元件；Skn-1 motif为诱导胚乳特异表达元件。预测转录起始位点位于ATG上游100bp处(见图1箭头所示)。

经过利用CARE软件对金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子序列分析，结果显示该序列具有启动子具有之基本元件。将测序所得的金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子序列提交GenBank中进行比对，结果显示没有可以与之比对的序列。说明所得到的1,000bp的金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子序列是新发现的序列。

实施例2

金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子驱动的GUS-GFP融合蛋白基因的烟草转化

步骤一，金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子的克隆

根据金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子的序列，设计能扩增出金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子序列全长的引物，在保证双元表达载体(如pCAMBIA 1304)中GUS-GFP报告基因阅读框架正确的前提下，在上游引物和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(本实施例选用载体pCAMBIA 1304，上游用Hind III和下游用Nco I)，以便构建表达载体。以金针菇基因组DNA为模板，经PCR扩增后，将金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子序列克隆至中间载体(本实施例选用pMD 18-T simple vector)，测序结果与所得的1,000bp FIP-fve-P的序列比较，一致性为100％，表明扩增没有出现错配。

步骤二，真核表达载体的构建

根据引物两端设计的酶切位点，用双酶切(本实施例采用的是pCAMBIA 1304载体，因此采用Hind I和Nco I进行双酶切)将FIP-fve-P片断从pMD 18-T simple vector上切下，把酶切后回收的FIP-fve-P片断与经同样的酶(本实施例采用的是pCAMBIA 1304载体，因此采用Hind I和Nco I进行双酶切)酶切的载体片断相连。将连接产物转化DH5α菌株中，提取质粒DNA，用双酶切鉴定，构建好的载体命名为：p1304::FIP-fve-P。

大量提取构建的表达载体(p1304::FIP-fve-P)的质粒DNA，取20uL(约1ug)转化农杆菌EHA105感受态细胞，在LB培养基(30mg/L利福平，50mg/L链霉素，25mg/L卡那霉素)上28℃培养两天，随机挑选5个克隆做菌液PCR鉴定，均扩增出目标条带。

步骤三，农杆菌转化烟草叶片

(1)挑取LB选择平板(30mg/L利福平，50mg/L链霉素，25mg/L卡那霉素)上的阳性单菌落，接种于2ml LB液体培养基(30mg/L利福平，50mg/L链霉素，25mg/L卡那霉素)，28℃，200rpm振荡培养24～36小时；

(2)取1ml以上培养物，加入50ml LB液体培养基(30mg/L利福平，50mg/L链霉素，25mg/L卡那霉素)中，28℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～1.0；

(3)将培养物4000rpm离心10分钟，收集菌体；

(4)用等体积MS₀(MS粉4.4g，蔗糖30g，pH 5.8)液体培养基悬浮，培养20～40min；

(5)取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约0.5平方厘米见方的小叶片；

(6)将大约200片叶盘放入两瓶200ml农杆菌培养液中，28℃，200rpm振荡培养5～6分钟；

(7)将叶片取出，放置在MS₀(MS粉4.4g，蔗糖30g，pH 5.8)固体培养基上暗培养36～48h；

(8)将叶片转移至MS₁(MS₀中加入0.1mg/Lα萘乙酸，1mg/L 6-苄基腺嘌呤，250mg/L羧苄西林钠)培养基中光照培养1周，每日光照12～16小时；

(9)将叶片转移至MS₂(在MS₁中加入30mg/L潮霉素)培养基中光照培养，每日光照12～16小时，每两周继代一次；每次将变黄的叶片或愈伤组织丢掉，大的愈伤组织切割成小块，经2～3次继代后，培养的愈伤组织陆续分化出苗。

(10)当苗长至约2cm时，转入MS₃(在MS₀中加入0.5mg/Lα萘乙酸，30mg/L潮霉素，250mg/L羧苄西林钠)培养基中培养至生根；

(11)将根系发育完全的烟草苗转移至珍珠岩，在温室中培养。

实施例3

烟草转基因后代的分子检测及FIP-fve-P启动子活性的检测

步骤一，烟草转基因后代的分子检测

(1)烟草总DNA小量提取

取移栽2～3周后的烟草幼嫩叶片(约100mg)放入1.5mL Ep管中，加入600μL 65℃预热SDS提取缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 8.0，0.5M NaCl，50mM EDTA，pH 8.0，1.5％SDS(W/V)，使用前加入2％～3％β-ME(V/V))，用磨砂头玻璃棒匀浆；65℃水浴50min，其间小心颠倒混匀3次；然后加入300μL酚(Tris-HCl pH 8.0平衡)和300μL氯仿，混匀后12,000rpm离心10min；取500μL上清移至新Ep管中，加入等体积氯仿并混匀，12,000rpm离心10min；重复上一步骤，以去除痕量的酚；吸上清，加2倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，充分混匀，12,000rpm离心10min；弃上清，用75％的乙醇洗涤DNA 2次，稍离心，吸去残余乙醇并在通风厨干燥20min至乙醇完全挥发；加入50μL灭菌水和1μL RNase混匀，轻离心后置37℃水浴1h，降解RNA；取3μL DNA用1％琼脂糖凝胶检测，保存于-20℃，备用。

(2)PCR检测

根据FIP-fve-P启动子基因的序列设计一对引物Promoter-F和Promoter-R。用这对引物检测用SDS法提取的转基因烟草基因组DNA。其中，PCR反应体系组成如下：10×缓冲液2.5μl，dNTP混合物(每种10mM)0.5μl，Promoter-F(浓度为10μM)0.5μl，Promoter-R(浓度为10 10μM)0.5μL，Taq酶(浓度为5U/1μL)0.5μL，转基因烟草总DNA(浓度为20ng/μL)1μL，灭菌水定容至25μL，PCR检测结果表明阳性烟草植株与待检测烟草植株的株数比为80％。

步骤二，FIP-fve-P启动子活性的检测

将PCR检测结果为阳性的烟草植株，取其小苗的根和叶进行GUS染色及荧光检测，分析FIP-fve-P的组织特异性表达，具体步骤如下：

(1)GUS蛋白检测

①X-gluc：用N，N-二甲基甲酰胺配成20mM的储存液，分装成每管100uL，保存于-20℃；

②底物溶液：1mM X-gluc于100mM磷酸钠缓冲液(pH为7)含10～100mM EDTA，1～5mMK₃[Fe(CN)₆]，1～5mM K₄[Fe(CN)₆]，0.1％Tritron X-100；

③使用时，将X-gluc用底物溶液稀释20倍；

④取一小片叶片及根放入GUS染液，37℃反应过夜，75％乙醇脱绿。

结果见图2，图中，A：非转基因烟草叶表皮毛(无色透明)；B：转基因烟草叶表皮毛(蓝色)；C：非转基因烟草根(无色透明)；D：转基因烟草根(蓝色)。

(2)GFP检测

取一小片叶片在荧光显微镜下观察。结果见图3，图中，A：非转基因烟草叶表皮毛(无色透明)；B：转基因烟草叶表皮毛(绿色)。金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子驱动的GUS-GFP报告基因检测结果表明：金针菇真菌免疫调节蛋白基因起始密码子ATG上游1,000bp的序列(FIP-fve-P)足以启动报告基因GUS-GFP在烟草的不同组织中表达。

序列表

<110>上海交通大学

<120>真菌免疫调节蛋白基因启动子、重组载体及宿主细胞

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1000

<212>DNA

<213>Flammulina velutipes

<400>1

tcgacgtcgc gaacgacgag cagacaggac gagaatgcca cctacactga agattatcgt    60

ggaaagagga gagaaagagg ttgggttgct ggaggcacaa cgacgaaggg tcaaaggaaa    120

tcgaaaaatg aaccggatgt cggagcttca aatattcaag gtccgactct tctcacgcag    180

gttcgcttcc gtacacgttc cctcattatt ccatgtcatt gccttgaaat acagccctgt    240

acagacatgt taatacgtcc tttataatgt aataggtgcg ccaccaatta ttgtaaaacc    300

actaacccta tgtcatagta gccgaaatca catccgcgcc accgacccga cgctaacttt    360

gacatgaggg actttctttg gcgagcaagc tccagtgact atctgtcctc cattcaagga    420

ccgtcaaagt cgtagtgctt aacagatgac ttgggaacaa aggaggactc ttgtccgaca    480

ttttcatcct gtacgcttcg atttactggc gataagaccg cttcaactcg atgtcattat    540

ggtcccgtca tagcgttcca cgatgtcgcg aaacggtggc agctgacatt ttccaaagct    600

aagttttccc agctgatacc gtgtcatatt gctctctgtg catctccgtt ggtttgactt    660

tctacttcgt cattgaactt catttgttcc cctcttcgaa gacactataa cctactgtct    720

ggtgtttcta cggcttatgt atctcaaccc gtggacgcgc aaacccttgc tcatgtattc    780

ttggattcta ctttgtgatt cgtcgaacac cagatgagcg atgatatcgc ctagccagta    840

aggacaattc ccataaacct ctccaatatc tatataagct ctccccactt tcgtagttca    900

accagcaacc catctagccc atctcaggta aatcctcctc ctcattctac gcagccaact    960

aactcctctt caactagctc atatcgtctc accgcatacc                          1000

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tagctgcttg gggtaccacg gcc                                            23

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aaggtgagcg acgtggcgga cat    23

Claims (5)

1.一种真菌免疫调节蛋白基因启动子，其特征在于，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的真菌免疫调节蛋白基因启动子，其特征是，所述的启动子的引物对具体为：

上游引物：TAGCTGCTTGGGGTACCACGGCC；

下游引物：AAGGTGAGCGACGTGGCGGACAT。

3.一种真菌免疫调节蛋白基因启动子重组载体，其特征在于，该载体含有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的真菌免疫调节蛋白基因启动子重组载体，其特征是，所述的重组载体所使用的载体为pCAMBIA 1304。

5.一种真菌免疫调节蛋白基因启动子烟草叶片宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

Images