CN104651396A - 一种植物表达载体pCAMBIA1304-hpa1xoo的构建方法及表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种植物表达载体pCAMBIA1304-hpa1xoo的构建方法，构建过程中，采用间接载体进行构建，具体为通过对pCAMBIA1304载体和pCAMBIA2301载体进行重组成pCAMBIA1304-2301中间载体，再将所述中间载体以及含有目标基因片段的载体进行酶切和重组，构建pCAMBIA1304-hpa1xoo表达载体，方法简便，便于推广与应用，得到的表达载体便于筛选与后期实验。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种植物表达载体pCAMBIA1304- hpa1xoo的构建方法，本发明还涉及一种由该方法构建的表达载体。
背景技术
hpa1xoo（亦称为hrfxoo或和hrf1）是来源于水稻白叶枯病菌菌株JXOⅢ的hrp基因簇成员，编码产物为蛋白类激发子harpin。Harpin蛋白是由植物病原细菌产生的富含甘氨酸、对热稳定但对蛋白酶K敏感的一类蛋白。它在非寄主植物上能诱导抗病性和过敏性细胞死亡，另外，harpin蛋白还能够诱导植物产生病虫抗性以及提高作物的产量与品质。Harpinxoo喷雾处理烟草、油菜和番茄，对烟草花叶病毒（TMV）、油菜菌核病和番茄灰霉病均表现较好的诱导抗病效果；施用Harpinxoo可提高烟草和番茄抗蚜虫、抗冻和抗旱的能力。将hpa1xoo转入烟草、水稻、棉花、油菜和寒菊等作物中，不同程度提高了转基因植物的抗病能力，同时也能改善出发品种的其他农艺性状。hpa1xoo基因及其片段分别连接到双元载体pBI121上，构建成了重组转基因载体供转化烟草使用。但该载体缺少报告基因及缺少GFP基因，为转化过程中的筛选带来不便。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种植物表达载体pCAMBIA1304- hpa1xoo的构建方法，方法简便，便于推广与应用。
同时，本发明的另一个目的在于提供了一种根据该方法构建的表达载体，为后期实验的进行，筛选等，更加方便操作。
本发明所采取的技术方案是：
一种植物表达载体pCAMBIA1304- hpa1xoo的构建方法，构建过程中，采用间接载体进行构建。
进一步，所述间接载体为pCAMBIA2301。
具体的，所述构建过程为：通过对pCAMBIA1304载体和pCAMBIA2301载体进行重组成pCAMBIA1304-2301中间载体，再将所述中间载体以及含有目标基因片段的载体进行酶切和重组，构建pCAMBIA1304-hpa1xoo 表达载体。
更加具体的，所述构建过程包括以下步骤：
a) 用HindⅢ，EcoRⅠ分别双酶切pCAMBIA1304载体和pCAMBIA2301载体；
b) 分别回收pCAMBIA1304载体大片段， pCAMBIA2301载体小片段；
c) 将pCAMBIA1304大片段与pCAMBIA2301小片段用T4连接酶链接；
d) 将连接产物转化大肠杆菌DH5a；
e) 提取pCAMBIA1304-2301中间载体，及pBI121-hpa1xoo 的大肠杆菌质粒；
f) pCAMBIA1304-2301中间载体进行SacⅠ，XbaⅠ双酶切，回收大片段；
g) 将pCAMBIA 1304-2301中间载体酶切回收的大片段与hpa1xoo基因片段用T4连接酶链接，转化到大肠杆菌感受态细胞中
发明人为提高实验准确性，在所述步骤d和e之间，还设有步骤d1：对重组子进行双酶切验证。
进一步，所述步骤g后，还包括验证步骤。
一种采用上述方法构建的表达载体。
本发明的有益效果是：本发明构建pCAMBIA1304兼具Gus报告基因和与GFP基因，有利于实验后续的筛选和基因定位的研究；本发明的构建方法设计合理，便于推广与应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pCAMBIA1304-hpa1xoo载体构建步骤示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，现有技术中，将hpa1xoo基因插入 pBI121 载体，由于hpa1xoo基因内部存在EcoRⅠ，故本发明通过中间表达载体过渡，以便获得必需的基因功能元件，再将所需片段整体切下插入 目的 载体；采用基因工程手段，利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pCAMBIA1304和pCAMBIA2301 载体获取“1304-2301”中间载体片段，再利用SacⅠ和XbaⅠ双酶切1304-2301中间载体，用PCR的方法从PBI121-hpa1xoo扩增得到具有SacⅠ和XbaⅠ酶切位点的hpa1xoo基因，利用T4连接酶将该基因插入到 酶切后的pCAMBIA1304-2301中间载体的多克隆位点区，构建完成pCAMBIA1304-hpa1xoo表达载体。
更加具体的过程，则根据本发明公开的方法，进行如下操作：
1） 用HindⅢ，EcoRⅠ分别双酶切pCAMBIA1304载体和pCAMBIA2301载体：
其中，采用到的试剂如下：
| 1304载体-质粒 | 10μL |
| 10×M Buffer | 5μL |
| HindⅢ | 2μL |
| EcoRⅠ | 2μL |
| ddH2O | 31μL |
| Total volume | 50μL |
| 2301载体-质粒 | 10μL |
| 10×M Buffer | 5μL |
| HindⅢ | 2μL |
| EcoRⅠ | 2μL |
| ddH2O | 31μL |
| Total volume | 50μL |
2） 分别回收pCAMBIA1304载体大片段， pCAMBIA2301载体小片段。
3） 将pCAMBIA1304大片段与pCAMBIA2301小片段用T4连接酶链接。
其中，连接体系为：
10ul，
T4酶1ul，
buffer 1ul，
1304胶回收产物0.5ul，
2301胶回收产物7.5ul，
16℃连接过夜。
4） 将连接产物转化大肠杆菌DH5a，过程如下：
① 加连接产物于100ul DH5a感受态细胞中轻弹混匀，冰浴20-30min；
② 42℃热激90s，立即置于冰上2min；
③ 加890ul LB液体培养基，37℃孵育1h；
④ 取100ul菌液涂布在LB平板，37℃培养过夜。
5） 对重组子进行双酶切验证，具体过程如下：
① 用HindⅢ，EcoRⅠ进行双酶切验证，获得到的大片段及小片段分别与1304酶切的大片段，和2301酶切的小片段大小相同；
② 用SacI，BamHI进行双酶切验证，获得片段大小约为1500-2000bp的小片段，这与目地片段Gus的基因大小相符合.故连接后长出的三个转化子是成功构建的1304-2301中间载体
6） 提取1304-2301中间载体，及2301-hpa1xoo 的大肠杆菌质粒
7） 1304-2301中间载体进行SacⅠ，XbaⅠ双酶切，回收大片段；
| 1304-2301中间载体-质粒 | 10μL |
| 10×M Buffer | 5μL |
| SacⅠ | 2μL |
| XbaⅠ | 2μL |
| ddH2O | 31μL |
| Total volume | 50μL |
pBI121-hpa1xoo 质粒进行PCR扩增（引物两端添加SacⅠ，XbaⅠ双酶切位点，扩增hpa1xoo基因），回收hpa1xoo基因片段，片段大小约为420bp。
其中，PCR反应程序：
95℃，5min；
95℃，30s；
56℃，30s；
72℃，30s；30 cycles
72℃，5min。
8） 将1304-2301中间载体酶切回收的大片段与hpa1xoo基因片段用T4连接酶链接，转化到大肠杆菌感受态细胞中（步骤同上）
9） 对连接转化后长出7个菌落，进行验证。
① 挑取菌落，进行PCR扩增，扩增得到片段大小与hpa1xoo基因大小相近；
另外，本实施例中，引物的设计只要基于上述的原则，根据本领域的现有技术既可以设计获得。
pCAMBIA 系列载体是植物基因工程中最常用的植物双元表达载体之一，pCAMBIA1304兼具Gus报告基因和与GFP基因，有利于实验后续的筛选和基因定位的研究。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种植物表达载体pCAMBIA1304- hpa1xoo的构建方法，其特征在于：构建过程中，采用间接载体进行构建。
2.如权利要求1中所述植物表达载体pCAMBIA1304- hpa1xoo的构建方法，其特征在于：所述间接载体为pCAMBIA2301。
3.如权利要求1或2中所述植物表达载体pCAMBIA1304- hpa1xoo的构建方法，其特征在于：通过对pCAMBIA1304载体和pCAMBIA2301载体进行重组成pCAMBIA1304-2301中间载体，再将所述中间载体以及含有目标基因片段的载体进行酶切和重组，构建pCAMBIA1304-hpa1xoo 表达载体。
4.如权利要求3中所述植物表达载体pCAMBIA1304- hpa1xoo的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
用HindⅢ，EcoRⅠ分别双酶切pCAMBIA1304载体和pCAMBIA2301载体；
分别回收pCAMBIA1304载体大片段， pCAMBIA2301载体小片段；
将pCAMBIA1304大片段与pCAMBIA2301小片段用T4连接酶链接；
将连接产物转化大肠杆菌DH5a；
提取pCAMBIA1304-2301中间载体，及pBI121-hpa1xoo 的大肠杆菌质粒；
pCAMBIA1304-2301中间载体进行SacⅠ，XbaⅠ双酶切，回收大片段；
将pCAMBIA 1304-2301中间载体酶切回收的大片段与hpa1xoo基因片段用T4连接酶链接，转化到大肠杆菌感受态细胞中。
5.如权利要求4中所述植物表达载体pCAMBIA1304- hpa1xoo的构建方法，其特征在于：在所述步骤d和e之间，还包括有步骤d1：对重组子进行双酶切验证。
6.如权利要求4中所述植物表达载体pCAMBIA1304- hpa1xoo的构建方法，其特征在于：所述步骤g后，还包括验证步骤。
7.一种表达载体，其特征在于：采用权利要求3中所述方法构建。
8.一种表达载体，其特征在于：采用权利要求1、2、4、5、6中任一所述方法构建。
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