CN104711259A - 一种双miRNA抑制表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents
一种双miRNA抑制表达载体及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104711259A CN104711259A CN201510115310.2A CN201510115310A CN104711259A CN 104711259 A CN104711259 A CN 104711259A CN 201510115310 A CN201510115310 A CN 201510115310A CN 104711259 A CN104711259 A CN 104711259A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- expression vector
- seq
- mirna
- seq3
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种双miRNA抑制表达载体及其构建方法和应用，本发明以Seq1和Seq2为引物经重叠延伸PCR反应，获得8～10个Seq1重复排列的序列Seq3。将Seq3序列片段连接到pEASAY-T1克隆载体上，得到克隆载体pEASAY-T1-Seq3，经酶切后将序列片段Seq3进一步连接到植物表达载体pBIGFP上，获得双miRNA抑制表达载体pBIGFP-Seq3，本发明所述的双miRNA抑制表达载体起到抑制苜蓿Ms-miR393和Ms-miR398活性的作用。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种双miRNA抑制表达载体及其构建方法和应用。
背景技术
RNA是生物体内一种重要物质，在生命活动中发挥着各种各样的功能。根据是否编码蛋白质，RNA可分为信使RNA(messager RNA，mRNA)和非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。小RNA(small RNA，smRNA)是一类重要的ncRNA。miRNA是生物体内一种内源性小RNA，长度一般为20-24nt。miRNA是pri-miRNA(primary RNA)的一部分，最初在细胞核中由RNA聚合酶Ⅱ转录表达。成熟的miRNA作为引导性分子，根据碱基配对原则与靶基因mRNA结合，引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译，从而发挥对靶标基因表达的负调控作用。
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)有“牧草之王”的美誉，是世界上被广泛种植的一种重要的饲料作物。由于紫花苜蓿粗蛋白含量在21.8％～37.6％之间，远高于小麦、玉米等粮食作物的粗蛋白含量，对保证奶牛产奶质量具有重要意义。我国许多地区都存在不同程度的干旱和盐渍化问题，为了优先保证粮食产量我国主要将苜蓿等牧草种植于受干旱、盐渍化等影响的贫瘠土地上，因此提高苜蓿抗逆性对提高苜蓿产量，进而保障我国牧草供应具有十分重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种结构简单、成本低、操作简便的双miRNA抑制表达载体。
一种部分重叠的互补引物对，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
一种将本发明所述的部分重叠的互补引物对同时作为引物和模板扩增得到的序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。
一种双miRNA抑制表达载体，其包括本发明所述的序列SEQ ID NO:3。
本发明所述双miRNA抑制表达载体在提高苜蓿抗逆性中的应用，所述双miRNA抑制表达载体转化苜蓿后能同时抑制苜蓿中Ms-miR393和Ms-miR398的表达，进而提高苜蓿中靶标基因MsTIR1、MsAFB2、MsCSD1和MsCSD2的表达，最终使苜蓿的耐盐、抗旱等抗逆性得到增强。
一种本发明所述的双miRNA抑制表达载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)根据苜蓿Ms-miR393和Ms-miR398序列以及miRNA海绵技术原理，设计权利要求1所述的部分重叠的互补引物对Seq1和Seq2，所述Ms-miR393和Ms-miR398序列的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，所述Seq1和Seq2序列的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；Seq1序列对应的转录产物包含Ms-miR393-sponge和Ms-miR398-sponge，核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7所示，它们分别与Ms-miR393和Ms-miR398存在2～3个碱基不能完全互补配对，进而形成发夹结构；
(2)用ddH2O将Seq1和Seq2配制成10μM浓度溶液，将Seq1和Seq2同时作为引物和模板进行重叠延伸PCR反应，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，30循环；72℃延伸5min；
经琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小为400～1000bp的弥散条带，主条带大小为600～800bp；将主条带进行切胶回收，连接到克隆载体pEASAY-T1上获得重组载体pEASAY-T1-Seq3，转化大肠杆菌，在含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上筛选出阳性克隆并测序，选出插入序列Seq3含有8～10个重复Seq1序列的阳性克隆，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，将阳性克隆大肠杆菌进行扩大培养并提取质粒，使用Xba I和BamH I双酶切后进一步将Seq3片段连接到植物表达载体pBIGFP上，获得双miRNA抑制表达载体pBIGFP-Seq3。
将重组载体pBIGFP-Seq3转化农杆菌(EH105)，通过50mg/L卡那霉素抗性筛选获得成功转化的农杆菌单克隆，使用农杆菌介导法转化苜蓿愈伤组织，最终获得遗传转化苜蓿阳性植株。阳性转化苜蓿植株能够大量表达与Ms-miR393和Ms-miR398分别互补的Ms-miR393sponge和Ms-miR398sponge，能够抑制Ms-miR393和Ms-miR398的活性，从而使Ms-miR393和Ms-miR398靶标基因的表达不受其抑制，进而增强苜蓿转化植株的耐盐抗旱等抗逆性。
本发明双miRNA抑制表达载体与现有技术不同之处在于：
本发明中PCR扩增目标序列所用引物Seq1和Seq2序列部分重叠互补，PCR反应时不需要添加模板，Seq1对应转录产物Ms-miR393sponge和Ms-miR398sponge与Ms-miR393和Ms-miR398能够分别形成不完全互补发夹结构；PCR扩增目标序列所用程序的72℃延伸时间控制在30sec，从而保证扩增产物Seq3序列包含8～10个重复Seq1序列。
双miRNA抑制表达载体pBIGFP-Seq3经遗传转化表达后可以应用于提高苜蓿抗逆性，所述载体pBIGFP-Seq3经转化苜蓿后能够同时抑制Ms-miR393和Ms-miR398的表达；miR393和miR398在植物抗逆调控中起着重要作用，通过设计miR393和miR398抑制表达载体能够明显提高植物抗逆性；针对苜蓿Ms-miR393和Ms-miR398设计抑制表达载体并转化苜蓿，将为抗逆高产苜蓿新品种的培育奠定基础。本发明通过抑制苜蓿Ms-miR393和Ms-miR398表达，进而增强Ms-miR393和Ms-miR398靶标基因MsTIR1、MsAFB2、MsCSD1和MsCSD2的表达，这些靶标基因对提高苜蓿耐盐、抗旱等抗逆性具有重要作用。将获得的pBIGFP-Seq3载体转化苜蓿阳性植株进行盐胁迫和干旱胁迫处理，结果表明转基因苜蓿比野生型苜蓿抗逆性明显增强。
下面结合附图对本发明的双miRNA抑制表达载体作进一步说明。
附图说明
图1为本发明中引物Seq1和Seq2互补结构图；
图2为本发明中Seq1对应的转录产物Ms-miR393-sponge和Ms-miRNA398-sponge与Ms-miR393和Ms-miRNA398形成的互补结构图；
图3为本发明中使用Seq1和Seq2为引物进行PCR扩增产物的电泳图；
图4为本发明双miRNA抑制表达载体pBIGFP-Seq3结构图；
图5为本发明中转基因紫花苜蓿(35S::Seq3)与野生型紫花苜蓿在盐胁迫下的比较图；
图6为本发明中转基因紫花苜蓿(35S::Seq3)与野生型紫花苜蓿在干旱胁迫下的比较图。
具体实施方式
实施例1
1、Ms-miR393和Ms-miRNA398串联互补载体的构建
根据苜蓿Ms-miR393和Ms-miR398序列，设计2条不完全重叠互补引物Seq1和Seq2，Seq1和Seq2的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，互补结构如图1，Seq1序列对应的转录产物Ms-miR393-sponge和Ms-miRNA398-sponge与苜蓿Ms-miR393和Ms-miR398之间存在2～3个碱基不能完全互补配对(图2)，不互补碱基位点随机选取，位于miRNA中部。Ms-miR393和Ms-miR398序列的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示，Ms-miR393-sponge和Ms-miR398-sponge序列的核苷酸序列分别如序列表中SEQID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
以Seq1和Seq2作为引物和模板进行重叠延伸PCR反应，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，30循环；72℃延伸5min。使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，切胶回收600～800bp的主条带(图3)，将回收片段(Seq3)连接到克隆载体pEASAY-T1上，转化大肠杆菌感受态细胞，使用含100mg/L氨苄青霉素固体LB培养基筛选阳性克隆并送测序公司测序，选择插入序列Seq3含8～10个Seq1序列串联重复的阳性克隆进行培养并提取质粒(pEASAY-T1-Seq3)。
2、植物表达载体的构建
使用Xba I和BamH I双酶切质粒pEASAY-T1-Seq3和pBIGFP，使用T4连接酶将Seq3片段与线性化植物表达载体pBIGFP过夜连接，获得重组植物表达载体pBIGFP-Seq3，重组载体结构如图4。
3、重组植物表达载体转化农杆菌
使用CaCl2溶液法制备农杆菌EH105感受态细胞，再使用液氮冻融法将重组载体pBIGFP-Seq3转化农杆菌EH105，使用含50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基筛选阳性克隆，挑取农杆菌阳性菌斑，使用PCR法鉴定阳性克隆。
4、农杆菌介导法转化苜蓿
选择转化pBIGFP-Seq3质粒的阳性农杆菌EH105菌株进行扩大培养，使用农杆菌介导法转化苜蓿愈伤组织，经含60mg/L卡那霉素筛选培养紫花苜蓿愈伤组织，获得遗传转化紫花苜蓿植株，使用基因组PCR和Southern杂交方法鉴定阳性转化植株，使用qPCR检测Ms-miR393、Ms-miRNA398、MsTIR1、MsAFB2、MsCSD1和MsCSD2的表达量，结果表明转基因阳性植株中Ms-miR393和Ms-miRNA398的表达量与野生型植株相比明显降低，而MsTIR1、MsAFB2、MsCSD1和MsCSD2的表达量则升高。
实施例2
Ms-miR393和Ms-miR398双抑制表达载体pBIGFP-Seq3在增强紫花苜蓿耐盐抗旱性方面的应用。
使用农杆菌介导法将miRNA双抑制表达载体pBIGFP-Seq3转化紫花苜蓿，挑选阳性紫花苜蓿转化植株进行耐盐和抗旱性鉴定。将转基因紫花苜蓿植株与野生型紫花苜蓿植株在Hogland水培营养液中预培养，每2天更新一次水培液，培养温度为白天25℃，夜晚22℃，每天光照和黑暗时间分别为为14h和10h，光照强度为2500-3000Lx。预培养10天后更换含250mM NaCl的Hogland水培营养液进行盐胁迫处理，每2天更新一次含相同浓度NaCl的水培液。盐胁迫处理6天后野生型紫花苜蓿萎蔫程度明显大于转基因紫花苜蓿，其中野生型紫花苜蓿植株95％以上叶片萎蔫变黄，无新叶长出，接近死亡状态；Ms-miR393和Ms-miR398双抑制表达转基因紫花苜蓿50％左右叶片萎蔫变黄，生长受到一定程度抑制，但仍有新叶长出(如图5)。
将转基因紫花苜蓿植株与野生型紫花苜蓿幼苗种植于含营养土的培养盆中预培养，每天在每个培养盆中浇入50mL水，培养温度为白天25℃，夜晚22℃，每天光照和黑暗时间分别为为14h和10h，光照强度为2500-3000Lx。预培养2周后进行干旱迫处理，每间隔5天在每个培养盆中浇入50mL水，15天后野生型紫花苜蓿萎蔫程度明显大于转基因紫花苜蓿，野生型紫花苜蓿植株85％以上叶片萎蔫变黄，无新叶长出，接近死亡状态；Ms-miR393和Ms-miR398双抑制表达转基因紫花苜蓿35％左右叶片萎蔫变黄，生长受到抑制程度较轻，仍能继续生长(如图6)。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (5)
1.一种部分重叠的互补引物对，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.一种将权利要求1所述的部分重叠的互补引物对同时作为引物和模板扩增得到的序列，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。
3.一种双miRNA抑制表达载体，其特征在于：其包括权利要求2所述的序列。
4.权利要求3所述双miRNA抑制表达载体在提高苜蓿抗逆性中的应用，所述双miRNA抑制表达载体同时抑制苜蓿中Ms-miR393和Ms-miR398的表达。
5.一种权利要求3所述的双miRNA抑制表达载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)根据苜蓿Ms-miR393和Ms-miR398序列以及miRNA海绵技术原理，设计权利要求1所述的部分重叠的互补引物对Seq1和Seq2，所述Ms-miR393和Ms-miR398序列的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，所述Seq1和Seq2序列的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；Seq1序列对应的转录产物包含Ms-miR393-sponge和Ms-miR398-sponge，核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7所示，它们分别与Ms-miR393和Ms-miR398存在2～3个碱基不能完全互补配对，进而形成发夹结构；
(2)用ddH2O将引物Seq1和Seq2配制成10μM浓度溶液，将Seq1和Seq2同时作为引物和模板进行重叠延伸PCR反应，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，30循环；72℃延伸5min；
经琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小为400～1000bp的弥散条带，主条带大小为600～800bp；将主条带进行切胶回收，连接到克隆载体pEASAY-T1上获得重组载体pEASAY-T1-Seq3，转化大肠杆菌，在含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上筛选出阳性克隆并测序，再选出插入序列Seq3为含有8～10个重复Seq1序列的阳性克隆，即权利要求2所述的序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，将阳性克隆大肠杆菌进行扩大培养并提取质粒，使用Xba I和BamH I双酶切后进一步将Seq3片段连接到植物表达载体pBIGFP上，获得重组植物表达载体pBIGFP-Seq3。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510115310.2A CN104711259B (zh) | 2015-03-17 | 2015-03-17 | 一种双miRNA抑制表达载体及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510115310.2A CN104711259B (zh) | 2015-03-17 | 2015-03-17 | 一种双miRNA抑制表达载体及其构建方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104711259A true CN104711259A (zh) | 2015-06-17 |
| CN104711259B CN104711259B (zh) | 2017-12-08 |
Family
ID=53410977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510115310.2A Expired - Fee Related CN104711259B (zh) | 2015-03-17 | 2015-03-17 | 一种双miRNA抑制表达载体及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104711259B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105678112A (zh) * | 2016-02-03 | 2016-06-15 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种计算机辅助筛选小分子化合物靶标适配体的实现方法 |
| CN108977445A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-12-11 | 山东农业大学 | 拟南芥microRNA400在调控植物耐镉性中的应用 |
| CN109022440A (zh) * | 2018-08-28 | 2018-12-18 | 东营职业学院 | 一种提升小麦植株抵抗盐害胁迫的方法 |
| CN109136246A (zh) * | 2018-07-11 | 2019-01-04 | 宁波大学 | 一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体及其构建方法、引物组合物 |
| CN110724712A (zh) * | 2019-10-09 | 2020-01-24 | 重庆医科大学附属第一医院 | 一种miRNA海绵表达载体的构建方法及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103585631A (zh) * | 2012-08-16 | 2014-02-19 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 利用microRNA海绵技术预防和治疗肿瘤的方法 |
| CN103789347A (zh) * | 2014-02-11 | 2014-05-14 | 遵义医学院 | 一种下调微小rna-7表达的载体及其应用 |
-
2015
- 2015-03-17 CN CN201510115310.2A patent/CN104711259B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103585631A (zh) * | 2012-08-16 | 2014-02-19 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 利用microRNA海绵技术预防和治疗肿瘤的方法 |
| CN103789347A (zh) * | 2014-02-11 | 2014-05-14 | 遵义医学院 | 一种下调微小rna-7表达的载体及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| WENNA FAN ET AL.: "Deep sequencing of the microRNA expression in fall dormant and non-dormant alfalfa", 《GENOMICS DATA》 * |
| 李铁军: "miRNA海绵表达载体的构建策略", 《医学分子生物学杂志》 * |
| 龙瑞才: "紫花苜蓿与蒺藜苜蓿盐胁迫应激调控蛋白和miRNA的鉴定分析", 《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105678112A (zh) * | 2016-02-03 | 2016-06-15 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种计算机辅助筛选小分子化合物靶标适配体的实现方法 |
| CN105678112B (zh) * | 2016-02-03 | 2018-08-03 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种计算机辅助筛选小分子化合物靶标适配体的实现方法 |
| CN108977445A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-12-11 | 山东农业大学 | 拟南芥microRNA400在调控植物耐镉性中的应用 |
| CN109136246A (zh) * | 2018-07-11 | 2019-01-04 | 宁波大学 | 一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体及其构建方法、引物组合物 |
| CN109022440A (zh) * | 2018-08-28 | 2018-12-18 | 东营职业学院 | 一种提升小麦植株抵抗盐害胁迫的方法 |
| CN110724712A (zh) * | 2019-10-09 | 2020-01-24 | 重庆医科大学附属第一医院 | 一种miRNA海绵表达载体的构建方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104711259B (zh) | 2017-12-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104711259A (zh) | 一种双miRNA抑制表达载体及其构建方法和应用 | |
| CN107056911A (zh) | 一种促进植物提前开花的草莓转录因子及其应用 | |
| CN109423492B (zh) | SlTOE1基因在调控番茄开花时间和产量中的应用 | |
| CN104086637B (zh) | 烟草独脚金内酯转运蛋白NtPDR6及其干扰表达载体和应用 | |
| CN110004154B (zh) | 茶树CsJAZ1基因的应用 | |
| CN109180791B (zh) | 一种与植物耐旱相关的基因及其编码蛋白与应用 | |
| CN104120130B (zh) | 一种盐胁迫诱导的植物叶片特异性启动子及其应用 | |
| CN105017395A (zh) | 一种橡胶树开花调控蛋白HbTFL1-2及其编码基因与应用 | |
| WO2005087922A1 (en) | Altered expression in filamentous fungi | |
| CN101775409A (zh) | 通过农杆菌浸染幼穗获得转基因玉米的方法 | |
| CN105039345B (zh) | 一种增强桑树耐盐能力的miRNA的克隆及其应用 | |
| CN102154337B (zh) | 一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6及其应用 | |
| WO2020093128A1 (pt) | Método para obtenção de sementes de mamoneira sem ricina/rca, plantas de mamona sem ricina/rca, método de identificação de plantas de mamona sem ricina/rca, polinucleotídeos, construções, e usos das mesmas | |
| CN102618561A (zh) | 与抗逆性相关基因及在提高植物对环境胁迫抗性中的应用 | |
| CN102373208B (zh) | 玉米逆境诱导型启动子的克隆及活性分析 | |
| CN103382475B (zh) | 植物耐旱耐碱相关的dna片段及其应用 | |
| CN110863006B (zh) | 一种提高水稻分蘖和再生的方法 | |
| CN105017396A (zh) | 一种橡胶树开花调控蛋白HbTFL1-1及其编码基因与应用 | |
| CN104059912B (zh) | 水稻缺铁诱导启动子及其应用 | |
| CN106244595B (zh) | 杉木植物磺肽素clpsk1基因及其应用 | |
| CN107488669A (zh) | 花椰菜BoTLP1基因的编码序列及其在培育耐盐抗旱转基因植物中的应用 | |
| CN103614385A (zh) | 一个基因kt525在提高植物耐逆性上的应用 | |
| CN103451190A (zh) | 一个花椰菜器官发育调控基因编码序列及其应用 | |
| CN105017398A (zh) | 一种橡胶树开花调控蛋白HbCEN2及其编码基因与应用 | |
| CN105017397A (zh) | 一种橡胶树开花调控蛋白HbCEN1及其编码基因与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20171208 Termination date: 20210317 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |