CN109022440A - 一种提升小麦植株抵抗盐害胁迫的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提升小麦植株抵抗盐害胁迫的方法，提取小麦总RNA，并自主设计合成的颈环RT引物反转录合成cDNA，通过PCR扩增产物连接至克隆载体pMD18‑T，转化至感受态大肠杆菌JM109中，提取质粒进行测序，获得了小麦miR398序列；在高盐迫条件下，研究小麦miR398和靶基因CSD表达水平相对变化，确定小麦中miR398表达水平变化与盐害胁迫响应的关系，确定小麦中miR398与CSD基因的负调控关系，以为后续CSD基因的超表达和提高小麦抗盐害胁迫能力奠定基础。本发明通过将构建的miR398 sponge元件导入小麦基因组内以达到“吸附”miR398的目的，抑制miR398对靶基因CSD基因的沉默作用，提高CSD基因的相对表达水平，进一步提升小麦植株抵抗盐害胁迫的能力，提高小麦的产量。

Description

一种提升小麦植株抵抗盐害胁迫的方法
技术领域
本发明涉及小麦技术方法领域，具体为一种提升小麦植株抵抗盐害胁迫的方法。
背景技术
植物体内所含microRNA长度约为22nt，是具有基因表达调控作用的非编码类RNA；其中，miR398靶向Cu/Zn过氧化物歧化酶（Cu/Zn superoxide dismutase, CSD）基因，直接参与胁迫应答网络，在植物光合作用和呼吸作用过程中产生的副产物活性氧（Reactiveoxygen species, ROS）对植物细胞生长具有毒害作用，而过量ROS的积累主要是由于植物受到盐害、重金属、冷害、机械伤害等多种胁迫所导致的；而活性氧（Reactive oxygenspecies, ROS）的清除主要依靠CSD，其可将 ROS 转变成 H2O和O2；盐害是影响小麦生长发育的主要不良因素，使得小麦产量下降，目前缺少解决盐害影响小麦生存发育、小麦产量问题的方式方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提升小麦植株抵抗盐害胁迫的方法，以解决上述背景技术中提出盐害影响小麦生存发育、影响小麦产量的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种提升小麦植株抵抗盐害胁迫的方法，包括如下步骤：步骤一，提取小麦总RNA，并自主设计合成的颈环RT引物反转录合成cDNA，通过PCR扩增产物连接至克隆载体pMD18-T，转化至感受态大肠杆菌JM109中，提取质粒进行测序，获得了小麦miR398序列；步骤二，在高盐迫条件下，研究小麦miR398和靶基因CSD表达水平相对变化，确定小麦中miR398表达水平变化与盐害胁迫响应的关系，确定小麦中miR398与CSD基因的负调控关系，以为后续CSD基因的超表达和提高小麦抗盐害胁迫能力奠定基础。
优选的，包括提取小麦总RNA的步骤，该小麦提取总RNA的步骤如下：取小于0.2g的小麦黄花苗尽快液氮研磨成粉末状后移入1.5ml小指管；并在小指管内立即加入1mlTRizol Reagent，轻弹管底，尽快将样品进行混合后重悬；水平将小指管放置在室温孵育20min；并用4℃、12000rpm的微型低温高速离心机中离心10min；然后移澄清上清液入一根新的1.5ml的小指管中，加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，用力摇动1.5ml小指管15s，室内孵育2min-3min；用4℃、12000rpm的微型低温高速离心机中离心15min；移动最上层水相到新的1.5ml的小指管中加入0.25ml的异丙醇、0.25ml的高盐混合液混匀，其中0.25ml高盐混合液为0.8mol/L柠檬酸钠与1.2mol/L NaCl的混合体；然后室内孵育30min，用14℃、12000rpm的微型低温高速离心机中离心10min；弃上清，用1ml 75%乙醇洗沉淀，涡旋混合样品，再用4℃、12000rpm的微型低温高速离心机中离心5min；然后弃上清，短暂进行干燥，RNA沉淀5min-10min，用RNase-free水溶解沉淀，-70℃保存即可。
优选的，包括提取质粒进行测序的前提步骤，该步骤为：以提取的总RNA为模板，再进行PCR扩增，扩增的产物用USER酶消化，然后将USER酶消化后的PCR扩增产物和质粒经回收、纯化后进行连接克隆，获得表达载体pMD18-T，最后，将表达载体转化至感受态大肠杆菌JM109中，提取质粒进行测序，获得了小麦miR398序列。
优选的，包括在高盐迫条件下，研究小麦miR398和靶基因CSD的表达，具有如下操作步骤：将测序鉴定正确的miR398质粒转化至感受态大肠杆菌JM109，挑取阳性克隆，菌落PCR鉴定，将原小麦与转化后的小麦置于培养箱中进行高盐胁迫，并分别于0h、12h、24h、48h、72h后取小麦，-80℃保存备用；然后检测内源与外源miR398及靶基因CSD的表达情况，结果表明miR398及靶基因CSD随高盐胁迫表现出规律性变化：以为转化的原小麦作为阳性对照，0h侵染为阴性对照，高盐胁迫处理不同的时间后，miR398相对表达量表现为先上升后下降，并在12h时达到峰值；其对应的靶基因CSD在0-4h范围内的表达量逐渐升高，在6-24h范围内的表达量与阴性对照相比逐渐降低，并都显著低于miR398的表达量，且于12h表达量最低；12h后随着miR398表达量的降低，其靶基因CSD表达量逐渐升高，miR398在48h表达量在次达到最低，而其靶基因CSD则达到峰值，表明miR398对其靶基因CSD呈负调控。
本发明进行实验后表明，高盐胁迫处理下，在原小麦与过表达miR398小麦植株中，随着高盐胁迫时间的增长，miR398表达量逐渐升高之后降低，其靶基因CSD出现与之相反的表达模式，高盐胁迫处理4h时miR398表达量降低，靶基因CSD表达量升高，4h即是过表达植株快速应答高盐胁迫的应激节点；在高盐胁迫处理24h后，由于过表达miR398能增加植物对环境胁迫的灵敏度，使其抗盐害胁迫，调节体内相应的生理生化功能，导致靶基因CSD表达上调，靶基因CSD的大量积累，通过膜透性、增强膜结构和功能的稳定性，使得植株细胞减少损伤，降低ROS对植株造成的伤害。
本发明进行实验后表明，在高盐胁迫下，过表达miR398植株通过负调控靶基因CDS来提高植株的抗盐害性能，能够根据miR398与靶基因CDS呈负调控关系，对miR398进行沉默或者敲除，解除miR398对靶基因CDS的抑制，进而提升小麦植株抵抗盐害胁迫的能力，提高小麦的产量。
本发明的有益效果是：通过小麦miR398和靶基因CSD在小麦盐胁迫条件下的相对表达水平变化的研究，并可进一步通过将构建的miR398 sponge元件导入小麦基因组内以达到“吸附”miR398的目的，抑制miR398对靶基因CSD基因的沉默作用，提高CSD基因的相对表达水平，进一步提升小麦植株抵抗盐害胁迫的能力，提高小麦的产量。
附图说明
图1为本发明小麦miR398和靶基因CSD的表达量图表。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：
一种提升小麦植株抵抗盐害胁迫的方法，包括如下步骤：
步骤一，提取小麦总RNA，并自主设计合成的颈环RT引物反转录合成cDNA，通过PCR扩增产物连接至克隆载体pMD18-T，转化至感受态大肠杆菌JM109中，提取质粒进行测序，获得了小麦miR398序列；步骤二，在高盐迫条件下，研究小麦miR398和靶基因CSD表达水平相对变化，确定小麦中miR398表达水平变化与盐害胁迫响应的关系，确定小麦中miR398与CSD基因的负调控关系，以为后续CSD基因的超表达和提高小麦抗盐害胁迫能力奠定基础。
提取小麦总RNA的步骤，该小麦提取总RNA的步骤如下：取小于0.2g的小麦黄花苗尽快液氮研磨成粉末状后移入1.5ml小指管；并在小指管内立即加入1ml TRizol Reagent，轻弹管底，尽快将样品进行混合后重悬；水平将小指管放置在室温孵育20min；并用4℃、12000rpm的微型低温高速离心机中离心10min；然后移澄清上清液入一根新的1.5ml的小指管中，加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，用力摇动1.5ml小指管15s，室内孵育2min-3min；用4℃、12000rpm的微型低温高速离心机中离心15min；移动最上层水相到新的1.5ml的小指管中加入0.25ml的异丙醇、0.25ml的高盐混合液混匀，其中0.25ml高盐混合液为0.8mol/L柠檬酸钠与1.2mol/L NaCl的混合体；然后室内孵育30min，用14℃、12000rpm的微型低温高速离心机中离心10min；弃上清，用1ml 75%乙醇洗沉淀，涡旋混合样品，再用4℃、12000rpm的微型低温高速离心机中离心5min；然后弃上清，短暂进行干燥，RNA沉淀5min-10min，用RNase-free水溶解沉淀，-70℃保存即可。
提取质粒进行测序的前提步骤，该步骤为：以提取的总RNA为模板，再进行PCR扩增，扩增的产物用USER酶消化，然后将USER酶消化后的PCR扩增产物和质粒经回收、纯化后进行连接克隆，获得表达载体pMD18-T，最后，将表达载体转化至感受态大肠杆菌JM109中，提取质粒进行测序，获得了小麦miR398序列。
在高盐迫条件下，研究小麦miR398和靶基因CSD的表达，具有如下操作步骤：将测序鉴定正确的miR398质粒转化至感受态大肠杆菌JM109，挑取阳性克隆，菌落PCR鉴定，将原小麦与转化后的小麦置于培养箱中进行高盐胁迫，并分别于0h、12h、24h、48h、72h后取小麦，-80℃保存备用；然后检测内源与外源miR398及靶基因CSD的表达情况，结果表明miR398及靶基因CSD随高盐胁迫表现出规律性变化：以为转化的原小麦作为阳性对照，0h侵染为阴性对照，高盐胁迫处理不同的时间后，miR398相对表达量表现为先上升后下降，并在12h时达到峰值；其对应的靶基因CSD在0-4h范围内的表达量逐渐升高，在6-24h范围内的表达量与阴性对照相比逐渐降低，并都显著低于miR398的表达量，且于12h表达量最低；12h后随着miR398表达量的降低，其靶基因CSD表达量逐渐升高，miR398在48h表达量在次达到最低，而其靶基因CSD则达到峰值，表明miR398对其靶基因CSD呈负调控。
本发明进行实验后表明，高盐胁迫处理下，在原小麦与过表达miR398小麦植株中，随着高盐胁迫时间的增长，miR398表达量逐渐升高之后降低，其靶基因CSD出现与之相反的表达模式，高盐胁迫处理4h时miR398表达量降低，靶基因CSD表达量升高，4h即是过表达植株快速应答高盐胁迫的应激节点；在高盐胁迫处理24h后，由于过表达miR398能增加植物对环境胁迫的灵敏度，使其抗盐害胁迫，调节体内相应的生理生化功能，导致靶基因CSD表达上调，靶基因CSD的大量积累，通过膜透性、增强膜结构和功能的稳定性，使得植株细胞减少损伤，降低ROS对植株造成的伤害。
本发明通过小麦miR398和靶基因CSD在小麦盐胁迫条件下的相对表达水平变化的研究，并可进一步通过将构建的miR398 sponge元件导入小麦基因组内以达到“吸附”miR398的目的，抑制miR398对靶基因CSD基因的沉默作用，提高CSD基因的相对表达水平，进一步提升小麦植株抵抗盐害胁迫的能力，提高小麦的产量。
其中，miR398能够响应多种胁迫的miRNA，在调节植物铜代谢平衡、应答过量的重金属胁迫以及臭氧、盐害等非生物胁迫方面发挥作用；当植株遭遇非生物胁迫时，为了保护膜组织免受伤害，体内的SOD升高达到清除过量ROS的目的。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种提升小麦植株抵抗盐害胁迫的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一，提取小麦总RNA，并自主设计合成的颈环RT引物反转录合成cDNA，通过PCR扩增产物连接至克隆载体pMD18-T，转化至感受态大肠杆菌JM109中，提取质粒进行测序，获得了小麦miR398序列；
步骤二，在高盐迫条件下，研究小麦miR398和靶基因CSD表达水平相对变化，确定小麦中miR398表达水平变化与盐害胁迫响应的关系，确定小麦中miR398与CSD基因的负调控关系，以为后续CSD基因的超表达和提高小麦抗盐害胁迫能力奠定基础。
2.根据权利要求1所述的一种提升小麦植株抵抗盐害胁迫的方法，其特征在于：包括提取小麦总RNA的步骤，该小麦提取总RNA的步骤如下：取小于0.2g的小麦黄花苗尽快液氮研磨成粉末状后移入1.5ml小指管；并在小指管内立即加入1ml TRizol Reagent，轻弹管底，尽快将样品进行混合后重悬；水平将小指管放置在室温孵育20min；并用4℃、12000rpm的微型低温高速离心机中离心10min；然后移澄清上清液入一根新的1.5ml的小指管中，加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，用力摇动1.5ml小指管15s，室内孵育2min-3min；用4℃、12000rpm的微型低温高速离心机中离心15min；移动最上层水相到新的1.5ml的小指管中加入0.25ml的异丙醇、0.25ml的高盐混合液混匀，其中0.25ml高盐混合液为0.8mol/L柠檬酸钠与1.2mol/L NaCl的混合体；然后室内孵育30min，用14℃、12000rpm的微型低温高速离心机中离心10min；弃上清，用1ml 75%乙醇洗沉淀，涡旋混合样品，再用4℃、12000rpm的微型低温高速离心机中离心5min；然后弃上清，短暂进行干燥，RNA沉淀5min-10min，用RNase-free水溶解沉淀，-70℃保存即可。
3.根据权利要求1所述的一种提升小麦植株抵抗盐害胁迫的方法，其特征在于：包括提取质粒进行测序的前提步骤，该步骤为：以提取的总RNA为模板，再进行PCR扩增，扩增的产物用USER酶消化，然后将USER酶消化后的PCR扩增产物和质粒经回收、纯化后进行连接克隆，获得表达载体pMD18-T，最后，将表达载体转化至感受态大肠杆菌JM109中，提取质粒进行测序，获得了小麦miR398序列。
4.根据权利要求1所述的一种提升小麦植株抵抗盐害胁迫的方法，其特征在于：包括在高盐迫条件下，研究小麦miR398和靶基因CSD的表达，具有如下操作步骤：将测序鉴定正确的miR398质粒转化至感受态大肠杆菌JM109，挑取阳性克隆，菌落PCR鉴定，将原小麦与转化后的小麦置于培养箱中进行高盐胁迫，并分别于0h、12h、24h、48h、72h后取小麦，-80℃保存备用；然后检测内源与外源miR398及靶基因CSD的表达情况，结果表明miR398及靶基因CSD随高盐胁迫表现出规律性变化：以为转化的原小麦作为阳性对照，0h侵染为阴性对照，高盐胁迫处理不同的时间后，miR398相对表达量表现为先上升后下降，并在12h时达到峰值；其对应的靶基因CSD在0-4h范围内的表达量逐渐升高，在6-24h范围内的表达量与阴性对照相比逐渐降低，并都显著低于miR398的表达量，且于12h表达量最低；12h后随着miR398表达量的降低，其靶基因CSD表达量逐渐升高，miR398在48h表达量在次达到最低，而其靶基因CSD则达到峰值，表明miR398对其靶基因CSD呈负调控。
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