CN114408898B - 一种生物质碳点及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物质碳点及其制备方法与应用，制备方法是以含酚酸的生物质为碳源，碳源与蒸馏水通过一步水热反应制备水溶性碳点，该制备工艺简单、易于操作、成本低、产率高达20～30％、反应在4～12h内完成，无污染，可用于产业化生产。本发明制备的碳点尺寸小，表面具有不同的含氧官能团，具有良好的生物相容性和水溶性，能够在低钾胁迫下显著促进植物根系对钾离子的吸收，增加根系活力，促进植物根系生长，提高植物的光合速率及抗氧化能力，从而显著缓解植物低钾胁迫。本发明提供的碳点具有缓解植物低钾胁迫的特点，可以应用在农业生产中提高低钾胁迫下农作物的产量和品质。
Description
技术领域
本发明涉及碳纳米材料及应用领域，具体涉及一种生物质碳点及其制备方法与应用。
背景技术
钾(K+)是植物生长发育所必需的三大营养元素之一，几乎参与植物整个生长发育和生理代谢的过程。然而中国钾资源匮乏，据统计我国约有70％的耕地缺钾，约有45％的耕地严重缺钾。低钾胁迫严重影响植物的生长发育，已有研究表明，缺钾会使植物叶片出现叶缘卷曲、叶片黄化、减少植株干物质积累、抑制植物根系生长、影响光合效率，导致农作物产量和品质显著下降。因此，低钾胁迫成为制约我国农业高效发展的重要因素之一。
近年来，随着纳米技术的快速发展，纳米材料作为纳米技术不可或缺的研究工具，其在生物传感、生物成像和生物医学等领域的应用得到了迅猛发展。碳点作为一种新型的零维纳米材料，由于其良好的生物相容性，近年来被广泛应用在植物中。然而不同碳源、粒径、浓度、化学和生物学特性的碳点对植物的影响不同。因此，开发和制备缓解植物低钾胁迫的碳点对农作物生产具有重要的研究意义和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物质碳点及其制备方法与应用，该方法具有工艺简单、易于操作、成本低、无污染的优点，可用于产业化生产；制备的生物质碳点尺寸小，具有良好的生物相容性和水溶性，能够在低钾胁迫下显著促进了植物根系对钾离子的吸收，促进植物根系生长和光合效率，从而有效缓解植物低钾胁迫。
为实现上述目的，本发明提供了一种生物质碳点的制备方法，包括以下步骤：
S1、将生物质均匀分散在蒸馏水中，生物质与蒸馏水之间的质量体积比为1g：(10～30)mL，搅拌10～20min形成悬浮液；
S2、将步骤S1得到的悬浮液置于高压反应釜中，在100～210℃下反应4～12h形成碳点溶液；
S3、将步骤S2得到的碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，除去杂质后获得纯净的生物质碳点。
优选的，步骤S1中，生物质为丹参粉末、甘薯秸秆粉末、红茶粉末、金银花粉末中的一种或多种。
优选的，步骤S1中，生物质与蒸馏水之间的质量体积比为1g：20mL，搅拌10min。
优选的，步骤S2中，悬浮液在150℃下反应6h形成碳点溶液。
优选的，步骤S3中，水系微孔滤膜的孔径为0.22μm，透析袋的分子量为3500Da。
一种生物质碳点，所述生物质碳点由上述制备方法制备得到。根据上述制备方法制备获得水溶性碳点，表面含有丰富的含氧官能团，含氧官能团使碳点具有优异的生物学特性，这为其增强钾元素利用效率提供了可能性。
上述制备方法制备得到的生物质碳点在缓解植物低钾胁迫中的应用。
优选的，将生物质碳点配制成碳点浓度为0.3～2.0mg/mL的碳点营养液。
优选的，将生物质碳点配制成碳点浓度为1.5mg/mL的碳点营养液。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明以含酚酸的天然生物质为原材料，如丹参粉末、甘薯秸秆粉末、红茶粉末、及金银花粉末等一系列生物质，以蒸馏水为溶剂通过一步水热反应制备碳点，原材料来源广且绿色环保；
(2)本发明工艺简单，易于操作，成本低，产率高达20～30％，反应在4～12h内完成，无污染，可用于产业化生产；
(3)本发明制备的生物质碳点尺寸小，表面具有不同的含氧官能团，具有良好的生物相容性和水溶性，能够在低钾胁迫下显著促进了植物根系对钾离子的吸收，增加根系活力，促进植物根系生长，提高植物的光合速率及抗氧化能力；本发明提供的碳点具有缓解植物低钾胁迫的特点，可以应用在农业生产中提高低钾胁迫下农作物的产量和品质。
附图说明
图1为本发明实施例三制备得到生物质衍生碳点的透射电镜图；
图2为本发明实施例三制备得到生物质衍生碳点的粒径分布图；
图3为本发明实施例一至六制备得到生物质衍生碳点的FTIR图；
图4为本发明实施例一至六制备得到生物质衍生碳点的XPS图；
图5为不同处理对甘薯幼苗根尖K+内流的影响；
图6为低钾胁迫下，碳点对甘薯幼苗根系生长的影响；
图7为不同处理对甘薯幼苗外型的影响；
图8为不同处理分别对整株甘薯幼苗、甘薯根、甘薯叶中K+的积累量的影响；
图9为不同处理对甘薯幼苗气孔导度的影响；
图10为不同处理对甘薯幼苗的胞间二氧化碳浓度的影响；
图11为不同处理对甘薯幼苗净光合速率的影响；
图12为不同处理对甘薯根系中基因表达量的影响，(a)为IbCBL1基因，(b)为IbCBL10基因，(c)为IbHAK5基因；
图13为田间试验中，碳点对甘薯块根中K+含量的影响。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例一
称取6.0g丹参粉末均匀分散于60mL蒸馏水中，在室温下搅拌10min，随后将悬浮液置于高压反应釜中，在100℃下反应4h形成碳点溶液，将形成碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，水系微孔滤膜的孔径为0.22μm，透析袋的分子量为3500Da，除去杂质后获得纯净的生物质碳点，其产率约为20％。
实施例二
称取3.0g丹参粉末均匀分散于60mL蒸馏水中，在室温下搅拌10min，随后将悬浮液置于高压反应釜中，在120℃下反应6h形成碳点溶液，将形成碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，水系微孔滤膜的孔径为0.22μm，透析袋的分子量为3500Da，除去杂质后获得纯净的生物质碳点，其产率约为27％。
实施例三
称取3.0g丹参粉末均匀分散于60mL蒸馏水中，在室温下搅拌10min，随后将悬浮液置于高压反应釜中，在150℃下反应6h形成碳点溶液，将形成碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，水系微孔滤膜的孔径为0.22μm，透析袋的分子量为3500Da，除去杂质后获得纯净的生物质碳点，其产率约为30％。
实施例四
称取3.0g生物质(丹参粉末与甘薯秸秆粉末1:1比例混合)均匀分散于60mL蒸馏水中，在室温下搅拌15min，随后将悬浮液置于高压反应釜中，在150℃下反应8h形成碳点溶液，将形成碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，水系微孔滤膜的孔径为0.22μm，透析袋的分子量为3500Da，除去杂质后获得纯净的生物质碳点，其产率约为25％。
实施例五
称取2.5g生物质(丹参粉末与红茶粉末2:1比例混合)均匀分散于60mL蒸馏水中，在室温下搅拌15min，随后将悬浮液置于高压反应釜中，在180℃下反应10h形成碳点溶液，将形成碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，水系微孔滤膜的孔径为0.22μm，透析袋的分子量为3500Da，除去杂质后获得纯净的生物质碳点，其产率约为26％。
实施例六
称取2.0g生物质(红茶粉末与金银花粉末2:1比例混合)均匀分散于60mL蒸馏水中，在室温下搅拌20min，随后将悬浮液置于高压反应釜中，在210℃下反应12h形成碳点溶液，将形成碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，水系微孔滤膜的孔径为0.22μm，透析袋的分子量为3500Da，除去杂质后获得纯净的生物质碳点，其产率约为21％。
将实施例一至六制备的生物质碳点进行透射电镜测试，具体以实施例三制备的生物质碳点为例，结果如图1所示，从图中可以看出，本发明获得的生物质碳点均呈球形颗粒，具有良好的单分散性。
以实施例三制备的生物质碳点为例，从透射电镜图中测量超过150个碳点的直径，获得碳点的粒径分布图，结果如图2所示，从图中可以看出，本发明获得的生物质碳点的粒径分布在1～6nm之间，其平均粒径为3.3nm。
将实施例一至六制备的生物质碳点进行红外光谱分析，结果如图3所示，从图中可以看出，所制备的碳点在3100～3700cm-1处有宽吸收带，这归因于-COOH和-OH的伸缩振动，表明存在酚羟基和羧酸。在2928cm-1处的峰对应于C-H的伸缩振动，1613cm-1处的特征峰归因于羧酸和芳香酮的C＝O伸缩，1524cm-1、1418cm-1和1355cm-1处的锋为C-H的伸缩振动和弯曲振动，1200～1000cm-1处的峰为C-O的伸缩振动，为多糖的特征吸收锋。这些结果表明制备的碳点中含有丰富的-COOH、-OH、C＝O。
将实施例一至六制备的生物质碳点进行X射线光电子能谱(XPS)分析，结果如图4所示，从图中可以看出，所制备的碳点主要由碳(62.33％)和氧(37.67％)两种元素组成。
根据实施例三制备的生物质碳点应用在植物中，探究其对低钾胁迫下植物生长的影响，具体应用过程如下：
选择甘薯作为植物模型，剪取15cm生长健壮的甘薯藤蔓扦插在1/4霍格兰营养液中诱导不定根生长，每隔两天换一次营养液，培养条件：光照时间为16h，光照温度为28℃，黑暗时间为8h，温度为23℃，相对湿度均为60％。7天后，选取大小一致，长势均匀的甘薯幼苗分别移植于四组营养液中，分别是A组为1/4霍格兰营养液(对照组)、B组为缺钾的1/4霍格兰营养液(含0.1mM K+)、C组为含1.5mg/mL碳点的1/4霍格兰营养液、D组为含1.5mg/mL碳点和缺钾的1/4霍格兰营养液(含0.1mM K+)，每隔2天更新一次处理溶液，每个处理设置六个重复。
其中，上述霍格兰营养液由945mg/L四水硝酸钙、506mg/L硝酸钾、80mg/L硝酸铵、136mg/L磷酸二氢钾、493mg/L七水硫酸镁、2.5mL铁盐溶液和5mL微量元素液组成。
铁盐溶液由1.39g/L七水硫酸亚铁和1.87g/L乙二胺四乙酸二钠组成。
微量元素溶液由0.83mg/L碘化钾、6.2mg/L硼酸、22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L硫酸铜和0.025mg/L氯化钴组成。
以上不同处理对甘薯幼苗根尖K+流的影响结果如图5所示，从图5中可以看出，D组较B组的钾离子吸收速率显著增大，由此可知，本发明制备得到的碳点显著促进了甘薯根系对K+吸收，从而改善根系生理状态；另外，从图6中可以看出，D组较B组中的甘薯根系更长、更密实，由此可知，本发明制备得到的碳点显著促进了根系生长，缓解甘薯低钾胁迫。
为了探究不同处理对甘薯幼苗生长的影响，结果如图7所示，与A组处理相比，C组幼苗生长没有明显变化，B组幼苗叶片明显失绿变黄，出现早衰现象，生长显著受到抑制，而D组幼苗生长较为旺盛，且几乎没有出现低钾现象，由此可知，本发明制备得到的碳点显著缓解甘薯低钾胁迫。进一步利用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定不同处理下甘薯幼苗根和叶中钾离子含量，从图8可知，碳点处理显著促进低钾胁迫下甘薯幼苗叶片中K+含量，由此可知，本发明制备得到的碳点通过增加低钾胁迫下甘薯叶片中K+含量而缓解甘薯低钾胁迫。
钾是植物的重要营养元素，虽然钾没有直接参与植物光合作用的反应过程，但其在光合代谢中具有重要的生理功能，如调节气孔、是植物光合作用过程中许多酶的活化剂、参与同化物的运输等，从而显著影响植物光合作用。由于气孔是CO2进入植物叶片的门户，钾可以调控叶片气孔开闭，如图9-11所示，低钾胁迫显著影响甘薯幼苗的气孔导度(图9)，使得进入甘薯叶肉细胞中的CO2减少，因此甘薯叶片的胞间CO2浓度显著下降(图10)，从而使得净光合速率下降(图11)。而添加碳点后，甘薯幼苗的气孔导度显著上升(图9)，因此进入甘薯叶肉细胞的CO2增加，甘薯幼苗的胞间CO2浓度上升(图10)，净光合速率显著升高(图11)。因此，上述结果表明本发明制备得到的碳点通过调控低钾胁迫下甘薯幼苗的K+内流，促进甘薯根系生长，增加甘薯叶片中K+含量，从而增大甘薯幼苗的气孔导度，增强光合作用，缓解甘薯幼苗钾胁迫。
为了探究碳点提高植物K+吸收的分子机制，我们测定了调控植物低钾胁迫响应相关基因的表达量。研究表明，HAK5是植物低钾胁迫响应最关键的基因，主要参与植物根部钾离子吸收。低钾胁迫通过诱导HAK5上调表达，促进根系对钾离子的吸收。而HAK5受Ca2+感受器CBL1和CBL10正向调控。如图12所示，低钾胁迫24h后，碳点显著上调甘薯幼苗根系IbCBL1和IbCBL10基因表达，从而上调IbHAK5基因的表达。因此，上述结果表明本发明制备得到的碳点通过诱导低钾胁迫响应相关基因的上调表达来缓解低钾胁迫。
田间实验：在田间试验中，将20株优质的甘薯幼苗种植在缺钾的试验田中，4周后，将上述幼苗分为2组，分别用300mL蒸馏水(对照)和碳点浇灌，每周浇灌1次，连续浇灌5周。当甘薯生长8周后采收，随后利用ICP-MS测定甘薯块根中K+含量。
大田实验结果表明，施加碳点显著增加甘薯块根中K+含量，如图13所示，与对照相比，添加碳点后甘薯块根K+含量显著增加25％，上述结果为碳点提高甘薯植株K营养的吸收和利用提供了直接证据。
综上所述，在低钾胁迫下，碳点通过上调低钾胁迫响应相关基因的表达，从而促进甘薯幼苗K+内流，促进甘薯根系生长，增加甘薯叶片中K+含量，从而增强低钾胁迫下甘薯幼苗光合作用，缓解低钾胁迫。其中数据分析采用单因素方差分析和最小显著差法进行差异显著性检验，图中星号表示不同处理之间分别在p<0.01(**)和p<0.01(***)p<0.0001(****)，时，具有显著差异，“ns”表示没有显著差异。
由以上实施例可知，本发明所用的碳源均为天然的生物质，来源广泛，价格便宜，适宜在农业中广泛应用。本发明提供的碳点具有制备方法简单、产量高、水溶性好及生物相容性良好等特性，其在缓解植物低钾胁迫的应用方面具有显著效果。
Claims (6)
1.一种生物质碳点在缓解植物低钾胁迫中的应用，所述生物质碳点通过上调低钾胁迫响应相关基因的表达、促进植物根系K+内流来缓解低钾胁迫；
所述生物质碳点的制备方法包括以下步骤：
S1、将生物质均匀分散在蒸馏水中，生物质与蒸馏水之间的质量体积比为1g：（10 ~30）mL，搅拌10 ~ 20 min形成悬浮液；生物质为丹参粉末、甘薯秸秆粉末、红茶粉末、金银花粉末中的一种或多种；
S2、将步骤S1得到的悬浮液置于高压反应釜中，在100 ~ 210℃下反应4~12 h形成碳点溶液；
S3、将步骤S2得到的碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，除去杂质后获得纯净的生物质碳点。
2.根据权利要求1所述的一种生物质碳点在缓解植物低钾胁迫中的应用，其特征在于，步骤S1中，生物质与蒸馏水之间的质量体积比为1g：20mL，搅拌10 min。
3.根据权利要求1或2所述的一种生物质碳点在缓解植物低钾胁迫中的应用，其特征在于，步骤S2中，悬浮液在150℃下反应6 h形成碳点溶液。
4.根据权利要求1或2所述的一种生物质碳点在缓解植物低钾胁迫中的应用，其特征在于，步骤S3中，水系微孔滤膜的孔径为0.22 μm。
5.根据权利要求1所述的一种生物质碳点在缓解植物低钾胁迫中的应用，其特征在于，将生物质碳点配制成碳点浓度为0.3~2.0 mg/mL的碳点营养液。
6.根据权利要求5所述的一种生物质碳点在缓解植物低钾胁迫中的应用，其特征在于，将生物质碳点配制成碳点浓度为1.5mg/mL的碳点营养液。
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