CN108164588B - 棉花转运蛋白GhBASS5基因在植物耐盐中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于植物抗逆境研究技术领域，具体涉及一个棉花转运蛋白GhBASS5基因在植物耐盐中的应用的专利申请。该基因位于第12号染色体上，全长2649bp，包含8个外显子，7个内含子，cDNA全长1233bp，编码411个氨基酸，包含一个位于C端的高度保守功能结构域YfeH。GhBASS5基因是一个离子转运体基因，主要功能是进行依赖于Na⁺的丙酮酸转运。离子转运蛋白负责离子的吸收、外排或者转运，是植物响应盐、旱胁迫的重要组分。总体而言，对于棉花GhBASS5基因的深入研究，可为耐盐棉花植物新品种培育奠定一定理论和应用基础，同时也可为其他耐盐基因研究及应用奠定基础。

Description

棉花转运蛋白GhBASS5基因在植物耐盐中的应用

技术领域

本申请属于植物抗逆境研究技术领域，具体涉及一个棉花转运蛋白GhBASS5基因在植物耐盐中的应用的专利申请。

背景技术

土壤盐渍化（Soil sanility）是指土壤底层或地下水的盐分水分上升到地表，水分蒸发后，使盐分积累在表层土壤中的过程。目前我国土壤盐渍化问题相当严重，全国盐渍化土地约占全国土地面积的10%，并且这一现象仍有不断加剧的趋势。由于大多数农作物对盐渍环境敏感，土壤盐渍化对农业生产造成了严重的威胁，成为导致全国范围内多种粮食作物减产的一项重要原因。培育耐盐、抗旱作物新品种已成为缓解粮食安全问题的重要途径。

随着基因工程技术发展，对植物抗逆基因进行分离及功能鉴定，然后运用转基因的方法改变植物本身的性状，使之更好地适应逆境环境，己经成为改良作物品质、提高作物产量的重要手段。耐盐品种的获得依赖于对作物耐盐抗旱机制的深入研究，因而分离克隆耐盐、抗旱基因，研究其在盐、旱胁迫下的生理功能和耐逆机制，是获取耐盐抗旱新品种的重要途径，对未来农业的发展有着重要的意义，己成为全世界范围内的研究热点之一。

棉花是中等耐盐作物，在土壤饱和浸提液电导率大于7.7 dS m⁻¹的盐渍化土壤中生长时，才开始表现出减产，高于大多数粮食作物3.0 dS m⁻¹的盐胁迫耐受性。因此棉花被视为盐碱地的“先锋作物”，开发利用粮食作物不宜生长的盐碱薄地植棉，是稳定我国棉花生产的重要途径。而提高棉花的耐盐抗逆能力则是利用盐碱地植棉急需解决的首要问题。

BASS（Bile acid：sodium symporter，胆汁酸钠同向转运体或Na⁺共转运体），最初在哺乳动物肝中被证实是胆汁酸转运体。研究表明，BASS转运蛋白广泛存在于不同生物体中，并表现出保守的Na依赖特异底物转运活性，包括非胆汁酸有机化合物，如丙酮酸、类固醇等。

植物中最早鉴定的BASS基因是水稻OsSbf1(OsBASS2)，在差异筛选水稻响应乙烯诱导的基因时获得。研究表明，水稻OsSbf1的表达被生长诱导的处理所促进，如水淹、乙烯利及GA处理，Sbf蛋白的一种可能的功能是参与结构上相关的酯化油菜素内酯的转运。根据现有对拟南芥的AtBASS5、AtBASS6、AtBASS2、C4类植物黄顶菊FtBASS2的研究结果，推测BASS转运体家族成员定位于质体膜上，依靠Na⁺梯度进行特异底物的转运，所转运具体物质因具体物种不同、具体转运体不同而有所不同。因而，对于不同物种中不同的BASS家族蛋白的具体功能仍有必要加以深入研究。

发明内容

本申请主要是对棉花中转运蛋白基因GhBASS5的基因功能进行了初步研究，从而为相关耐盐机理及耐盐植物新品种奠定一定理论及应用基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一个棉花转运蛋白GhBASS5基因，该基因位于第12号染色体上，全长2649 bp，包含8个外显子，7个内含子，cDNA全长1233 bp，具体cDNA碱基序列如SEQ ID NO.1所示；该基因编码一个包含411个氨基酸的蛋白质，该蛋白包含一个高度保守、位于C端的结构域YfeH；

所述GhBASS5基因的cDNA序列，具体如下：

ATGAGTTCAACCACTGGTCAGTTCTTGATCCAGCGTCCACGATTCAATCATGTTTTCTTGCAAAACAATAGCTTTCATATACCTAAGCGAGTCCAGTTCTCAGTTTTGCCACAAAGTTCCTATATTCCTGTTCCACTCAGTTCATTTTCTCAGTTTAGGGGCTCTAAATTTTTGGAGTGTAAATGTGCATCAGAGAAAGTTTCAGAATCTTTTGAAAGGGACCCAGGTCAGGAATTTGAACCGGAACCAAATCAGATTGTTAAACAAAAGAAGGCTTCTGTAGTGGATATTTTGAAGCAATCAAATTCCATTCTGCCTCATGTAGTCCTTGCTAGTACAATTATGGCTCTTGTGTATCCGCCTTCTTTCACATGGTTTACCAGCAGGTACTATGCCCCTGCATTGGGTTTTTTGATGTTTGCAGTGGGGGTTAATTCCAGTGAGAAGGATTTTATTGAAGCATTTAAAAGGCCAGATGCTATTTTTGCTGGCTATGTTGGTCAATTTGTTGTGAAACCCCTGCTTGGATATATTTTTGGAATAATTGCTGTGACAGTGTTTGGTCTTCCTACTCCTTTAGCTGCAGGGATTATGTTGGTATCCTGCGTAAGTGGTGCCCAGCTCTCGAATTATGCTACATTTTTGACAGATCCACCACTAGCTCCATTAAGCATCGTTATGACATCTTTATCTACTGCTACTGCTGTTTTTGTTACACCAATGTTGTCTCTCCTGCTTATTGGAAAAAGACTGCCGGTTGATGTAGTGGGAATGGTTTCTAGCATTCTGCAGATTGTTATTGCTCCTATTACTGCAGGATTGCTTTTGAATCGGTTGTTCCCTCGTCTTTGTGAAGCCATGAGACCATTTCTGCCGCCGCTTTCTGTACTTGATACAGCTTGTTGTGTTGGAGCGCCCCTTGCTATTAACATTAATTCGGTTCTGTCCCCATTTGGCTTAACTGTTTCGTTGCTCATTGTTGCATTCCATTTATCAGCATTCATTGCTGGTTATTTCCTCAGTGGTTCACTCTTCCATAAAGCACCTGATGTGAAAGCATTGCAAAGAACACTACCTTTTGAGACAGGAATGCAAAGCAGTCTTTTGGCGCTTGCACTTGCTAATAGGTTCTTCCAGGATCCACTTGTCAGTGTGCCTCCAGCTATCTCGACTGTGATCATGTCACTGATGGGCTTCGCTCTGGTCATGATTTGGGCAAAGAAAAAAGAATAA。

一种获得棉花转运蛋白GhBASS5基因对应的cDNA的PCR克隆方法，具体包括如下步骤：

（一）提取棉花RNA，并反转录为cDNA；

（二）设计引物，进行PCR扩增，

设计引物序列如下：

GhBASS5-F：5'-CGGAATTCATGAGTTCAACCACTGGTCA-3'，

GhBASS5-R：5'-GAGGTACCCTTTGCCCAAATCATGACCA-3'；

以步骤（一）中所制备cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物长度为1233 bp。

所述棉花转运蛋白GhBASS5基因在棉花培育中的应用，GhBASS5基因是一个离子转运体基因，主要功能是进行依赖于Na⁺的酮酸转运。

棉花生产中，对陆地棉耐盐基因的克隆、鉴定及其功能分析，研究陆地棉盐胁迫应答机理，是遗传改良耐盐棉花新品种，提高陆地棉耐盐能力的重要基础。前期研究过程中，发明人通过对两个耐盐性差异显著的陆地棉材料的生理及表型分析，发现盐胁迫后敏盐材料叶片的Na⁺含量显著高于耐盐材料，并且根系表型差异较为显著。进一步转录组分析表明，GhBASS5基因在耐盐材料中的表达水平始终低于敏盐材料，可能对材料的耐盐差异有重要影响。

为进一步确定GhBASS5基因功能，利用基因沉默技术沉默了陆地棉（中棉79）中转运蛋白基因GhBASS5，对其具体生物学功能及非生物胁迫条件下的应答响应机制进行了初步分析；结果表明，GhBASS5基因是一个离子转运体基因，主要功能是进行依赖于Na⁺的酮酸转运。

离子转运蛋白负责离子的吸收、外排或者转运，是植物响应盐、旱胁迫的重要组分。总体而言，对于棉花GhBASS5基因的深入研究，可为耐盐棉花植物新品种培育奠定一定理论和应用基础，同时也可为其他耐盐基因研究及应用奠定基础。

附图说明

图1为GhBASS5基因结构示意图；分析表明，该基因位于棉花第12号染色体上，全长2649 bp，包含8个外显子，7个内含子，cDNA全长1233 bp，编码411个氨基酸；该基因包含一个高度保守、位于C端的结构域YfeH，它是胆汁酸转运体家族所特有的；

图2为GhBASS5 cDNAs全序列克隆的电泳检测图；

图3为从GenBank检索BASS蛋白序列后，在标准条件下使用MUSCLE6比对结果；比对时，使用具有标准参数的MEGA6创建了邻居树，Bootstrap分析用1000次重复进行，比例尺表示每个位点0.2个氨基酸取代；

图4为GhBASS5的组织表达分析结果。其中(A)为半定量PCR结果，(B)为荧光定量PCR结果；

图5为GhBASS5基因在不同耐盐品种间表达分析；

图6为GhBASS5基因在烟草叶片原生质体和棉花根部原生质体中的定位结果；

图7为分别注射pTRV:RNA2-GFP、pTRV:RNA2-GhBASS5、pTRV:RNA2-CLA的棉花植株在正常和400 mM NaCl 盐胁迫条件下的生长状况比较，左图为棉花表型结果，右图为株高统计结果；

图8为分别注射pTRV:RNA2-GFP、pTRV:RNA2-GhBASS5的棉花植株在正常土培和400mM NaCl 盐胁迫条件下叶片叶绿素含量比较；

图9为分别注射pTRV:RNA2-GFP、pTRV:RNA2-GhBASS5的棉花植株在正常土培和400mM NaCl 盐胁迫条件下叶片脯氨酸含量比较;

图10为分别注射pTRV:RNA2-GFP、pTRV:RNA2-GhBASS5的棉花植株在正常土培和400 mM NaCl 盐胁迫条件下叶片可溶性糖比较；

图11为分别注射pTRV:RNA2-GFP、pTRV:RNA2-GhBASS5的棉花植株在正常土培和400 mM NaCl 盐胁迫条件下叶片丙二醛含量比较；

图12为分别注射pTRV:RNA2-GFP、pTRV:RNA2-GhBASS5的棉花植株在正常土培和400 mM NaCl 盐胁迫条件下叶片SOD酶活比较；

图13为分别注射pTRV:RNA2-GFP、pTRV:RNA2-GhBASS5的棉花植株在正常土培和400 mM NaCl 盐胁迫条件下叶片POD酶活比较；

图14为分别注射pTRV:RNA2-GFP、pTRV:RNA2-GhBASS5的棉花植株在正常土培和400 mM NaCl 盐胁迫条件下叶片CAT酶活比较；

图15为分别注射pTRV:RNA2-GFP、pTRV:RNA2-GhBASS5的棉花植株在正常土培和400 mM NaCl 盐胁迫条件下根、茎、叶中Na⁺含量比较；

图16为分别注射pTRV:RNA2-GFP、pTRV:RNA2-GhBASS5的棉花植株在正常土培和400 mM NaCl 盐胁迫条件下根、茎、叶中K⁺含量比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料、实验试剂、实验设备等基本实验背景情况简要介绍如下。

生物材料

棉花材料：敏盐品种，中棉所G5（ZG5）；耐盐品种，中棉所07（Z07）；栽培种，中棉所79（Z79），均为可公开获得棉花品种；

具体栽培时，棉花在温室中种植，环境条件为：光照16 h、黑暗8 h，23~28 ℃条件下培养，相对湿度为50-70%；

质粒载体：VIGS体系的pTRV:RNA1、阳性对照pTRV:RNA2-CLA、阴性对照pTRV:RNA2-GFP、实验组pTRV:RNA2-GhBASS5；均按现有技术制备即可；

pMD19-T载体，购自于TAKARA公司；

生物菌株：大肠杆菌（E.coli）DH5α菌株（37℃条件下培养）、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株（28℃条件下培养），均为常用转化菌株，可由公开渠道获得；

引物合成及序列测序工作均由上海生工完成。

实验试剂：

大肠杆菌液体LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L ，pH为7.0~7.4；

农杆菌液体YEB培养基：牛肉膏5 g/L、酵母粉1 g/L、蛋白胨5 g/L、蔗糖5g/L、MgSO₄-7H₂O 0.5 g/L；

Amp（氨苄青霉素）、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）、Kan（卡那霉素）、Rif（利福平）、Gen（庆大霉素）、AS（乙酰丁香酮）等抗生素或蛋白表达诱导剂等溶剂母液，按现有技术制备保存即可，使用时将母液稀释至使用浓度即可；

PCR反应所用dNTP、Taq DNA Polymerase、PCR Buffer，均购于康为公司（CWBIO）；

T4-DNA连接酶、限制性内切酶，购于NEB公司；

SuperPure多糖多酚植物RNA快速提取试剂盒（SuperPure Plantpoly RNA Kit）、Gene Pure琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒General Plasmid Mini Kit（FOREGENE）、荧光定量PCR 试剂（Real Time PCR Kit），购于Gene Answer公司；

脯氨酸、磺基水杨酸、酸性茚三酮、硫代巴比妥酸等，购自Takara公司；

其他常用试剂如乙醇、丙酮、甲苯、三氯乙酸、蒽酮、PVP、甲硫氨酸、NBT、愈创木酚等均为国产分析纯，不再详述。

实验设备：

高速冷冻离心机H1858R，湖南湘仪实验设备开发有限公司；

稳压稳流电泳仪DYY-8B，北京市六一仪器厂；

PCR扩增仪T100，伯乐生命医学产品（上海）有限公司；

凝胶成像系统TC-2020D-Ⅱ，北京沃德；

荧光定量PCR仪Rotor-Gene3000，澳大利亚CORBETTRESEARCH；

紫外分光光度计UV-2450，日本snimadzu公司；

超微量核酸蛋白测定仪Nano Drop 2000，芯起点基因科技(北京)有限公司；

火焰光度计FP640，上海忻一精密仪器有限公司。

实施例1

前期对比耐盐棉花Z07和敏盐棉花材料ZG5研究基础上，发明人认为GhBASS5基因与棉花耐盐性高度相关，为此，发明人对于GhBASS5基因进行了具体克隆和分析。

（一）提取棉花RNA，并反转录为cDNA，

因棉花组织中富含多糖多酚，因此用Gene Answer公司的SuperPure多糖多酚植物RNA快速提取试剂盒（SuperPure Plantpoly RNA Kit）提取棉花的RNA（具体提取步骤，参考试剂盒说明书进行操作即可）；

对所提取RNA采用DNasel消化去除DNA后，采用晶彩生物的M-MLV反转录试剂盒进行RNA反转录以制备cDNA（相关操作参考试剂盒说明书进行操作即可）。

（二）设计引物，进行PCR扩增，

设计引物序列如下：

GhBASS5-F：CGGAATTCATGAGTTCAACCACTGGTCA，

GhBASS5-R：GAGGTACCCTTTGCCCAAATCATGACCA；

以步骤（一）中所制备cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物长度为1233bp；50μL扩增体系设计如下：

10xTaq PCR Buffer with Mg²⁺，5.0μL；

dNTP Mix，2.5mM、4.0μL；

GhBASS5-F引物，10μM、2.0μL；

GhBASS5-R引物，10μM、2.0μL；

模板cDNA，1.0μL；

Taq DNA Polymerase，5U/μL、0.25μL；

RNase-Free Water加至50μL；

PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃、30 s，57℃、30 s，72℃、70 s，35个循环；72℃终延伸5 min；

对PCR扩增产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳分析检测，并将目的片段切胶回收纯化。

（三）与T载体连接，并转化，

将步骤（二）中回收产物与T载体（pMD19-T Vector）连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用含Amp 的LB培养基进行抗性筛选，对阳性克隆摇菌扩增后，采用试剂盒General Plasmid Mini Kit（FORE GENE）提取质粒，对所提取质粒采用KpnⅠ、XbaⅠ酶进行双酶切验证，将酶切验证正确的质粒进一步进行测序，以获得GhBASS5基因的cDNA序列，该cDNA序列全长1233 bp，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示（或者参见前述“发明内容”部分内容即可）。

对于GhBASS5基因结构分析后，其结构示意图如图1所示（cDNA电泳检测结果如图2所示）。分析表明，GhBASS5位于第12号染色体上，全长2649 bp，包含8个外显子，7个内含子，cDNA全长1233 bp，编码411个氨基酸，包含一个高度保守、位于C端的结构域YfeH，它是Na依赖胆汁酸转运体家族所特有的。

利用ClustalW（www.ebi.ac.uk/clustalw/）对GhBASS5蛋白序列进行在线比对，比对对象包含人类、酵母、拟南芥等；序列结构分析结果表明：它们都含有10个跨膜结构，且序列高度保守，蛋白序列折叠后有两个Na⁺特异结合位点，SN-LS-ST-P-E和ET-MQ。

进一步地，将GhBASS5蛋白的氨基酸序列在BLAST上进行同源性比对分析（将同源性高的一些序列进行下载及序列比对，包含人类、拟南芥、高粱、水稻、可可、雷蒙德式棉、亚洲棉、陆地棉A和D组），利用MEGA6的N-J算法构建系统进化树。结果如图3所示。分析表明，在其序列进化过程中基本没有发生突变，高度保守，说明该基因所编码的蛋白在植物中起着稳定且重要的作用。

实施例2

本实施例介绍如何构建基因沉默载体，转化沉默植株基因，具体过程详细介绍如下。

首先，准备烟草脆裂病毒（TRV: tobacco rattle virus）VIGS系统，具体包括：病毒复制酶载体pTRV:RNA1（RNA1包括3部分基因片段：分别为烟草脆裂病毒的病毒复制酶基因，RNA聚合酶基因，移动蛋白基因）农杆菌菌落，转化效应对照载体pTRV:RNA2-CLA（RNA2包括烟草脆裂病毒的外壳蛋白和其他必须结构蛋白基因，经过改造后用于连入目标沉默基因的片段）农杆菌菌落，转化阴性载体pTRV:RNA2-GFP农杆菌菌落，以及pTRV:RNA2载体的农杆菌菌落；

同时，按照现有技术扩增GhBASS5特异片段后，构建获得沉默载体pTRV:RNA2-GhBASS5，并转化、筛选获得相应的阳性农杆菌菌落；

将上述含有重组载体的阳性农杆菌菌落分别到YEB培养基（Kan: 100 mg/ml,Gen:30 mg/ml, Rif: 20 mg/ml）中，28℃、180 rpm培养至OD₆₀₀为1.5左右；然后将菌液6000rpm离心6 min收集菌体细胞，并以适当体积的重悬液（200 μmol/L As，10 mmol/L MgCl₂，10 mmol/L MES 1 M）重悬菌体，至终浓度为1.5（OD₆₀₀），将重悬液于室温下静置3 h待用；

再分别将含pTRV:RNA1与pTRV: RNA2-GhBASS5、pTRV:RNA2-CLA、pTRV:RNA2-GFP载体的农杆菌重悬液分别按体积比1：1混匀（即：pTRV:RNA1与pTRV:RNA2-GhBASS5，pTRV:RNA1与pTRV:RNA2-CLA，pTRV:RNA1与pTRV:RNA2-GFP的混合液）作为注射棉花子叶用菌液。

其次，将陆地棉79的种子经浓硫酸脱绒，在自来水下冲洗半小时，在培养皿中加入水后放入棉花种子，置于水平摇床上过夜，待种子露白后，将种子移到由蛭石与营养土（1：3）的混合物中，置于28℃、光照16 h黑暗8 h培养，培养10 d左右待子叶完全展开，但真叶还未长出时，准备接种菌液进行转化。

第三，接种转化，具体而言：准备1 mL的注射器，用注射器针头在棉花子叶背面扎孔但不扎穿，每片子叶4个孔，然后用去掉针头的注射器吸取菌液，在背面有孔的位置注射菌液，使菌液完全进入叶片，两片子叶都进行注射；待注射完毕后，将棉花进行避光培养过夜，第二天转到光照16 h黑暗8 h条件下培养。

接种农杆菌两周后观察棉花植株的生长状况，当观察到阳性对照组棉花植株叶片出现白化或白斑时（图7），说明接种的棉花植株体内已形成了病毒系统性侵染，表明该VIGS系统是有效的，目的基因应已被沉默，得到了GhBASS5基因沉默的棉花植株。

待注射过含pTRV:RNA2-CLA菌液的阳性对照植株出现白化表型时，取注射含pTRV:RNA2-GhBASS5和阴性对照pTRV:RNA2-GFP的棉花植株的幼嫩真叶，提取RNA，经反转录获得cDNA，进行半定量PCR检测GhBASS5基因的表达量。

半定量PCR检测引物序列设计如下：

sRTBASS5-F: TCAGTTCTTGATCCAGCGTCCACGATT，

sRTBASS5-R:TGGCTCTTGTGTATCCGCCTTCTTTCA；

β-actin F：TGGTGTCATGGTTGGGATGG，

β-actin R：CGTGAGAAGAACAGGGTGCT；

分别以注射pTRV:RNA2-GhBASS5和阴性对照pTRV:RNA2-GFP的棉花幼嫩真叶的cDNA做模板，以β-actin作为内参基因，半定量检测GhBASS5表达量；20 μL半定量PCR扩增体系设计如下：

模板cDNA，0.8 μL；

F引物，10 μM、0.8 μL；

R引物，10 μM、0.8 μL；

10x Taq PCR Buffer with Mg²⁺，2.0 μL；

dNTP Mix，2.5 mM、1.6 μL；

Taq DNA Polymerase，5 U/μL、0.1 μL；

RNase-Free Water，13.9 μL；

PCR反应如下：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，22个循环；分别将所得的RT-PCR产物经琼脂糖凝胶跑胶检测，比较实验组和对照组目的基因和内参基因的表达量。

结果表明：GhBASS5在pTRV:RNA2-GhBASS5注射株中被沉默，而在pTRV:RNA2-GFP注射株中仍正常表达（图5）；即，本实施例成功获得了GhBASS5基因沉默的棉花植株，可用于后续的进一步的盐胁迫研究中。

实施例3

利用实施例2所获得的GhBASS5基因沉默的棉花植株，发明人对GhBASS5基因在表达模式、基因定位、耐盐应答调节等方面进行了进一步研究，相关实验简要介绍如下。

（1）GhBASS5基因表达模式

参考实施例1的相关操作，首先分别提取棉花不同组织（根、茎、叶及花）样品的RNA，并反转录获得cDNA；

以β-actin、UBQ7为双内参基因，设计引物序列如下：

β-actin F：TGGTGTCATGGTTGGGATGG，

β-actin R：CGTGAGAAGAACAGGGTGCT；

UBQ7-F：AGAGGTCGAGTCTTCGGACA，

UBQ7-R：GCTTGATCTTCTTGGGCTTG；

qRTBASS5-F：ACCCAGGTCAGGAATTTGAACCGGAA，

qRTBASS5-R：AAAACCCAATGCAGGGGCATAGTACCT；

以所制备的cDNA为模板，进行荧光定量PCR分析，20 μL qPCR反应体系设计如下：

模板cDNA，1.0 μL；

F引物，10 μM、0.8 μL；

R引物，10 μM、0.8 μL；

2×SYBR qPCR Mix，10.0 μL；

DEPC-ddH₂O，7.4 μL；

PCR循环（三步法）如下：94℃ 预变性 10 min；94℃变性15 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，40个循环；65℃至95℃ (融链曲线循环)。

反应体系扩增完成后，对荧光值变化曲线以及融链曲线进行分析，设置3个生物学重复，每个样品的模板设3个重复，再用2^-△△ct法计算，求得平均值，并对数据进行分析处理。

如图4、5所示，发明人比较了GhBASS5在不同棉花品种不同组织间的表达差异，分析其表达水平与材料耐盐能力之间的相关性。图4检测了GhBASS5在不耐盐的常规栽培种Z79根、茎、叶中的表达，发现GhBASS5在各组织均有表达，但在根中表达量较高。图5检测了耐盐品种Z07和敏盐品种ZG5根、茎、叶中GhBASS5的表达量，发现GhBASS5在敏盐品种ZG5和耐盐材料Z07中的表达与Z79一致，在根中表达量较高，但在Z07的根、茎和叶中表达量显著低于敏盐材料。因此可以推测GhBASS5在根中的表达量与棉花的耐盐呈负相关，降低GhBASS5在根中的表达水平，可利于棉花耐盐性的提升。

（2）GhBASS5基因的亚细胞定位

第一步，构建植物表达载体pCAMBIA3301-GhBASS5-GFP，具体而言：参考实施例1操作，PCR扩增获得GhBASS5基因全长序列，并与pMD19-T Vector连接，获得重组GhBASS5-T质粒。

第二步，分别将pCAMBIA3301-GFP质粒（含GFP基因）与GhBASS5-T质粒进行SphⅠ酶切，50 μL酶切，体系参考设计如下：

pCAMBIA3301-GFP质粒（或重组质粒GhBASS5-T），10 μL；

CutSmart， 5 μL；

SphⅠ，1 μL；

ddH₂O，34 μL；

37℃水浴3 h；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的片段。

第三步，将酶切后所回收产物进行连接，10 μL连接体系设计如下：

pCAMBIA3301-GFP酶切产物，1.5 μL；

重组质粒GhBASS5-T酶切产物（目的基因片段），6.5 μL；

T4 DNA连接酶，1 μL；

T4 DNA ligase Buffer，1 μL；

16℃连接过夜。

第四步，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并进行抗性筛选、酶切验证，以确保质粒pCAMBIA3301-GhBASS5-GFP构建正确，对构建正确的菌株扩增后提取质粒备用。

第五步，制备棉花叶片原生质体和棉花根部原生质体，将pCAMBIA3301-GhBASS5-GFP转化原生质体，具体如下：

选取陆地棉栽培种Z79饱满的种子，将其播种在蛭石与营养土混合土壤中（质量混合比为2:1），光照培养室中自然生长，28℃、12 h光培养/25℃、12 h暗培养)10~14 d左右，其间不定时观察幼苗状态，以防叶片严重失水；选取子叶完全伸展时，真叶一心左右的棉花子叶作为提取棉花原生质体的外植体材料；

配制10 mL的酶液：其中含有8 mL ddH₂O、1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、20 mmol/LKCl、0.4 mmol/L甘露醇、20 m mol/L MES；充分溶解后，45℃水浴10 min，自然冷却后，再加入1.0g/L BSA、0.1 mol/L CaCl₂，经过0.45 μm纤维素微孔滤膜过滤后待用；

将待提取棉花原生质体的外植体材料用刀片切下，用单面刀片切割子叶叶片，切割子叶细条宽度为0.5-1.0 mm左右；将约1.0 g叶片切成细丝放置酶解液中，使之充分混合，26℃避光，放在摇床上40 rpm轻摇5-10 h；酶解至子叶叶肉完全酶解，叶片只剩一层薄薄的表皮，混合液为绿色为止；

待酶解结束后，加入等体积(10 mL)的W5溶液(4 mmol/L MES、125 mmol/L CaCl₂、154 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl，用1 mol/L HCl调pH至5.7)，缓缓冲洗酶解混合液中的残余叶片和培养皿底部；用枪头缓慢吸取混合液，用尼龙网（孔径为30 μm）过滤至50 mL的离心管中，放在离心机中100 g离心2 min；弃上清液，加入2 mL W5溶液洗一次原生质体，加入2 mL W5溶液重新悬浮，在冰上放置30 min沉淀原生质体；

用0.1 mm血球记数板来统计棉花原生质体的数量，用0.02%荧光素双醋酸(FAD)来测定原生质体活性；将计数后的原生质体用MMG溶液(0.4 mol/L 甘露醇、15 mmol/LMgCl₂、4 mmol/L MES，用1 mol/L HCl调pH至5.7)，调节浓度到2×10⁵个/mL；

取2 mL的离心管加入稀释好的原生质体-MMG 200μL，再加入15 μg 的pCAMBIA3301-GhBASS5-GFP质粒，轻轻晃动EP管混匀，室温放置5-10 min，再缓慢加入等体积的配置好的40% PEG4000，室温放置5-10 min；然后向EP管中缓慢加入880 μL的W5，重悬原生质体，终止转化；放入离心机中100 g离心2 min，小心吸取上清液，勿将原生质体悬浮，加1mL WI溶液(4 mmol/L MES，0.5 mol/L 甘露醇，20 m mol/L KCl)，将混合液转移至用1.0 g/L BSA冲洗过得六孔板中于26℃培养箱中暗光培养12-16 h；

将培养后的原生质体放在离心机中200 g离心1 min，吸取上清，用20 μL重悬。

用共聚焦显微镜观察转化结果，转化结果中，图中绿色为GFP蛋白所发荧光，红色是棉花叶肉原生质体叶绿体的自发荧光，黄色为两种巧光叠加之后的效果，还有白光时为原生质体的图像。

烟草原生质体和棉花根部原生质体对GhBASS5进行亚细胞定位，结果如图6所示，发现其在定位在质体膜，叶中定位在叶绿体外被膜，根中定位于白色质体膜。

（3）GhBASS5共表达分析

GhBASS5在已公布的陆地棉基因组数据中找到其对应的基因编号为GhA12G2036。在棉花基因共表达数据库http://bioinformatics.cau.edu.cn/ZhenSuLab/database.html中对GhA12G2036进行共表达分析。

综合分析表明，GhBASS5是一个转运蛋白，其共表达基因为编码K⁺、Ca²⁺、ATP、2-酮酸等的转运蛋白。

（4）盐胁迫前后植株表型及生理变化情况

选取在营养钵中生长状况一致的棉花VIGS：GFP植株和生长一致的VIGS：BASS5棉花植株进行盐胁迫试验（实施例2所制备），每组处理做三个重复。每隔一天给VIGS：GFP棉花植株和VIGS：BASS5棉花植株浇灌氯化钠水溶液，每个营养钵施盐量相等，盐分完全溶解，对照组浇等量清水。连续12 d的盐胁迫处理后取材，测量叶片叶绿素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量等各项生理指标。

（4.1）株高(cm)变化情况

对胁迫组和对照组材料的株高情况进行统计，结果如图7所示，去离子水处理的不同棉花植株的株高无明显差异；而盐胁迫处理后，不同棉花植株的生长均受到抑制，但GhBASS5沉默株被抑制程度显著弱于阴性对照组(VIGS-GFP)。

（4.2）叶绿素含量(mg/g FW)变化情况

棉花叶片中叶绿素含量的测定：用丙酮:无水乙醇:水（体积比为4.5:4.5:1）混合均匀后配制成叶绿素提取液，取处理后各样本的棉花叶片0.5 g，将材料剪成细丝状放入试管中，加5 ml提取液，用塞子塞好试管口，17℃黑暗条件下放置过夜，待细丝完全变白，取上清，以提取混合液作对照，测定在645 nm和663 nm波长处的吸光值，通过Arnon公式算得叶绿素的含量（mg·g^-1 FW），具体而言：

叶绿素a=（12.7 D663-2.69 D645）V/(1000×W)；

叶绿素b=（22.9 D645-4.68 D663）V/(1000×W)；

叶绿素总含量=（20.2 D645+8.02 D663）V/(1000×W)；

其中V代表叶绿素提取液体积（ml）；W为取的叶片鲜重（g）。

不同组棉花中叶绿素含结果如图8所示。去离子水处理条件下，沉默GhBASS5使得棉花叶片中的叶绿素含量上升；施加盐胁迫处理后，实验组和对照组棉花叶片中叶绿素含量均升高，但VIGS-GhBASS5沉默组的上升量显著高于VIGS-GFP的阴性对照组以及无处理的正常对照组，反应了实验组的生长状况优于对照组。

（4.3）脯氨酸含量(mg/g FW)变化情况

棉花叶片中脯氨酸含量的测定：

首先，绘制标准曲线，以零浓度为对照，测定不同脯氨酸浓度下520 nm的光吸收值制备脯氨酸标准曲线。

之后，测定样品中脯氨酸含量，具体步骤为：

称取盐胁迫处理后的棉花叶片，每个处理取三份，每份0.5 g；剪碎后放入试管中，加3%的磺基水杨酸5 ml，封口，置于沸水中水浴10 min，期间要进行间隔摇动。

待溶液冷却后，3000 r/min离心10 min，取2 ml上清，加2 ml水、2 ml冰醋酸、4 ml2.5%的酸性茚三酮，密封管口，沸水浴1 h，至溶液呈现红色。

冷却后取5 ml加4 ml甲苯，摇动30 s，静置，取上层液测其在520 nm下的光吸收值；

根据公式 (μg·g^-1FW)=(CV/a)/w，求出脯氨酸含量，脯氨酸含量。

其中，C：根据标准曲线查得脯氨酸的微克数；V：提取液总体积（ml）；a：测定液体积（ml）；w：样品鲜重（g）。

对棉花叶片脯氨酸含量进行测定和统计，结果如图9所示。分析可以看出，在水处理条件下，不同VIGS处理棉花材料间叶片中脯氨酸没有差异；施加盐胁迫后，VIGS-GFP的阴性对照组以及无处理的正常对照组的棉花叶片中脯氨酸含量均显著上升，而VIGS-BASS5组未出现显著变化。

脯氨酸是植物应答盐胁迫而积累的重要保护剂，一方面作为渗调剂对植物细胞的渗透调节具备着重大作用，另一方面还能够作为植物的氮源以及细胞的保护剂维护其结构完整，避免质膜的通透性发生改变，有效维持质膜的完整结构，维持膜结构保持在稳定状态。因此，盐胁迫后，VIGS-BASS5植株的脯氨酸含量未出现显著变化，反映了同等盐胁迫条件系下，沉默GhBASS5棉花受到的盐胁迫程度明显低于GhBASS5表达正常株，表明沉默GhBASS5提高了棉花的耐盐性。

（4.4）可溶性糖含量(mg/g FW)变化情况

棉花叶片中可溶性糖含量的测定，具体而言：

首先，制作可溶性糖标准曲线：取6支大试管，从0-5分别编号，按下表加入各试剂；

蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量

将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮10 min，取出冷却，在620 nm波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，以含葡萄糖量(μg)为横坐标绘制标准曲线。

之后，测定样品的可溶性糖含量，步骤如下：

分别取实施例2中不同条件处理后的棉花叶片，每种处理各取三份，每份0.5 g，放入大试管中，加入15 mL蒸馏水，在沸水浴中煮沸20 min，取出冷却，过滤入100 mL容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。

取待测样品提取液1.0 mL，加蒽酮试剂5 mL，同以上操作显色测定光密度。重复3次。结果计算：

可溶性糖含量（％）＝C × VT × 稀释倍数/[V1 × W × 10⁶] × 100；

式中：C——从标准曲线查得葡萄糖量，μg；

VT——样品提取液总体积（mL）；

V1——显色时取样品液量（mL）；

W ——样品重（g）。

对不同条件处理后的棉花叶片可溶性糖含量进行测定和统计，结果如图10所示。可以看出，在水处理条件下，沉默GhBASS5会显著增加棉花叶片中的可溶性糖含量，并在盐胁迫后保持不变。而在盐胁迫处理条件下，VIGS-GFP的阴性对照组和野生型对照组棉花叶片中可溶性糖含量相比于水处理组均显著上升，并显著高于GhBASS5沉默棉花。

可溶性糖与脯氨酸相似，是植物应答盐胁迫而积累的重要保护剂。沉默GhBASS5显著增加棉花叶片中的可溶性糖含量并在盐胁迫无显著变化，而VIGS-GFP的阴性对照组和野生型对照组棉花在盐胁迫后可溶性糖含量显著升高。可溶性糖含量变化结果说明，沉默GhBASS5可以提高棉花可溶性糖含量，增加棉花的耐盐性。

（4.5）丙二醛（MDA）含量(μM)变化情况

棉花叶片中丙二醛含量的测定：

首先，提取丙二醛，步骤如下：

称取盐胁迫处理后的棉花叶片1 g，加少量的石英砂和2 ml 10％三氯乙酸，研磨成匀浆，再加8 ml 10％三氯乙酸继续研磨，4000 r/min离心10 min，其上清液即为丙二醛提取液。

之后，进行显色反应及测定，具体而言：对试管进行编号，在试管中分别加2 ml提取液，2 ml 0.6％硫代巴比妥酸溶液，对照则加2 ml ddH₂O，2 ml 0.6％硫代巴比妥酸溶液；混匀后在沸水浴中煮沸15 min，将试管放置水中迅速冷却，6000 r/min离心10 min；取上清，用分光光度计分别在532 nm、600 nm和450 nm波长下测吸光光度值（A）；

丙二醛含量的计算：C_MDA= 6.45 × (A532-A600) − 0.56 × A450（μmol·L^-1）；

提取液中MDA浓度（μmol·ml^－1）= C_MDA × 反应液体积（ml）/测定时提取液用量（ml）

MDA含量（μmol·g^-1 FW）=提取液中MDA浓度（μmol·ml^-1）× 提取液总量（ml）/植物组织鲜重（g）/1000。

对棉花中丙二醛含量进行测定和统计，结果如图11所示。与可溶性糖类似，在水处理条件下，沉默GhBASS5使得棉花叶片中的丙二醛含量显著增加，并在盐胁迫后保持不变。而在盐胁迫处理后对照组棉花叶片中丙二醛含量显著上升，并显著高于GhBASS5沉默株。

丙二醛是膜脂过氧化最重要的产物之一，因此在植物抗性生理研究中MDA含量是一个常用指标，可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。沉默GhBASS5提高了棉花叶片的丙二醛含量，可能反映了沉默GhBASS5会使得棉花的过氧化水平升高，这会使得GhBASS5沉默株在正常生长条件下启动了抗性应答，并积累抗逆物质，从而提高抗逆性。

（4.6）SOD、POD、CAT酶活含量(U /mg protein)变化情况

棉花叶片氧化还原酶活测定，步骤如下：

首先，提取不同处理棉花材料叶片SOD、POD、CAT粗酶液：将研钵121℃灭菌20 min，烘干并放入冰箱-20℃预冷；称取0.5 g棉花叶片，置于-20℃预冷的研钵中，加入5 ml预冷50 mM PBS缓冲液（pH=7.8，含有1%（W/V）PVP），迅速研磨成匀浆，再加入5 ml预冷的PBS缓冲液冲洗研钵，并将用于冲洗的PBS缓冲液转入离心管中，12000 rpm，4℃离心10 min，上清即为粗酶液，可用于SOD、POD、CAT酶活的测定。

其次，测定SOD酶活性。超氧化物歧化酶（SOD）活力的测定采用氧化硝基四氮唑蓝比色法。该方法的原理是：SOD可以歧化超氧化物形成H₂O₂和O₂，在有氧条件下，核黄素可产生超氧阴离子O^2-，这些超氧阴离子在在光照条件下与NBT结合生成甲腙，而甲腙在560 nm处有最大吸收峰，通过测定甲腙的吸光度来测定SOD活性。

第三，测定POD酶活力。过氧化物酶（POD）活力测定采用愈创木酚比色法。该方法的原理是：POD能够催化H₂O₂和愈创木酚产生红棕色物质，因此检测这种物质在470nm波长处吸光度的变化即可计算出POD酶活性，单位时间内生成的红棕色物质4-邻甲基苯酚越多，说明POD的活性越强。

第四，测定CAT酶活力。过氧化氢酶（CAT）可分解H₂O₂，而H₂O₂在240 nm波长处有最大吸收峰，以H₂O₂为底物，单位时间内H₂O₂减少的越多，则表明该样品CAT活性越高。

对棉花中SOD、POD、CAT酶活含量进行测定和统计，结果如图12、图13、图14所示。在在水处理条件下，沉默GhBASS5使得棉花叶片中的SOD和CAT的酶活升高，POD酶活下降；而施加盐胁迫后，GhBASS5沉默株降低了SOD酶活，并显著增强了POD酶活。反观对照株发现，其SOD、CAT、POD酶活在盐胁迫后均被增强。

盐胁引发的迫渗透胁迫和离子毒害会引起植物细胞代谢失衡，产生大量氧化胁迫，酶类抗氧化剂包括超氧化物类歧化酶(SOD)与过氧化物酶（POD）以及过氧化氢酶（CAT）可以清除氧化胁迫。

正常生长条件下，增强SOD酶活可以清除植物体内自由基，形成H₂O₂和O₂，而减低POD活性可以减低H₂O₂的代谢，这可以使得棉花的过氧化水平升高，促使正常生长条件下GhBASS5沉默棉花材料启动抗性应答，积累抗逆物质，从而提高抗逆性。而在胁迫条件下，过高的H₂O₂会造成严重的氧化胁迫，因而降低SOD酶活、提高POD活性将有助于降低植物体内H₂O₂水平，增强棉花耐盐能力。

（4.7）植株体内Na⁺、K⁺含量变化情况

棉花根、茎、叶中Na⁺，K⁺含量的测定：

首先，取实施例2中不同处理组的棉花根，茎，叶材料，70℃烘干。用植物粉碎机磨细过l mm筛，准确称取1 g根，茎，叶粉末置于250 ml三角瓶内，加入30 ml硝酸-高氯酸(5:1)混合酸，瓶口放一只弯颈漏斗，静置过夜。第二天，在通风柜内用控温电炉消煮，释放棕色NO₂气体，至冒白烟，升高炉温消煮至溶液透明。冷却后，加入20 ml无离子水，经定性滤纸过滤到250 ml容量瓶内。用去离子水定容，摇匀，作为待测溶液。

其次，制备钾、钠混合标准工作溶液系列，取5只100ml容量瓶，分别加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 100 μg/mL钾标准液和0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL 100 μg/mL钠标准液，再分别加入2 ml 5% CsCl溶液，用无离子水定容。

第三，取2-10 mL待测溶液和空白分别置于100 mL容量瓶，加入2 mL 5% CsCl溶液，用去离子水定容。用空气——C₂H₂气火焰法，分别在766.5 nm和589.0 nm测定钾和钠吸光值；绘制标准工作曲线，并将标准溶液输入仪器，读出浓度值。

植物组织中钾、钠的百分比含量可按下式计算：

K、Na (%) = (C × D ×体积)/（重量× 100000）；

式中：C——从标准工作曲线直接读出的浓度（μg/mL）；D——稀释倍数。

对棉花不同组织中Na⁺、K⁺含量进行测定和统计，结果如图15~16所示。

在水处理的情况下，VIGS-BASS5沉默株和VIGS-GFP对照株相比，根、茎、叶中的Na⁺、K⁺含量无差异（图15，图16）。在盐胁迫处理后，VIGS-BASS5沉默株根、茎、叶中的Na⁺含量均显著低于VIGS-GFP对照株（图15）。盐胁迫处理后，VIGS-BASS5沉默株根、茎中K⁺含量与水处理的情况下相比无显著变化，但叶部K⁺含量升高，而VIGS-GFP对照株根、茎中的K⁺含量则显著下降。沉默GhBASS5使盐胁迫下进入棉花体内的Na含量低于正常对照，并使得叶部K含量高于对照，这使得GhBASS5沉默株棉花更耐盐。

综合上述结果，可以对GhBASS5基因应答盐胁迫的调控机制简要概括如下：GhBASS5是钠：胆汁酸转运蛋白家族基因，其蛋白序列保留了该家族基因两个极为保守的钠离子转运位点，可能反映了GhBASS5的钠依赖性；GhBASS在棉花根中表达量高，蛋白分析发现其在叶片细胞中位于叶绿体外被膜上，而在根细胞中定位于紧邻细胞膜的白质体膜中。GhBASS5在棉花遭受盐胁迫后表达量下降，盐胁迫下，沉默GhBASS5使得棉花处于一个相对稳定的应答状态中，根茎叶中的钠离子含量显著低于对照组。沉默GhBASS5降低了棉花对于钠离子的吸收，降低了棉花地上部的钠含量，提高了棉花的耐盐能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学

中国农业科学院棉花研究所

中棉种业科技股份有限公司

<120> 棉花转运蛋白GhBASS5基因在植物耐盐中的应用

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1233

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum

<400> 1

atgagttcaa ccactggtca gttcttgatc cagcgtccac gattcaatca tgttttcttg 60

caaaacaata gctttcatat acctaagcga gtccagttct cagttttgcc acaaagttcc 120

tatattcctg ttccactcag ttcattttct cagtttaggg gctctaaatt tttggagtgt 180

aaatgtgcat cagagaaagt ttcagaatct tttgaaaggg acccaggtca ggaatttgaa 240

ccggaaccaa atcagattgt taaacaaaag aaggcttctg tagtggatat tttgaagcaa 300

tcaaattcca ttctgcctca tgtagtcctt gctagtacaa ttatggctct tgtgtatccg 360

ccttctttca catggtttac cagcaggtac tatgcccctg cattgggttt tttgatgttt 420

gcagtggggg ttaattccag tgagaaggat tttattgaag catttaaaag gccagatgct 480

atttttgctg gctatgttgg tcaatttgtt gtgaaacccc tgcttggata tatttttgga 540

ataattgctg tgacagtgtt tggtcttcct actcctttag ctgcagggat tatgttggta 600

tcctgcgtaa gtggtgccca gctctcgaat tatgctacat ttttgacaga tccaccacta 660

gctccattaa gcatcgttat gacatcttta tctactgcta ctgctgtttt tgttacacca 720

atgttgtctc tcctgcttat tggaaaaaga ctgccggttg atgtagtggg aatggtttct 780

agcattctgc agattgttat tgctcctatt actgcaggat tgcttttgaa tcggttgttc 840

cctcgtcttt gtgaagccat gagaccattt ctgccgccgc tttctgtact tgatacagct 900

tgttgtgttg gagcgcccct tgctattaac attaattcgg ttctgtcccc atttggctta 960

actgtttcgt tgctcattgt tgcattccat ttatcagcat tcattgctgg ttatttcctc 1020

agtggttcac tcttccataa agcacctgat gtgaaagcat tgcaaagaac actacctttt 1080

gagacaggaa tgcaaagcag tcttttggcg cttgcacttg ctaataggtt cttccaggat 1140

ccacttgtca gtgtgcctcc agctatctcg actgtgatca tgtcactgat gggcttcgct 1200

ctggtcatga tttgggcaaa gaaaaaagaa taa 1233

Claims (2)

1.棉花转运蛋白GhBASS5基因在培育耐盐棉花中的应用，其特征在于，所述棉花转运蛋白GhBASS5基因，其cDNA碱基序列如SEQ ID NO.1所示；GhBASS5基因是一个离子转运体基因，主要功能是进行依赖于Na⁺的酮酸转运；

GhBASS5基因用于耐盐棉花培育时，GhBASS5基因与棉花耐盐性相关，GhBASS5沉默株棉花更耐盐。

2.如权利要求1所述棉花转运蛋白GhBASS5基因在培育耐盐棉花中的应用，其特征在于，通过PCR克隆方法来获得棉花转运蛋白GhBASS5基因对应的cDNA，具体PCR克隆时，包括如下步骤：

（一）提取棉花RNA，并反转录为cDNA；

（二）设计引物，进行PCR扩增，

设计引物序列如下：

GhBASS5-F：CGGAATTCATGAGTTCAACCACTGGTCA，

GhBASS5-R：GAGGTACCCTTTGCCCAAATCATGACCA；

以步骤（一）中所制备cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物长度为1233bp。

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