CN101805743A - 一种提高光合作用效率转基因盐藻的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种提高光合作用效率转基因盐藻的制备方法，其特征在于：克隆或者改造光合自养生物的碳固定及光合作用相关基因，而后将它们转入盐藻叶绿体基因组或者核基因组中表达，再进行继代选择性培养，最终得到稳定的转基因盐藻藻株。本发明通过导入高效的碳固定及光合作用相关基因的单独或组合表达，提高转基因盐藻中CO₂的浓度和转化速度，使这种转基因盐藻利用CO₂进行光合作用的能力得到提升，从而促进转基因盐藻的自养生长，加快和提高盐藻细胞生物量的积累，满足生物柴油以及代谢产物和基因工程产品的规模化生产要求。

Description

一种提高光合作用效率转基因盐藻的制备方法

技术领域

本发明涉及微藻基因工程，是一种提高光合作用效率转基因盐藻的制备方法，具体是通过克隆或者改造光合自养生物的碳固定及光合作用相关基因，导入盐藻基因组中单独或组合表达，提高盐藻利用CO₂进行光合作用的能力，加快和提高盐藻细胞生物量的积累，满足开放式培养条件下盐藻生物柴油以及盐藻代谢产物和基因工程产品的规模化生产要求。

背景技术

石油的大量使用导致能源枯竭和温室气体排放的增加，为了实现经济和环境的和谐发展，必须使用可再生能源代替石油，并减少温室气体的排放，保护人类赖以生存的自然环境成为当前和今后世界各国急需解决的问题。

生物柴油是以生物体油脂为原料，通过分解、酯化而得到的长链脂肪酸甲酯，是一种可以替代现有普通柴油使用的环保、可再生能源。生物柴油的主要成分是脂肪酸甲酯(FAME)，是以可再生资源，如植物油(菜籽油、豆油、玉米油、棉籽油、花生油等)、回收烹饪油、动物油以及微生物油脂等为原料而制成，具备与石油柴油相近的性能。生产和使用生物柴油的技术已经存在了50余年，作为化石燃料的替代品，与化石柴油及燃料乙醇等其他液体燃料相比，有着突出的特性：不含石蜡，闪点高，燃烧性能和效率要高于普通柴油，使用时更安全；同时可以通过种植、养殖或培养源源不断地得到其原料，因而可再生；生物柴油产品中含硫和氮较少，可以减少SO₂和NO的排放。目前，生物柴油主要是以植物和动物脂肪酸为原料来生产的，但是产量仅占所需柴油的3％，而增加生物柴油所需的植物油脂和动物油脂的产量将导致土地资源紧缺的问题以及由此引起的其他农作物价格上涨的问题。特别是在中国人多地少的情况下，这些问题尤为突出。

微藻跟植物一样，也是利用光照产油，但却比植物作物的效率高很多。大多数微藻的产油量远远超过了最好的油料作物。微藻生长极为迅速，而且含有极其丰富的油脂。藻类光合作用转化效率可达10％以上，含油量达30％以上。微藻的生物柴油产量是最好的油料作物的8～24倍。与其他油料作物相比，利用微藻培养生产生物柴油所需占地面积最少，同时微藻培养产油具有不与农业争地的明显优势，可以利用滩涂地、荒废地等非耕地，而且可用海水作为天然培养基进行大量繁殖。因此，利用微藻生产的生物柴油是将来有可能部分满足交通、运输等所需的燃料。

另一方面，大气“温室效应”是目前全球环境问题中最重要、亟待解决的问题之一，其中CO₂是对“温室效应”影响最大的气体，占总效应的49％。同时，CO₂又是地球上最丰富的碳资源，它与工业的发展密切相关，而且还关系到能源政策问题。近年来，能源紧张，资源短缺，公害严重，世界各国都在探索解决上述问题的途径，因此，CO₂的固定在环境、能源、资源方面具有极其重要的意义。目前，CO₂的固定方法主要有物理法、化学法和生物法，而大多数物理和化学方法最终必须依赖生物法来固定CO₂。生物CO₂固定法是地球上最主要和最有效的固碳方式，在碳循环中起决定作用，利用生物来进行CO₂固定，符合自然界循环和节省能源的理想方式。能利用该法进行固碳的主要是植物、光合细菌以及藻类。其中微藻具有光合速率高、繁殖快、环境适应性强、处理效率高、可调控以及易与其他工程技术集成等优点，且可获得高效、立体、高密度的培养技术，同时固碳后产生大量的藻体具有很好的利用价值，因此具有高度的工业化潜力。显然，微藻CO₂固定有望成为一种最佳的CO₂固定方法，从而有效地降低大气中CO2浓度。

综上所述，利用微藻培养，既可有效地减少大气中CO₂的含量，又可以作为生产生物柴油的理想原料，是保护自然环境，实现经济和环境的和谐发展一举两得的发展途径，具有广阔的发展前景。

微藻的高密度大规模自养培养是提高微藻生长速率，降低生产成本，实现微藻产业化发展的必经之路。微藻规模化自养培养有封闭式和开放式两种方式：封闭式培养以管状光生物反应器培养为代表，可以很好的控制培养条件，使其更适合于微藻生长，一年四季都可以培养，可以维持较高的培养密度而且容易收获。但是由于使用人工照明，而且需要控制污染，实现微藻的纯种培养，其培养成本较高。开放式培养以跑道式大池培养为代表，培养成本低廉，但是由于很多微藻不抗杂菌或抵抗杂菌的能力较弱，跑道式大池培养发展受到很大限制。

微藻包括蓝藻、绿藻、红藻、裸藻、甲藻、硅藻、金藻、褐藻等水生藻类植物，其中盐藻是目前所知耐盐性最强的单细胞真核生物，生长在海水或咸水湖等高盐环境下，由于无细胞壁可通过快速的细胞体积变化来适应细胞外渗透压的变化。因此对环境适应性极强，可在低浓度和接近饱和的高浓度盐水中生长。在这样的环境中杂菌难以生长，因此盐藻是非常适合开放式培养的微藻。盐藻也具有很强的光合作用能力，养殖容易，成本低廉。盐藻也是实现胡萝卜素的商业化生产的微藻，其产品附加值极高。这些特点，使得盐藻有望成为理想的固定CO₂、生产生物柴油的一种微藻。

作为光能自养生物，光合作用的效率高低决定了盐藻固定CO₂的能力和产物得率，也就直接决定了高密度大规模自养培养的成本，决定了其能否真正用于CO₂的固定和生物柴油的生产。

利用基因工程和转基因技术提高光合作用的效率，主要涉及光合作用和碳固定的相关酶系，包括(1)卡尔文循环中CO₂固定反应相关酶系，即Rubisco和Rubisco活化蛋白(Rubisco activase)；(2)卡尔文循环还原阶段相关酶系--3-磷酸甘油酸激酶(PGK)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)；(3)卡尔文循环更新阶段的相关酶系--丙糖磷酸异构酶(TPI)、果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(ALD)、果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)、景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(SPBase)、转酮酶(TKL)、核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶(RPE)、核糖-5-磷酸异构酶(RPI)和磷酸核酮糖激酶(PRK)；(4)C4植物光合关键酶系，如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)、苹果酸脱氢酶(NADP-ME)、丙酮酸双激酶(PPDK)等；(5)CO₂转运与浓缩机制相关蛋白基因，如碳酸酐酶(CA)、碳转运蛋白(inorganic carbon transporter，ict)等。

Rubisco是所有光合生物进行光合碳同化的关键酶，但是其本身效率很低，改造Rubisco和Rubisco活化蛋白来提高Rubisco的羧化效率，即直接降低加氧酶活性的方法没有取得非常明显的成果，有时甚至得到负面的结果。将C4旁路中的酶系重组并成功表达，但是并没有得到任何专一性方面的明显提高。这些酶单一的高水平表达并没有明显影响到植物的生长，即使是这些基因的组合转化与表达，也没有能够有效改善光合效率。

藻类作为较为原始的水生植物，或多或少地保留了其祖先的Rubisco对CO₂亲和力低的特性，但同时进化出一种提高Rubisco周围CO₂浓度的机制，以提高光合作用的效率。业已证明，蓝藻的ictB基因在烟草、拟南芥和大米中都显示出增强光合作用的功能。绿藻中叶绿体CA也被证明能够提高Rubisco周围CO₂浓度，提升光合作用的效率。

果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)是调控Calvin循环中光合和磷酸化循环的关键酶之一。该酶活性轻微受抑制.就会导致Calvin循环更新能力的减弱、光合活性的急剧下降。FBPase催化的反应处于代谢物离开Calvin循环，流入淀粉合成的一个分支点上，在决定碳元素到最终产物的分配上有着重要的作用。业已证明，蓝藻中果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)/景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(SBPase)转入烟草叶绿体中，可明显提高转基因烟草光合固定CO₂的效率和糖类的累积，同时也加速了其生长，表明改变一个酶就能显著地提高植物的光合作用。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术，而专门提供的一种提高光合作用效率转基因盐藻的制备方法，主要是通过转入相关基因提高盐藻的光合作用效率和CO₂固定能力的方法，即将克隆或者改造的光合自养生物的碳固定及光合作用相关基因(如来源于鱼腥藻PCC7120的碳转运蛋白ictB、碳酸酐酶CA、果糖-1，6-二磷酸酶FBP基因)，构建同源转化载体，并转化盐藻细胞，再进行继代选择性培养，最终得到稳定的转基因盐藻株。通过导入的光合作用相关的高效基因(如ictB、CA和FBP基因)的单独或组合表达，提高转基因盐藻中CO₂的浓度和转化速度，使这种转基因盐藻利用CO₂进行光合作用的能力得到提升，从而促进转基因盐藻自养生长，加快和提高生物量的积累，建立基于光合作用效率提高从而可以在开放式培养条件下规模化生产的基因工程盐藻株，满足生物柴油以及代谢产物和基因工程产品的规模化生产要求。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

提高光合作用效率转基因盐藻的制备方法，是利用分子细胞生物学技术，克隆或者改造光合自养生物的碳固定及光合作用相关基因，而后将它们导入盐藻的基因组中，再进行继代选择性培养，最终得到稳定的碳固定及光合作用效率提升的转基因盐藻藻株。

所述光合自养生物包括但不限于蓝藻、绿藻、红藻、裸藻、甲藻、硅藻、金藻、褐藻等水生藻类植物以及苔藓、蕨类、裸子植物和被子植物等陆生高等植物。

所述碳固定及光合作用相关基因包括但不限于(1)卡尔文循环相关酶系基因，如果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)、景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(SPBase)等；(2)CO₂转运与浓缩机制相关蛋白基因，如碳酸酐酶(CA)、碳转运蛋白(inorganic carbon transporter，ict)等。直接克隆上述(1)、(2)所述的基因或者对它们的基因和蛋白序列进行人工改造和设计。

将克隆或者改造的基因通过聚乙二醇(PEG)、电激法、基因枪法、玻璃珠搅拌法等转化法，导入盐藻的核基因组或者叶绿体基因组中。

筛选培养过程包括以下步骤：将转基因处理后的盐藻扩增后，涂布于含抗生素或者除草剂的培养基平板上，光照培养，然后挑取单一藻落于常规液体培养基中进行继代培养，如此反复接种培养至少15代。

本发明的转基因盐藻的制备方法具体包括以下步骤：

1)、盐藻培养；

2)、光合作用相关的高效基因的克隆与改造；

3)、盐藻表达质粒的构建；

4)、将光合作用相关的高效基因导入盐藻，可通过电激法、基因枪法、PEG法来实现；

5)、转基因盐藻转化子的筛选。

本发明的优点在于：通过基因转化技术，得到碳固定及光合作用效率提高、细胞生物量的积累加快、适用于开放式培养条件的基因工程盐藻，为盐藻生物柴油的制备提供优质原料，为盐藻代谢产物、基因工程产品的生产降低成本。

附图说明

图1为质粒pSP710atpA-rbcL图谱。

图2为盐藻表达载体pchlN-CAT图谱。

具体实施方式

本发明以下结合实施例(以真核单细胞微藻一盐藻为例)做进一步描述，但不限于盐藻。

一、盐藻培养

1、液体培养：盐藻细胞接种于Mclachlan培养液，培养条件如下：温度25±2℃，光照强度3000lux，每天光照培养14小时，黑暗培养10小时。

2、固体培养：Mclachlan培养液中加入琼脂浓度为0.5-0.8％，于超净台用消毒白金耳从液体培养液取藻种立即接种到固体培养基面上，置恒温箱内培养，恒温箱中需配置荧光管照射，按液体培养条件要求进行培养。

二、蓝藻培养

藻种鱼腥藻PCC7120接种于BG-11培养液，接种量5％，光照度1000lux，光暗周期12h/12h，旋转式摇床转速150rpm。

三、蓝藻ictB、CA和FBPase/SBPase基因克隆和盐藻表达质粒的构建

1、蓝藻ictB、CA和FBPase/SBPase基因克隆

(1)蓝藻总DNA的提取

收集对数期蓝藻培养物，用STE洗涤。用裂解液重悬，液氮和37℃反复冻融数次。加入溶菌酶，振荡混合完全，温育。加入SDS，蛋白酶K，温育。用酚：氯仿、氯仿抽提。加入乙酸铵和异丙醇，沉淀DNA，离心，用70％的乙醇洗涤沉淀，用TE重悬。

(2)PCR扩增蓝藻ictB、CA和FBPase/SBPase基因

设计如下六条引物：

引物1：5’-GCCCATAATCCGTGCGCCGCTGACG-3’；

引物2：5’-GGCCACCGCTGGGGCTGGGCAGTG-3’；

引物3：5’-GTTTGCAACGTTTAGTTTAATAT-3’；

引物4：5’-GCAACACAAAATCCGGGGAAG-3’；

引物5：5’-GTCGCTAGGAAGTACATAACATGG-3’；

引物6：5’-TTATTCTCCCCCTGCCTCCTGCCT-3’

以蓝藻总DNA为模板，分别以引物1和2扩增鱼腥藻PCC7120ictB基因，以引物3和4扩增CA基因，以引物5和6扩增FBPase/SBPase基因，产物分别克隆到T载体pMD-18上，质粒分别命名为pMDT-ictB，pMDT-CA，pMDT-FBP。

(3)ictB-CA、ictB-FBP、CA-FBP、ictB-CA-FBP串联基因的构建

将(2)中所得到的PCR产物分别进行补平、连接、鉴定，获得ictB、CA和FBP基因两两连接的串联融合基因ictB-CA、ictB-FBP、CA-FBP和三者串联的融合基因ictB-CA-FBP，分别克隆到质粒载体pUC18上，质粒分别命名为pUC-IC，pUC-IF，pUC-CF和pUC-ICF。

2、蓝藻ictB、CA和FBP基因系列表达盒的构建

本实验室构建的质粒pSP71-atpA-rbcL(参考文献1，图谱见图1)上，克隆有衣藻叶绿体atpA启动子和rbcL终止子。用BamHI/SphI双酶切割质粒pSP71-atpA-rbcL和pMDT-ictB、pMDT-CA、pMDT-FBP、pUC-IC、pUC-IF、pUC-CF和pUC-ICF。将蓝藻ictB、CA和FBP基因以及他们的串联融合基因ictB-CA、ictB-FBP、CA-FBP、ictB-CA-FBP序列分别连接到atpA启动子和rbcL终止子之间，构成完整的表达盒，使之分别在atpA启动子控制下转录。

3、盐藻表达质粒的构建

本实验室构建的盐藻表达载体pchlN-CAT(图谱见图2)中含有叶绿体基因chlN序列4.1kb为同源片段，有atpA-CAT-rbcL表达盒(可表达氯霉素抗性，用于转化藻的筛选)和多克隆位点MCS(来源于pUC18)。将上述2中构建完整的ictB、CA和FBP基因系列表达盒用EcoRI/SacI切下后，分别连入载体pchlN-CAT的EcoRI/Sac I位点，构建成系列表达质粒pchlN-ictB、pchlN-CA、pchlN-FBP、pchlN-IC、pchlN-IF、pchlN-CF和pchlN-ICF。该系列质粒可由chlN序列介导同源重组，使CAT表达盒和蓝藻ictB、CA和FBP基因系列表达盒定位整合于盐藻叶绿体基因组的chlN区，经氯霉素抗性筛选鉴定转化藻，转化藻可表达ictB、CA和FBP以及它们的基因组合，提高光合作用的效率，促进转化藻的光合自养生长。

四、将外源目的基因导入盐藻

1、用电激法将外源目的基因导入盐藻

取培养第5天的盐藻培养液，1000rpm离心15min，弃上清，用含有0.2M甘露醇和0.2M山梨醇液处理后加入电激缓冲液，调整盐藻密度在10⁸个/ml。继之加入终浓度为10μg/ml的含外源基因的质粒及25μg/ml的处精DNA，混匀后，置冰上5-10min，吸取0.5ml置于轰击小室中待用。电激仪(Backon 2000型)电激时电压为9.5KV，每次电激时间为0.05μs，次数为2¹⁰，循环次数100次，电激高度2mm，每次电激间隔时间为62.5sec。

2、用基因枪法将外源目的基因导入盐藻

取培养第5天的盐藻培养液，1000rpm离心15min，弃上清，用盐藻培养液将盐藻密度调整在10⁸个/ml，再取0.5ml盐藻培养液铺于含抗生素的固体培养基中央，直径为3cm的圆形有效轰击范围内，置超净台下吹干待用。

在无菌条件下，用基因枪(Bio-Rad公司产的PDS-1000型)轰击。具体步骤如下：取50μl(60μg/ml)金粉悬浮液加入6μg含有外源基因的质粒以及50μl 2.5M Cacl₂和20μl 0.1M亚精胺，振荡3min，12000rpm离心10sec，弃上清。用无水乙醇洗一次，振荡，12000rpm离心，弃上清，共二次。最后将附有金粉的质粒悬浮于60μl无水乙醇中。每次轰击取6-8μl，每皿轰击3次，轰击后将培养皿放入盐藻适宜培养条件下培养。

3、用PEG法将外源目的基因导入盐藻

取0.5ml盐藻培养液(细胞密度10⁷-10⁸个/ml)，在超净台内接种于含抗生素的固体培养基上，直径为3cm，吹干待用。

构建携带外源目的基因的农杆菌Ti质粒和盐藻细胞原生质体。尔后将新制备的原生质体悬浮液与Ti质拉DNA一起保温培养，同时加入分子量4000-6000的PEG，在pH 8-9下促进原生质体摄取DNA，从而使细胞转化，为促进转化，在转化培养时加入运载DNA(小牛胸腺DNA)，培养后离心收集原生质体，并重新悬浮到原生质体培养基中继续培养。

五、转基因盐藻转化子的筛选

取电激法、基因枪法或PEG介导基因转化法的盐藻细胞团，铺于含有200μg/ml氯霉素的固体培养基上，300lux弱光培养2-3天，正常光照进行筛选培养。10-15天后出现若干藻落，再将此藻落悬浮培养于液体培养液中，3-5天后再在抗生素的固体培养基上进行二次筛选。经三次筛选培养，获得稳定转基因盐藻藻株。

六、转基因盐藻转化子的鉴定

1、杜氏盐藻叶绿体DNA的提取

取10ml处于对数生长后期的杜氏盐藻培养液，6000rpm 4℃离心5min，盐藻细胞沉淀用350μ1NET(0.1mol/L NaC1，50mmol/L EDTA，20mmol/LTris·HCl，pH 8.0)悬浮后，加入25μl蛋白酶K(10mg/ml)、25μl 20％SDS，混匀，55℃水浴2h后，置于冰上冷却，加入200μ1.5mol/L乙酸钾，冰上静置30min。12000rpm 4℃离心5min，上清液加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，抽提两次，再用等体积的氯仿抽提一次。水相加入2倍体积的无水乙醇，混匀后置于-70℃，15min。12000rpm 4℃离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤去盐，真空干燥后溶于30μl双蒸水中。

2、Sourthern blotting检测和序列测定

提取转基因盐藻转化子叶绿体DNA，以胶回收纯化的ictB、CA和FBP基因片段为模板标记探针，进行Sourthern blotting；并以提取的转基因盐藻转化子叶绿体DNA为模板，分别以引物1和2、引物3和4、引物5和6进行PCR扩增，克隆产物到T载体，进行序列测定，确定目的基因已稳定整合到转基因盐藻转化子的叶绿体基因组中。

七、转基因盐藻的光合活性检测

1、放氧光合活性(放氧光曲线)的测定

取对数期藻细胞，用Hanstech DW/1型氧电极测定转基因藻与野生藻在不同光照强度下的净光合放氧和呼吸，按下式计算放氧活性：

$V=\frac{S\×K\×60\×1000}{P}$

其中：V为放氧活性，单位是μmolO₂/mgChl·hr

S为记录纸走的斜率，单位是min^-1；

K为常数，表示一定温度下水中的溶氧量，单位是μmolO₂/ml；

P为样品的叶绿素浓度，单位是mgChl/ml；

60表示60min，1000表示记录纸的满量程为1000。

2、CO₂同化速率的测定

剪一张内径为1.5cm的黑塑料薄膜，取1ml藻液均匀地涂在喷有少量培养液的滤纸上，尽量使滤纸上的藻细胞数目均匀，盖上内径为1.5cm的黑塑料薄膜。用CIRAS-1型(England PP System)CO₂分析仪进行测定野生型藻和转基因藻株的CO₂同化速率(μmolCO₂/m²·s)。

参考文献：

1潘卫东，吕玉民，张贵星，牛向丽，侯桂琴，薛乐勋。莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻中转录活性的检测。郑州大学学报(医学版)2004，39(1)：35-38。

Claims (7)

1.一种提高光合作用效率转基因盐藻的制备方法，其特征在于：利用分子细胞生物学技术，克隆或者改造光合自养生物的碳固定及光合作用相关基因，而后将它们导入盐藻的基因组中，再进行继代选择性培养，最终得到稳定的碳固定及光合作用效率提升的转基因盐藻藻株。

2.根据权利要求1所述的转基因盐藻的制备方法，其特征在于：光合自养生物是指蓝藻、绿藻、红藻、裸藻、甲藻、硅藻、金藻、褐藻等水生藻类植物以及裸子植物和被子植物等陆生高等植物。

3.根据权利要求1所述的转基因盐藻的制备方法，其特征在于：碳固定及光合作用相关基因包括(1)卡尔文循环相关酶系基因，如果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)、景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(SPBase)等；(2)CO₂转运与浓缩机制相关蛋白基因，如碳酸酐酶(CA)、碳转运蛋白(inorganic carbontransporter，ict)等。

4.根据权利要求1所述的转基因盐藻的制备方法，其特征在于：直接克隆上述权利要求3中所述的基因或者对它们的基因和蛋白序列进行人工改造和设计。

5.根据权利要求1所述的转基因盐藻的制备方法，其特征在于：将相关基因导入盐藻基因组中的方法包括聚乙二醇(PEG)、电激法、基因枪法、玻璃珠搅拌法等。

6.根据权利要求1所述的转基因盐藻的制备方法，其特征在于：将克隆或者改造的基因通过权利要求5所述的转化法，导入盐藻的核基因组或者叶绿体基因组中。

7.根据权利要求1所述的转基因盐藻的制备方法，其特征在于：筛选培养过程包括以下步骤：将转基因处理后的盐藻扩增后，涂布于含抗生素或者除草剂的培养基平板上，光照培养，然后挑取单一藻落于常规液体培养基中进行继代培养，如此反复接种培养至少15代。

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