CN103757019B - 一种启动子及表达外源蛋白的重组表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的启动子序列，可以应用于柄篮状菌表达系统，实现柄篮状菌对外源蛋白的表达。本发明还构建了一种新型表达载体，可用于以柄篮状菌为宿主细胞的转化方法；本发明还提供了一种表达外源蛋白的新方法，能高效表达黑曲霉（Aspergillus？niger）的植酸酶、特异腐质霉（Humicola？insolens）的纤维素内切酶、烟曲霉（Aspergillus？fumigatus）的脂肪酶、里氏木霉（Trichoderma？reesei）的木聚糖酶、枯草芽孢杆菌（Bacillus？subtilis）的果胶酶等多种外源基因，摇瓶发酵蛋白表达量约为0.3-1.0g/L，酶活约为30-90IU/ml。本发明提供的表达载体和表达外源蛋白的新方法将有利于实现更多蛋白质的工业化生产，从而降低生产成本。

Description

一种启动子及表达外源蛋白的重组表达系统

技术领域

本发明属于分子生物学和遗传工程技术领域，具体涉及一种启动子及表达外源蛋白的重组表达系统。

背景技术

通过基因重组技术生产有价值的外源性蛋白质是当今生物技术研究与开发的热点之一。细菌、酵母和丝状真菌具有生长快、易培养、表达量高以及分子操作简单的特点，这使得它们已广泛地开发应用于异源蛋白质的表达（张小霞等，2004，国外医学卫生学分册）。目前已有的比较成熟的细菌类表达系统有大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、假单胞菌和克雷伯氏菌等；而真菌类表达系统有酵母类和丝状真菌类，其中酵母类有酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、多型汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母；而丝状真菌类有镰刀菌、木霉、黑曲霉、粗糙脉孢霉和米曲霉等。但由于受蛋白自身结构、分子大小和翻译后修饰等影响，不同表达系统中目的蛋白的表达量（活性）往往不一样，这就需要选择合适的表达系统。选择合适的表达系统往往要考虑以下因素：表达量、目的用途、筛选策略、密码偏爱性、蛋白可溶性、纯化回收、宿主的蛋白酶和修饰系统等。尤其是目的蛋白的用途是重要的考虑因素，如药物筛选要求保持蛋白天然状态，抗原蛋白仅需考虑表达量，饲用或食用蛋白需要考虑表达系统的安全性，而工业应用类则需多考虑蛋白的功能。因此，尽管很多研究机构和生物企业开发了很多表达系统；但是，每个表达系统总有其优点和缺点，任何一个表达系统不可能适合表达所有的蛋白。

下面介绍目前使用的几种表达系统：

1）大肠杆菌表达系统开发至今已超过30年、也是应用最广泛的蛋白表达系统；其优点是遗传背景清楚、繁殖快、表达量高（1-5g/l）；但是缺点也很明显，对结构复杂如二硫键的蛋白极易形成无活性的包涵体，加之胞内表达需要破碎细胞、使得下游处理工艺复杂（Jana,S.,andDeb,J.K.2005，Appl.Microbiol.Biotechnol.）。

2）德国MoBiTec公司开发了B.megaterium和B.subtilis为宿主的表达系统。芽孢杆菌宿主的优点是：公认的安全菌株、分泌表达、无明显的密码偏爱性。其缺点是：分泌大量能降解目的蛋白的胞外蛋白酶。因此，敲除芽孢杆菌的蛋白酶基因是其高效表达的关键步骤之一。

3）链霉菌是革兰氏阳性原核细菌，它具有发酵成本低，分泌水平高的特点。但是，链霉菌往往不能高水平的表达真核生物的基因。目前，报道最多的是变铅青链霉素（Steptomyceslividans）。加拿大Cangene公司利用该菌生产的巨噬细胞集落刺激因子已到III期临床水平。

4）酵母表达系统的优点是代时短、生长快，分泌表达和翻译后修饰系统；所以其表达蛋白多能正确折叠而具活性。由酵母成功表达的蛋白有3000多种，包括以用于临床的胰岛素和乙肝疫苗等。酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）应用历史最悠久，广泛应用于酿酒和烘焙；也是第一个用于异源表达的酵母（StrausbergandStrausberg，2001，Curr.Protoc.ProteinSci）。S.verevisiae缺点是质粒不稳定、拷贝数低和表达蛋白的高度糖基化。目前，已开发的酵母类表达系统有很多；其中毕赤酵母（Pichiapastoris）表达系统应用最广最成功、蛋白表达量达77mg-20g/l不等；其表达的分子量最大蛋白是β-半乳糖苷酶（117kDa）（Cregg,J.M.，2007，MethodsMol.Biol.）。

5）丝状真菌具有很高的蛋白质分泌能力，能进行各种翻译后加工，如内含子剪切和糖基化修饰等。丝状真菌如曲霉(Aspergillus)等又是公认安全菌株（GRAS）；因此丝状真菌表达生产外源蛋白已经广泛用于工业酶的生产（唐国敏，1992，真菌学报；吴其威，1993，生命科学）。已成功工业化开发的丝状真菌表达系统有里氏木霉表达系统，黑曲霉表达系统和米曲霉表达系统等。

尽管上述表达系统已广泛应用于工业生产中，但仍然不能满足工业上对于成本降低的需要，此外，还有很多蛋白因为没有合适的表达系统，无法实现放大生产和应用，因此开发新型的表达系统，寻找更多、更高效的表达外源蛋白的方法，一直是本领域技术人员的研究热点和难点。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种新型启动子及由该启动子所构建的表达外源蛋白的表达系统。申请人从柄篮状菌（Talaromycesstipitatus）中分离得到了cbh1（纤维素外切酶1）启动子和终止子序列，构建得到一种新型表达载体，并开发出一种以柄篮状菌为宿主细胞、以硫胺素作为筛选标记的高效表达外源蛋白的方法，从而丰富现有的蛋白质表达系统。

本发明一方面提供了一种启动子，其特征在于，所述启动子包含有：

a)核苷酸序列为SEQIDNO:1的启动子；

b)与a）中的启动子序列相似性不低于90%，且具有a）中启动子功能的启动子。

上述b）中序列相似度优选为95%，更优为98%.

本发明另一方面提供了一种含有上述启动子的表达载体。

所述表达载体优选携带有柄篮状菌cbh1基因的终止子。

所述终止子，其一种核苷酸序列为SEQIDNO:2。

在表达载体上还包含有筛选标记，

所述的筛选标记可以是表达载体中常用的。

本发明还提供一种表达系统，其中宿主为柄篮状菌，表达载体为携带有上述启动子的真核表达载体；

上述的表达系统中，筛选标记优选为硫胺素抗性基因（PyrithiamineResistanceGene，ptrA）。

所述的柄篮状菌宿主优选柄篮状菌VL-1（TalaromycesstipitatusVL-1），已于2013年12月20日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2013679。

本发明还提供了一种表达外源蛋白的方法，包括如下步骤：

1）外源基因的克隆；

2）利用上述表达载体，构建携带步骤1）外源基因的重组表达载体；

3）将重组表达载体转化柄篮状菌，获得重组表达外源蛋白的重组菌株。

其中步骤3）所述转化方法可选用电击转化法、农杆菌介导转化法或原生质体转化法中的任意一种。

步骤3）所述转化方法优选原生质体转化法。

所述原生质体转化法包括柄篮状菌原生质体的制备、转化和筛选步骤，

所述柄篮状菌原生质体的制备方法，包括：将柄篮状菌接种至YEG培养基，培养温度为26-32℃，优选28℃；转速为200-250rpm，优选200rpm；培养时间为20-36小时,优选24小时；加入去细胞壁的酶，可选自溶壁酶，蜗牛酶和/或纤维素酶，优选裂解酶，其工作浓度为5-20mg/ml，优选10mg/ml，作用2-4小时。

所述转化方法选用的融合试剂为聚乙二醇（PEG），优选PEG4000。

所述筛选方法中选用的筛选标记优选硫胺素抗性基因（PyrithiamineResistanceGene，ptrA），其工作浓度为0.4-1.4μg/ml。

本发明提供了一种新的启动子序列，可以应用于柄篮状菌表达系统，实现柄篮状菌对外源蛋白的表达。本发明还构建了一种新型表达载体，可用于以柄篮状菌为宿主细胞的转化方法；本发明还提供了一种表达外源蛋白的新方法，能高效表达黑曲霉（Aspergillusniger）的植酸酶、特异腐质霉（Humicolainsolens）的纤维素内切酶、烟曲霉（Aspergillusfumigatus）的脂肪酶、里氏木霉（Trichodermareesei）的木聚糖酶、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的果胶酶等多种外源基因，摇瓶发酵蛋白表达量约为0.3-1.0g/L，酶活约为30-90IU/ml。本发明提供的表达载体和表达外源蛋白的新方法将有利于实现更多蛋白质的工业化生产，从而降低生产成本。

附图说明

图1：柄篮状菌野生型和突变体菌落形态比较。

图2：表达质粒pTS-phyA的质粒图谱，

其中，Pcbh1为启动子序列（SEQIDNO:1），phyA指被表达的植酸酶基因，Tcbh1为终止子序列（SEQIDNO:2），Amp为氨苄青霉素抗性标记，ColEori为质粒复制起始位点。

图3：阳性转化子TS-1的摇瓶发酵上清液SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1为蛋白maker；泳道2为宿主阴性对照；泳道3为阳性转化子TS-1发酵上清液，箭头所指处蛋白条带即为重组表达的外源植酸酶。

图4：阳性转化子发酵上清液SDS-PAGE电泳图，其中泳道1，2，3分别为获得的三个阳性转化子发酵上清液，箭头所指处蛋白条带即为重组表达的外源纤维素内切酶。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。而不仅限于实施例所记载的具体方法、实验方案和试剂，本领域的技术人员可在本发明技术方案的基础上选择其它常规方法。

除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,3ndEd.(Singletonetal.,2006)和COLLINSDICTIONARYBIOLOGY(Haleetal.,2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。

除非另作说明，核酸是按5′至3′方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向从左至右书写。

如本文所用，术语“重组”当被用于修饰细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的单字母或三字母代码。

如本文所用，术语“基因”指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

术语“核酸”包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰的衍生物。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。

术语“载体”指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。

术语“表达载体”表示包含目的DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。

术语“启动子”表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。

术语“终止子”表示DNA分子中终止转录的核苷酸序列。

与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比较这两个序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。

由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸，本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。

术语“筛选标记”表示抗生素抗性标记基因，如红霉素、氯霉素等抗性标记基因。依据原理是负筛选，即未转化细胞被抗生素杀死，而转化细胞因携带抗生素抗性基因而存活，从而将含有外源基因的转化细胞和不含外源基因的非转化细胞分开。

术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的编码脂肪酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。

如本文所用，术语“柄篮状菌”，拉丁文名“Talaromycesstipitatus”，本发明所述柄篮状菌还涉及柄篮状菌的亚种，以及以该菌株为野生型获得的突变型。

下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。

实施例1柄篮状菌（Talaromycesstipitatus）的活化

本发明选用的柄篮状菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号CGMCC3.4299。

配制PDA固体平板：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和15g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，115℃灭菌30分钟后，备用；

菌种活化：将上述柄篮状菌接种至PDA固体平板上进行菌种活化，培养温度为28℃。

实施例2表达质粒的构建

2.1柄篮状菌基因组DNA的提取

从PDA固体平板上刮取上述柄篮状菌菌丝，放入2ml的eppendorf管中，加入500μl的2×CTAB缓冲液（100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，2%(w/v)CTAB，40mmol/L巯基乙醇）和500μl酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）溶液，37℃，220rpm振荡1-1.5h，然后离心13200rpm×15min；取上清液并加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀0.5-2小时，然后离心12000rpm×10min；最后，用75%乙醇洗涤沉淀1次、待沉淀干燥后加入30-50μl含有RNase的去离子水；提取的DNA作为PCR反应模板。

2.2cbh1启动子序列的克隆

以实施例2.1中提取的柄篮状菌基因组DNA为模板，利用引物proF和proR进行PCR扩增。

proF:CTGAAGCAAAGCAACAGCTC

proR:ACATGCATTGTGTCGTTTGCTTCTATTC；

其中ATGCAT为SphI酶切位点。

PCR扩增条件是：95℃4min；94℃40S；55℃30S，72℃1.5min30个循环；72℃7min。扩增产物凝胶回收后，克隆至pMD18-Tsimple载体（购自TaKaRa），获得质粒pTPcbh，将质粒进行测序分析，结果显示克隆得到的cbh1基因的启动子序列为SEQIDNO:1。

NCBIBlast序列比对结果显示，本发明克隆得到的cbh1基因的启动子序列SEQIDNO:1与现有序列的相似性最高仅为47.7%，该启动子并没有在现有技术文献中报道过，为一新型的启动子。

2.3cbh1终止子序列的克隆

以实施例2.1中提取柄篮状菌的基因组DNA为模板，利用引物terF和terR进行PCR扩增。

terF:ACAT ATCGAT GCGGCCGC ACTAGT ATGGTTGATATCGGTTGAATG；

其中为SphI酶切位点，ATCGAT为ClaI酶切位点，为BglII酶切位点，GCGGCCGC为NotI酶切位点，为SnaBI酶切位点，ACTAGT为SpeI酶切位点，为XhoI酶切位点。

terR:ACATGCATGCCACTTCCTAATCTGGATAGC；

其中GCATGC为SphI酶切位点。

PCR扩增条件是：95℃4min；94℃40S；55℃40S，72℃1.0min30个循环；72℃7min。扩增产物凝胶回收后，连接至pMD18-Tsimple载体进行测序分析。结果显示克隆的得到的cbh1基因的终止子序列为SEQIDNO:2。

NCBIBlast序列比对结果显示，本发明克隆得到的cbh1基因的终止子序列SEQIDNO:2与现有序列的相似性最高仅为50.8%，该终止子并没有在现有技术文献中报道过，为一新型的终止子。

上述启动子和终止子的序列进行了多个克隆测序，确定序列中没有扩增、测序导入的序列错误。

2.4表达载体的构建

对实施例2.3得到的PCR产物进行SphI酶切过夜；同样，对实施例2.2得到的质粒pTPcbh进行SphI酶切过夜；然后，回收2个酶切产物，在16℃条件下过夜连接；最后将连接产物导入大肠杆菌DH5a。

随机选取10个转化子，分别提取质粒，利用PCR验证其连接方向是否正确。PCR引物采用实施例2.2中的proF和实施例2.3中terR。选择一个连接方向正确的表达质粒，命名为pTS-1。质粒pTS-1即含有柄篮状菌自身的cbh1（纤维素外切酶1）启动子和终止子序列，可用于以柄篮状菌为宿主细胞的转化过程。

2.5植酸酶表达质粒pTS-phyA的构建

按照实施例2.1中方法提取黑曲霉基因组DNA作为PCR模板。以phyA-F/phyA-R扩增黑曲霉的植酸酶基因序列（GenBank:Z16414.1）。

phyA-F:AAATCGATATGGGCGTCTCTGCTGTTC；(ATCGAT为ClaI酶切位点)

phyA-R:AAGCGGCCGCTAAGCAAAACACTCCG；（GCGGCCGC为NotI酶切位点）

PCR扩增条件是：95℃4min；94℃40S；55℃40S，72℃1.5min30个循环；72℃7min。扩增产物凝胶回收后，对其进行ClaI和NotI双酶切；同样，对实施例2.4构建得到的质粒pTS-1也进行ClaI和NotI双酶切；然后，将两个酶切产物回收，并在16℃条件下过夜连接；最后将连接产物导入大肠杆菌DH5a。将获得的表达质粒命名为pTS-phyA，质粒图谱如图2所示。

实施例3柄篮状菌原生质体的制备

在PDA固体平板上进行上述柄篮状菌菌种活化，培养温度28℃；取经活化的柄篮状菌接种于液体YEG培养基(0.5-1%酵母粉，1-2%葡萄糖)，培养温度为28℃，转速为200-250rpm，培养时间为24-36小时。所得的培养液用灭菌的三层擦镜纸过滤，用无菌的生理盐水冲洗悬浮的菌丝体；加入10mg/ml的裂解酶（购自Sigma，货号为L1412），所述的酶液经过滤除菌后每20ml酶液加入约0.9-1.1g湿菌体，置于30℃摇床，转速为50-60rpm，酶解2.5小时后过滤去除菌丝残片，离心获得到原生质体沉淀；用缓冲液STC（10%的蔗糖，浓度为50mM的Tris·Cl，PH8.0，浓度为50mM的CaCl₂）悬浮洗涤原生质体沉淀1-2次；最后，原生质体沉淀悬浮于STC溶液中，显微镜检查和计数，调整原生质体的浓度为10⁸个/ml左右用于以下转化。

实施例4PEG介导的原生质体转化

将2μgpTG-phyA质粒DNA（含ptrA基因的质粒）加入150μl柄篮状菌原生质体中，室温静置25min；然后分2次加入1ml60%PEG（PEG4000，PEG6000或PEG8000），轻轻混匀，室温静置25min；然后把原生质体混合液加到50ml的上层SF培养基中（18.32%山梨醇，1%葡萄糖，0.6%(NH₄)₂SO₄，1%KH₂PO₄,0.1%MgSO₄，0.3%C₆H₅Na₃O₇·2H₂O，0.005%FeSO₄·7H₂O，0.002%MnCl₂·4H₂O，0.0014%ZnSO₄·7H₂O，0.0012%CoCl₂，0.65-0.75%的琼脂粉），轻轻混匀后倒入下层XF培养基平板（含1.3%琼脂粉和终浓度为0.4μg/ml的硫胺素的SF固体培养基），倒置培养6-8天至转化子长出。最后，挑取转化子接种于含有0.4μg/ml硫胺素的下层XF培养基上继代培养，3-5天后刮取菌丝，提取DNA进行验证。

实施例5转化子的鉴定与摇瓶发酵

5.1转化子的鉴定

将实施例4所述从XF培养基上刮取的柄篮状菌菌丝，放入2ml的eppendorf管中，加入500μl的CTAB缓冲液和500μl酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）溶液，37℃，220rpm振荡1-1.5h，然后离心13200rpm×15min；取上清液并加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀0.5-2小时，然后离心12000rpm×10min；最后，用75%乙醇洗涤沉淀1次、待沉淀干燥后加入30-50μl含有RNase的去离子水，作为下一步PCR反应模板。PCR反应验证转化子：以提取的DNA为模板，引物ptrA-F和ptrA-R（CCCCAGGCTTTACACTTTAT和CCGCTCTTGCATCTTTGTT）进行PCR扩增抗硫胺素基因；同时，利用引物phyA-F和phyA-R扩增目的基因，即植酸酶基因序列。PCR反应条件：95℃5min;95℃30s,56℃30s,72℃2min,30个循环；72℃10min。PCR结果显示抗硫胺素基因ptrA和植酸酶基因phyA均能有效扩增；测序分析结果也显示扩增结果无误。这说明携带ptrA和phyA基因的表达载体已经整合到柄篮状菌宿主的基因组中。

5.2转化子摇瓶发酵

从实施例5.1得到的阳性转化子中选取一个，命名为TS-1，接种于液体种子培养基（酵母粉20g/L，葡萄糖20g/L），30℃培养48小时；然后按照5-10%的比例转接至发酵培养基M2（纤维素30g/L，蛋白胨7.5g/L，玉米粉15g/L，KH₂PO₄5g/L，CaCl₂·2H₂O2g/L，KCl1.8g/L，柠檬酸0.5g/L，吐温-800.18g/L，聚丙二醇0.18g/L），28℃培养3-7天；离心收集发酵上清液，进行12%SDS-PAGE电泳检测分析。结果如图3所示，箭头所指处的蛋白条带即为阳性转化子TS-1重组表达的植酸酶，对该蛋白条带进行质谱测序分析，也证实该蛋白为植酸酶，从而说明本发明构建的柄篮状菌重组菌株能表达外源植酸酶，柄篮状菌可作为一种新的表达系统用于表达外源基因。

5.3植酸酶酶活力检测

单位定义：在一定条件下，每分钟从浓度为5mmol/L的植酸钠中降解释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位U。

植酸酶测定方法：

5.3.1磷标准溶液及样品溶液配制

磷标准溶液:称取基准磷酸二氢钾适量于105℃干燥2h,置干燥器中冷却至室温后,精确称取0.3415g于具塞锥形瓶中,加入约100mL醋酸缓冲液并称量,准确至0.0001g,得25.0055μmol/g磷标准液。用移液器准确移取磷标准液0.1g、0.2g、0.3g、0.5g、0.8g、1g,置于10mL刻度试管中,加醋酸缓冲液至5g(精确至0.0001g),配制成系列浓度的磷标准液:0.5001μmol/g、1.0002μmol/g、1.5003μmol/g、2.5006μmol/g、4.0010μmol/g、5.0011μmol/g。备用。

样品溶液:称取1g植酸酶样品于具塞三角瓶中,加醋酸缓冲液至100g并称量(准确至0.0001g),搅拌30min后取上清液于4000r/min离心10min(或用玻璃滤纸过滤),称取上清液0.1g,加醋酸缓冲液稀释至100g,使得到酶活为0.05FTU/g左右的样品溶液,所有称量均需精确至0.0001g。

5.3.2测定步骤与酶活计算

测定称取磷标准溶液、样品溶液、空白醋酸缓冲液各1g(精确至0.0001g)于试管(18mm×180mm)中,按表1进行反应。样品反应操作间隔时间为30s。反应完毕后静置10min,再将反应溶液于4000r/min离心10min。取上清液于波长415nm测定其吸收度。根据磷标准液的反应总磷量和吸收度绘制标准曲线并求取二次曲线方程，再根据下式计算样品酶活:

式中:P———由样品吸收度根据二次曲线方程求得的反应总磷量,μmol

W———样品重量，克（g）

F———样品总稀释倍数

30———反应时间，秒（S）

5.3.3酶活测定

按照上述方法分别测定不同发酵时间段柄篮状菌宿主菌（阴性对照）和阳性转化子TS-1发酵液的酶活，结果如表2所示。

表2：不同时间的摇瓶发酵酶活

由表1中的数据可以看出，黑曲霉的植酸酶基因在本发明所述柄篮状菌宿主菌中得到了表达，且在发酵96h时酶活水平最高，达50.10u/ml，说明本发明构建的柄篮状菌重组菌株能高效表达外源基因。

实施例6纤维素内切酶基因在柄篮状菌中的表达

6.1提取特异腐质霉总基因组DNA

将特异腐质霉（Humicolainsolens）过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100mMTris-HCl,100mMEDTA,250mMNaCl,1%SDS);然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl10MNH4AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。

6.2基因克隆

以6.1中提取的DNA为模板，利用引物pri-F和pri-R进行PCR扩增。

pri-F：AAATCGATTATGCGTTCCTCCCCCCTC；（ATCGAT为ClaI酶切位点；

pri-R：AAGCGGCCGCCTACAGGCACTGATGGTAC；（GCGGCCGC为NotI酶切位点）

PCR扩增条件为95℃4min；94℃30S；55℃40S，72℃1min30个循环；72℃，7min；凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。将6.2中回收的扩增产物分别连接到pMD18-T载体，获得克隆载体pMD-EG，送至北京华大基因研究中心进行测序分析无误。采用实施例2所述方法，构建携带实施例2所述启动子、终止子和扩增产物的表达质粒，命名为pTS-ec。

6.3工程菌的构建与鉴定

采用实施例3所述方法制备柄篮状菌原生质体；按照实施例4所述，进行转化操作，将表达质粒pTS-ec导入柄篮状菌菌株中，获得3个转化子。提取转化子的DNA作为模板，利用引物priF和priR进行PCR扩增验证。结果显示3个阳性转化子均能扩增出目的条带；同时，测序分析也显示PCR扩增结果无误。

6.4工程菌的摇瓶发酵

按照实施例5.2所述，将上述获得的含纤维素内切酶的阳性转化子接种于液体种子培养基，30℃培养48小时；然后按照5-10%的比例转接至发酵培养基M2，28℃培养3-7天；离心收集发酵上清液，进行12%SDS-PAGE电泳检测分析。结果如图4所示，发酵上清液中箭头所指处蛋白条带即为重组表达的纤维素内切酶。经测定，上述3个阳性转化子的摇瓶发酵上清液酶活分别为30.12U/m、45.51U/ml和70.13U/ml。

纤维素酶测定方法如下：

以10mg/ml的羧甲基纤维素钠（CMC）为底物，以pH6.0的柠檬酸缓冲液将待测酶液稀释至适当倍数，取0.5mL酶液加入到已预热的0.5mL底物溶液中，在50℃水浴中精确反应15min，加入1.5mLDNS试剂终止反应，沸水浴中加热5min，迅速冷却后加入2.5mL蒸馏水，混匀后测定415nm波长下的吸光度，并计算酶活力。酶活定义为，在50℃、pH6.0条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个活力单位（IU），还原糖以葡萄糖等量。

上述实验结果表明，本发明提供的新的启动子序列SEQIDNO:1可以应用于柄篮状菌表达系统，实现柄篮状菌对外源蛋白的表达，这也是第一个适用于柄篮状菌表达系统的启动子序列。

实施例7柄篮状菌（Talaromycesstipitatus）的诱变与筛选

在PDA固体平板上进行柄篮状菌（CGMCC3.4299）菌种活化，培养温度为28℃；培养至孢子成熟后，加入醋酸缓冲液制备孢子悬液；将刚取出成熟的新鲜孢子于盛有玻璃珠和醋酸缓冲液的三角瓶中，振荡5分钟，用无菌脱脂棉过滤，滤液用血球计数板计数后，调整孢子数为10⁶个/ml。然后，取10ml单孢子悬浮液于无菌平皿中，于9W紫外灯下20cm处照射120s-180s不等；取致死率为98%以上的孢子悬液涂布于PDA平板上进行初筛；挑选形态变小的突变株进行摇瓶发酵复筛。

经过多轮诱变筛选，申请人最终获得一株形态小，分枝多的突变株（见图1），摇瓶发酵结果显示，该突变株胞外总蛋白含量比野生型出发株提高了3倍以上。申请人将该突变株命名为柄篮状菌VL-1（TalaromycesstipitatusVL-1），并于2013年12月20日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCCNO:M2013679。

实施例8表达质粒的构建

8.1柄篮状菌VL-1基因组DNA的提取

在PDA固体平板上活化实施例5所述突变菌株柄篮状菌VL-1，刮取柄篮状菌菌丝，放入2ml的eppendorf管中，加入500μl的2×CTAB缓冲液（100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，2%(w/v)CTAB，40mmol/L巯基乙醇）和500μl酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）溶液，37℃，220rpm振荡1-1.5h，然后离心13200rpm×15min；取上清液并加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀0.5-2小时，然后离心12000rpm×10min；最后，用75%乙醇洗涤沉淀1次、待沉淀干燥后加入30-50μl含有RNase的去离子水；提取的DNA作为PCR反应模板。

8.2cbh1启动子序列的克隆

以实施例8.1中提取的柄篮状菌VL-1基因组DNA为模板，利用引物proF和proR进行PCR扩增。

proF:CTGAAGCAAAGCAACAGCTC

proR:ACATGCATTGTGTCGTTTGCTTCTATTC；

其中ATGCAT为SphI酶切位点。

PCR扩增条件是：95℃4min；94℃40S；55℃30S，72℃1.5min30个循环；72℃7min。扩增产物凝胶回收后，克隆至pMD18-Tsimple载体（购自TaKaRa），获得质粒pTPcbh-2，将质粒进行测序分析，结果显示克隆的得到的cbh1基因的启动子序列也为SEQIDNO:1。

8.3cbh1终止子序列的克隆

以实施例8.1中提取柄篮状菌VL-1的基因组DNA为模板，利用引物terF和terR进行PCR扩增。

terF:ACAT ATCGAT GCGGCCGC ACTAGT ATGGTTGATATCGGTTGAATG；

其中为SphI酶切位点，ATCGAT为ClaI酶切位点，为BglII酶切位点，GCGGCCGC为NotI酶切位点，为SnaBI酶切位点，ACTAGT为SpeI酶切位点，为XhoI酶切位点；

terR:ACATGCATGCCACTTCCTAATCTGGATAGC；

其中GCATGC为SphI酶切位点；

PCR扩增条件是：95℃4min；94℃40S；55℃40S，72℃1.0min30个循环；72℃7min。扩增产物凝胶回收后，连接至pMD18-Tsimple载体进行测序分析。结果显示克隆得到的cbh1基因的终止子序列也为SEQIDNO:2。

8.4表达载体的构建

对实施例8.3得到的PCR产物进行SphI酶切过夜；同样，对实施例8.2得到的质粒pTPcbh-2进行SphI酶切过夜；然后，回收2个酶切产物，在16℃条件下过夜连接；最后将连接产物导入大肠杆菌DH5a。

随机选取10个转化子，分别提取质粒，利用PCR验证其连接方向是否正确。PCR引物采用实施例8.2中的proF和实施例8.3中terR。选择一个连接方向正确的表达质粒，命名为pTS-2。质粒pTS-2即含有柄篮状菌VL-1自身的cbh1（纤维素外切酶1）启动子和终止子序列，可用于以柄篮状菌为宿主细胞的转化过程。

8.5植酸酶表达质粒pTS-phyA-2的构建

按照实施例8.1中方法提取黑曲霉基因组DNA作为PCR模板。以phyA-F/phyA-R扩增黑曲霉的植酸酶基因序列（GenBank:Z16414.1）。

phyA-F:AAATCGATATGGGCGTCTCTGCTGTTC；（ATCGAT为ClaI酶切位点）

phyA-R:AAGCGGCCGCTAAGCAAAACACTCCG；（GCGGCCGC为NotI酶切位点）

PCR扩增条件是：95℃4min；94℃40S；55℃40S，72℃1.5min30个循环；72℃7min。扩增产物凝胶回收后，对其进行ClaI和NotI双酶切；同样，对实施例8.4构建得到的质粒pTS-2也进行ClaI和NotI双酶切；然后，将两个酶切产物回收，并在16℃条件下过夜连接；最后将连接产物导入大肠杆菌DH5a。将获得的表达质粒命名为pTS-phyA-2。

实施例9柄篮状菌VL-1原生质体的制备

在PDA固体平板上进行上述柄篮状菌VL-1菌种活化，培养温度28℃；取经活化的柄篮状菌VL-1接种于液体YEG培养基(0.5-1%酵母粉，1-2%葡萄糖)，培养温度为28℃，转速为200-250rpm，培养时间为24-36小时。所得的培养液用灭菌的三层擦镜纸过滤，用无菌的生理盐水冲洗悬浮的菌丝体；加入10mg/ml的裂解酶（购自Sigma，货号为L1412），所述的酶液经过滤除菌后每20ml酶液加入约0.9-1.1g湿菌体，置于30℃摇床，转速为50-60rpm，酶解2.5小时后过滤去除菌丝残片，离心获得到原生质体沉淀；用缓冲液STC（10%的蔗糖，浓度为50mM的Tris·Cl，pH8.0，浓度为50mM的CaCl₂）悬浮洗涤原生质体沉淀1-2次；最后，原生质体沉淀悬浮于STC溶液中，显微镜检查和计数，调整原生质体的浓度为10⁸个/ml左右用于以下转化。

实施例10柄篮状菌VL-1原生质体转化

将2μgpTG-phyA-2质粒DNA（含ptrA基因的质粒）加入150μl柄篮状菌VL-1原生质体中，室温静置25min；然后分2次加入1ml60%PEG（PEG4000，PEG6000或PEG8000），轻轻混匀，室温静置25min；然后把原生质体混合液加到50ml的上层SF培养基中（18.32%山梨醇，1%葡萄糖，0.6%(NH₄)₂SO₄，1%KH₂PO₄,0.1%MgSO₄，0.3%C₆H₅Na₃O₇·2H₂O，0.005%FeSO₄·7H₂O，0.002%MnCl₂·4H₂O，0.0014%ZnSO₄·7H₂O，0.0012%CoCl₂，0.65-0.75%的琼脂粉），轻轻混匀后倒入下层XF培养基平板（含1.3%琼脂粉和终浓度为0.4μg/ml的硫胺素的SF固体培养基），倒置培养6-8天至转化子长出。最后，挑取转化子接种于含有0.4μg/ml硫胺素的下层XF培养基上继代培养，3-5天后刮取菌丝，提取DNA进行验证。

实施例11转化子的鉴定与摇瓶发酵

11.1转化子的鉴定

将实施例10所述从XF培养基上刮取的柄篮状菌VL-1的菌丝，放入2ml的eppendorf管中，加入500μl的CTAB缓冲液和500μl酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）溶液，37℃，220rpm振荡1-1.5h，然后离心13200rpm×15min；取上清液并加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀0.5-2小时，然后离心12000rpm×10min；最后，用75%乙醇洗涤沉淀1次、待沉淀干燥后加入30-50μl含有RNase的去离子水，作为下一步PCR反应模板。PCR反应验证转化子：以提取的DNA为模板，引物ptrA-F和ptrA-R（CCCCAGGCTTTACACTTTAT和CCGCTCTTGCATCTTTGTT）进行PCR扩增抗硫胺素基因；同时，利用引物phyA-F和phyA-R扩增目的基因，即植酸酶基因序列。PCR反应条件：95℃5min;95℃30s,56℃30s,72℃2min,30个循环；72℃10min。PCR结果显示抗硫胺素基因ptrA和植酸酶基因phyA均能有效扩增；测序分析结果也显示扩增结果无误。这说明携带ptrA和phyA基因的表达载体已经整合到柄篮状菌VL-1宿主的基因组中。

11.2转化子摇瓶发酵

从实施例11.1得到的阳性转化子中选取一个，命名为TS-2，接种于液体种子培养基（酵母粉20g/L，葡萄糖20g/L），30℃培养48小时；然后按照5-10%的比例转接至发酵培养基M2（纤维素30g/L，蛋白胨7.5g/L，玉米粉15g/L，KH₂PO₄5g/L，CaCl₂·2H₂O2g/L，KCl1.8g/L，柠檬酸0.5g/L，吐温-800.18g/L，聚丙二醇0.18g/L），28℃培养3-7天；离心收集发酵上清液，进行12%SDS-PAGE电泳检测分析。结果显示，阳性转化子TS-2发酵上清液中含有外源植酸酶，说明本发明获得的柄篮状菌VL-1可用于表达外源基因。

分别测定不同发酵时间段柄篮状菌VL-1宿主菌（阴性对照）和阳性转化子TS-2发酵液的酶活，结果如表3所示。

表3：不同时间的摇瓶发酵酶活

由表3中的数据可以看出，黑曲霉的植酸酶基因在本发明所述柄篮状菌VL-1宿主菌中得到了高效表达，且在摇瓶发酵96h时酶活水平最高，达90.31u/ml，比野生型柄篮状菌（CGMCC3.4299）的表达水平提高了约80%。

实施例12纤维素内切酶基因在柄篮状菌中的表达

12.1提取特异腐质霉总基因组DNA

将特异腐质霉（Humicolainsolens）过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100mMTris-HCl,100mMEDTA,250mMNaCl,1%SDS);然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl10MNH4AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。

12.2基因克隆

以6.1中提取的DNA为模板，利用引物pri-F和pri-R进行PCR扩增。

pri-F：AAATCGATTATGCGTTCCTCCCCCCTC；（ATCGAT为ClaI酶切位点）

pri-R：AAGCGGCCGCCTACAGGCACTGATGGTAC；（GCGGCCGC为NotI酶切位点）

PCR扩增条件为95℃4min；94℃30S；55℃40S，72℃1min30个循环；72℃，7min；凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。将12.2中回收的扩增产物分别连接到pMD18-T载体，获得克隆载体pMD-EG-2，送至北京华大基因研究中心进行测序分析无误。采用实施例2所述方法，构建携带实施例2所述启动子、终止子和扩增产物的表达质粒，命名为pTS-ec-2。

12.3工程菌的构建与鉴定

采用实施例9所述方法制备柄篮状菌VL-1原生质体；按照实施例10所述，进行转化操作，将表达质粒pTS-ec-2导入柄篮状菌VL-1菌株中，获得5个转化子。提取转化子的DNA作为模板，利用引物priF和priR进行PCR扩增验证。结果显示有2个阳性转化子均能扩增出目的条带；同时，测序分析也显示PCR扩增结果无误。

12.4工程菌的摇瓶发酵

按照实施例11.2所述，将上述获得的含纤维素内切酶的阳性转化子接种于液体种子培养基，30℃培养48小时；然后按照5-10%的比例转接至发酵培养基M2，28℃培养3-7天；离心收集发酵上清液，进行12%SDS-PAGE电泳检测分析和纤维素内切酶酶活测定。SDS-PAGE电泳图显示发酵上清液中含有纤维素内切酶的蛋白条带，而2个阳性转化子的摇瓶发酵上清液酶活分别为72.44U/ml和85.51U/ml。

此外，本发明所述宿主菌柄篮状菌（CGMCC3.4299）和突变株柄篮状菌VL-1还能高效表达烟曲霉（Aspergillusfumigatus）的脂肪酶、里氏木霉（Trichodermareesei）的木聚糖酶、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的果胶酶等多种外源基因，摇瓶发酵蛋白表达量约为0.3-0.5g/L，酶活约为30-60IU/ml。

本发明所述野生型柄篮状菌（CGMCC3.4299）和突变株柄篮状菌VL-1对外源蛋白的表达，仅是本发明的优选实施方案；除了本发明所述柄篮状菌之外，以其他的柄篮状菌为宿主菌，采用本发明实施例所述表达载体的构建方法和原生质体转化方法，同样也能实现外源基因的表达，从而证明本发明构建的表达系统具有广泛的适用性。

Claims (10)

1.一种启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列为SEQIDNO:1。

2.一种表达载体，包括有启动子和终止子，其特征在于所述的启动子为权利要求1所述的启动子。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述的终止子的核苷酸序列为SEQIDNO:2。

4.如权利要求2或3所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体上还包含有筛选标记。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述的筛选标记为硫胺素抗性基因ptrA。

6.一种外源蛋白表达系统，包含有宿主和表达载体，其特征在于，所述的宿主为柄篮状菌，表达载体为权利要求2所述的表达载体。

7.如权利要求6所述的外源蛋白表达系统，其特征在于，所述的外源蛋白表达系统的筛选标记为硫胺素抗性基因。

8.如权利要求6所述的外源蛋白表达系统，其特征在于，所述的柄篮状菌为柄篮状菌VL-1，保藏编号为CCTCCNO:M2013679。

9.一种表达外源蛋白的方法，包括如下步骤：

1)外源基因的克隆；

2)利用权利要求2所述的表达载体，构建携带步骤1)外源基因的重组表达载体；

3)将重组表达载体转化柄篮状菌，获得重组表达外源蛋白的重组菌株。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述的步骤3)中的转化柄篮状菌，所述的转化为电击转化法、农杆菌介导转化法或原生质体转化法中的任意一种。