CN102776215B - 优化的乳糖酶基因及其分泌表达方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了优化的乳糖酶基因及其分泌表达方法和应用。本发明将源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的乳糖酶基因按照巴斯德毕赤酵母的偏爱密码子进行改造得到核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的乳糖酶优化基因，优化后的乳糖酶基因降低了转录能量屏障，提高了转录效率，显著提升了其在毕赤酵母中的分泌表达水平，所表达的重组乳糖酶酶活高。牛奶水解实验结果表明，本发明所制备的重组乳糖酶在不同温度下乳糖水解率均可达到80%以上，水解乳糖效果良好。本发明为乳糖酶进一步工业化扩大生产奠定了基础。

Description

优化的乳糖酶基因及其分泌表达方法和应用

技术领域

本发明涉及乳糖酶优化基因，尤其涉及将来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的乳糖酶原基因进行密码子优化后所得到的乳糖酶优化基因，本发明还涉及该乳糖酶优化基因在制备重组乳糖酶中的应用，属于乳糖酶的制备领域。

背景技术

乳糖酶（β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，β-D-galactoside galactohydrolase，EC3.2.1.23）具有水解和转糖苷的双重作用。一方面，人们利用其水解功能生产低乳糖乳制品来解除乳糖不耐受患者因食用乳制品而引起的多种不良反应；另一方面，可利用其转糖苷特性的作用生产具有良好保健作用的低聚半乳糖(Hydrolysis of lactose:aliterature review.Journal Name:Process Biochem.;(United Kingdom);Journal Volu-me:20:11985,Medium:X;Size:Pages:2-12.)。乳糖酶广泛存在于植物、微生物以及动物肠道细胞中。目前，商业化生产的乳糖酶主要来源于曲霉（Aspergillus sp.）和克鲁维斯氏酵母（Kluyveromyces sp.）这两个属的微生物发酵。克鲁维斯氏酵母是从牛乳中分离到的，其产生的乳糖酶最适pH与新鲜牛乳的天然pH(6.6～6.8)相近，主要适用于分解牛乳及脱脂奶粉中的乳糖，该酶在pH6.2～7.0稳定，6.2～7.0以上或以下酶活迅速下降。最适温度为35～40℃。分子量为135kDa。40℃处理1h，pH在6.5～8.5之间稳定。40℃以上就急剧失活(谢毅等，复旦学报(自然科学版)，1999，Vol.38,No.5:523-528)。从曲霉所得的乳糖酶pH较低，而且在高温下有活性，分子量为106kDa，最适温度60℃，最适pH在3.5～5.0。从霉菌来的乳糖酶的最大特点是热稳定性高，最适pH值低，这样在食品工业上就不容易受到微生物的污染，更具有应用价值。

由于原始菌株生产的乳糖酶产量低，无法满足工业生产的要求，因此本领域研究人员试图利用基因工程手段来提高乳糖酶的表达量。特别是利用毕赤酵母和曲霉表达系统在提高乳糖酶的表达水平上取得了较大进展。Berka(US 5,736,374)公开了一种提高曲霉乳糖酶表达的方法，该方法将产乳糖酶的米曲霉(A.oryaze)CCC28菌株通过紫外、NTG诱变处理获得乳糖酶表达量较高的突变株CCC161(ATCC74285)(亲本乳糖酶分泌量为5U/ml，突变株分泌量为50U/ml)，以其为受体，将其自身的乳糖酶基因置于GalA启动子之下导入其中，所筛选的阳性克隆子中的乳糖酶蛋白表达量为1g/L发酵液，乳糖酶活性达500U/ml以上，比原始菌提高了100倍。本发明人公开了一种性质优良的乳糖酶编码基因的克隆、高效表达乳糖酶的重组毕赤酵母的构建以及重组酵母的高密度发酵大量产生乳糖酶的方法，重组酵母中乳糖酶的表达量可达到6mg/ml发酵液，酶活达到3600U/ml，高效表达乳糖酶的重组酵母可用来大规模工业化廉价生产乳糖酶（授权公告号：CN 1233826C，发明名称：一种重组毕赤酵母乳糖酶及其应用）。Machida,M.等报道了一种从米曲霉（Aspergillus oryzae）中分离、克隆的乳糖酶基因（Machida,M.,Asai,K.,Sano,M.,et.al,Genome sequencing and analysisof Aspergillus oryzae,Nature,2005,438(7071),1157-1161），该乳糖酶基因在酵母细胞中的分泌表达水平较低，所表达的乳糖酶酶活不高，限制了其在工业化扩大生产中的应用。

发明内容

本发明目的之一是提供一种密码子经过改造且mRNA二级结构稳定性好的乳糖酶优化基因，该乳糖酶优化基因在宿主细胞中的分泌表达量高；

本发明目的之二是提供含有该乳糖酶优化基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞；

本发明目的之三是将所述乳糖酶优化基因以及含有该优化基因的重组表达载体和重组宿主细胞应用于生产重组乳糖酶；

为实现上述目的，本发明首先将米曲霉（Aspergillus oryzae）乳糖酶基因进行修饰改造得到乳糖酶优化基因(lacm)，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明将米曲霉（Aspergillus oryzae）乳糖酶原基因(laco)（SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列）在不改变其蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率，GC含量的调整，不稳定序列的删除、mRNA二级结构等影响因素，按照巴斯德毕赤酵母的偏爱密码子对米曲霉（Aspergillus oryzae）乳糖酶基因(laco)进行改造，其中，共改变379个碱基，涉及311个氨基酸，修饰改造后获得的乳糖酶优化基因(lacm)（SEQID NO.1）的GC含量由51.5%降为48.5%；此外，优化后乳糖酶基因的mRNA二级结构自由能也得到了较大幅度的提高，降低了转录能量屏障，提高了转录效率，有效提高了其在毕赤酵母中的分泌表达量。

本发明另一方面提供了含有所述乳糖酶优化基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞；

优选的，所述重组表达载体是重组真核表达载体，更优选为重组酵母表达载体，最优选为重组毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体。

将所述乳糖酶优化基因可操作的与酵母的表达调控序列相连就可得到在酵母细胞中分泌表达乳糖酶的重组酵母表达载体；为了达到更好的分泌表达效果，本发明优选将所述乳糖酶优化基因可操作的与毕赤酵母的表达调控序列相连得到在毕赤酵母细胞中分泌表达重组乳糖酶的重组毕赤酵母表达载体。

本发明所述的酵母包括能够表达编码乳糖酶的优化基因的各种酵母中的任一种。选择用于表达重组乳糖酶的合适酵母是在所属领域的普通技术人员的能力范围之内。在选择用于表达的酵母宿主中，合适的宿主可包括展示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好的可溶蛋白产生和总体稳固的酵母。这些酵母包括但不限于产子囊酵母（内孢霉目（Endomycetales）、担孢子酵母和属于半知菌（芽孢纲（Blastomycetes））类的酵母。所述产子囊酵母分为两科，即：蚀精霉科（Spermophthoraceae）和酵母菌科（Saccharomycetaceae）。后者包含四个亚科，Schizosaccharomycoideae（例如裂殖酵母属（Schizosaccharomyces））、Nadsonioideae、Lipomycoideae和Saccharomycoideae（例如毕赤酵母属（Pichia）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）和酵母属（Saccharomyces）。担孢子酵母包括Leucosporidium属、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、锁掷酵母属（Sporidiobolus）、Filobasidium属和线黑粉菌属（Filobasidiella）。

优选的，本发明所述的酵母为毕赤酵母(Pichia pastoris)。

用于酵母表达载体的表达调控序列对于所属领域的普通技术人员是众所周知的，包括但不限于来自诸如以下基因的启动子区域：醇脱氢酶（ADH）、烯醇化酶、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAP或GAPDH）、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸变位酶和丙酮酸激酶（PYK）。其它用于酵母宿主的合适启动子序列包括用于3-磷酸甘油酸激酶（Hitzeman et al.,J.Biol.Chem.(1980)255:2073）及其它诸如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡糖异构酶的糖解酶的启动子（Holland et al.,Biochemistry(1978)17:4900；Hess etal.,J.Adv.ENZYME REG.(1968)7:149）。酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。此外，合成启动子也可起到酵母启动子的作用。酵母启动子可包括具有结合酵母RNA聚合酶和起始转录的能力的天然产生的非酵母来源的启动子，可包含部分酵母表达载体的其它控制元件包括例如来自GAPDH或烯醇化酶基因的终止子（Holland et al.,J.Biol.Chem.(1981)256:1385）。用于酵母中的合适选择基因是存在于酵母质粒中的trp1基因，所述trp1基因提供用于缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株的选择标记。

进一步的，本发明提供了一种利用所述的乳糖酶基因生产重组乳糖酶的方法，包括：将SEQ ID NO.1所示的乳糖酶优化基因可操作性的与表达载体相连接得到重组表达载体；将所述重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；培养重组菌株，诱导重组乳糖酶的表达，回收并纯化所表达的重组乳糖酶，即得。

上述生产重组乳糖酶的方法中，所述的重组表达载体优选为重组真核表达载体，更优选为重组毕赤酵母表达载体；所述的宿主细胞优选为酵母，更优选为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

将乳糖酶优化基因转化到酵母宿主中的方法对所属领域的普通技术人员是众所周知的。举例而言，酵母转化可根据以下文献中描述的方法进行：Hsial et al.,P.Natl.Acad.SCI.USA(1979)76:3829和Van Solingen et al.,J.Bact.(1977)130:946；也可按照通常在SAMBROOK et al.,Molecular Cloning:A Lab Manual(2001)中所述的方法进行转化，诸如通过核注射、电穿孔或原生质体融合等方式，将乳糖酶优化基因引入到酵母细胞中；只要构建了重组宿主细胞菌株(即将重组酵母表达载体引入酵母细胞中并分离具有合适表达载体的重组酵母宿主细胞)，则在适于产生重组乳糖酶的条件下培养重组宿主细胞菌株，培养重组宿主细胞菌株的方法依赖于所用表达载体的性质和宿主细胞的特性，这对所属领域的普通技术人员来说属于常规的技术手段，其包括但不限于发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、空心纤维生物反应器、转瓶培养系统和搅拌槽生物反应器系统等方法，这些方法的每一种都可以采用分批、补料或连续模式等方法进行，同时以分批或连续型式采集细胞或采集培养物上清液。在含有碳、氮和无机盐的可吸收源和视情况含有维生素、氨基酸、生长因子及其它众所周知的蛋白培养补充物的液体培养基中培养重组宿主细胞。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不希望的微生物生长和/或含有包括但不限于抗生素的化合物以选择含有表达载体的宿主细胞。

用于在酵母宿主细胞中表达异源蛋白的其它方法对所属领域的普通技术人员是众所周知的。可在扩增阶段使用所属领域的普通技术人员众所周知的标准补料发酵法（standard feed batch fermentation method）使酵母宿主菌株在发酵罐内生长。所述发酵法可经调适以解决特定酵母宿主的碳利用路径或表达控制模式中的差异。举例而言，酵母属酵母宿主的发酵可能需要单个葡萄糖、复合氮源（例如酪蛋白水解产物）和多种维生素补充。通常为碳的生长限制营养素可在扩增阶段加入发酵罐中以允许最大生长。另外，发酵法通常应用设计为含有足够量的碳、氮、基本盐、磷及其它次要营养素（例如维生素、微量矿物质和盐等）的发酵培养基。

本发明的重组乳糖酶于重组系统中表达之后进行纯化，可以采用多种所属领域中已知的方法从酵母宿主细胞中纯化或浓缩重组乳糖酶，任何以下方法或手段都可用于纯化本发明重组乳糖酶,例如：亲和色谱、阴离子或阳离子交换色谱（例如DEAESEPHAROSE）、硅胶色谱、反相HPLC、凝胶过滤（例如SEPHADEX G-75）、疏水相互作用色谱、大小排除色谱、金属螯合色谱、超滤/透滤、乙醇沉淀、硫酸铵沉淀、色谱聚焦、置换色谱、电泳程序（包括但不限于制备型等电聚焦）、差别溶解性（包括但不限于硫酸铵沉淀）、SDS-PAGE或萃取。举例而言，可离心或过滤发酵培养液以去除细胞碎片，将上清液浓缩或稀释到所要体积或透滤入合适缓冲液中以调节制剂以用于进一步纯化。更优选的，可以将发酵后的上清液离心去除菌体沉淀，将上清酶液过滤，弃去滤过液，即得到浓缩的酶液；其中，所述的过滤可分为两次，第一次过滤采用0.1μm微滤膜进行过滤，以除去上清酶液中残留的细胞碎片和可能存在的杂质，收集滤过液；第二次过滤是将第一次的滤过液再经过截留分子量为10kDa的超滤膜进行过滤。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或者已经用作重组载体或其他转移DNA的接受体的酵母。所述术语包括已经接收重组载体或其它转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。由于偶然或有意的突变，单个亲本细胞的后代可不必在形态上或与原始亲本互补的基因组或总DNA上完全一致。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包括外源性多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其他方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Cassol et al.,(1992);Rossolini et al.,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994)）。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白（即抗原），其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“表达”指外源基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。

术语“转化”指将外源基因引入到宿主细胞中的方法。

术语“外源基因”指对特定的宿主细胞而言，该基因序列是属于外来的来源，或是来自相同的来源但其原始序列进行了修饰或改造。

附图说明

图1乳糖酶原基因（laco）的密码子使用频率。

图2本发明乳糖酶优化基因（lacm）的密码子使用频率。

图3乳糖酶原基因（laco）mRNA二级结构图。

图4本发明乳糖酶优化基因（lacm）mRNA二级结构图。

图5酵母重组表达质粒pPIC9-laco(lacm)的构建示意图。

图6转lacm和laco基因的酵母转化子的PCR鉴定电泳图；1：阴性对照；2-6：转乳糖酶优化基因(lacm)酵母转化子的PCR检测，以MF1和MR1为引物扩增，扩增出约3kb的lacm基因全长片段；8-12：转乳糖酶原基因(laco)酵母转化子的PCR检测，以5AOX和MR2为引物扩增，扩增出包括部分启动子和laco基因的约1.6kb大小的片段；M：1kb DNA marker。

图7转laco(1#)、转lacm（Y7#）的酵母菌株3升发酵罐中乳糖酶酶活结果。

图8Y7#酵母菌株在3升发酵罐中乳糖酶经甲醇诱导不同时间内的表达量的SDS-PAGE；M：蛋白分子量marker。

图9本发明所制备的重组乳糖酶水解牛奶的应用效果试验。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

说明：以下具体实施例中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook et al，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel et al,1994)。

实施例1乳糖酶基因的优化设计和合成

1.1菌株和质粒

米曲霉(Aspergillus oryzae)由本发明人实验室保存；

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株TOP10和克隆载体pSP72购自北京全式金生物技术有限公司；lacm全基因片段由北京奥科生物技术公司合成。

1.2乳糖酶基因的优化设计

本发明首先对从米曲霉(Aspergillus oryzae)中克隆获得的乳糖酶原始基因(laco)的序列进行分析，在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率，GC含量的调整，不稳定序列的删除、mRNA二级结构稳定性等影响因素，按照巴斯德毕赤酵母的偏爱密码子对乳糖酶基因序列进行改造。乳糖酶基因优化前后的密码子使用情况如图1和图2所示。米曲霉来源的乳糖酶原基因全长3015bp，共编码1005个氨基酸。其中前57个碱基编码的19个氨基酸为信号肽序列。通过GenBankBlast比对，米曲霉来源的乳糖酶原基因与曲霉属来源的乳糖酶基因相似性最高。乳糖酶原基因在毕赤酵母中表达时需去除自带的信号肽序列，以表达载体pPIC9上的α因子为信号肽，因此去除自身信号肽的乳糖酶原基因(laco)由2958个碱基组成，编码986个氨基酸(SEQ ID NO.2)。在不改变氨基酸序列的前提下，本发明对laco基因进行修饰改造，共改变了379个碱基，涉及311个氨基酸，GC%含量由原来的51.5%降低为48.5%(表1)，所得到的乳糖酶优化基因(lacm)序列为SEQ ID NO.1所示；而且，优化后的基因(lacm)（SEQ ID NO.1）通过软件预测(RNA structure 4.5)，其mRNA二级结构自由能相比laco(SEQ ID NO.2)得到了较大幅度的提高，这样有利于降低转录能量屏障，提高转录效率，进而提高蛋白表达量（表2）。同时，优化前后基因的mRNA的二级结构也发生了很大的改变，优化基因(lacm)的mRNA二级结构减少了发夹结构，更加简单，有利于基因的转录(图3、4)。

表1  乳糖酶基因优化前后GC含量的变化表

表2  laco和lacm的mRNA二级结构自由能比较

注：mRNA二级结构自由能使用RNA structure 4.5软件进行计算。

1.3密码子优化后的乳糖酶基因（lacm）的合成

将lacm（SEQ IDNO.1）人工合成后连接在载体pSP72上。

实施例2 乳糖酶重组毕赤酵母菌株的构建和筛选

1.1菌株和质粒

Top10大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；

表达载体pPIC9和毕赤酵母受体菌株GS115为Invitrogen公司产品。

将lacm（SEQ ID NO.1）人工合成后连接在载体pSP72上得到质粒pSP72-lacm；将laco（SEQ ID NO.2）人工合成后连接在载体pSP72上得到质粒pSP72-laco。

1.2试剂、培养基及其他溶液

邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（oNPG）为Applichem公司产品；

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基含1.5%琼脂粉)，108℃灭菌15min。

10×YNB（酵母无氨基酸氮源）：134g YNB固体溶于1L去离子水，过滤灭菌，4℃保存。

500×生物素：生物素20mg/100mL水，过滤灭菌，4℃保存。

10×葡萄糖：200g D-葡萄糖溶于1000mL水，过滤灭菌，4℃保存。

MD培养基：YNB 13.4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4x10^-4g/L，琼脂糖20g/L。

MM培养基：YNB 13.4g/L，甲醇0.5%，生物素4x10^-4g/L，琼脂糖20g/L。

BMGY培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，YNB 13.4g/L，生物素4x10^-4g/L，甘油10ml/L，用pH6.0磷酸盐缓冲液配制。

BMMY培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，YNB 13.4g/L，生物素4x10^-4g/L，甲醇5mL/L，用pH6.0磷酸盐缓冲液配制。

1mol/L山梨醇：将182.1gD-山梨醇溶于1L水中，过滤灭菌，4℃保存。

Basal salts（发酵培养基）：KH₂PO₄ 12g/L，NH₄H₂PO₄ 80g/L，K₂SO₄ 43g/L，MgSO₄·7H₂O 26g/L，Ca₂SO₄ 2.86g/L，KOH 3.0g/L。

发酵中所用的微量盐溶液（PTM）：硫酸铜4.0g/L、碘化钠0.18g/L、硫酸锰1.8g/L、钼酸钠0.4g/L、硼酸0.02g/L、氯化钻1.5g/L、氯化锌10g/L、硫酸亚铁34g/L、生物素0.25g/L、硫酸3ml/L；过滤灭菌，4℃保存。

1.3乳糖酶原基因和优化基因酵母重组表达载体的构建

分别提取pSP72-lacm和pPIC9质粒，并分别用SnaBI和NotI对这两个重组质粒进行双酶切处理，并将lacm基因（SEQ IDNO.1）和表达载体pPIC9酶切产物进行回收及连接，通过酶切和测序对阳性克隆进行鉴定，由此构建了酵母重组表达载体pPIC9-lacm(图5)。

参照酵母重组表达载体pPIC9-lacm的构建方法，将乳糖酶原基因(laco)（SEQ IDNO.2）和表达载体pPIC9酶切产物进行回收及连接，通过酶切和测序对阳性克隆进行鉴定，构建得到酵母重组表达载体pPIC9-laco（图5）。

1.4乳糖酶原基因和优化基因在毕赤酵母中的表达

用BglII分别酶切重组表达质粒pPIC9-lacm和pPIC9-laco，使质粒线性化，按照毕赤酵母表达手册分别将其转化毕赤酵母宿主菌GS115。以每板200μl菌液量涂布于MD平板上，28℃培养至长出转化子。随机挑选5个克隆子提取基因组，利用CTAB法提取基因组DNA，然后以基因组DNA为模板，以特异引物进行PCR扩增检测。对转乳糖酶原基因(laco)酵母基因组的PCR检测采用laco基因内部引物MR2(5’GGTTACCAGCACTGGTAGGAAG)和pPIC9载体启动子处的引物5AOX(5’GACTGGTTCCAATTGACAAGC)进行PCR扩增，可扩增出1.6kb大小的片段；转优化基因(lacm)的酵母基因组的PCR检测，以改造基因lacm的5’端特异引物MF1(5’TCCATCAAG CACCGTTTGAATG)与3’端特异引物MR1(5’GTAAGCTCCCTTT CTCTGCTCG)进行PCR扩增，可扩增出3kb大小的基因全长片段(图6)。

经PCR扩增检测表明，laco和lacm基因均已成功的转化到毕赤酵母细胞中。

1.5产乳糖酶重组毕赤酵母在摇床水平的筛选

首先采用平板筛选方法对转化子进行初筛。用无菌牙签将MD平板上长出来的转化子复制到具有编号的MM平板上(平板上均匀涂有80μl浓度为20mg/ml的X-gal)，同时复制在具有相同编号的MD平板上，将MM复制平板和MD复制平板置于28℃培养箱培养，阳性菌株在平板上可显示蓝色，据此确定阳性率及乳糖酶毕赤酵母表达菌株。随后对平板初筛的转化子进行复筛。用无菌牙签将初筛具有酶活的相应克隆挑到10mL BMGY培养基中摇床培养48h（28℃，200rpm），然后离心（6000rpm，8min），弃去培养基上清，加入5mL BMMY，摇床培养（28℃，200rpm），期间每隔24h补加0.5%甲醇，诱导60h后离心（6000rpm，8min，4℃），收集上清液测定酶活力。复筛结果进行再次重复试验，确认酶活力。

筛选测定了转lacm基因的酵母转化子800个，发现800个酵母转化子中平均约有30%的转化子（240个）具有乳糖酶的活性。

同样筛选测定了转乳糖酶原基因（laco）的酵母转化子1000个，发现1000个酵母转化子中平均约有28%的转化子（280个）具有乳糖酶的活性；其中转laco基因的1#转化子的酶活最高（4321.8U/ml）；转lacm的800个酵母转化子中酶活最高的转化子Y7#在摇床水平的酶活(1411.8U/ml)是转laco基因的1#转化子(433.6U/ml)的3.3倍(表3)；其中有75%的转lacm基因的转化子的酶活均高于转laco基因的产乳糖酶重组毕赤酵母（其中包括酶活最高的转laco基因的1#转化子）。

乳糖酶活性的定义

1个单位的乳糖酶的活性为在pH5.2、60℃下每分钟分解邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷(ONPG)生成1μmoL邻硝基酚(ONP)所需的酶量。

酶活的测定方法：将表达上清用0.1mol/L pH5.2醋酸缓冲液稀释，取200μL稀释液加入800μL 0.25%ONPG(邻硝基苯酚-β-D吡喃半乳糖苷，0.1mol/L pH5.2醋酸缓冲液配制)，60℃水浴15min，加入1mL10%三氯乙酸终止反应，再加入1mL 1mol/L碳酸钠显色液，OD₄₂₀测定乳糖酶活性，同时以0.1mol/L pH5.2醋酸缓冲液代替上清稀释液作为对照，计算水解产物对硝基酚的含量，通过标准曲线算出酶的活性。

表3  部分转乳糖酶优化基因酵母的酶活测定结果

注：表3中的对照1#为转laco基因（SEQ ID NO.2）的转化子；其余均为转lacm基因（SEQ ID NO.1）的转化子。

1.6乳糖酶重组毕赤酵母的发酵

分别以转乳糖酶原基因(laco)的乳糖酶表达量最高的重组毕赤酵母菌1#和经将复筛实验中比对照菌株酶活显著提高的转乳糖酶优化基因(lacm)的Y7#进行实验室3升发酵罐水平诱导产酶发酵。

分别将上述2株酵母转化子用无菌牙签挑到40ml YPD培养基中，摇床培养（28℃，200rpm）48h后，转接到200ml YPD培养基中，摇床培养（28℃，200rpm）24h作为发酵种子菌液，接种于3升发酵罐中。

发酵罐参数设置为pH5.5，温度30℃，搅拌速率为1000rpm，通气量为200，初始接种量为200ml菌液，当溶氧下降至最低，然后又开始上升到100%时，开始补糖（300ml的40%葡萄糖+12mlPTM盐），补糖4-5h后，开始混饲（80ml的40%葡萄糖+1mlPTM盐+7ml甲醇），混饲2-4h后开始流加甲醇（500ml甲醇+12mlPTM盐）诱导产酶，开始诱导后，每隔12h取发酵样品测定菌体湿重和样品酶活并留样，酶活随着诱导时间的延长而增加，当酶活开始下降时，停止发酵，下罐，将发酵液离心（10000rpm，10min，4℃），收集上清酶液。从3升小试水平发酵结果可知，转乳糖酶原基因laco的酵母转化子1#在甲醇诱导132h后乳糖酶的活性为4321.8U/ml；转乳糖酶优化基因lacm的的酵母转化子Y7#酶活诱导132h后为13021.1U/ml，其酶活是1#转化子的3.0倍(图7、图8)。

由此可见，本发明将米曲霉来源的乳糖酶经密码子优化、GC含量改变等综合改造后所得到的优化基因（SEQ ID NO.1）能够显著提高乳糖酶蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量，大幅提高了乳糖酶的酶活。与国内外部分研究比较，本发明重组乳糖酶的最终表达量达到较高的表达水平，为进一步工业化扩大生产奠定了基础。

实验例1  乳糖酶的牛奶水解实验

一、实验材料

1、供试材料：转lacm的毕赤酵母菌株（Y7#、Y1#、Y3#、Y231#等转化子）经发酵、微滤、超滤浓缩，去除酵母菌体，得到的乳糖酶酶液(30000U/ml)；

2、牛奶样品：市场上销售的伊利公司生产的纯牛奶样品(利乐枕包装)。

二、实验方法

通过测定乳糖酶活性将乳糖酶样品的酶活调整至30000U/ml。在无菌状态下，量取纯牛奶1L，混匀，按1:1000的比例将酶制剂添加到1L牛奶中，混匀后进行分装，每个三角瓶装液量20ml，编号，每一处理条件做三个重复。并同时取相同量的未添加酶制剂样品的牛奶样品作为对照。研究乳糖酶于不同温度(6℃、10℃、15℃、25℃)下，不同时间内水解牛乳中的乳糖的程度。

根据取样时间，取出对应的样品瓶，测定pH值并记录。取0.4ml牛奶样品加入EP管中，加入0.4mL 20%醋酸铅，振荡以除去蛋白，再加0.4mL草酸钾-磷酸氢二钠溶液(称取3g草酸钾和7g磷酸氢二钠，加水溶解并定容至100ml)，除去Pb²⁺，剧烈振荡，12000rpm离心10min后，取0.8mL上清液，以相同条件再离心一次，取0.7mL上清液至EP管中，冷冻保藏，通过高效液相色谱测定各处理样品中的乳糖含量，得出各条件下的乳糖水解率。

三、实验结果

实验结果见图9(图9结果是上述酵母转化子发酵生产的乳糖酶水解牛奶实验的平均结果)。实验结果表明，本发明所制备的重组乳糖酶样品在不同温度下乳糖水解率均可达到80%以上，水解效果良好，具有很好的应用前景。

                         序列表

 

<110>  优化的乳糖酶基因及其分泌表达方法和应用

 

<120>  中国农业科学院生物技术研究所

 

<130>  DQXL-0016

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  2958

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  1

tccatcaagc atcgtctcaa tggcttcacg atcctggaac atccggatcc ggcgaaaaga       60

 

gacttgctgc aagacattgt tacatgggat gacaaatctc tgttcatcaa tggagagagg      120

 

attatgttat tcagcggaga agtgcatcct ttcagattgc cagtaccttc gctttggctt      180

 

gatatcttcc acaagatcag agctcttggt ttcaactgtg tatctttcta tattgattgg      240

 

gctcttctgg agggaaagcc tggcgactac agagcagaag gcatctttgc tctggaaccc      300

 

ttcttcgatg cagccaagga agcaggcatt tatctgatcg cccgccccgg ttcgtacatc      360

 

aatgccgagg tctcaggcgg tggcttccct ggatggttgc agagggtcaa tggcactctt      420

 

cgctcgtctg atgagccatt ccttaaagct actgataact atatcgccaa tgccgctgct      480

 

gccgtggcga aggctcaaat cacgaatgga gggccagtaa ttctctacca gcccgaaaac      540

 

gaatacagcg gtggctgctg cggtgtcaaa taccccgatg cagactacat gcagtatgtt      600

 

atggatcagg cccggaaggc tgacattgtt gtacctttca tcagcaacga tgcctcacct      660

 

tctgggcaca atgctcctgg aagtggaacg ggcgctgttg atatttatgg tcacgatagc      720

 

tatccccttg gctttgattg cgcaaaccca tccgtatggc ccgagggtaa actgcccgac      780

 

aacttccgca cgctccatct tgagcagagc ccatcaactc cgtattcact tcttgagttc      840

 

caagcgggtg ctttcgaccc atggggtgga cccggctttg aaaaatgcta tgccctcgtt      900

 

aaccacgaat tctcgagagt tttctatagg aacgacttga gtttcggagt ttctaccttt      960

 

aacttataca tgactttcgg cggaacaaac tggggtaacc tcggacatcc cggtggatat     1020

 

acatcctacg actacggctc gcctataact gaaacgcgaa acgttacacg ggagaagtac     1080

 

agcgacataa agctccttgc caactttgtc aaagcatcgc catcctatct caccgctact     1140

 

cccagaaacc tgactactgg tgtttacaca gacacatctg acctggctgt caccccgtta     1200

 

atgggtgata gtccaggctc attcttcgtg gtcagacata cggactattc cagccaagag     1260

 

tcaacctcgt acaaacttaa gcttcctacc agtgctggta acctgactat tccccagctg     1320

 

gagggcactc taagtctcaa cggacgtgac tcaaaaattc atgttgttga ttataatgtg     1380

 

tctggaacga acattatcta ttcgacagct gaagtcttca cctggaagaa gtttgacggt     1440

 

aacaaggtcc tggtgttata cggcggaccg aaggaacacc atgaattggc cattgcctcc     1500

 

aagtcaaatg tgaccatcat cgaaggttcg gactctggaa ttgtctcaac gaggaagggc     1560

 

agctctgtta tcattggctg ggatgtctct tctactcgtc gcatcgttca agtcggtgac     1620

 

ttgagagtgt tcctgcttga tagaaactct gcttacaact actgggtccc cgaactcccc     1680

 

acagaaggta cttctcccgg gttcagcact tcgaagacga ccgcctcctc cattattgtg     1740

 

aaggccggct acctcctccg aggggctcac ctggatggtg ctgatcttca tcttactgct     1800

 

gatttcaatg ccaccacccc gattgaagtg atcggtgctc caacaggcgc caagaatctg     1860

 

ttcgtgaatg gtgaaaaggc tagccacaca gtcgacaaaa acggcatctg gagtagtgag     1920

 

gtcaagtacg cggctccaga gatcaagctc cccggtttga aggatttgga ctggaagtat     1980

 

ctggacacgc ttcccgaaat taagtcttcc tatgatgact cggcctgggt ttcggcagac     2040

 

cttccaaaga caaagaacac tcaccgtcct cttgacacac caacatcgct atactcctct     2100

 

gactatggct tccacactgg ctacctgatc tacaggggtc acttcgttgc caacggcaag     2160

 

gaaagcgaat tttttattcg cacacaaggc ggtagcgcat tcggaagttc cgtatggctg     2220

 

aacgagacgt atctgggctc ttggactggt gccgattatg cgatggacgg taactctacc     2280

 

tacaagctat ctcagctgga gtcgggcaag aattacgtca tcactgtggt tattgataac     2340

 

ctgggtctcg acgagaattg gacggtcggc gaggaaacca tgaagaatcc tcgtggtatt     2400

 

cttagctaca agctgagcgg acaagacgcc agcgcaatca cctggaagct cactggtaac     2460

 

ctcggaggag aagactacca ggataaggtt agaggacctc tcaacgaagg tggactgtac     2520

 

gcagagcgcc agggcttcca tcagcctcag cctccaagcg aatcctggga gtcgggcagt     2580

 

ccccttgaag gcctgtcgaa gccgggtatc ggattctaca ctgcccagtt cgaccttgac     2640

 

ctcccgaagg gctgggatgt gccgctgtac ttcaactttg gcaacaacac ccaggcggct     2700

 

cgggcccagc tctacgtcaa cggttaccag tatggcaagt tcactggaaa cgttgggcca     2760

 

cagaccagct tccctgttcc cgaagggatc ctgaactacc gcggaaccaa ctatgtggca     2820

 

ctgagtcttt gggcattgga gtcggacggt gctaagctgg gtagcttcga actgtcctac     2880

 

accaccccag tgctgaccgg atacggggat gttgagtcac ctgagcagcc caagtatgag     2940

 

cagcggaagg gagcatac                                                   2958

 

 

<210>  2

<211>  2958

<212>  DNA

<213>  Aspergillus oryzae

 

<400>  2

tccatcaagc accgtttgaa tggtttcact atcctggagc atccagatcc tgctaaaaga       60

 

gacttgctgc aagacattgt tacttgggac gacaaatctt tgttcatcaa cggagagaga      120

 

attatgttat tctctggaga agttcaccct ttcagattgc cagttccttc tttgtggctt      180

 

gatatcttcc acaagatcag agctcttggt ttcaactgtg tctctttcta cattgactgg      240

 

gctcttttgg agggtaagcc tggtgactac agagctgagg gtatcttcgc tctggaacct      300

 

ttcttcgacg ctgccaagga ggctggtatt tacttgatcg ccagaccagg ttcttacatc      360

 

aacgccgagg tctccggtgg tggtttccct ggttggttgc aaagagtcaa tggtaccctt      420

 

agatcctctg acgagccatt cttgaaggct actgacaact acatcgccaa cgccgctgct      480

 

gccgtcgcta aggctcaaat caccaatggt ggtccagtta ttttgtacca gccagaaaac      540

 

gagtactccg gtggctgttg tggtgtcaaa tacccagatg ctgactacat gcagtacgtt      600

 

atggatcaag ccagaaaggc tgacattgtt gtccctttca tctctaacga tgcctctcct      660

 

tctggtcaca acgctcctgg atccggaact ggtgctgttg acatttacgg tcacgattcc      720

 

tatccattgg gttttgactg cgctaaccca tccgtatggc cagagggtaa attgccagac      780

 

aacttccgta cgttgcacct tgagcaaagc ccatccactc catattcttt gcttgagttc      840

 

caagctggtg ctttcgaccc atggggtggt ccaggttttg aaaaatgtta cgccttggtt      900

 

aaccacgagt tctcgagagt tttctacaga aacgacttgt ctttcggtgt ttctaccttt      960

 

aacttataca tgactttcgg tggtactaac tggggtaact tgggacatcc aggtggatac     1020

 

acttcctacg actacggttc ccctattact gaaaccagaa acgttaccag agagaagtac     1080

 

tccgacatta agttgcttgc caactttgtc aaagcatctc catcctactt gaccgctact     1140

 

ccaagaaacc tgactactgg tgtttacact gacacctctg acttggctgt caccccatta     1200

 

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gtcaagtacg ctgctccaga gatcaagttg ccaggtttga aggacttgga ctggaagtac     1980

 

ctggacaccc ttccagagat taagtcttcc tacgatgact ctgcctgggt ttccgcagac     2040

 

ttgccaaaga ccaagaacac tcaccgtcct cttgacactc caacatcctt gtactcctct     2100

 

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tacaagttgt ctcaactcga gtctggcaag aattacgtca tcactgttgt tattgataac     2340

 

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ccacttgaag gtttgtctaa gccaggtatc ggattctaca ctgcccaatt cgaccttgac     2640

 

ttgccaaagg gttgggatgt cccattgtac ttcaacttcg gtaacaacac ccaagctgct     2700

 

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ttgagtttgt gggctttgga gtccgacggt gctaagctgg gttccttcga attgtcctac     2880

 

accaccccag ttttgaccgg atacggtgac gttgagtctc ctgagcagcc aaagtacgag     2940

 

cagagaaagg gagcttac                                                   2958

Claims (13)

1.乳糖酶优化基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.含有权利要求1所述乳糖酶优化基因的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体是重组真核表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组真核表达载体是重组酵母表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组酵母表达载体是重组毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体。

6.一种宿主细胞，其特征在于：含有权利要求2-5任何一项所述的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞是酵母细胞。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞是毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

9.权利要求1所述的乳糖酶优化基因在生产重组乳糖酶中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括：将SEQ ID NO.1所示的乳糖酶优化基因可操作性的与表达载体相连接得到重组表达载体；将所述重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；培养重组菌株，诱导重组乳糖酶的表达，回收并纯化所表达的重组乳糖酶。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述的重组表达载体为重组真核表达载体；所述的宿主细胞为酵母。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述的重组表达载体为重组酵母表达载体；所述的酵母为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述的重组酵母表达载体为重组毕赤酵母表达载体。