CN102952183B - 与植物抗蚜虫能力相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与植物抗蚜虫能力相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明提供了一种与植物抗蚜虫能力相关的蛋白。本发明所提供的与植物抗蚜虫能力相关的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗蚜虫相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明将包含Amlec基因的重组植物表达载体通过农杆菌介导法导入烟草，获得了转基因烟草对转基因烟草进行蚜虫抗性鉴定，发现转基因烟草与对照烟草相比，对蚜虫的抗性明显提高，对蚜虫种群的平均抑制率为35.5％。

Description

与植物抗蚜虫能力相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及与植物抗蚜虫能力相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

蚜虫为同翅目蚜科，是一种破坏力极强的农业害虫，它的特点为：个头小，身子软，繁殖能力特强，多寄主，能进行孤雌生殖和有性生殖。由于蚜虫具有适应能力强，食谱广，繁殖率极强等特点，如何有效地对它进行有效防治成为许多科学工作者多年来一直致力研究的难题。植物基因工程的发展为蚜虫防治开辟了新的途径。目前研究者已克隆得到了多个与抗蚜相关的基因。从抗蚜虫广谱性上来分，这些基因主要分为两类：一个是特异性抗蚜基因：如Nr基因(Nasonovia ribisnigr)：该基因从一种野生型的莴苣中获得，只针对Nasonovia ribisnigr(属于蚜虫的一个种)起作用；Vat基因：法国的一个研究小组从朝鲜的一个甜瓜品种中发现的，该基因可抑制蚜虫在植物器官上繁殖，又可以防止蚜虫传播病毒；sd1基因：只针对于苹果红圆尾蚜(Dysaphis devecta)生物I型和II型起作用，目前该基因已经被绘制了精密的物理图谱，为克隆该基因奠定了基础；Mi-1，2基因：该基因来源于茄科植物番茄中，全长14.7kb，编码由1257个氨基酸组成的蛋白，该基因属于nucleotide-binding leucine rich repeat(NBLRR)家族，即富含亮氨酸的核苷酸结合家族，后来Rossi等(1998)进行了进一步研究，发现其位于番茄的第6号染色体上，并且该基因具有高度的种属特异性，对转该基因的马铃薯分析发现，转基因马铃薯只对Wu3型的蚜虫起作用，将该基因转入茄子发现，转基因茄子只针对于线虫起作用，而对蚜虫不起作用(Rossi，M.，Goggin，F.L.，Milligan，S.B.，Kaloshian，I.，Ullman，D.E.，and Williamson，V.M.，The nematode resistance gene Mi of tomato confersresistance against the potato aphid.Proc Natl Acad Sci U S A 1998.95：9750-9754)。另一种是广谱性的抗蚜基因：如细胞分裂素基因：Smigocki等(1993)将细胞分裂素基因ipt(异戊烯基转移酶：细胞分裂素合成的关键酶)基因转化烟草，发现阳性植株能够抑制绿桃蚜(Myzuspersicae)的发育，经后续试验证发现是植物激素的过量表达从而干扰了昆虫正常的生理代谢而使桃蚜的发育受到抑制(Smigocki，A.，Neal，J.W.，Jr.，McCanna，I.，and Douglass，L.，Cytokinin-mediated insect resistance in Nicotiana plants transformedwith the ipt gene.Plant Mol Biol 1993.23：325-335)；蛋白酶抑制剂基因：由于同翅目昆虫体内缺乏蛋白酶，因而目前常见的蛋白酶抑制剂基因抑制蚜虫的效果，但是一些小的蛋白酶抑制剂，如胃蛋白酶抑制剂(pepstain)和抑糜酶素(chymostain)对蚜虫有致死作用；凝集素基因：具有对多种单糖和寡聚糖专一性结合的能力，因而使这类基因在抗蚜基因工程育种方面具有很大的潜力，该基因也是迄今为止研究最为深入、广泛的抑制蚜虫发育、繁殖比较明显的基因(郭洪年，侯汉娜，欧阳青，吴家和，抗蚜基因及其转基因植物.中国生物工程杂志2008.28：118-124)。

植物凝集素是一种存在于许多植物的种子和营养器官中具有一个或多个能够与单糖或寡聚糖特异可逆结合的非免疫蛋白。到目前为止，已对雪花莲、石蒜(Zhao，X.，Yao，J.，Sun，X.，and Tang，K.，Molecular cloning and characterization of a novel lectin gene fromLycoris radiata.DNA Seq 2003.14：223-226)、观音莲、红豆杉、掌叶半夏、小麦、扁豆等植物凝集素基因进行了克隆、序列及功能分析。

按照植物凝集素亚基结构特征的不同，将其分为四种类型：部分凝集素(merolectins)：部分凝集素是具有单一的糖结合结构域的一种小分子蛋白，它不具有凝集细胞或沉淀糖缀合物的能力。目前发现仅有很少的凝集素属于该类型，如克隆自橡胶树的几丁质结合橡胶素和兰科的单子叶甘露糖结合凝集素；全凝集素(hololectins)：全凝集素是至少具有两个糖结合结构域的一种植物蛋白，这些糖结合结构域相同或高度同源，该类型的凝集素具有凝集细胞或沉淀糖缀合物的能力，目前发现的大部分植物凝集素属于该类型，如抗蚜效果明显的单子叶甘露糖凝集素就属于该类；嵌合凝集素(chimerolectins)：嵌合凝集素是具有至少一个单一糖结合结构域和另一种结构域组成的一种融合蛋白质，后一结构域一般具有催化等生物活性，该区域功能的发挥与糖结合结构域结合糖功能的发挥是相对独立的，两个功能域功能的发挥互不影响；超凝集素(superlectins)：超凝集素是由两个在结构和糖结合种类上都不一样的糖结合结构域组成的融合蛋白，两个糖结合结构域相互独立，超凝集素也可看做一类特殊的嵌合凝集素。按照氨基酸序列相似性及其在进化上关系的不同，可将其分为7个家族：豆科凝集素家族、木菠萝素家族、葫芦科韧皮部凝集素、苋科凝集素、几丁质结合凝集素家族、单子叶甘露糖结合凝集素和II型核糖体失活蛋白。目前用于抗蚜虫研究的主要是单子叶植物甘露糖结合的凝集素，对于单子叶植物甘露糖特异结合的植物凝集素，利用基于结构注解的序列分析可以看到，它们的同源性非常高。它们形成了一个共同的识别糖环的不连续表位，即Gln-X-Asp-X-Asn-X-X-X-Tyr(QDNY结构域)，该区域为凝集素作用位点。

凝集素在植物的防御体系中起着非常重要的地位，目前已经有多种证据证明了凝集素在植物保护方面起到的地位，一个重要的证据即是植物凝集素具有单糖或寡聚糖特异可逆结合的能力，尤其是对于在植物中不常见或压根不存在的寡糖具有更高的亲和性(Lam，S.K.，and Ng，T.B.，Lectins：production and practical applications.ApplMicrobiol Biotechnol 2011.89：45-55)。例如，几丁质结合凝集素能够识别并结合真菌细胞壁成分中的几丁质或无脊椎动物外骨骼成分中的寡糖，从而防止真菌对植物的感染或害虫对植物的蚕食；另外植物凝集素的保护作用可以从提取的植物蛋白人工饲喂蚜虫及转凝集素基因的植物具有良好的抗蚜虫效果方面得到了充分的证明，下面几个直接证据进一步说明植物凝集素的防御作用：(1)植物凝集素的抗细菌活性。豆科凝集素中的几种同细菌肽聚糖的组成成分N-乙酰氨基葡糖，N-乙酰胞壁酸及胞壁酰二肽能强烈作用，防止细菌对植物的侵害。(2)植物凝集素抗真菌性。几丁质结合凝集素可结合真菌细胞壁，体外研究表明麦胚凝集素可抑制某些真菌孢子的出芽及绿色木霉菌的生长，荨麻凝集素可以通过牵连真菌的内生菌丝从而控制核糖体的定位，继而导致菌体结构形态发生改变，并且Chrispeels(1991)通过研究表明荨麻凝集素具有抑制灰霉病菌生长的作用(Chrispeels，M.J.，and Raikhelb，N.V.，Lectins，Lectin Genes，and TheirRole in Plant Defense.The Plant Cell 1991.3：1-9)。(3)植物凝集素对高等动物抗性。II型核糖体失活蛋白对所有真核生物具有普遍毒性。原则上，II型核糖体失活蛋白到达胞质后对所有真核生物有极毒性，II型核糖体失活蛋白由A链和B链组成，B链可以结合到细胞的受体上，然后促进A链的进入，A链能够切割核糖体RNA的单一腺苷残基，最后核糖体的失活，因此，该蛋白可保护植物免受动物或昆虫的蚕食。(4)植物凝集素对昆虫的抗性作用。某些凝集素可以识别并结合到昆虫消化道上皮细胞的糖蛋白上，从而对昆虫产生局部或系统的影响，继而对昆虫的生长繁殖产生抑制作用，使昆虫的虫口密度下降，例如单子叶甘露糖凝集素对蚜虫的抗性；而且某些凝集素(如Mi-1.2基因)表现出了抗植物病原性线虫活性。(5)植物凝集素的抗病毒性。很多单子叶甘露糖凝集素对动物(包括人类)的反转录病毒具有有效的抑制作用，如兰科植物单子叶甘露糖凝集素可抑制HIV靶细胞的结合过程；许多凝集素具有间接防治病毒作用，例如，单子叶甘露糖凝集素防治蚜虫从而防止病毒的传播；并且II型核糖体失活蛋白具有对植物病毒的抑制活性，但其机理正在进一步研究之中。

发明内容

本发明的一个目的是提供与植物抗蚜虫能力相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物抗蚜虫能力相关的蛋白，名称为AmLec，来源于海芋(Alocasia macrorrhiza)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗蚜虫相关的由(a)衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由270个氨基酸残基组成。

所述与植物抗蚜虫能力相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述与植物抗蚜虫能力相关蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)序列表中序列2自5′末端起第39位-第851位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)或3)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列2由1093个碱基组成，自5′末端起第39位-第851位为其编码序列，编码具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有所述与植物抗蚜虫能力相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体是在载体p2300-35S的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体；

所述载体p2300-35S是通过包括如下步骤的方法得到的：

(1)将pCAMBIA2300载体经过EcoRI和HindIII双酶切，回收8.7kb的载体大片段；

(2)将pBI121载体经过EcoRI和HindIII双酶切，回收3kb的片段；

(3)将步骤(1)中回收8.7kb的载体大片段与步骤(2)中回收的3kb的片段连接，得到重组载体p2300-35S。

所述pCAMBIA2300载体购自澳大利亚CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Biovector Co.，LTD。

扩增所述与植物抗蚜虫能力相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围；

所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将所述与植物抗蚜虫能力相关蛋白的编码基因导入目的植物中，得到与所述目的植物相比抗蚜虫能力增强的转基因植物。

所述与植物抗蚜虫能力相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为烟草。

本发明将包含Amlec基因的重组植物表达载体通过农杆菌介导法导入烟草，获得了转基因烟草，通过PCR检测，结果表明目的基因已整合到烟草基因组中。对转基因烟草进行蚜虫抗性鉴定，发现转基因烟草与对照烟草相比，对蚜虫的抗性明显提高，对蚜虫种群的平均抑制率为35.5％。Amlec基因能够提高植物的抗蚜虫能力，在植物抗蚜虫基因工程中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为植物表达载体p2300-35S-AmLec示意图。

图2为转p2300-35S-PtLec载体获得的烟草无菌苗PCR检测图。

图3为转基因阳性植株RT-PCR检测图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、与植物抗蚜虫能力相关相关的蛋白及其编码基因的获得及功能验证

一、与植物抗蚜虫能力相关的蛋白及其编码基因的获得

1、Amlec基因片段的克隆

利用RNA提取试剂盒(Andybio)提取海芋(Alocasia macrorrhiza)(购自大森林花卉市场)叶片RNA，同时根据已知lectin基因的保守序列设计简并引物：

p-F1(5’-CTTKRTCATGCAGGAHGACTGCA-3’)，

p-R1(5’-CCTGCATSACSAGCHKRTGGTT-3’)，通过PCR扩增基因片段。PCR反应条件为：94℃变性5min；94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸10min。将得到的目的片段克隆到pMD18-T载体，热击法转化DH5α，筛选鉴定阳性克隆，对阳性克隆进行测序，得到基因片段。

2、Amlec基因cDNA 3’末端的获得

根据得到的基因片段设计特异引物primerF2(5’-ACTGCAACGCCGTCCTGTACAATGG-3’)。利用RNA提取试剂盒(Andybio)提取海芋的叶片RNA。参考3’RACE(TaKaRa，Japan)试剂盒说明书，以3Sites AdaptorPrimer(5’GTTTTCCCAGTCACGAC 3’)和p-F2为引物，以海芋RNA反转录得到的cDNA为模板，PCR扩增得到Amlec3’末端产物。PCR反应条件为：94℃变性5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸10min。将得到的目的片段克隆到pMD18-T载体，热击法转化DH5α，筛选鉴定阳性克隆，对阳性克隆进行测序，得到基因的3’端序列。

3、Amlec基因cDNA 5’末端的获得

根据得到的基因序列设计并合成引物p-RT(5’-CTTATGGTTCTTCGCGGTGAGC-3’)、p-R2(5’-GTGAGCATGCCGTCTTCGTAG-3’)和p-R3(5’-TGCCGTCTTCGTAGAGGACTTGTTC-3’)，根据5’RACE试剂盒(5’RACE Systemfor Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0，Invitrogen，USA)说明书，首先利用p-RT引物和反转录酶Superscript^TM II RT对叶片RNA进行反转录，然后去除包含在cDNA中的蛋白、dNTPs、引物、DNA，在cDNA5’末端加上TdT，最后以5’RACE引物(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’)和p-R2(5’-GTGAGCATGCCGTCTTCGTAG-3’)，巢式引物(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’)和p-R3(5’-TGCCGTCTTCGTAGAGGACTTGTTC-3’)进行嵌套PCR得到5’末端产物。PCR反应条件为：94℃变性4min；94℃ 45s，57℃ 30s，72℃ 1min，32个循环；72℃延伸10min。RACE得到的产物连接到pMD18T-Vector(TaKaRa，Japan)上，筛选鉴定阳性克隆，并进行序列测定，得到基因的5’端序列。

4、Amlec基因全长cDNA的获得

用DNAMAN软件分析组装5’和3’序列获得AmLec全长cDNA，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，自5′末端起第39位-第851位为其编码序列，编码具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列1由270个氨基酸残基组成。将该基因命名为AmLec，将其编码的蛋白命名为AmLec。

二、植物表达载体的构建

根据获得的Amlec基因全长cDNA序列，分别设计引物p-F3(5’-TCTAGAATGGCCAAGCTCCTCCTCTTC-3’)和p-R4(5’-CCCGGGTTATTTCGCTTTCACCTTCTC-3’)。为方便载体构建，在p-F3的5’端和p-R4的3’端分别引入Xba I和SmaI酶切位点。以海芋叶片RNA反转录得到的第一链cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性4min；94℃ 45s，58℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸10min。目的基因片段连接到pMD18-T-Vector(购自Takara公司，产品目录号为D101A)中，获得T-AmLec，进行测序，保证AmLec蛋白cDNA的阅读框及酶切位点的正确。用Xba I和SmaI酶切T-AmLec质粒，回收AmLec基因片段备用。

将pBI121载体(购自Biovector Co.，LTD，产品目录号为Biovector008)经过EcoRI和HindIII双酶切，回收3kb的片段；将pCAMBIA2300载体(购自CAMBIA公司)经过EcoRI和HindIII双酶切，回收8.7kb的载体大片段；将回收的8.7kb的载体大片段与回收的3kb的片段连接，得到中间载体p2300-35S。

用Xba I和Sma I酶切此中间载体p2300-35S，回收11.7kb大小的条带，与回收的AmLec基因片段重组成目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体p2300-35S的Xba I和SmaI酶切位点间插入了序列表中序列2第39到851位所示的AmLec基因片段，证明质粒构建正确，将重组载体命名为植物表达载体p2300-35S-AmLec。AmLec基因由CaMV 35S启动子驱动，3’末端为NOS终止子(见图1；图中：35S P：CaMV 35S启动子；AmLec：海芋凝集素基因；GUS：β-葡萄糖苷酸酶；Nos 35S：35S的终止子；35S P：CaMV 35S启动子；kan(R)：卡那抗性基因；35S PloyA：35S的终止子；RB：T-DNA右边界；LB：T-DNA左边界)。

三、农杆菌介导法获得双价转基因烟草

采用的烟草受体材料为烟草品种NC89(公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：姚斌，范云六，曾勤，赵荣敏.表达昆虫特异性神经毒素AalT基因的转基因烟草的抗虫性.生物工程学报，1996，12(2)：113-118)，农杆菌为LBA4404(北京鼎国生物技术有限公司)，具体操作步骤如下：

1)根癌农杆菌LBA4404感受态的制备

(1)从平板上挑取单菌落，接种到5ml YEB液体培养基(含链霉素Strep 125mg/L)，28℃、250rpm振荡培养过夜；

(2)取2ml菌液，加入50ml YEB液体培养基(含Strep125mg/L)中，28℃、250rpm振荡培养至OD₆₀₀约0.6左右；

(3)将菌液转至50ml无菌离心管中，冰浴30min。5000rpm离心5min；

(4)弃上清，沉淀用2ml 20mM CaCl₂重悬，每份100μl分装到1.5ml离心管中，液氮中保存备用。

2)重组质粒DNA转入农杆菌

(1)将约1μg的重组质粒p2300-35S-AmLec DNA加入到100μl LBA4404感受态细胞中，混匀，冰浴5min；

(2)将离心管置液氮中冷冻8min，迅速转至37℃水浴中温浴5min；

(3)加入1ml YEB液体培养基，在28℃摇床上250rpm复苏4-5h；

(4)取适量菌液涂布到含Strep(链霉素)250-300mg/L、Rif(利福平)250-300mg/L和Kan(卡那霉素)100mg/L的YEB固体培养基上，置28℃培养24-48h。

同时，按照上述方法，得到转空载体p2300-35S对照的农杆菌菌液。

3)叶盘法转化烟草品种NC89

(1)农杆菌的活化

从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5ml YEB液体培养基中(Kan 100mg/L，Strep 100mg/L，Rif 300mg/L)，振荡培养过夜；取1ml菌液接种到50ml YEB液体培养基(Kan 100mg/L，Strep 100mg/L，Rif 300mg/L)中，剧烈振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.5(约3-4h)；5,000rpm离心5min，菌体用MS0培养基(不含激素)重悬，使OD₆₀₀为0.1-0.2。

(2)烟草的遗传转化

a)侵染：将烟草叶片切成1cm左右的小圆盘，在步骤(1)获得的菌液中放置10分钟，然后晾干。

b)共培养：将侵染过的叶块摆放在铺有2层滤纸的烟草芽分化培养基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L)上，25℃暗培养4天，得到经过共培养的烟草外植体。

c)抗性芽的筛选：将经过共培养的烟草外植体转移到抗性芽筛选培养基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L+Kan 100mg/L+Cef(噻孢霉素)500mg/L)上，2～3周后即可生芽。

生根：待抗性芽长到1cm左右时，将其转移到生根培养基(MS+Kan 100mg/L+Cef500mg/L)上，1～2周后即有不定根形成。

同时，用上述方法得到转空载体对照烟草植株。设未转化的烟草NC89为野生型对照烟草。

(3)转基因烟草的PCR检测

通过CTAB法提取转基因烟草DNA  ，以AmLec-F(ATGGCCAAGCTCCTCCTCTTC)和AmLec-R(TTATTTCGCTTTCACCTTCTC)为引物，进行PCR扩增；同时，设非转基因烟草为阴性对照，质粒p2300-35S-AmLec DNA为阳性对照。结果如图2所示(图2中Marker为MarkerIII；泳道1-泳道7为转化获得烟草苗；泳道8为阴性对照；泳道9为阳性对照)，从图中可见，7株转化烟草苗均扩增到813bp的目的片段)。利用Trizol提取PCR扩增阳性植株的RNA，同样以AmLec-F(ATGGCCAAGCTCCTCCTCTTC)和AmLec-R(TTATTTCGCTTTCACCTTCTC)为引物，以烟草RNA为模板进行RT-PCR扩增；同时设非转基因烟草为阴性对照，质粒p2300-35S-AmLec DNA为阳性对照。结果如图3所示(图3中Marker为MarkerIII；泳道1-泳道5为阳性烟草苗(从左向右为图2中的2、3、4、6和7号烟草)；泳道6为阴性对照；泳道7为阳性对照)，从图中可见，阳性烟草苗均扩增得到813bp的目的基因片段。以上结果表明目的基因已整合到烟草基因组中。

(4)将PCR和RT-PCR均为阳性的转基因烟草进行继代繁殖，并进行编号，编号方式为母体号-1，-2，等依次类推，分别得到的转基因烟草植株为：2-1、2-2、3-1、3-2、3-3和6。同时，分别设野生型对照植株CK-1、CK-2和CK-3和转空载体对照植株K-1和K-2进行转基因烟草的抗蚜虫鉴定。

四、转基因烟草的抗蚜虫鉴定

本实验委托河北省农林科学院植物保护研究所进行，测试烟蚜(Myzus persicaeSulzer)(公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：尹翔宇；朱信宁；李鑫；马丽；闫培俊；邓小成.烟蚜及天敌种群动态的模糊聚类分析.中国烟草科学，2000，(1)：33-37)为河北省农林科学院植物保护研究所杀虫剂组养虫室内饲养在烟草上的烟蚜，饲养条件为：温度23-25℃，相对湿度50％-80％，光照周期L∶D＝16∶8。实验过程为用毛笔将2头烟蚜成蚜接于烟草植株顶部的嫩叶上，置于光周期L∶D＝16∶8、温度23-25℃的养虫室内，不同处理间罩上纱网相互隔离以避免烟蚜在不同处理的烟苗上转移，待成蚜产下若蚜后，每株留下10头若蚜，其余若蚜和成蚜抹去。然后每3天调查一次烟草上的蚜虫数量，并统计11天后蚜虫种群数量。以转基因烟草对蚜虫的种群抑制率作为指标，来评价各转基因烟草对蚜虫的毒力效果：种群抑制率(％)＝(野生型对照株存活蚜虫数-转基因烟草株存活蚜虫数)/野生型对照株存活蚜虫数*100％)。检测结果如表1所示：从表中可看出，2-1、2-2、3-1、3-2、3-3和6号转Amlec基因烟草都表现出了蚜虫抑制能力，平均抑制率为35.5％，6号转基因烟草抑制能力最强，达到了48.4％。而转空载体对照烟草接虫11d每个株系平均头数与野生型对照无显著差异。

表1阳性转基因烟草对烟蚜繁殖的抑制率

Claims (9)

1.一种蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1）或2）所述的基因：

1）序列表中序列2自5′末端起第39位-第851位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体或重组菌。

5.扩增权利要求2或3所述编码基因全长的引物对，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的植物中，得到与所述目的植物相比抗蚜虫能力增强的转基因植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4所述的重组表达载体导入目的植物中。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为烟草。