CN101979591B - 一种以水稻为生物反应器生产人溶菌酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种以水稻为生物反应器生产人溶菌酶的方法。将水稻密码子优化的人溶菌酶基因，采用双农杆菌介导的遗传共转化的方法导入粳稻品种台粳309的种子成熟胚诱导的愈伤组织中，得到可以大量生产重组人溶菌酶蛋白的转基因水稻，实现了重组人溶菌酶融合基因在水稻中的高效表达。本发明的特点是重组人溶菌酶具有表达体系稳定、表达效率高、成本低，规模化生产容易、生物活性高和无病原菌污染；用这种方法生产的人溶菌酶融合蛋白，可广泛应用于生命科学研究领域，医药新产品，生物制药领域，饲料添加剂以及食品防腐剂等。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质的制备方法，具体的说是涉及以水稻为“生物反应器”生产人溶菌酶蛋白的方法，属于基因工程领域。
本发明利用水稻胚乳特异表达、蛋白质定向储存和目的基因密码子优化等技术，在水稻胚乳特异性高效表达重组人溶菌酶，通过提纯方式获得高纯度的重组人溶菌酶的原料，该原料可广泛应用于生命科学领域、医药产品、生物制药、饲料添加剂、食品防腐剂等。
背景技术
人溶菌酶(human lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂、内容物逸出而使细菌溶解。人溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。主要功用是水解细菌细胞壁，在细胞内，则对吞噬后的病原菌起破坏作用.该酶对革兰氏阳性菌中的枯草杆菌、耐辐射微球菌有分解作用。对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有一定程度的溶解作用，其最有效浓度为0.05％。
人溶菌酶广泛存在于人体多种组织中，在每升母乳中含有50～250mg溶菌酶蛋白。人溶菌酶由130个氨基酸残基组成，有4个对二硫键，分子量为14600道尔顿，其溶菌活性比鸡蛋清人溶菌酶高3倍，而且没有过敏原。人溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性和耐酸碱环境，而且不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，人溶菌酶的活力可全部恢复；人溶菌酶作为天然防腐剂安全性高。
人溶菌酶是一个多功能蛋白，在各个领域均有极其广泛的应用，在医学上可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质，具有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能和促进和增强免疫能力等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。
1992年，FAO/WTO的食品添加剂协会认定人溶菌酶在食品中的应用是安全的，可加入到婴儿乳制品，增加婴儿的免疫能力；还可作为天然食品防腐剂，可提高其防腐效果。同时利用水稻表达人溶菌酶的稻米添加到动物饲料，可作为替代抗生素的效果。
虽然人溶菌酶具有独特的优越性和多种多样的药理作用效果，在临床上具有多种重要的应用价值，但天然人溶菌酶来源极其困难。人溶菌酶在母乳中含量较高，但其来源极其有限。利用DNA重组技术进行生产是解决这一难题的有效途径。
在上世纪50年代，利用DNA重组技术生产医药产品主要是以细菌作为生物反应器。但由于细菌属于原核生物，不具备真核生物的蛋白质合成与加工系统，而一些蛋白质的生物活性是依靠蛋白质的修饰来达到的，所以，它的应用受到了限制。酵母作为第二代生物反应器，在上世纪70年代开始应用于医药产品生产，但由于产量低，其体内修饰和加工系统不完善，也限制了它的广泛应用。第三代生物反应器是利用高等植物、动物细胞作为生物反应器。目前，真核生物反应器可分为动物和植物反应器两大类，动物生物反应器有细胞培养与转基因动物两种，目前一些主要的医用抗体使用动物CHO细胞系(或小鼠)细胞培养来生产。转基因动物研究方面主要是在转基因乳牛的乳腺细胞表达重组蛋白以及在鸡蛋蛋清中表达重组蛋白质。目前市场上的溶菌酶即主要通过鸡蛋清生产。然而，动物细胞培养和转基因动物无法克服动物病原菌污染等问题。例如，通过鸡蛋清生产的溶菌酶含有过敏原，并且其活性比人溶菌酶低3.5倍，因此蛋清来源的溶菌酶不能用于食品添加剂，更不能用于婴儿食品。另外，动物细胞培养的成本极高，大规模生产需要巨大的投资，有人估计，全世界目前只有1000公斤的生产单克隆抗体的能力；据计算，每扩大1000公斤的生产能力，需要投资40亿美元，并要花10年的时间来建成投产，这些数据说明目前的重组蛋白的生产能力大大地小于市场需求。在医药应用方面没有竞争优势，使得在医药上的应用也受到限制。目前的应用是没有选择的选择。因而急需一个高效、安全的表达系统来满足巨大的市场需求。
基于表达水平高、生产成本低以及加工简单等显著优势，种子表达体系是目前规模化生产较为成熟的表达体系之一。种子能够提供一个相对稳定的内环境，使重组蛋白表达积累到一个较高水平；同时，种子是最佳的“天然容器”，重组蛋白在常温下储藏2-3年而不丧失生物活性，并且由于重组蛋白贮藏在一个很小的空间，产品运输十分便利。
一种较好的种子表达体系是利用水稻进行表达和生产。水稻是我国乃至亚洲的主要粮食作物，亚洲种植面积占全球的92％；在我国具有5000多年的栽培历史，我国种植面积为4.4亿亩，产量占世界水稻产量的31％，水稻学名为Oryza sativa L.sp，俗名为水稻，水稻属于禾本科、稻属，两个为栽培种即亚洲栽培稻Oryza.sativa和非洲栽培稻Oryza.glaberrima，普通栽培稻(Oryza sativa)可以种植。在栽培稻种又分为籼稻和粳稻两个亚种。台北309是我国台湾育成的品种，在转基因研究上有广泛的应用。
美国Ventria Bioscience公司曾利用基因枪转化获得了表达人溶菌酶和人铁乳蛋白以及人血清白蛋白的转基因水稻，在1998年已得到美国农业部(USDA)的种植批准。2008年美国农业部(USDA)的环境署通过对这三种转基因水稻的安全评估，认为它们是安全的。
但是，美国Ventria Bioscience公司是采用大肠杆菌作为遗传物质转化载体，有很多缺点：如大肠杆菌作为遗传物质的受体，会有多拷贝、多位点的克隆，得到的表达体系不稳定，编辑序列也不能很好地进行检测；同时大肠杆菌作为宿主具有可能的病原污染，存在着明显的安全隐患，而且以大肠杆菌构建的转基因水稻所得的盐溶储藏蛋白溶解性较差。
本发明采用水稻储藏醇溶谷蛋白Gt13a为胚乳特异性表达的启动子和信号肽，与Ventria Bioscience公司生产重组人溶菌酶使用的Gt1相比，更有效地提高了水稻胚乳细胞蛋白的表达量，可以提高40％以上，从而比Ventria Bioscience公司的转基因水稻具有更高的表达并生产重组人溶菌酶的能力，缩短生产周期，便于实现大规模的生产，使生产成本大大降低。另外，本发明采用农杆菌作为转基因载体，使转基因水稻表达体系中插入的基因片段容易检测和控制，同时比以大肠杆菌为载体采用基因枪方法得到的转基因水稻表达体系更稳定，同时表达的储藏蛋白水溶性更好，更利于下游纯化工艺，有效提高了重组人溶菌酶的生产效率。
发明内容
本发明摒弃传统的利用鸡蛋清生产溶菌酶的方法，采用粳稻品种台北309种子成熟的胚乳为遗传转化的受体，采用双农杆菌介导的遗传共转化方法，将载体导入水稻中，获得可以大量生产人溶菌酶蛋白的转基因水稻。本发明所得的重组人溶菌酶具有表达体系稳定、表达效率高、成本低，规模化生产容易、生物活性高、无病原菌污染等优点。可以大规模生产来满足市场需求。
本发明获得了经水稻密码子优化的人溶菌酶基因的目的基因，该基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，同时其表达的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；并获得了包含目的基因的农杆菌载体(限制酶切图谱见图1)和包含标记基因的农杆菌载体(限制酶切图谱见图2)。
本发明提供一种以水稻为生物反应器生产人溶菌酶的方法，其特征为，将水稻的种子成熟胚诱导的愈伤组织作为遗传转化的受体，采用载体介导的遗传共转化方法，将人溶菌酶基因导入水稻中，基因重组后的水稻能表达重组人溶菌酶蛋白。
在一个优选实施方案中，本发明方法中使用的水稻品种为粳稻品种台北309。
在一个优选实施方案中，所用的载体为农杆菌，优选为JH2600、LBA4404、EHA103、105；其中JH2600的转染效果最好。
在一个优选实施方案中，使用两种农杆菌载体(本说明书中称为“双农杆菌”)，分别为包含目的基因的农杆菌载体和包含标记基因的农杆菌载体。目的基因优选为经水稻密码子优化的人溶菌酶基因，该基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。标记基因优选为潮霉素磷酸转移酶基因。包含目的基因的农杆菌载体优选为pOsPMP105，包含标记基因的农杆菌载体优选为pOsPMP5。
本发明还提供了用本发明的方法生产的重组人溶菌酶蛋白在生命科学研究、医药新产品、生物制药、饲料添加剂以及食品防腐剂领域的应用。
附图说明
图1显示带有密码子优化目的基因的农杆菌载体pOsPMP105的限制性内切酶图谱；
图2显示带有标记基因的农杆菌载体pOsPMP5的限制性内切酶图谱；
图3显示PCR扩增产物的长度及其引物相对于载体的位置；
图4显示供试转基因品系PCR鉴定结果的图谱；
图5显示溶菌酶活性测试的标准曲线；
图6显示Gt13a启动子介导的重组人溶菌酶在水稻胚乳中表达的结果；
图7显示重组人溶菌酶的细胞裂解活性的检测；
图8显示构建的水稻胚乳特异性表达载体pOsPMP2(Gt13aSp-Stuff-Nos)的限制性内切酶图谱；
图9人溶菌酶脂质体混悬液兔鼻腔给药的血浆药物浓度-时间曲线(n＝6)。
序列1(SEQ ID NO.1)：水稻密码子优化的人溶菌酶基因核苷酸序列；
序列2(SEQ ID NO.2)：水稻密码子优化的人溶菌酶基因核苷酸序列所对应的氨基酸序列；
序列3(SEQ ID NO.3)：水稻谷蛋白基因Gt13a的启动子序列；
序列4(SEQ ID NO.4)：水稻胚乳特异性表达的基本载体的核苷酸序列；
序列5(SEQ ID NO.5)：水稻CP启动子的PCR正向引物；
序列6(SEQ ID NO.6)：水稻CP启动子的PCR反向引物；
序列7(SEQ ID NO.7)：抗潮霉素基因的PCR的正向引物；
序列8(SEQ ID NO.8)：抗潮霉素基因的PCR的反向引物。
具体实施方式
水稻特异性的启动子和信号肽的获得：为了获得较强的水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，根据生物信息学分析，采用水稻储藏蛋白的醇溶谷蛋白基因家族中的一个成员Gt13a用于PCR扩增。为了便于基因克隆，在正向引物的5′端加了一个平末端的酶切位点。从水稻品种台北309叶片中提取基因组DNA，以此DNA片段为模板，按照标准的PCR程序，用上述引物扩增出了一个1284碱基的DNA片段。经DNA序列分析，此DNA片段具有明显的启动子结构，得到了一种可介导重组蛋白在谷物胚乳中表达的启动子和信号肽，其具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建：经PCR获得Gt13a启动子和信号肽的序列后，PCR产物经粘性末端和平末端内切酶消化后，将这个片段与粘性末端和平末端内切酶消化的PBI221片段连接，然后导入大肠杆菌均系DH10B中，形成了含有Gt13a启动子、Gt13a信号肽和Nos终止子的水稻胚乳特异性表达的基本载体，并将这个载体质粒命名为pOsPMP2，见图8，其具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
水稻特异性表达目的基因的农杆菌载体的构建：首先，密码子优化的人溶菌酶基因(具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列)通过PCR的方法扩增，克隆到经限制性内切酶MscI和XhoI消化的pOsPMP2质粒DNA，转化农杆菌JH2600，产生一个中间质粒pOsPMP105。
包含目的基因的农杆菌：插入序列大小(包括T-DNA Border)为2.9kb左右，主要包含有T-DNA Border序列，Gt13a启动子，信号肽，密码子优化的人溶菌酶基因和Nos终止子；目的基因是经水稻密码子优化的人溶菌酶基因，该基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，基因表达的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；目的基因的启动子为水稻来源的储藏谷蛋白基因Gt13a的启动子，大小为1.2kb，是一个胚乳特异性非常强的启动子；终止子是来源于农杆菌Ti质粒的NOS终止子，大小为0.3kb，是一种真核生物的终止子。
选择性标记基因载体的构建：为了使选择性标记基因在水稻愈伤组织内高效表达而提高转基因的选择效果，采用水稻半胱氨酸蛋白酶β基因(Cysteine proteinaseβ，CP)的启动子介导选择性标记基因(抗潮霉素基因-潮霉素磷酸转移酶)在愈伤组织中的特异表达。首先，合成了一对PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示，在PCR引物的两端添加了HindIII和SmaI位点；以水稻品种台北309的基因组DNA为模板，采用标准PCR反应，扩增出一个长度为1103碱基、含有启动子的片段。PCR产物经HindIII和SmaI消化后，该PCR片段与克隆载体PBI221(美国的克隆技术有限公司)连接，然后转化大肠杆菌均系DH10B，产生了中间质粒pOsPMP4。选择性标记基因采用潮霉素磷酸转移酶基因(HygromycinβPhosphotransferase，Hpt)，该基因从质粒pCAMBIA 1301(澳大利亚的哥伦比亚公司)扩增。在正向引物(其核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示)的5′末端加上了一个平末端限制性内切酶位点SmaI，在反向引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)的5′末端加上了一个粘性末端的限制性内切酶位点XhoI，以Pcambia 1301质粒为模板，采用标准PCR反应，扩增出潮霉素磷酸转移酶基因片段。PCR产物用SmaI和XhoI消化，pOsPMP4DNA用NaeI和XhoI消化，然后将潮霉素磷酸转移酶基因片段与具有CP(Cysteine proteinaseβ，CP)启动子的pOsPMP4质粒经NaeI和XhoI消化的DNA片段连接，插入农杆菌双元载体JH2600中，最终产生了水稻组织特异性表达的选择性标记表达载体，命名为pOsPMP5。
包含标记基因的农杆菌：本发明的标记基因为潮霉素磷酸转移酶(Hpt)基因，编码潮霉素磷酸转移酶，可使除草剂潮霉素B中活性成份磷酸化而失去活性，从而达到筛选转基因愈伤组织的目的。全基因大小为2833bp(含启动子和终止子)，插入到农杆菌双元载体JH2600中，其限制性内切酶图谱见图2。Hpt基因的表达由克隆的水稻来源的愈伤组织特异性表达的水稻半胱氨酸蛋白酶β基因(Cysteine Proteinaseβ基因)的启动子引导，只在愈伤组织表达，终止子采用根瘤农杆菌来源的Nos终止子。
种子成熟胚诱导的愈伤组织：水稻品种台北309种子，脱去谷壳后，经20％次氯酸钠消毒20分钟，经无菌水漂洗3次，每次10分钟，然后放在愈伤组织诱导培养基上经20-30天的诱导，产生愈伤组织。将0.5微克的质粒pOsPMP105和0.5微克具有选择性标记质粒pOsPMP5的DNA放入愈伤组织中，在室温(20-25℃)下反应30分钟，用酒精洗三次，然后采用双农杆菌株进行转染，目的基因和选择性标记基因载体随机整合到台北309愈伤组织的细胞中。在含有50微克/毫升的潮霉素B的选择培养基上经45天的筛选，继续生长的愈伤组织为抗潮霉素B的阳性愈伤组织。将潮霉素B抗性的愈伤组织转移到再生培养基上，在光照下经20天左右的诱导，愈伤组织分化成绿色的小植株，然后将幼小植株转到生根培养基上，经15-20天的诱导，形成完整的植株，最后转到温室或试验田生长发育成熟的种子。此为T1种子。
高表达转基因植株的筛选：转基因水稻经过4个月左右的生长和发育，抽穗开花后，经过一个月的时间，形成成熟的转基因水稻T1代种子，其中有50-60％的转基因植株正常结实。当T1种子收获后，从水稻成熟胚乳的粗提物，采用蛋白印迹法，筛选高效表达的转基因单株，利用蛋白质定量检测的酶联免疫技术(美国的R&D System公司产品)定量分析表达量，从T1种子中筛选表达融合蛋白高的转基因个体，经T1代的继续选择，形成稳定表达融合蛋白的转基因品系。供大面积生产融合蛋白之用。
本发明利用水稻的胚乳细胞作为生物反应器生产小分子多肽，克服了动物、微生物和其他植物表达体系存在的表达量低、生产成本高、可溶性差和安全性低等弊病。
本发明利用DNA重组技术，通过水稻胚乳特异表达、蛋白质定向储存和目的基因密码子优化等技术，在水稻胚乳特异性高效表达重组人溶菌酶，并经提纯方式获得高纯度的重组人溶菌酶的原料，是解决人溶菌酶规模化生产的有效途径。本发明所得的重组人溶菌酶具有表达体系稳定、表达效率高、成本低、规模化生产容易、生物活性高和无病原菌污染等优点。本发明采用水稻储藏醇溶谷蛋白Gt13a为胚乳特异性表达的启动子和信号肽，与Ventria Bioscience公司生产重组人溶菌酶使用的Gt1比较，更有效地提高了水稻胚乳细胞蛋白的表达量，可以提高40％以上，从而比Ventria Bioscience公司的转基因水稻具有更大的生产重组人溶菌酶的能力，而且生产成本大大降低。本发明采用农杆菌作为转化载体，使转基因水稻表达体系中插入的基因片段容易检测和控制，同时比以大肠杆菌为载体采用基因枪方法得到的转基因水稻表达体系更稳定，表达的蛋白质水溶性更强从而生物活性更高，同时也会避免大肠杆菌作为转化载体的病原菌污染。
本发明所得的重组人溶菌酶蛋白可广泛应用于生命科学领域、医药产品、生物制药、饲料添加剂、食品防腐剂等，可以在医药临床应用上，通过药物传递系统(drug delivery system，DDS)技术，运用新剂型新技术，开发不同的人溶菌酶医药产品应用于医药领域，如可做成鼻腔给药制剂、脂质体混悬液喷雾剂、口腔贴片、微球注射剂等等。
实施例
实施例1
包含目的基因的农杆菌载体的构建
1、Gt13a启动子和信号肽的克隆：
为了从水稻基因组序列里克隆醇溶谷蛋白的Gt13a基因的启动子与信号肽，利用序列3的引物，采用标准的聚合酶链(PCR)反应，从台北309品种的基因组DNA中扩增到了1284碱基的DNA片段。扩增的片段经限制性内切酶NaeI和XhoI消化，克隆到载体质粒pBI221中，产生了水稻胚乳细胞特异性表达的表达载体pOsPMP2，见图8。经DNA序列分析，这个DNA片段具有明显的启动子特征和信号肽的序列(SEQ ID NO.3)。
2、人工合成含有优化水稻遗传密码子的目的基因：
从NIBC数据库获取了目的基因人溶菌酶的氨基酸序列，使用DNA分析软件马克载体(MacVector)将融合蛋白基因转换成水稻遗传密码子的核苷酸序列，其优化后的目的基因的遗传密码改变了60％，但其氨基酸序列完全相同。此目的基因由美国的Blue HeronBiotechnology公司人工合成。在基因合成过程中加上了MyII和XhoI酶切位点，克隆到pUC18质粒载体，产生了水稻密码子优化的溶菌酶基因(其核苷酸序列序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQID NO.2)，总共有390个核苷酸编码130个氨基酸。
3、构建水稻特异性表达目的基因的农杆菌载体：
首先，密码子优化的人溶菌酶基因通过PCR的方法扩增，克隆到经限制性内切酶MscI和XhoI消化的pOsPMP2质粒DNA，转化农杆菌JH2600，产生一个中间质粒pOsPMP105，见图1。以下表1显示了目的基因表达载体序列以及组件的来源：
表1.pOsPMP105序列以及组件的来源
| 序列位置 | 序列来源 | 功能 | 备注 |
| 1-347 | 农杆菌 | T-DNA RBS | |
| 348-1497 | 水稻 | Gt13a启动子 | |
| 1498-1570 | 水稻 | 信号肽 | |
| 1571-1955 | 人工合成人溶菌酶基因 | 人溶菌酶编码序列 | 水稻偏爱密码子 |
| 1956-2239 | 农杆菌 | 终止子 | |
| 2240-2904 | 农杆菌T质粒 | T-DNA LBS | |
| 2905-5108 | pUC18 | ||
| 5109-5943 | pBI221 | 细菌启动子 | |
| 5944-6740 | pBI221 | 卡那霉素抗性基因 | |
| 6741-7148 | pBI221 | 细菌终止子 | |
| 7149-10177 | Vir质粒 | Vir基因 | |
| 10178-10818 | pUC18 | Origin | |
| I0819-11457 | pUC18 | Lac Z部分序列 |
实施例2
包含选择性标记基因的载体的构建
1、克隆水稻半胱氨酸蛋白酶β(cp)启动子：
采用PCR方法从水稻基因组DNA克隆水稻半胱氨酸蛋白酶β基因的启动子。根据基因库的核苷酸序列设计了两个PCR引物，引物序列见SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。利用标准PCR反应，从水稻人工细菌染色体文库中，筛选到一个阳性克隆42M2(BAC克隆编号)。BAC克隆经XhoI消化后，一个5kb的片段经Southern杂交证实含有半胱氨酸蛋白酶β基因的全序列，以这个BAC克隆DNA为模板，采用标准PCR反应，获得了一个1113碱基的DNA片段，将这个片段克隆到pBI221载体中，转化大肠杆菌菌系DH10B，最终产生了一个中间载体pOsPMP04。
2、构建选择性标记基因载体：
以pCAMBIA-1301质粒DNA为模板，应用引物(见SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)，用标准PCR方法进行扩增。扩增出的PCR片段经SmaI和XhoI消化，然后克隆到经限制性内切酶NaeI和XhoI消化的pOsPMP4载体上，插入农杆菌双元载体JH2600中，产生了水稻特异性表达的选择性标记的载体pOsPMP5，见图2。以下表2显示了标记基因表达载体序列以及组件的来源：
表2.pOsPMP5序列以及组件的来源
| 序列位置 | 序列来源 | 功能 | 备注 |
| 1-334 | 农杆菌 | T-DNA RBS | |
| 335-1444 | 水稻 | CP启动子 | |
| 1445-1479 | pUC18 | 多克隆位点 | |
| 1480-2505 | 真菌 | 潮霉素抗性基因 | |
| 2506-2544 | pUC18 | 多克隆位点 | |
| 2545-2818 | 农杆菌 | Nos | |
| 2819-3479 | 农杆菌质粒 | T-DNA LBS | |
| 3480-5719 | pUC18 | ||
| 5720-6518 | pBI221 | 细菌启动子 | |
| 6519-7315 | pBI221 | 卡那霉素抗性基因 | |
| 7316-7723 | pBI221 | 细菌终止子 | |
| 7724-10572 | Vir质粒 | Vir基因 | |
| 10573-11385 | pUC18 | Origin | |
| 11386-12032 | pUC18 | Lac Z部分序列 |
实施例3
双农杆菌随机整合法的基因转化：
水稻品种台北309种子，脱去谷壳后，经20％次氯酸钠消毒20分钟，经无菌水漂洗3次，每次10分钟，然后放在愈伤组织诱导培养基上经20-30天的诱导，产生愈伤组织。将0.5微克的质粒pOsPMP105和0.5微克具有选择性标记质粒pOsPMP5的DNA放入愈伤组织中，在室温(20-25℃)下反应30分钟，用酒精洗三次，然后采用双农杆菌株进行转染，目的基因和选择性标记基因载体随机整合到到台北309愈伤组织的细胞中。在含有50微克/毫升的潮霉素B的选择培养基上经45天的筛选，继续生长的愈伤组织为抗潮霉素B的阳性愈伤组织。将潮霉素B抗性的愈伤组织转移到再生培养基上，在光照下经20天的诱导，愈伤组织分化成绿色的小植株。然后将幼小植株转到生根培养基上，经15-20天的诱导，形成完整的植株，最后转到温室或试验田生长发育成熟的种子。
实施例4
筛选表达融合蛋白高的转基因植株：
实施例3获得的转基因植株在温室或大田经生长与发育，然后开花结种子，形成转基因T1代种子，当T1种子收获后，每株转基因植株取10粒种子，加入10毫升的提取缓冲液(50mM Tris，pH8.0，50mM NaCl，10mM EDTA)匀浆，在离心机上每分钟14000转离心10分钟，上清液用ELISA定量药盒进行酶联免疫检测。经检测每粒种子的重组溶菌酶表达水平达到100微克左右。从T1种子中筛选表达融合蛋白高的转基因个体，经T1代的继续选择，形成稳定表达融合蛋白的转基因品系，供大面积生产融合蛋白之用。
从T1种子中筛选表达重组人溶菌酶最高的转基因个体。为了验证高效表达融合蛋白的转基因株系，不同转基因品系的T1代种子的粗提取液经SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯亮蓝染色和蛋白印迹法检测，重组溶菌酶蛋白在聚丙烯酰胺凝胶中清晰可见(见图6箭头所示)。
实施例5
对转基因植物进行PCR检测
1、引物序列：
引物1(Gt13a正向)：5’-GCATCCATAAATCGCCCCATAG-3’(SEQ ID NO.9)
引物2(人溶菌酶反向)：5’-GCCCTTGAAGAAGATGTAGTTC-3’(SEQ ID NO.10)
2、PCR扩增产物的长度及其引物相对于载体的位置如图3所示；
3、PCR方法：
取实施例4获得的转基因植株粳稻台北309的叶片100mg，与200微升的DNA提取液，在碾钵中碾磨至无明显碎片，温浴30分钟，离心后，加入0.8倍体积的异丙醇沉淀，经离心后，DNA沉淀经70％乙醇洗脱、干燥后，加入TE缓冲液溶解，直接用于PCR反应。
4、PCR鉴定的结果
以3个独立转基因事件的5个供试转基因株系和非转基因的基因组DNA为模板，采用Gt13a启动子的特异性引物和人溶菌酶基因的特异性引物进行PCR扩增，在5个转基因品系和阳性对照(表达载体质粒DNA)均可检测到预计的645bp的PCR产物，而在阴性对照中检测不到PCR产物，如图4所示，结果显示在转基因水稻品系中含有目的基因。
实施例6
比浊定量法检测供试转基因植株的人溶菌酶
1.样品制备方法：实施例4获得的转基因植株的每粒转基因种子经研磨后加500毫升的PBS提取液，离心后上清液备用。
2.比浊法检测人溶菌酶的浓度
细菌品系：冻干的Micrococcus lysodeikticus(Letus)(Sigma公司产品)
步骤1：制备标准曲线；
步骤2：稀释溶菌酶样品到最终浓度在1.6μg/ml以下。
步骤3：加上阴性对照(台北309)
操作过程：
1)取细胞悬浮液250μl/孔到96孔板；
2)设置96孔板为动力学模式为5分钟，每1分钟读数一次，设置读数波长在450nm。
3)加入10μl的标准样品和适合浓度的待测样品，采用震动功能混和，并开始用动力学模式读数。
4)按照图5的活性测试的标准曲线计算溶菌酶的浓度。
3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：每粒转基因种子经研磨后加1毫升PBS，离心取20微升上清液上样，经10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯亮蓝R250染色后，经脱色后扫描。
4.蛋白质印迹法：种子的蛋白粗提物经10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移到硝酸纤维素膜上，进行蛋白印迹实验，用NBT/BCIP显色试剂盒显色1-2分钟。
5.结果描述，见图6。
在转基因水稻种子表达的重组溶菌酶在考马斯亮蓝胶上清晰可见，但在对照受体品种台北309中没有信号。根据比浊测定法测定重组人溶菌酶的杀菌酶活力为18450U/粒种子，转换成表达量为100微克左右/每粒种子，重组人溶菌酶占总可溶性蛋白含量的50％，箭头所示为大约14kDa的人溶菌酶。
实施例7
重组人溶菌酶的生物活性检测
为了检测重组人溶菌酶的裂解细菌细胞的生物活性，将实施例4获得的人溶菌酶转基因水稻的粗提取液与细菌(Micrococcus Letus)悬浮液混合，结果加入人溶菌酶转基因种子提取液处理的细菌悬浮液在30分钟后变清，而只加缓冲液和非转基因种子提取液的细菌细胞悬浮液没有任何变清现象(图7A)。结果表明：由水稻胚乳表达的重组人溶菌酶具有裂解细胞的功能，具有杀菌的生物学活性。同时利用比浊测定法(Turbidimetric rate assay)测定重组人溶菌酶的杀菌酶活力为18450U/粒种子；活性测试结果见图7B。A：单粒种子加1.5毫升1.5ml的66mMK3PO4缓冲液提取，上清液加50μl的0.075％(w/v)Micrococcus Letus细胞悬浮液，在室温下温浴30分钟。B：比浊测定法测定重组人溶菌酶的酶活性。单粒种子加200μl 66mM K3PO4缓冲液提取，10μl 50倍稀释的提取液+250μl 0.015％(w/v)Micrococcus Letus细胞液体，经检测450nm的OD值，10次/10分钟。OD450nm每分钟下降0.001为一个活力单位(U)。
实施例8
转基因基因整合位点数研究
实验原理：当转基因整合到水稻基因组时，目的基因主要依据在T-DNA序列在农杆菌中形成T-复合体，然后通过非同源重组的方式整合到水稻基因组中。在整合过程中，目的基因可以单个位点整合，也可以多个位点整合，虽然在农杆菌介导的遗传转化中70％的事件是以单个位点整合。在研究整合位点时，Southern分析不能准确地解决整合位点问题，精确的整合位点可以通过遗传分离给予确定；在原理上可以根据目的基因表达与不表达的分离比例，结合卡方检验，推测目的基因在水稻基因组的整合位点数目。本实施例采用蛋白印迹法，检测了前述实施例获得的T1代植株产生的T2种子重组人溶菌酶的表达的遗传分离来确定整合位点。
试验结果：对两个转基因品系的T1代种子的表达和不表达人溶菌酶的分析显示，在T1代种子中表达与不表达人溶菌酶的分离比例不符合孟德尔单基因(3∶1)的分离比例，而是符合两基因(15∶1)的分离比例，见下表。
转基因在T1代的遗传学分析
实施例9
从转基因水稻中分离纯化重组人溶菌酶的方法1
a、重组人溶菌酶的初步提取。称取前述实施例获得的转基因水稻500g，经脱皮、粉碎处理后，加入5升0.05mol/L pH值为8.5的磷酸钠缓冲溶液(其中含有浓度为0.35mol/L的氯化钠)，室温搅拌下提取1小时，收集提取液；
b、提取液的过滤处理。采用布氏漏斗进行两次减压过滤，继而采用微孔滤膜进行过滤处理，得到澄清的样品溶液；
c、样品溶液的透析除盐。将澄清的样品溶液经透析膜包扎后，放入pH值为8.5浓度为0.05mol/L的磷酸钠缓冲溶液中，检测样品的电导率与缓冲液的电导率一致时，停止透析；
d、将透析后的样品采用弱酸型琼脂糖型阳离子交换树脂进行分离。首先用0.05mol/L的磷酸钠缓冲液(pH值为8.5)对离子交换柱进行平衡；将透析后的样品进行上样，采用pH值为8.5浓度为0.05mol/L的磷酸钠缓冲溶液进行洗脱，同时采用紫外在线检测仪进行检测，当基线平稳后，采用0.2mol/L的氯化钠pH值为8.5浓度为0.05mol/L的磷酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集重组人溶菌酶级分；
e、对以上收集所得的重组人溶菌酶进行纯化。将样品溶液采用聚丙烯酰胺葡聚糖S-100柱进行纯化处理，采用0.05mol/L的磷酸钠缓冲液(pH值为8.5)为洗脱液，收集重组人溶菌酶级分，得到高纯度的样品溶液。
f、对高纯度样品进行浓缩和脱盐；最后进行样品溶液的冷冻处理，得到重组人溶菌酶冻干粉19g。
实施例10
从转基因水稻中分离纯化重组人溶菌酶的方法2
a、重组人溶菌酶的初步提取。称取前述实施例获得的转基因水稻500g，经脱皮、粉碎处理后，加入5升0.05mol/L pH值为8.2的磷酸钠缓冲溶液(其中含有浓度为0.35mol/L的氯化钠)，室温搅拌下提取1小时，收集提取液；
b、提取液的离心处理。将上述提取液采用10000r/min的离心机，离心10分钟，收集澄清的上清液备用；
c、样品溶液的透析除盐。将澄清的样品溶液经透析膜包扎后，放入pH值为8.2浓度为0.05mol/L的磷酸钠缓冲溶液中，检测样品的电导率与缓冲液的电导率一致时，停止透析；
d、将透析后的样品采用弱酸性丙烯酸型阳离子交换树脂进行分离。首先用0.05mol/L的磷酸钠缓冲液(pH值为8.2)对离子交换柱进行平衡；将透析后的样品进行上样，采用pH值为8.2浓度为0.05mol/L的磷酸钠缓冲溶液进行洗脱，同时采用紫外在线检测仪进行检测，当基线平稳后，采用0.2mol/L的氯化钠pH值为8.2浓度为0.05mol/L的磷酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集重组人溶菌酶级分；
e、对以上收集所得的重组人溶菌酶进行纯化。将样品溶液采用聚丙烯酰胺葡聚糖S-100柱进行纯化处理，采用0.05mol/L的磷酸钠缓冲液(pH值为8.2)为洗脱液，收集重组人溶菌酶级分，得到高纯度的样品溶液。
f、对高纯度样品进行浓缩和脱盐；最后进行样品溶液的冷冻处理，得到重组人溶菌酶冻干粉16g。
实施例11
从转基因水稻中分离纯化重组人溶菌酶的方法3
a、重组人溶菌酶的初步提取。称取前述实施例获得的转基因水稻500g，经脱皮、粉碎处理后，加入5升0.05mol/L的pH值为8.5的磷酸钠缓冲溶液(其中含有浓度为0.35mol/L的氯化钠)，室温搅拌下提取1小时，收集提取液；
b、提取液的过滤处理。采用中空纤维膜进行过滤处理，得到澄清的样品溶液；
c、样品溶液的透析除盐。将澄清的样品溶液经透析膜包扎后，放入pH值为8.5、浓度为0.05mol/L的磷酸钠缓冲溶液中，检测样品的电导率与缓冲液的电导率一致时，停止透析；
d、将透析后的样品采用弱酸性大孔丙烯酸型的阳离子交换树脂进行分离。首先用0.05mol/L的磷酸钠缓冲液(pH值为8.5)对离子交换柱进行平衡；将透析后的样品进行上样，采用pH值为8.5浓度为0.05mol/L的磷酸钠缓冲溶液进行洗脱，同时采用紫外在线检测仪进行检测，当基线平稳后，采用0.2mol/L的氯化钠pH值为8.5浓度为0.05mol/L的磷酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集重组人溶菌酶级分；
e、对以上收集所得的重组人溶菌酶进行纯化。将样品溶液采用葡聚糖凝胶柱G-50进行纯化处理，采用0.05mol/L的磷酸钠缓冲液(pH值为8.5)为洗脱液，收集重组人溶菌酶级分，得到高纯度的样品溶液。
f、对高纯度样品进行浓缩和脱盐；最后进行样品溶液的冷冻处理，得到重组人溶菌酶冻干粉17g。
实施例12
人溶菌酶鼻腔给药制剂的制备及生物利用度考察
处方：人溶菌酶100000单位，可降解淀粉100g，蒸馏水适量，制成100瓶(每瓶10mL)。制法：将以上实施例获得的人溶菌酶配成100单位/mL水溶液1000mL，加入可降解淀粉100g，混合使成凝胶状，冷冻干燥，形成的淀粉微球过63μm孔径的药筛，分装入瓶。
将制得的人溶菌酶淀粉微球用普通雾化器将药物喷入beagle犬鼻腔后，测得生物利用度为18％±5％，而普通溶液组的生物利用度仅为9％±7％，试验证明，在生理条件下，凝胶与鼻腔中粘液混合，粘度增大，有利于滞留药物和提高生物利用度。
实施例13
人溶菌酶脂质体混悬液喷雾剂的制备及体外释放、体内药动学试验
取二棕榈酰磷脂酰胆碱及胆固醇(摩尔比为2∶1)溶于氯仿与异丙醇混合液中，将含有以上实施例获得的人溶菌酶的缓冲溶液加入上述混合液中，在超声波仪内进行超声处理10min(45℃)，然后于45℃下减压除去有机溶剂，得到一种稠厚的胶状物，加适量缓冲液，再继续减压蒸发15分钟除去微量有机溶剂，放置30分钟后，灌装于喷雾装置即得。
将制得的人溶菌酶脂质体混悬液进行体外释放试验和兔鼻腔给药的体内药动学试验，试验证明人溶菌酶脂质体混悬液鼻腔给药，可以延长药物释放时间，提高生物利用度，结果如图9所示。
实施例14
人溶菌酶口腔贴片的制备及口腔粘附力测试
处方：人溶菌酶10000单位，卡波姆934 10g，羟丙甲纤维素15g，硬脂酸镁适量，制成100片。制法：取羟丙甲纤维素和卡波姆934的混合物25g，加上以上实施例获得的人溶菌酶10000单位与1％硬脂酸镁适量，混匀，直接压片，在药片背衬上涂上不透水的聚丙烯酸树脂，即得。
将制得的人溶菌酶口腔贴片进行粘附力测试，结果在健康人口腔唇颊部可粘附8～20h，贴片在给药部位逐渐溶解，无显著异物感，受试者在试验中可以自由饮水、进食。试验证明将人溶菌酶制成口腔贴片，可发挥药物的长效作用，有助于提高口腔患病部位的药物浓度并维持较长时间，从而提高药物的临床疗效。
实施例15
人溶菌酶微球注射剂
将称取3-羟基丁酸酯(PHB)20g溶于适量二氯甲烷中，密闭水浴加热溶解，冷至4℃后加入以上实施例获得的人溶菌酶100000单位，涡旋震荡并超声分散，冰箱冷藏。取浓度为1.0％的PVA水溶液于冰浴中搅拌(190～210r/min，4℃以下)，将冷藏的人溶菌酶混悬液振荡混匀，用注射器缓缓推入PVA溶液中，乳化1min。置于室温下120～140r/min搅拌固化完全，抽滤，水洗，减压干燥72h，过65目筛，即得。
得到的产品进行粒径分布、包封率和相应的体内外评价，结果表明，粒径分布在25μm左右，包封率36.8％，体内试验显示，给药后24h的释放占总药量的15％，在以后的120h内持续释药。
Claims (7)
1.一种以水稻为生物反应器生产人溶菌酶的方法，其特征为，将水稻的种子成熟胚诱导的愈伤组织作为遗传转化的受体，采用载体介导的遗传共转化方法，将人溶菌酶基因导入水稻中，使基因重组后的水稻表达重组人溶菌酶蛋白，其中所述人溶菌酶基因是经水稻密码子优化的人溶菌酶基因，该基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种以水稻为生物反应器生产人溶菌酶的方法，其特征为，所采用的水稻品种为粳稻品种台北309。
3.根据权利要求1所述的一种以水稻为生物反应器生产人溶菌酶的方法，其特征为，所采用的载体为农杆菌。
4.根据权利要求3所述的一种以水稻为生物反应器生产人溶菌酶的方法，其特征为，所述农杆菌载体为JH2600。
5.根据权利要求3所述的一种以水稻为生物反应器生产人溶菌酶的方法，其特征为，所述的农杆菌载体包含两种，分别为包含目的基因的农杆菌和包含标记基因的农杆菌。
6.根据权利要求5所述的一种以水稻为生物反应器生产人溶菌酶的方法，其特征为，标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因。
7.一种包含目的基因的农杆菌载体，其特征为，目的基因是经水稻密码子优化的人溶菌酶基因，该基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
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