JPH08116977A

JPH08116977A - 植物分泌液中にタンパク質を産生させる方法

Info

Publication number: JPH08116977A
Application number: JP5312537A
Authority: JP
Inventors: Pappusamy Arokiaraj; パプサミイ・アロキアライ; Kay Fong Cheong; カイ・フォング・チョング; Abdul Rahaman Wan Y Wan; ワン・ヤーコブ・ワン・アブダル・ラハマン; Hoong Yeet Yeang; ホーング・イエート・ヤング; Stephen A Boffey; ステファン・エー・ボッフィー; Heddwin Jones; ヘドウィン・ジョンズ; Robert J Slater; ロバート・ジェイ・スレイター
Original assignee: University of Hertfordshire; Board of Rubber Res Inst of Malaysia
Current assignee: University of Hertfordshire; Board of Rubber Res Inst of Malaysia
Priority date: 1992-11-17
Filing date: 1993-11-17
Publication date: 1996-05-14
Anticipated expiration: 2017-06-04
Also published as: ES2217257T3; EP0598589B1; CA2103195A1; CN1078042C; CN1091583A; JP3289021B2; EP0598589A2; KR940010897A; DK0598589T3; GB9224118D0; MY124303A; CA2103195C; DE69333476T2; KR100190253B1; DE69333476D1; EP0598589A3; ATE263839T1; US5580768A; PT598589E

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】遺伝子組換法により植物（例えばゴム植物）
の産生する分泌液中に目的産物（例えば医薬的に有用な
タンパク質）の産生方法の提供。【構成】植物組織中に、標的産物の発現を制御する遺
伝子または遺伝子フラグメントを挿入し、前記組織から
植物を再生すること。その遺伝子で形質転換された植物
がその産生する分泌液中に標的産物を発現することがで
きる遺伝子で形質転換され分泌液を産生する植物の製造
方法。また、その細胞中に産生される分泌液中に標的産
物が発現されるように染色体挿入断片を含有する、遺伝
子で形質転換され分泌液を産生する植物のクローン。さ
らに遺伝子で形質転換され分泌液を産生する木もしくは
植物またはそのクローンから分泌液を収穫し、その分泌
液から標的タンパク質などの産物を回収することからな
るタンパク質などの標的産物の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、所望の遺伝子産物を発
現することができる遺伝子で形質転換された植物の製造
方法、および同じ性能を有する前記の遺伝子で形質転換
された植物のクローンに関する。さらに詳しくは、関連
する植物は大容積の分泌液を産生する種類の植物であ
り、その標的遺伝子産物は前記分泌液中に発現される。
最も好ましくは、その植物はゴムの植物〔ヘベア（ Hev
ea）属の植物〕であり、かつその遺伝子は医薬として価
値のあるタンパク質産物をコードする遺伝子であり、そ
の産物は該植物によって産生されるラテックス中に収穫
されそのラテックスから抽出される。

【０００２】

【従来の技術と課題】“異種”の遺伝子の発現によって
特定のタンパク質を産生させるために、酵母、真菌およ
び細菌のような各種の微生物を遺伝子で形質転換させる
方法は公知である。しかし微生物は、生存させて繁殖さ
せるには適切な条件を維持する必要がある。例えば周囲
温度、ｐＨ値および通気レベルは通常、慎重に制御する
必要があり、一方栄養素は注意深く調節した用量で培地
に添加し、排泄産物は除去しなければならない。外来性
微生物による汚染を回避するために厳重な無菌の実施を
まもらねばならい。したがって微生物は通常、精巧な醗
酵器またはバイオリアクターで培養され、これらの装置
は高価な保守がなされている工場内に収納されている。
このような固定費が、タンプク質の最終製品の高価格を
もたらしている。

【０００３】ごく最近は、タバコの植物のような植物に
異種の遺伝子を導入することに注意が向けられている。
遺伝子による形質転換法をこのように適用することによ
って、作物の改善、および抽出可能で価値のある異種の
タンパク質（例えば抗体）の生物工学的製造を行うため
に種々の重要な遺伝子の特質を組込むことが可能になっ
ている。植物は、微生物と異なり、自らの状態に注意す
る傾向があり、日光、水および基本的な園芸学的な入力
はごくわずかしか必要とせず費用効率の高い原理で容易
に栽培することができる。種々の植物の種に異種の遺伝
子を導入できるいくつもの異なる方法が開発されてい
る。これらの方法としては次の方法がある。

【０００４】− アグロバクテリウム（ Agrobacterium
）属細菌のベクター系：このベクター系は異種の遺伝
子が挿入された細菌（アグロバクテリウム属）を植物の
組織に感染させる。植物細胞をアグロバクテリウム属の
細菌で形質転換する多くの方法はよく知られている（ V
ancanneyt らの１９９０年の文献； Horsh らの１９８
５年の文献； Bevan の１９８４年の文献；および He
rrera - Estrella らの１９８３年の文献）；

【０００５】− バイオリスティックガン法（ biolist
ic gun method ）またはパーティクルガン法（ parti
cle gun method ）：この方法によれば、ＤＮＡをコ
ートした微細投射体を用いて、分裂組織または胚形成カ
ルスのような再生可能な組織に投射することによって、
無傷の細胞また組織に遺伝物質を直接送り込むことがで
きる。この微細投射体は植物細胞に侵入して導入すべき
遺伝物質の不活性な担体として作用する（ Gordon - Ka
mm らの１９９０年の文献および Sanfard らの１９８
７年の文献）、胚形成カルス懸濁培養物に対する微小投
射体の投射によって、ユリノキ（ Dayton らの１９９２
年の文献）、綿（ Finer および McMullen の１９９
０年の文献）、トウモロコシ（ Gordon - Kamm らの１
９９０年の文献）および大豆（ McMulle および Fine
r の１９９０年の文献）の形質転換植物の産生に成功し
たことが実証されている。粒子投射によるＤＮＡ分配に
影響する種々のパラメータが定義されている（ Klein
らの１９８８年の文献；Wang らの１９８８年の文
献）；

【０００６】− 異種の遺伝子を植物組織中に吸収させ
ることによる方法（ Simon の１９７４年の文献）；お
よび − エレクトロポレーション法である。しかしこの方法を採用すると、標的産物を回収する際に
は収穫とともに、植物全体または植物の少なくともかな
りの部分が破壊される。植物がすっかり破壊されている
わけではない場合でも、その後の収穫が可能になるまで
再成長するには長い回復期間が必要である。その上に、
タバコのような植物からタンパク質の生成物を抽出する
こと（および上記のような目的のために通常使用される
大部分の微生物からの抽出）は組織固形分の均一化がも
たらされる。このことは比較的問題をはらむ非効率的な
操作である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】ブラジルのゴムの木であ
るヘベアブラジリエンシスムエル−アルグ（ Hevea
brasiliensis Muell - Arg ）はトウダイグサ科（ f
amily Euphorbiaceae）に属し、天然ゴムを製造するた
めに約１世紀にわたって商業的に利用している。ヘベア
属には実際には９種類の種があるが、ヘベアブラシリ
エンシスが最も広く栽培され商業的に価値が高い。その
理由はラテックスの収量が最も高いからである。

【０００８】ラテックスは、“切りつけ法（ tapping
）”として知られている方法で、伝統的にゴムの木か
ら分離されている。この方法は、帯状の樹皮を樹木の幹
から切取ってラテックスの流出を開始させる樹皮削除法
（次の切付けは同じ切取り部から樹皮の薄い層を削除す
ることによって実施される）か、または一つ以上の穴を
樹皮に作ってラテックスの流出を開始させる樹皮切り目
法によって実施できる。このように切付け法は、非破壊
的なラテックス回収法であり、繰返しかつ規則的な間隔
をおいて一般に一日置き毎に行うことができる。天然ゴ
ムはラテックスの約１／３を構成し、遠心分離のような
種々の分離法によって容易に分離することができる。

【０００９】ゴムの木は、大容積の樹液または浸出液す
なわちラテックスを産生することができる殆ど類のない
木であり、ラテックスは有害な作用は全くなしで連続し
て収穫することができる。本発明の発明者らはゴムの木
のこの特性を遺伝子工学の技術とともに利用して、医薬
として価値のあるタンパク質などの標的産物を生産する
新しくかつ有利な手段を提供するものである。

【００１０】本発明は、 i) 標的産物の発現を制御する遺伝子または遺伝子フラ
グメントを植物組織中に挿入し、次いで ii) 植物を前記組織から再生させることからなり、そ
の遺伝子で形質転換された植物がその産生する分泌液中
に標的産物を発現することができる、遺伝子で形質転換
され分泌液を産生する植物の製造方法を提供するもので
ある。

【００１１】さらに本発明の別の実施態様によって、標
的産物の発現を制御するプロモーターおよび遺伝子また
は遺伝子フラグメントを含有する染色体挿入断片をその
細胞内に含有し、その結果、前記標的産物を、産生され
る分泌液中に発現するかまた発現できる植物クローンが
提供される。

【００１２】特に好ましい実施態様において、本発明
は、標的産物の発現を制御するプロモーターおよび遺伝
子または遺伝子フラグメントを含有する染色体挿入断片
をその細胞内に含有し、その結果、前記標的産物をラテ
ックス中に発現するかまた発現することができるヘベア
属の植物クローンを提供するものである。

【００１３】本発明はさらに、適切に遺伝子で形質転換
された植物の、芽接ぎ（ bud grafting ）、挿木（ t
aking a cutting ）または栄養繁殖を実施することか
らなる上記の種類のクローンの製造方法を提供するもの
である。

【００１４】さらに別の実施態様において、本発明は、 i) 遺伝子で形質転換され分泌液を産生する木もしくは
植物またはそのクローンから分泌液を収穫し、次いで ii) その分泌液から標的タンパク質などの産物を回収
する、ことからなる、タンパク質などの産物の製造方法
を提供するものである。

【００１５】この方法はヘベア属の植物のすべての種に
適用できるが、本願でヘベア属の植物と木を参照してい
るのはそのように解すべきである。しかしヘベアブラ
シリエンシスが特に好ましい。

【００１６】ヘベア属の植物は本発明に用いるのに好適
である。というのは、この植物が産生する分泌液（すな
わちラテックス）が、非破壊的に収穫し易く、処理が容
易であり、かつ本来タンパク質が豊富である（それ故形
質転換植物中に異種タンパク質を産生させることが容易
である）からである。しかし、大容積も分泌液または樹
液を産生（すなわち保有もしくは浸出する）他の植物も
本発明で使用するのに適していると解すべきである。そ
の例としては次のものがある。すなわち、 − リユウゼツラン植物。いくつかの変種はその空洞髄
から１日当り１ｌまでの浸出液を産生することができ
る。 − ヤシの木。その花序は切込みつけて、多量の浸出液
を流出させることができる。 − 浸出はしないがかなりの容積の分泌液を保持する植
物器官。例えば若いヤシの実の液状内乳（すなわち
“水”もしくは“ミルク”）は大量に収穫することがで
きる。

【００１７】本発明の根底にある方法は、三つの主要段
階に分かれる。すなわち i) 植物の遺伝子による形質転換（標的タンパク質など
の産物をコードする遺伝子であるＤＮＡ分子が植物の組
織の遺伝的補体に挿入される）。またその遺伝子にはプ
ロモーターが付随している必要があることは理解される
であろう。いわゆる“普遍”プロモーター（組織特異的
ではなく、樹液もしくは分泌液を含め、一般に植物のす
べての組織に遺伝子の発現を起こさせる）を利用できる
が、プロモーターは分泌液特異的の方が好ましい。ゴム
の木の場合、プロモーターはラテックス特異的のものが
最も好ましい。

【００１８】上記のように、植物に遺伝子を導入する各
種の方法は公知であり、そのどれでも利用することがで
きる。特に好ましいのはアグロバクテリウム属の細菌の
ベクター系であり、このベクター系は所望の遺伝子を予
め挿入されたアグロバクテリウム属の細菌を組織に感染
させるが、バイオリスティックガン法またはパーティク
ルガン法によって所望の遺伝子が組織中に微小投射体で
推進される。挿入された遺伝子または遺伝子フラグメン
トを有する植物組織は形質転換されれた組織として公知
である。ゴムの植物の場合、形質転換は、ヘベア属の植
物の花の雄ずい柱から採取した葯由来のカルス組織（ a
nther derived callus tissue ）に対して実施し
た。

【００１９】形質転換法で導入されるプロモーターおよ
び遺伝子または遺伝子フラグメントは関連植物に対して
固有のものまたは異種のものであってもよい。プロモー
ターを修飾したり、またはその遺伝子の多数のコピーを
挿入することによって固有の遺伝子の発現を強化するこ
とができる。各種のタンパク質主体の産物、最も好まし
くは医薬として価値があるタンパク質の産物をコードす
る異種の遺伝子を導入することができる。

【００２０】ii) 形質転換された組織からの植物の再
生すなわち植栽と栄養付与による成熟。例えば、組織培
養法によって、ヘベア属植物の形質転換されたカルス組
織は、胚の段階を経て、形質転換されてその遺伝補体中
に挿入遺伝子を有する小植物に再生される。その小植物
はやがて充分に成長し、形質転換されたゴムの木に成熟
し、挿入した遺伝子によって発現された標的タンパク質
などの産物がそのラテックス中に存在している。

【００２１】iii) 植物または木が産生した分泌液中の
標的タンパク質などの産物の収穫と分泌液からの産物の
回収。ヘベア属の植物の場合、収穫される分泌液は勿論
ラテックスである。形質転換されたゴムの木が成長して
充分に成熟したならば、通常２〜５年後に、切付けが行
われラテックスが規則的な間隔をおいて収穫される。次
にラテックスは通常は遠心分離に付され、天然ゴム、水
性Ｃ−漿液およびいわゆる“ボトムフラクション（ bot
tom fraction ）”に分離される。標的タンパク質など
の産物はラテックスのどの部分にも含有されており、通
常の手段（例えば分離カラムクロマトグラフィー）によ
って抽出・精製することができる。産物はＣ−漿液また
はボトムフラクション中に存在している方が好ましい。
後者は主にルトイド（ lutoid ）で構成され、このルト
イドはそれ自体の漿液（Ｂ−漿液）が入っている、膜で
連結された小胞である。このＢ−漿液は、界面活性剤例
えばTriton Ｘ−１００を用いるかまたは凍結と融解
を交互に行うことによってその膜を破裂させることによ
ってルトイドから放出させることができる。ラテックス
中で生体膜に結合されている標的タンパク質などの産物
はいずれもドデシル硫酸ナトリウムのごとき界面活性剤
で化溶化することによって回収することができる。

【００２２】本発明は、タンパク質および非タンパク質
の広範囲の産物を合成するのに用いる新しい有利な手段
を提供するものである。本発明は医薬として価値のある
タンパク質産物を製造するのに特に適している。本発明
の技術は、産物の発現をコードする遺伝子が知られてい
るならば、ほとんどすべてのタンパク質主体の産物の合
成にほぼ適用できるであろう。挿入された遺伝子によっ
て直接コードされるタンパク質産物はそれ自体、植物内
で、異なる最終産物の産生反応を触媒する場合があるこ
とは理解されるのである。この異なる産物（タンパク質
または非タンパク質）は商業的に価値のある最終産物と
して収穫することができる。形質転換された植物または
木によって製造できる産物の例は次のとおりである。 (a) 糖尿病を治療するのに用いるインスリン。 (b) 血友病の治療に用いる血液凝固因子。 (c) 心臓治療用の血餅溶解活性化剤。 (d) 癌治療用の腫瘍壊死因子。 (e) 貧血治療用のエリトロポイエチン。 (f) ワクチン製造に用いるウイルスコートタンパク
質。 (g) “ＰＨＢ”、ポリプロピレンに類似のプラスチッ
クであり、びん、包装材料などを製造するのに用いられ
る。

【００２３】本発明に特にゴムの木を使用することは、
下記の特に注目すべき多数の有意な利点がある。 − 産生が連続的である。というのは標的タンパク質な
どの産物を含有するラテックスが規則的な間隔をおい
て、収穫されかつ産物の回収が簡単だからである。ラテ
ックスは流体であるから、標的産物の回収によって組織
の均質化が起こらない。 − この方法は環境に対してやさしい方法である。その
プロセスは太陽によって駆動されるのでエネルギー効率
が高く特に無公害である。 − ゴムの木は通常の園芸的維持以上に特別の注意を全
く必要としない、。したがってゴムの木の使用は費用効
率が高い。 − この方法は広範囲の標的産物に対して使用すること
ができる。 − ゴムの木から流出するラテックスは細菌および動物
ウイルスを全く含有していない、このことは遺伝子で形
質転換された微生物または動物が用いられるときに適用
する必要がある厳しい無菌の処置と対照的である。 − ゴムの木は、クローン繁殖または栄養繁殖が容易で
あり、最も普通には芽接ぎで行われる。他の方法には挿
木、marcotting または組織培養がある。したがって、
無制限の数の遺伝子が同一の植物（クローン）を、単一
の形質転換植物から生成させることができ、これらクロ
ーン植物はすべてそのラテックス中に所望の産物を発現
し続けることができる。 − ゴムの木は経済寿命が約３０年である。この期間
中、遺伝子で形質転換された木は、標的産物の産生に加
えて、勿論そのラテックス中に天然ゴムを産生し続ける
が、ラテックスはゴムの木独特の価値のある商品であ
る。ゴムの木は最終的に伐採されると、価値ある南洋材
（ゴム材木）が得られ、輸出用および家具製造用に非常
に要望されている。これらの利点のいくつかは、本発明
に用いるのに適している他の分泌液産生植物も共有して
いる。

【００２４】

【実施例】本発明は下記の実施例によってさらに説明す
る。実施例１はパーティクルガン法を用いるヘベアブ
ラシリエンシスの遺伝子形質転換に関し、実施例２と３
はそれぞれ、アグロバクテリウム属細菌のベクター系お
よび吸入法を用いた場合を示す。酵素のグルクロニダー
ゼを標的タンパク質の例として用いるが、他の産物につ
いては、グルクロニダーゼの産生を制御する遺伝子を他
の産物の標的タンパク質に対して適切な遺伝子で置換し
て、同様の方法を一般に適用する。実施例には以下の略
語が引用される。

【００２５】ＭＢ＝ヘベア属植物の葯培養開始培地。ＧＵＳ／ｇｕｓ＝β−グルクロニダーゼ。ＮＰＴII／ｎｐｔII＝ネオマイシンホスホトランススフ
エラーゼ。ＣＡＴ／ｃａｔ＝クロラムフエニコールアセチルトラン
スフエラーゼ。ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応。ＥＬＩＳＡ＝酵素結合イムノソルベルト検定法。ＣａＭＶ＝カリフラワーモザオクウイルス

【００２６】実施例１植物材料と組織培養胚形成ヘベア葯カルスを、雄ずい柱の個々の葯から生成
させた。カルスはＭＢ倍地上２５℃で生成させて保持し
（ Chen らの１９８４年の文献）、この培地に４週間お
いた後、形質転換するのに用いた。全組織培養法は Che
n らの１９８４年の文献に記載される手順にほぼ従っ
た。

【００２７】植物発現ベクター形質転換には以下のプロスミドを使用した。すなわち、
β−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）遺伝子を含有するｐＢ
Ｉ２２１．１（ Jefferson の１９８７年に文献）；ｇ
ｕｓとｎｐｔIIの遺伝子を含有するｐＭＯＮ９７９３
（ Gasser 、Monsanto Company 、未発表）；ｃａｔと
ｎｐｔIIの遺伝子を含有するｐＤＥ１０（Rhodes 、 No
rwich 、英国）；およびｎｐｔIIを含有するｐＨＰ２
３（ Paszkowski および Saul の１９８８年の文献）
である。これらの遺伝子は強力なＣａＭＶ３５Ｓプロモ
ーターの制御下にあった。組換えプラスミドはイー・コ
リ（E. Coli）中で増殖させ、アルカリ溶解法で単離
し、塩化カルシウム／臭化エチジウム密度勾配遠心分離
法で精製した（ SambrooK 、Fritsch および Maniatis
の１９８９年の文献）。プラスミドＤＮＡは２６０ｎｍ
波長光の吸光度とゲル電気泳動法によって定量した。

【００２８】微細投射体投射法プラスミドＤＮＡを、すでに報告されているようにして
（ Gordon - Kamm らの１９９０年の文献）タングステ
ン粒子上に沈澱させた。その沈澱混合物は、１．３０ｍ
ｇのタングステン粒子、２５μｇのプラスミドＤＮＡ、
１．１ＭのＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏおよび８．７ｍＭのス
ペルミジンを含有する合計容積５７５μｌの混合物であ
った。上記の順序で成分を添加した後、混合物を４℃で
１０分間攪拌し、５００×ｇで５分間遠心分離し、次に
５５０μＬの上澄み液を廃棄した。生成したペレット
を、残りの上澄み液２５μＬ中に再懸濁させ、次いでこ
の懸濁液からの１μＬのタングステン懸濁液を微細投射
体に充填し、バイオリスティックパーティクルガン（ S
pearline Precision Engineering Ｌｔｄ．、英国）
で標的に向って加速させた。葯カルスを Whatman １号
フイルター紙のディスク（７ｃｍ）の中心に置き、これ
を、投射を行う前に、ＭＢ培地が入っているプラスチッ
ク製ペトリ皿（直径９ｃｍ）の中心に置いた。カルス培
養物を微細投射体停止プレートの下方５ｃｍの位置にお
き、１００μｍメッシュのステンレス鋼のスクリーン
を、該停止板と組織の間の中ほどに置いて、タングステ
ン粒子分散を促進させた。各プレート上に１回ずつ投射
を行い、次いでカルスを、増殖チャンバー中暗所で２５
℃にて短時間インキュベートした。

【００２９】形質転換体の選択投射後２５℃にて暗所でインキュベートした後、カルス
をフイルター紙からおだやかに取外し、ＭＢ培地が入っ
ている新しいプレート上に置き、さらに、暗所で２５℃
にて１０日間インキュベートした。投射されたカルスと
対照を、１００μｇ硫酸カナマイシンｍＬ^-1を含有する
ＭＢ選択培地に移した。抗生物質耐性のコロニーを、投
射を行ってから４週間後に単離し、１００μｇ硫酸カナ
マイシンｍＬ^-1を含有する分化培地（ differentiation
medium ）に移し、２５℃にて明るい所でインキュベ
ートした（２５０μＥｍ^-2ｓ^-1）。これは茎と根の成長
を刺激したが、抗生物質選択がなくても、小パーセント
（３％）の体細胞胚が小植物（ plantlet ）に分化した
（ Chen らの１９８１年の文献ｂ）。

【００３０】酵素検定ＮＰＴII ：形質転換組織のＮＰＴII活性をＥＬＩＳＡ法
キット（５ Prime -３ Prime 、Ｉｎｃ．、ＣＰ Labo
ratoreis 、英国から入手）を用いて測定した。抽出タ
ンパク質約４００μｇを検定毎に使用した。

【００３１】ＧＵＳ：ヘベア属植物の形質転換された葯
カルス、胚様体および根のβ−グルクロニダーゼの組織
化学分析を、Jefferson の１９８７年の文献の方法にし
たがって、基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ルグルクロニド（Ｘ - gluc）を用いて実施した。組織
はＸ - gluc を添加してから１８〜３６時間後に青色に
染色した細胞について試験した。 Nikon ＳＺＭ−Ｕ
１：１０ズーム両眼顕微鏡を使い、kodacolor タングス
テン１６０Ｔフイルムを用いて、顕微鏡写真を撮った。
ＧＵＳ活性の蛍光分析検定を、基質４−メチル−ウンベ
リフエリル−β−Ｄ−グルクロニドを用いて実施した
（ Jefferson らの１９８７年の文献）。

【００３２】ＣＡＴ：ＣＡＴの活性を Gorman らの文献
１９８２年に記載されているようにして測定した。正の
対照を、１単位の細菌ＣＡＴ酵素（ Sigma 社）を用い
て、被投射組織の試料と平行して走行させた。負の対照
には、ＣＡＴ緩衝液の試料と投射されていない胚様体か
らの抽出物とが含まれている。

【００３３】ＤＮＡ単離とＰＣＲＤＮＡの単離：ゲノムＤＮＡを Draper らの文献１９８
８年に記載されているプロテアーゼ法を用いて単離し
た。凍結乾燥したヘベアの組織５０ｍｇを、乳棒と入鉢
を用いて微細粉末に粉砕した。次にこの粉末にした組織
を４００μＬのプロテアーゼ緩衝液（１００ｍＭトリス
−ＨＣＬｐＨ８．５、１００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍ
ＭＥＤＴＡｐＨ８．０、２．０％ＳＤＳ、０．１ｍ
ｇプロテナーゼＫｍｌ^-1）と充分に混合し、時々ゆるや
かに反転させながら３７℃にて１〜２時間インキュベー
トした。得られた組織／緩衝液のホモジネートを、８０
μＬのフエノールと８０ｍＬの２４：１（ｖ／ｖ）クロ
ロホルム／イソアミルアルコールで抽出した。水性相を
遠心分離によって分離し、抽出操作を繰返した。第２回
の抽出を行ってから集めた水性相を、０．５４倍容積の
イソプロパノールを用い、−２０℃で一夜沈澱させた。
翌日、沈澱を７０％のエタノールで洗浄し、５０μＬの
ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．０、１
０ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０）中に再懸濁させた。ヘ
ベアのゲノムＤＮＡを制限（ restriction )するため
に、２μＬの１０×ＢＳＡ／スペルミジン（２５ｍｇ
ＢＳＡｍＬ^-1 、４０ｍＭスペルミジン）を通常どおり
に、制限緩衝液に加えて、不純物の存在による問題を克
服した。

【００３４】ＰＣＲ：各ＰＣＲ反応を、１０ｍＭトリス
−ＨＣｌｐＨ８．８、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、５０μＬ鉱油、２００μＭｄＡＴＰ、
２００μＭｄＴＴＰ、２００μＭｄＣＴＰ、２００
μＭｄＧＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ（０．５〜１．０
Ｕ）、ＤＮＡ（２〜１０ｎｇ）ならびにオリゴヌクレオ
チドのプライマー：５′ＧＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＧＣＧ
ＴＴＡＣＡＡＧ３′および５′ＧＴＴＴＡＣＧＣＧＴＴ
ＧＣＴＴＣＣＧＣＣＡ３′（４００〜４２０位と１５９
９〜１５７９位はそれぞれＧＵＳ遺伝子中にある、Jeff
erson らの文献１９８６年）を含有する５０μＬ中で実
施した。各プライマー１００ｎｇずつをＰＣＲ反応に使
った。Ｔａｑポリメラーゼは Amersham International
plc.社から入手した。変性温度は９２℃であり、（変
性時間は１分間）、アニーリング温度は５５℃であり
（アニーリング時間は２０分間）、およびエクステンー
ション温度は７２℃（期間は２０分間）であった。反応
は、プログラマブル熱制御器（ The Hybaid Thermal
Reactor ）を用い、３０サイクルをプログラムした。
ＴＢＥ（０．９Ｍトリス−ＨＣｌ２５ｍＭＥＤＴＡ
０．９ｍＭＨ₃ＢＯ₃ ）を走行緩衝液として用い、
試料を１．０％アガロース／臭化エチジウムゲル上を走
行させた後にＤＮＡを検出した。

【００３５】試験結果形質転換と再生採用したバイオリスティック法は、過度遺伝子発現の研
究を行うのに、大麦の胚に遺伝子を導入するため確立さ
れた方法にしたがった（ M. G. K. Jones 、 Rothamste
d 、英国）。パーティクル投射法について使用した葯カ
ルスは高度に胚形成性のヘベア属植物クローン（クロー
ン受託番号１１）から誘導した。投射されたカルスを選
択培地に転移させた所、カナマイシン耐性ミクロカルス
が非常にゆっくり成長するのが見えたが、これらの形質
転換カルスは健康のようであり、暗色の死にかかってい
る投射されていないカルス中に白色に見えた（図１）。
Ｘ− gluc を添加すると青色に着色する、抗生物質で選
択されたカルスと胚様体の百分率は、プラスミドｐＭＯ
Ｎ９７９３を用いて投射を行った後、カルスでは９０％
に達し、胚様体では８０％に達した。カナマイシンの選
択なしでｐＢＩ２２１．２を用いた場合、青色の着色の
百分率はカルスの場合６０％に、胚様体の場合は７０％
に達した（表２）。プラスミドｐＭＯＮ９７９３を用い
て投射されたカルスと胚様体が示した高い転移効率は恐
らくカナマイシン選択が原因であろう。

【００３６】表２：ＧＵＳ活性を発現するカルスと胚様
体の百分率プラスミド１０形質転換体１０カルスの数９ＧＵＳを発現するカスルの数８百分率９０ｐＭＯＮ９７９３１０葯カルス１０胚様体６ｐＢＩ２２１．２７葯カルス６０胚様体７０

【００３７】ＧＵＳについての組織化学的検定では、カ
ナマイシン選択なしで保持されたカルスに酵素活性の不
均一なパターンが再々示されたが、カナマイシン選択を
行った後のカルスには均一なパターンが示された。対照
の（投射されなかった）葯カルス、胚様体または根はい
ずれもＸ− gluc を使用したときに青色に染色されなか
った。これらの実験結果を図１および図２に示す顕微鏡
写真に要約してある。

【００３８】ＧＵＳ活性について組織化学的に染色して
得られた結果を蛍光分光検定法を用いて確認した（図
３）。ＧＵＳの蛍光活性は分析された形質転換胚様体の
９０％に明確であった。そして形質転換された胚様体の
ＧＵＳ活性は全般的に投射されていない対照の値と比べ
て４倍に増大した。

【００３９】ＮＰＴIIのレベルを、形質転換されたカル
スについてＥＬＩＳＡ法を用いて定量した（図４）。全
般的にＮＰＴIIタンパク質のレベルは、バックグランド
の対照の値の約４倍であり、２８〜３２ｎｇＮＰＴII／
ｍｇ全タンパク質の範囲であった。

【００４０】ｇｕｓをリポーター遺伝子として使用した
のに加えて、本発明の発明者らは、ヘベア属植物への遺
伝子の導入を監視するためにｃａｔ遺伝子を用いた。こ
れらの試験の結果は図５に示すオートラジオグラフに要
約されている。ｃａｔ遺伝子を含有するプラスミドは投
射によって導入することができるので、ヘベア属植物の
カルスと胚様体組織に効率的に発現されることは明らか
である。投射されていない対照の組織には非常に低いレ
ベルのＣＡＴ活性しかみとめられなかった（図５のレー
ン３）。

【００４１】ヘベア属植物のカルス中に導入されたリポ
ーター遺伝子の存在についての直接検査を、ＰＣＲ法を
用いて実施した。ｇｕｓの内部配列を増幅するのに Ham
illら（１９９１年の文献）の方法を用いた。３０サイ
クルの増幅を行った後、０．８ｎｇの少量の鋳型ＤＮＡ
を使い、単一のバンドが、アガロース／臭化エチジウム
ゲル上に目視可能になった（図６）。この増幅されたバ
ンドはｇｕｓの遺伝子と大きさが同一であった。

【００４２】最後に、本発明の発明者らは、パーティク
ル投射を行った後２個のヘベア属植物の小植物（無菌で
増殖させた）を再生させるように処理した（図７及び図
８）。その小植物は全く正常に見えた。そして根はＸ−
gluc で処理したところ青色に染色された。これらの小
植物のうちの一つにｇｕｓ遺伝子が存在することは、カ
ルス由来のＤＮＡに対して実施したのと同じＰＣＲのプ
ロトコルを用いて確認した。図９に示すように、ｇｕｓ
遺伝子の増幅は、４．０ｎｇの少量のヘベア属植物の葉
のＤＮＡを用いて成功した。本発明の発明者らは、先に
述べたのと同じＰＣＲ条件を使用して、対照の（投射さ
れていない）カルス、胚様体または小植物のどれにもｇ
ｕｓ遺伝子を増幅させることはできなかった。

【００４３】これらの試験結果は、リポーター遺伝子の
検定、カナマイシン耐性の形質転換体の回収およびＰＣ
Ｒ法の利用によって測定した場合、微細投射体／微細粒
子が異種ＤＮＡをヘベアブラシリエンシスの細胞に導
入できることを示している。細胞内に運ばれたＤＮＡは
微細投射体の表面から明らかに放出され、なんらかの受
動的または活性の機構によって、その遺伝子が発現され
る核内に輸送される。

【００４４】実施例２ I.カルス組織の形質転換選択されたヘベア属植物の品種の雄花を Chlorox（５．
２５％ａ．ｉ．次亜塩素酸ナトリウム）で５分間消毒
し次いで滅菌蒸留水で数回洗浄した。葯を雄ずい柱から
切取り、ＭＢ培地に接種した（２０個の葯／ペトリ
皿）。培養物を暗所にて２５℃でインキュベートした。

【００４５】アグロバクテリウム属細菌による遺伝子形
質転換４週齢のヘベア属植物の葯カルスに、酵素のグルタロニ
ダーゼ（ＧＵＳ）とネオマイシンホスホトランスフエラ
ーゼに対する遺伝子をもっているアグロバクテリウム
ツメフアシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）を感
染させた。後者の酵素の遺伝子は抗生物質カナマイシン
に対する耐性を与える。カルスは、アグロバクテリウム
ツメフアシエンス懸濁液ｐＨ５．８の一夜培養物中に
１分間浸漬し、次に７％のスクロースを含有しているが
ホルモンの補充なしの液状ＭＢ培地で希釈して、最終の
測定細菌集団数を３．７×１０⁸ 細胞／ｍｌにした。集
団密度の評価は一夜培養物の６００ｎｍ波長光の吸光度
を測定することによって実施した。過剰の細菌懸濁液
を、滅菌 Whatman １号フイルター紙を用いてカルスか
らブロットし、そのフイルター紙をペトリー皿に移し２
日間共生培養を行った。

【００４６】カルスを、抗生物質のセホタキシム（２５
０μｇ／ｍｌ）および Ticar（５００μｇ／ｍｌ）を含
有するＭＢ培地に移し前記のアグロバクテリウム属細菌
を絶滅させた。１週間後、カルスは、セホタキシムと T
icarを保持したまま選択プレート（ＭＢ、Ｋｍ１００
μｇ／ｍｌ）上に置いた。セホタキシムと Ticarの濃度
は、続いて１週間間隔で行った継代培養中に徐々に低下
した。

【００４７】II. 形質転換された小植物の再生カルス培養物をＭＢ培地の上にプレートし、１週間イン
キュベートし、次いで７日間毎に新しい培地に移した。
３週間後に、培養物を選択分化培地に移した。この相の
期間は、３０日間後に新しい培地に移して約２カ月続け
る。培養物を再び暗所にて２５℃でインキュベートし
た。開始培地（ＭＢ）と分化培地は、形質転換細胞を選
択するため硫酸カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含
有させた。

【００４８】分化培地中に約６０日間置いた後、発育し
た胚様体を、茎と根を形成させるため発育培地に移し
た。得られた小植物を土壌に植え、栄養を与え成熟させ
ることができた。

【００４９】ヘベアブラシリエンシスの小植物は、ア
グロバクテリウム属細菌の仲介によってＧＵＳ遺伝子を
挿入した後再生させることに成功した。その小植物は正
常に見え、葉の試料はＸ− gluc で処理した後青色に染
色された。このことはＧＵＳ遺伝子の発現を示してい
る。形質転換されずに生体外で栽培されたヘベア属植物
の葉の試料は、同様にＸ− gluc で処理しても染色され
なかった。その結果を図１０に示す。

【００５０】実施例３アグロバクテリウムのベクター系の代わりに、遺伝子形
質転換を下記のように吸入法で行ったことを除いて、実
施例２の方法にほぼしたがって試験した。４週齢のヘベ
ア属植物の葯カルスを、３７℃のインキュベーター中に
３０分間置いて脱水した。カルスは、グルクロニダーゼ
に対する遺伝子を含有するＤＮＡ溶液（滅菌水中１００
μｇの pBI ２２１．１ＤＮＡ）中で３０分間吸入さ
せた。培養物をＭＢ培地に移し、続いて分化培地に移し
た。しかし実施例２と異なり、培地は硫酸カナマイシン
を含有していなかった。

【００５１】なお、本明細書中にて引用した文献および
本発明に関連する文献のリストを下表に示す。

【００５２】

【表１】

【００５３】

【表２】

【００５４】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】クロモゲン基質Ｘ− gluc で処理した後のヘベ
ア属植物の組織のＧＵＳ活性を示す写真（いずれも２５
倍の倍率）である。(A) は対照のカルス、(B) は３週齢
の投射された葯カルス由来の細胞である。

【図２】クロモゲン基質Ｘ− gluc で処理した後のヘベ
ア属植物の組織のＧＵＳ活性を示す写真（いずれも２５
倍の倍率）である。(C) は対照の胚様体、(D) はパーテ
ィクル投射を行った後の胚様体である。

【図３】被投射ヘベア属植物の胚様体（Ｔ．Ｅ．）のＧ
ＵＳ活性を対照の値（Ｕ．Ｔ．Ｅ．）と比べて示す棒グ
ラフである。結果は、平均値±ｓ．ｄ．；ｎ＝２０個の
胚様体として示している。

【図４】被投射ヘベア属植物のカルスのＮＰＴIIタンパ
ク質のレベルを対照の値と比較して示す棒グラフであ
る。結果は、ｎｐｔII遺伝子を投射した３種のプラスミ
ド（方法の項参照）について示してある。数値は平均値
±ｓ．ｄ．；ｎ＝ｘ繰返し数で示してある。

【図５】予めプラスミド pDE １０で投射されたヘベア
属植物の組織のＣＡＴ活性を示すオートラジオグラフで
ある。〔¹⁴Ｃ〕クロラムフエニコール（ＣＡＰ）、〔¹⁴
Ｃ〕１−アセチルクロラムフエニコール（１−ＣＡ
Ｐ）、および〔¹⁴Ｃ〕３−アセチルクロラムフエニコー
ル（３−ＣＡＰ）の位置を示している。レーン１：正の
対照として用いた市販のＣＡＴ（Sigma 社）、レーン
２：負の対照（緩衝液のみ含有）、レーン３：対照の
（投射されていない）葯カルス、レーン４〜６：硫酸カ
ナマイシンで選択してから３週間後の各種の形質転換葯
カルス、レーン７：硫酸カナマイシンの存在下、投射さ
れたカルスから再生された胚組織。

【図６】ｘ週齢のヘベア属植物の抗生物質で選択された
カルスから単離したＤＮＡ由来のｇｕｓ遺伝子の増幅を
示す図である。レーン１：１ｋｂラダー（ladder）、レ
ーン２：５００ｎｇのＤＮＡ、レーン３：１００ｎｇの
ＤＮＡ、レーン４：２０ｎｇのＤＮＡ、レーン５：４ｎ
ｇのＤＮＡ、レーン６：０．８ｎｇのＤＮＡ。

【図７】(E) 図１に示すパーティクル投射を受けた組織
から成長したヘベア属小植物、クロモゲン基質Ｘ− glu
c で処理した後のＧＵＳ活性；２５倍率の写真を示す。

【図８】(F) 対照の根；(G) 形質転換胚様体から再生し
た根；のいずれも２５倍率の写真を示す。

【図９】再生したヘベアブラシリエンシス小植物から
単離したゲノムＤＮＡのＰＣＲによるｇｕｓ遺伝子の検
出を示す図である。レーン１：１ｋｂラダー；レーン
２：対照（投射されていない）植物由来の４．０ｎｇの
ＤＮＡ；レーン３：形質転換カルス由来の４．０ｎｇの
ＤＮＡ；レーン４：形質転換胚様体由来の４．０ｎｇの
ＤＮＡ；レーン５：形質転換されたヘベア属小植物の単
一の葉から単離した４．０ｎｇのＤＮＡ。

【図１０】(H) はＸ− gluc 中でインキュベートされた
葉の試料の表面の写真（１０倍）である。形質転換され
ていない試料（上方）は染色されていないが形質転換さ
れた試料（下方）は青色に染色されている。(I) はＸ−
gluc 中でインキュベートされた葉の試料の断面の写真
（３１倍）である。形質転換されていない試料（上方）
は染色されていないが形質転換された試料（下方）は青
色に染色されている。

【手続補正書】

【提出日】平成７年８月２３日

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】予めプラスミドｐＤＥ１０で投射されたヘ
ベア属植物の組織のＣＡＴ活性を示すオートラジオグラ
フの写真である。〔^１４Ｃ〕クロラムフエニコール（Ｃ
ＡＰ）、〔^１４Ｃ〕１−アセチルクロラムフエニコール
（１−ＣＡＰ）、および〔^１４Ｃ〕３−アセチルクロラ
ムフエニコール（３−ＣＡＰ）の位置を示している。レ
ーン１：正の対照として用いた市販のＣＡＴ（Ｓｉｇｍ
ａ社）、レーン２：負の対照（緩衝液のみ含有）、レー
ン３：対照の（投射されていない）葯カルス、レーン４
〜６：硫酸カナマイシンで選択してから３週間後の各種
の形質転換葯カルス、レーン７：硫酸カナマイシンの存
在下、投射されたカルスから再生された胚組織。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図６

【補正方法】変更

【補正内容】

【図６】ｘ週齢のヘベア属植物の抗生物質で選択された
カルスから単離したＤＮＡ由来のｇｕｓ遺伝子の増幅を
示す写真である。レーン１：１ｋｂラダー（ｌａｄｄｅ
ｒ）、レーン２：５００ｎｇのＤＮＡ、レーン３：１０
０ｎｇのＤＮＡ、レーン４：２０ｎｇのＤＮＡ、レーン
５：４ｎｇのＤＮＡ、レーン６：０．８ｎｇのＤＮＡ。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図９

【補正方法】変更

【補正内容】

【図９】再生したヘベアブラシリエンシス小植物から
単離したゲノムＤＮＡのＰＣＲによるｇｕｓ遺伝子の検
出を示す写真である。レーン１：１ｋｂラダー；レーン
２：対照（投射されていない）植物由来の４．０ｎｇの
ＤＮＡ；レーン３：形質転換カルス由来の４．０ｎｇの
ＤＮＡ；レーン４：形質転換胚様体由来の４．０ｎｇの
ＤＮＡ；レーン５：形質転換されたヘベア属小植物の単
一の葉から単離した４．０ｎｇのＤＮＡ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者パプサミイ・アロキアライマレーシア国クアラ、ルンプール、ジャラン、アンパング 260 ザ・ラバー・リサーチ・インスティテュート・オブ・マレーシア内 (72)発明者カイ・フォング・チョングマレーシア国クアラ、ルンプール、ジャラン、アンパング 260 ザ・ラバー・リサーチ・インスティテュート・オブ・マレーシア内 (72)発明者ワン・ヤーコブ・ワン・アブダル・ラハマンマレーシア国クアラ、ルンプール、ジャラン、アンパング 260 ザ・ラバー・リサーチ・インスティテュート・オブ・マレーシア内 (72)発明者ホーング・イエート・ヤングマレーシア国クアラ、ルンプール、ジャラン、アンパング 260 ザ・ラバー・リサーチ・インスティテュート・オブ・マレーシア内 (72)発明者ステファン・エー・ボッフィー英国エーエル10 ９エービー、ハートフォードシャー、ハットフィールド、カレッジ、レイン、ハットフィールド、キャンパス（番地なし）ユニヴァーシテイ、オブ、ハートフォードシャー内 (72)発明者ヘドウィン・ジョンズ英国エーエル10 ９エービー、ハートフォードシャー、ハットフィールド、カレッジ、レイン、ハットフィールド、キャンパス（番地なし）ユニヴァーシテイ、オブ、ハートフォードシャー内 (72)発明者ロバート・ジェイ・スレイター英国エーエル10 ９エービー、ハートフォードシャー、ハットフィールド、カレッジ、レイン、ハットフィールド、キャンパス（番地なし）ユニヴァーシテイ、オブ、ハートフォードシャー内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 i) 植物組織中に、標的産物の発現を制
御する遺伝子または遺伝子フラグメントを挿入し；次い
で ii) 前記組織から植物を再生することからなり、その
遺伝子で形質転換された植物が、その産生する分泌液中
に標的産物を発現することができる、遺伝子で形質転換
され分泌液を産生する植物の製造方法。
【請求項２】植物がヘベア属の種でありかつ標的産物
がそのラテックス中に発現される請求項１記載の方法。
【請求項３】植物がヘベア・ブラシリエンシスである
請求項２記載の方法。
【請求項４】遺伝子または遺伝子フラグメントの挿入
がアグロバクテリウム属細菌のベクター系を用いて行わ
れる請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】遺伝子または遺伝子フラグメントの挿入
がバイオリスティックガン法またはパーティクルガン法
を用いて行われる請求項１〜３のいずれか一つに記載の
方法。
【請求項６】標的産物がタンパク質である請求項１〜
５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】その細胞中に、標的産物の発現を制御す
るプロモーターおよび遺伝子または遺伝子フラグメント
を含有する染色体挿入断片を含有し、その結果、前記標
的産物を、産生する分泌液中に発現するかまたは発現す
ることができる分泌液産生植物のクローン。
【請求項８】その細胞中に、標的産物の発現を制御す
るプロモーターおよび遺伝子または遺伝子フラグメント
を含有する染色体挿入断片を含有し、その結果、前記標
的産物を、ラテックス中に発現するかまたは発現するこ
とができるヘベア属植物のクローン。
【請求項９】植物がヘベア・ブラシリエンシスである
請求項８記載のクローン。
【請求項１０】プロモーターおよび／または遺伝子も
しくは遺伝子フラグメントが植物に対して異種のもので
ある請求項７〜９のいずれか一つに記載のクローン。
【請求項１１】プロモーターおよび／または遺伝子も
しくは遺伝子フラグメントが植物に対して固有のもので
ある請求項７〜９のいずれか一つに記載のクローン。
【請求項１２】標的産物がタンパク質がある請求項７
〜１１のいずれか一つに記載のクローン。
【請求項１３】適切に遺伝子で形質転換された植物の
芽接ぎで挿木または栄養繁殖を行うことからなる請求項
７〜１２のいずれか一つに記載されたクローンを製造す
る方法。
【請求項１４】 i) 遺伝子で形質転換され分泌液を産
生する木もくしは植物またはそのクローンから分泌液を
収穫し、次いで、 ii) 前記分泌液から標的タンパク質などの産物を前記
分泌液から回収する、ことからなる、タンパク質などの
産物の製造方法。
【請求項１５】植物がヘベア属の種であり、かつタン
パク質などの産物が産生されるラテックスから回収され
る請求項１４記載の方法。