JP2017093347A - 遺伝的に改変された植物体を作製するための形質転換植物体の製造方法、及びこの製造方法により作製された、遺伝的に改変された形質転換植物体 - Google Patents
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Abstract
Description
なお、本発明の製造方法は、上記各工程を含む限りその他の工程を含んでいてもよく、上記各工程は、1回行ってもよいし、植え継ぐなどして複数回行ってもよい。
培養工程では、ゴム産生植物由来の組織片を培養して培養組織片を得る。この工程は、ゴム産生植物由来の組織片を培養して培養組織片を得るために通常行われる方法を採用することができ特に制限されないが、例えば、パラゴムノキ由来の節、腋芽、又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養することで、培養組織片(好ましくは、シュート)を誘導、形成させる誘導工程であることが好ましい。
また、殺菌又は滅菌処理を行った組織を用いる場合には、殺菌剤、滅菌剤の影響を除くため切り口を切除して培養に用いてもよい。
特に、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニンを使用する場合の、該ベンジルアデニンの濃度は、4.0〜6.0mg/Lであることが好ましく、最も好ましくは、5.0mg/Lである。他方、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを使用する場合の、該カイネチンの濃度は、0.8〜1.2mg/Lであることが好ましく、最も好ましくは、1.0mg/Lである。
なお、本明細書において、固体培地のpHは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のpHを意味する。
伸長工程では、誘導工程により形成させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む伸長培地で培養することにより、シュートを伸長させる。具体的には、誘導工程により形成させたシュート(例えば、2〜3cm程度)を伸長培地に差し込み移植し、4週間程度培養することで、シュートが伸長し、また新たな芽を取得することも可能となる。
なお、伸長培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地にシュートを差し込んで培養することでシュートが伸長しやすくなるため、固体培養が好ましい。また、伸長培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
増殖工程では、誘導工程により形成させたシュート、又は、伸長工程により伸長させたシュートを採取し、分割した後、該分割されたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養することで、シュートを形成させる。この工程を行うことにより、シュートの数を増加させることができ、接ぎ穂となる組織を大量に増殖させることが可能である。そして更には、この工程を繰り返し行ったり、植え継ぎ培養したりすることによって更に大量に増殖させることができる。
なお、採取したシュートの分割は従来公知の方法により行うことができ、分割する大きさは適宜設定することができる。
形質転換工程では、培養工程で得られた培養組織片、又は、増殖工程により得られた培養組織片、具体的には、誘導工程により形成されたシュート、又は、増殖工程により形成されたシュート、を遺伝子コンストラクトで形質転換する。
すなわち、上記形質転換工程は、培養工程で得られた培養組織片、又は、増殖工程により得られた培養組織片を、遺伝子コンストラクトで形質転換されたアグロバクテリウム属菌とともに培養する感染工程、該感染工程で得られた培養組織片を、カルバペネム系抗生物質を含む除菌培地で培養して、アグロバクテリウム属菌を除菌する除菌工程を含むものである。
上記感染工程において用いられるアグロバクテリウム属菌としては、含有する遺伝子コンストラクトを植物細胞に導入させることができるアグロバクテリウム属菌であれば特に限定されるものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)であることが好ましい。感染効率が良好であり、アグロバクテリウム法において汎用されているためである。
このように、上記遺伝子コンストラクトが、標的のゴム産生植物のゲノムと同種の遺伝物質を含むこともまた、本発明の好適な実施形態の1つであり、また、標的のゴム産生植物のゲノムと異種の遺伝物質を含むこともまた、本発明の好適な実施形態の1つである。
また、これらの遺伝子に組織特異的に機能するプロモーター等の調節領域を含ませることにより、標的遺伝子がコードしているタンパク質を、植物体の特定の組織において発現させることもできる。
マーカー遺伝子(選択マーカー遺伝子ともいう。)としては、後述する選択培養培地に含まれる選択試薬に対する抵抗性を付与する選択マーカーをコードする遺伝子であればよく、例えば、カナマイシン耐性遺伝子(nptII)、ハイグロマイシン耐性遺伝子(hptI)、グリフォサート耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。植物体での発現位置を確認するためのレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、GUS(βグルクロニダーゼ)遺伝子、GFP(緑色蛍光タンパク質)、RFP(赤色蛍光タンパク質)等を挙げることができる。
このように、上記遺伝子コンストラクトが、選択試薬に対する抵抗性を付与する選択マーカー遺伝子を含むこともまた、本発明の好適な実施形態の1つである。
感染工程では、標的遺伝子等を含む遺伝子コンストラクトを含有するアグロバクテリウム属菌(アグロバクテリウム属菌調製工程により得られたアグロバクテリウム属菌)を、誘導工程により形成されたシュート、又は、増殖工程により形成されたシュートに感染させる。
また、感染培地は、上記誘導培地同様、更に、硝酸銀を含むことが好ましい。
特に、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニンを使用する場合の、該ベンジルアデニンの濃度は、4.0〜6.0mg/Lであることが好ましく、最も好ましくは、5.0mg/Lである。他方、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを使用する場合の、該カイネチンの濃度は、0.8〜1.2mg/Lであることが好ましく、最も好ましくは、1.0mg/Lである。
共存培養工程では、感染工程により得られたシュート(アグロバクテリウム属菌が感染したシュート)を共存培養培地中で培養する。これにより、感染によりシュートに導入された標的遺伝子等の遺伝子断片が、植物細胞の遺伝子中に組み込まれ、より安定した形質転換シュートを得ることができる。
また、共存培養培地は、上記誘導培地同様、更に、硝酸銀を含むことが好ましい。
特に、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニンを使用する場合の、該ベンジルアデニンの濃度は、4.0〜6.0mg/Lであることが好ましく、最も好ましくは、5.0mg/Lである。他方、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを使用する場合の、該カイネチンの濃度は、0.8〜1.2mg/Lであることが好ましく、最も好ましくは、1.0mg/Lである。
除菌工程は、感染工程で得られた培養組織片、又は、共存培養工程で得られた培養組織片を、カルバペネム系抗生物質を含む除菌培地で培養して、アグロバクテリウム属菌を除菌する工程である。この工程により、感染工程により得られるシュート、又は、共存培養工程により得られるシュートとともに存在するアグロバクテリウム属菌を除菌することができる。該工程は、アグロバクテリウム法において一般的に行われている手法で行うことができるが、特に、本発明においては、アグロバクテリウム属菌を除菌するための除菌剤としてカルバペネム系抗生物質を用いるところに特徴がある。これにより、アグロバクテリウム属菌の除菌のための除菌剤を低濃度での使用に抑えることができ、かつ、短期間で充分にアグロバクテリウム属菌を除菌することが可能となることから、アグロバクテリウム属菌除菌による植物体への悪影響を最小限に留めることで、形質転換された組織片の生存率の低下を防ぎ、結果、遺伝的に改変された遺伝子導入植物の作製効率を高めることが可能となり、遺伝的に改変された遺伝子導入植物を短期間で効率的に得ることができる。
なお、液体除菌培地に浸漬する際には、静置してもよいし、振とうしてもよい。また、液体除菌培地での洗浄は、1回行ってもよいし、複数回繰り返し行ってもよい。
また、液体除菌培地は、上記感染培地同様、更に、硝酸銀を含むことが好ましい。
上記カルバペネム系抗生物質としては、具体的には、イミペネム、メロペネム、ドリペネムなどが挙げられるが、本発明の効果がより好適に得られることから、メロペネムが特に好ましい。これらカルバペネム系抗生物質は、1種を単独で用いてもよいし、2種以上を併用してもよい。
上記その他の除菌剤としては、例えば、セフォタキシム、カルベニシリン、オーグメンチン等が挙げられる。
なお、該洗浄時間は、例えば、液体除菌培地中に、シュートを浸漬させる場合、浸漬時間を意味する。
また、液体除菌培地での洗浄を複数回繰り返し行う場合の該洗浄時間は、洗浄が行われた時間の合計(総洗浄時間)を表す。
特に、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニンを使用する場合の、該ベンジルアデニンの濃度は、4.0〜6.0mg/Lであることが好ましく、最も好ましくは、5.0mg/Lである。他方、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを使用する場合の、該カイネチンの濃度は、0.8〜1.2mg/Lであることが好ましく、最も好ましくは、1.0mg/Lである。
選択培養工程は、アグロバクテリウム法において一般的に行われている手法で行うことができる。この工程により、形質転換されたシュートと、形質転換されていないシュートを選別することができる。
特に、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニンを使用する場合の、該ベンジルアデニンの濃度は、4.0〜6.0mg/Lであることが好ましく、最も好ましくは、5.0mg/Lである。他方、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを使用する場合の、該カイネチンの濃度は、0.8〜1.2mg/Lであることが好ましく、最も好ましくは、1.0mg/Lである。
また、このようにして選別された形質転換シュートを上述の増殖工程に供すれば、標的遺伝子等の導入された形質転換シュートを大量に増殖させることも可能である。
なお、上記選別された形質転換シュートが実際に形質転換されているかは、当該シュートからDNA抽出を行い、標的遺伝子等が導入されているかをPCR分析により分析する、といった方法や、遺伝子コンストラクトにGUS遺伝子やGFP遺伝子といったレポーター遺伝子を組み込んでおき、GUS観察やGFP観察をする、といった方法等の従来公知の方法により確認することができる。
再生工程では、形質転換工程により形質転換された組織片、より好ましくは、選択培養工程により選別された形質転換組織片、から植物体を再生する。
以下、発根工程について説明する。
発根工程では、形質転換された組織片を発根誘導培地で培養することにより発根させる。ここで、形質転換された組織片としては、上記形質転換工程により形質転換された組織片(シュート)、より好ましくは、上記選択培養工程により選別された形質転換組織片(シュート)が使用される。
なお、上記形成されたクローン苗を用いて、上述した増殖工程を繰り返し実施することにより、優良品種のクローン苗を大量に生産することも可能である。
BA:ベンジルアデニン
硝酸銀:メルク社製の硝酸銀
アガー:フルカ(FLUKA)社製のアガー(Agar)(パウダー)
アセトシリンゴン:東京化成工業株式会社製のアセトシリンゴン
メロペネム:大日本住友製薬株式会社製のメロペネム(メロペン 点滴用バイアル)
パロモマイシン:和光純薬工業株式会社製のパロモマイシン(パロモマイシン硫酸塩)
ハイグロマイシン:和光純薬工業株式会社製のハイグロマイシン(ハイグロマイシンB)
セフォタキシム:UTOPIAN社製のセフォタキシム(CEFOX(商品名))
アグロバクテリウム:EHA105株
パラゴムノキ:東京大学樹芸研究所由来のパラゴムノキ
<誘導工程>
パラゴムノキの成木、苗木から節、腋芽、頂芽を含む組織を採取した。また、パラゴムノキの種子を試験管内で無菌的に発芽させて培養した実生苗(無菌実生苗)から節、腋芽、頂芽を含む組織を採取した。
次に、成木、苗木から採取した節、腋芽、頂芽を含む組織を流水で洗浄し、更に70質量%エタノールで洗浄した後、約5〜10体積%に希釈した次亜塩素酸ナトリウム水溶液で滅菌し、滅菌水で洗浄した。
引き続いて、植え継ぎにより3cm程度に成長したシュートを、節、腋芽や頂芽の部分を残して1〜2.5cmに分割し、形質転換用の材料とした。
GFP(緑色蛍光タンパク質)遺伝子及びGUS(βグルクロニダーゼ)遺伝子と共に選択マーカー遺伝子であるパロモマイシン耐性遺伝子を挿入したバイナリーベクターpCAMBIA2300(商品名、Marker Gene Technologies, Inc社製)を導入したアグロバクテリウム(アグロバクテリウム・ツメファシエンス;EHA105株)をYEB培地中で培養温度28℃、24時間、振とう培養した。600nmで測定した吸光度(OD600)=約1.0になるまで培養し、遠心分離で集菌し、懸濁用溶液(5.0mg/LのBA、3.0質量%のスクロース、1.0mg/Lの硝酸銀を添加したMS液体培地)でOD600=0.6になるように調整した。
準備したアグロバクテリウム懸濁液25mLと、誘導工程で調製した形質転換用の材料(シュート)5本を50mLチューブに入れ、28℃で30分間穏やかに振とうした(感染工程)。振とう後、シュートを滅菌したろ紙上に置き、余分な懸濁液をよく除去した。当該シュートを共存培養培地(固体培地)に差し込み、培養温度28℃、暗所(0.1lx未満の明るさ)で、3日間共存培養した(共存培養工程)。
共存培養培地は、MS培地に、ベンジルアデニン(BA)、硝酸銀、スクロース、アセトシリンゴンをそれぞれ、5.0mg/L、1.0mg/L、3.0質量%、200μM添加し、培地のpHを5.7に調整した後、アガーを0.75質量%となるように添加して、オートクレーブ(121℃、20分)で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
共存培養させたシュートを取り出し、液体除菌培地(5.0mg/LのBA、3.0質量%のスクロース、1.0mg/Lの硝酸銀、50mg/Lのメロペネムを添加したMS液体培地)に10分間浸漬し、洗浄した。
洗浄後、シュートを滅菌したろ紙上に置き、余分な水気を拭き取った。当該シュートを除菌培地(固体培地)に差し込み、培養温度28℃、12.5μmol/m2/sの照明の下、14時間の明時間という条件で4週間培養した(除菌工程)。なお、1週間ごとに同じ組成の除菌培地に移植する植え継ぎを行った。これにより目視にてアグロバクテリウムのコロニーは観察されなくなった。
除菌培地は、MS培地に、ベンジルアデニン(BA)、硝酸銀、スクロース、メロペネムをそれぞれ、5.0mg/L、1.0mg/L、3.0質量%、50mg/L添加し、培地のpHを5.8に調整した後、アガーを0.75質量%となるように添加して、オートクレーブ(121℃、20分)で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
(シュート生存率(%))={(枯渇せずに生存が確認できたシュート数)/(除菌工程に供したシュート数)}×100
除菌培地で培養したシュートを取り出し、当該シュートを選択培養培地(固体培地)に差し込み、遺伝子導入個体の選抜のために、培養温度28℃、12.5μmol/m2/sの照明の下、14時間の明時間という条件で10週間培養した(選択培養工程)。なお、2週間ごとに以下の組成の選択培養培地に移植する植え継ぎを行った。
(0〜2週目の培養)
MS培地に、ベンジルアデニン(BA)、硝酸銀、活性炭、スクロース、パロモマイシンをそれぞれ、5.0mg/L、1.0mg/L、0.05質量%、3.0質量%、50mg/L添加し、培地のpHを5.7に調整した後、アガーを0.75質量%となるように添加して、オートクレーブ(121℃、20分)で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した選択培養培地を使用。
(2〜4週目の培養)
MS培地に、ベンジルアデニン(BA)、硝酸銀、活性炭、スクロース、パロモマイシンをそれぞれ、5.0mg/L、1.0mg/L、0.05質量%、3.0質量%、100mg/L添加し、培地のpHを5.7に調整した後、アガーを0.75質量%となるように添加して、オートクレーブ(121℃、20分)で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した選択培養培地を使用。
(4〜6週目の培養)
MS培地に、ベンジルアデニン(BA)、硝酸銀、活性炭、スクロース、パロモマイシンをそれぞれ、5.0mg/L、1.0mg/L、0.05質量%、3.0質量%、150mg/L添加し、培地のpHを5.7に調整した後、アガーを0.75質量%となるように添加して、オートクレーブ(121℃、20分)で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した選択培養培地を使用。
(6〜8週目の培養)
MS培地に、ベンジルアデニン(BA)、硝酸銀、活性炭、スクロース、パロモマイシンをそれぞれ、5.0mg/L、1.0mg/L、0.05質量%、3.0質量%、200mg/L添加し、培地のpHを5.7に調整した後、アガーを0.75質量%となるように添加して、オートクレーブ(121℃、20分)で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した選択培養培地を使用。
(8〜10週目の培養)
MS培地に、ベンジルアデニン(BA)、硝酸銀、活性炭、スクロース、パロモマイシンをそれぞれ、5.0mg/L、1.0mg/L、0.05質量%、3.0質量%、250mg/L添加し、培地のpHを5.7に調整した後、アガーを0.75質量%となるように添加して、オートクレーブ(121℃、20分)で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した選択培養培地を使用。
(シュート発生率(%))={(新たなシュートの発生が確認できたシュート数)/(選択培養工程に供したシュート数)}×100
(シュート選択効率(%))={(遺伝子導入が確認されたシュート数)/(遺伝子導入の成否を確認したシュート数(GFP観察を行ったシュート数))}×100
なお、シュート選択効率とは、選択培養工程後に発生が確認された新たなシュートのなかから数個体抜取りGFP観察を行う抜取り試験を行い、抜取り試験個体のうちのどれだけから遺伝子導入が確認されるかの指標である。
<誘導工程>
実施例1と同様にして行い、形質転換用の材料を得た。
GFP(緑色蛍光タンパク質)遺伝子、GUS(βグルクロニダーゼ)遺伝子及びCPT(シス型イソプレノイド鎖合成酵素)遺伝子と共に選択マーカー遺伝子であるパロモマイシン耐性遺伝子を挿入したバイナリーベクターpCAMBIA2300(商品名、Marker Gene Technologies, Inc社製)を導入したアグロバクテリウム(アグロバクテリウム・ツメファシエンス;EHA105株)をYEB培地中で培養温度28℃、24時間、振とう培養した。600nmで測定した吸光度(OD600)=約1.0になるまで培養し、遠心分離で集菌し、懸濁用溶液(5.0mg/LのBA、3.0質量%のスクロース、1.0mg/Lの硝酸銀を添加したMS液体培地)でOD600=0.6になるように調整した。
準備したアグロバクテリウム懸濁液を用いた以外は実施例1と同様にして、感染工程、共存培養工程を行った。
実施例1と同様にして、除菌工程を行った。これにより目視にてアグロバクテリウムのコロニーは観察されなくなった。
除菌培地で培養したシュートを取り出し、実施例1と同様にして、選択培養工程を行った。
<誘導工程>
実施例1と同様にして行い、形質転換用の材料を得た。
GFP(緑色蛍光タンパク質)遺伝子及びGUS(βグルクロニダーゼ)遺伝子と共に選択マーカー遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子を挿入したバイナリーベクターpCAMBIA1304(商品名、Marker Gene Technologies, Inc社製)を導入したアグロバクテリウム(アグロバクテリウム・ツメファシエンス;EHA105株)をYEB培地中で培養温度28℃、24時間、振とう培養した。600nmで測定した吸光度(OD600)=約1.0になるまで培養し、遠心分離で集菌し、懸濁用溶液(5.0mg/LのBA、3.0質量%のスクロース、1.0mg/Lの硝酸銀を添加したMS液体培地)でOD600=0.6になるように調整した。
準備したアグロバクテリウム懸濁液を用いた以外は実施例1と同様にして、感染工程、共存培養工程を行った。
実施例1と同様にして、除菌工程を行った。これにより目視にてアグロバクテリウムのコロニーは観察されなくなった。
除菌培地で培養したシュートを取り出し、当該シュートを選択培養培地(固体培地)に差し込み、遺伝子導入個体の選抜のために、培養温度28℃、12.5μmol/m2/sの照明の下、14時間の明時間という条件で9週間培養した(選択培養工程)。なお、1週間ごとに同じ組成の選択培養培地に移植する植え継ぎを行った。
選択培養培地は、MS培地に、ベンジルアデニン(BA)、硝酸銀、活性炭、スクロース、ハイグロマイシンをそれぞれ、5.0mg/L、1.0mg/L、0.05質量%、3.0質量%、5mg/L添加し、培地のpHを5.7に調整した後、アガーを0.75質量%となるように添加して、オートクレーブ(121℃、20分)で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
<誘導工程>
実施例1と同様にして行い、形質転換用の材料を得た。
GFP(緑色蛍光タンパク質)遺伝子、GUS(βグルクロニダーゼ)遺伝子及びCPT(シス型イソプレノイド鎖合成酵素)遺伝子と共に選択マーカー遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子を挿入したバイナリーベクターpCAMBIA1304(商品名、Marker Gene Technologies, Inc社製)を導入したアグロバクテリウム(アグロバクテリウム・ツメファシエンス;EHA105株)をYEB培地中で培養温度28℃、24時間、振とう培養した。600nmで測定した吸光度(OD600)=約1.0になるまで培養し、遠心分離で集菌し、懸濁用溶液(5.0mg/LのBA、3.0質量%のスクロース、1.0mg/Lの硝酸銀を添加したMS液体培地)でOD600=0.6になるように調整した。
準備したアグロバクテリウム懸濁液を用いた以外は実施例1と同様にして、感染工程、共存培養工程を行った。
共存培養させたシュートを取り出し、液体除菌培地(5.0mg/LのBA、3.0質量%のスクロース、1.0mg/Lの硝酸銀、1000mg/Lのセフォタキシムを添加したMS液体培地)に10分間浸漬し、洗浄した。この洗浄操作を5回繰り返した。
洗浄後、シュートを滅菌したろ紙上に置き、余分な水気を拭き取った。当該シュートを除菌培地(固体培地)に差し込み、培養温度28℃、12.5μmol/m2/sの照明の下、14時間の明時間という条件で4週間培養した(除菌工程)。なお、1週間ごとに同じ組成の除菌培地に移植する植え継ぎを行った。これにより目視にてアグロバクテリウムのコロニーは観察されなくなった。
除菌培地は、MS培地に、ベンジルアデニン(BA)、硝酸銀、スクロース、セフォタキシムをそれぞれ、5.0mg/L、1.0mg/L、3.0質量%、500mg/L添加し、培地のpHを5.8に調整した後、アガーを0.75質量%となるように添加して、オートクレーブ(121℃、20分)で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
除菌培地で培養したシュートを取り出し、当該シュートを選択培養培地(固体培地)に差し込み、遺伝子導入個体の選抜のために、培養温度28℃、12.5μmol/m2/sの照明の下、14時間の明時間という条件で10週間培養した(選択培養工程)。なお、2週間ごとに同じ組成の選択培養培地に移植する植え継ぎを行った。
選択培養培地は、MS培地に、ベンジルアデニン(BA)、硝酸銀、活性炭、スクロース、ハイグロマイシンをそれぞれ、5.0mg/L、1.0mg/L、0.05質量%、3.0質量%、5mg/L添加し、培地のpHを5.7に調整した後、アガーを0.75質量%となるように添加して、オートクレーブ(121℃、20分)で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
<誘導工程>
実施例1と同様にして行い、形質転換用の材料を得た。
比較例1と同様にして行い、アグロバクテリウム懸濁液を調製した。
準備したアグロバクテリウム懸濁液を用いた以外は実施例1と同様にして、感染工程、共存培養工程を行った。
共存培養させたシュートを取り出し、液体除菌培地(5.0mg/LのBA、3.0質量%のスクロース、1.0mg/Lの硝酸銀、1000mg/Lのセフォタキシムを添加したMS液体培地)に10分間浸漬し、洗浄した。この洗浄操作を8回繰り返した。
洗浄後、シュートを滅菌したろ紙上に置き、余分な水気を拭き取った。当該シュートを除菌培地(固体培地)に差し込み、培養温度28℃、12.5μmol/m2/sの照明の下、14時間の明時間という条件で4週間培養した(除菌工程)。なお、1週間ごとに同じ組成の除菌培地に移植する植え継ぎを行った。これにより目視にてアグロバクテリウムのコロニーは観察されなくなった。
除菌培地は、MS培地に、ベンジルアデニン(BA)、硝酸銀、スクロース、セフォタキシムをそれぞれ、5.0mg/L、1.0mg/L、3.0質量%、400mg/L添加し、培地のpHを5.8に調整した後、アガーを0.75質量%となるように添加して、オートクレーブ(121℃、20分)で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
除菌培地で培養したシュートを取り出し、当該シュートを選択培養培地(固体培地)に差し込み、遺伝子導入個体の選抜のために、培養温度28℃、12.5μmol/m2/sの照明の下、14時間の明時間という条件で10週間培養した(選択培養工程)。なお、2週間ごとに同じ組成の選択培養培地に移植する植え継ぎを行った。
選択培養培地は、MS培地に、ベンジルアデニン(BA)、硝酸銀、活性炭、スクロース、ハイグロマイシンをそれぞれ、5.0mg/L、1.0mg/L、0.05質量%、3.0質量%、50mg/L添加し、培地のpHを5.7に調整した後、アガーを0.75質量%となるように添加して、オートクレーブ(121℃、20分)で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
<誘導工程>
実施例1と同様にして行い、形質転換用の材料を得た。
比較例1と同様にして行い、アグロバクテリウム懸濁液を調製した。
準備したアグロバクテリウム懸濁液を用いた以外は実施例1と同様にして、感染工程、共存培養工程を行った。
共存培養させたシュートを取り出し、液体除菌培地(5.0mg/LのBA、3.0質量%のスクロース、1.0mg/Lの硝酸銀、400mg/Lのセフォタキシムを添加したMS液体培地)に10分間浸漬し、洗浄した。この洗浄操作を14回繰り返した。
洗浄後、シュートを滅菌したろ紙上に置き、余分な水気を拭き取った。当該シュートを除菌培地(固体培地)に差し込み、培養温度28℃、12.5μmol/m2/sの照明の下、14時間の明時間という条件で4週間培養した(除菌工程)。なお、1週間ごとに同じ組成の除菌培地に移植する植え継ぎを行った。これにより目視にてアグロバクテリウムのコロニーは観察されなくなった。
除菌培地は、MS培地に、ベンジルアデニン(BA)、硝酸銀、スクロース、セフォタキシムをそれぞれ、5.0mg/L、1.0mg/L、3.0質量%、200mg/L添加し、培地のpHを5.8に調整した後、アガーを0.75質量%となるように添加して、オートクレーブ(121℃、20分)で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
除菌培地で培養したシュートを取り出し、当該シュートを選択培養培地(固体培地)に差し込み、遺伝子導入個体の選抜のために、培養温度28℃、12.5μmol/m2/sの照明の下、14時間の明時間という条件で10週間培養した(選択培養工程)。なお、2週間ごとに同じ組成の選択培養培地に移植する植え継ぎを行った。
選択培養培地は、MS培地に、ベンジルアデニン(BA)、硝酸銀、活性炭、スクロース、ハイグロマイシンをそれぞれ、5.0mg/L、1.0mg/L、0.05質量%、3.0質量%、50mg/L添加し、培地のpHを5.7に調整した後、アガーを0.75質量%となるように添加して、オートクレーブ(121℃、20分)で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
Claims (13)
- ゴム産生植物由来の組織片を培養して培養組織片を得る培養工程、前記培養工程で得られた培養組織片を遺伝子コンストラクトで形質転換する形質転換工程、前記形質転換工程により形質転換された組織片から植物体を再生する再生工程を含み、
該形質転換工程は、前記培養組織片を遺伝子コンストラクトで形質転換されたアグロバクテリウム属菌とともに培養する感染工程、前記感染工程で得られた培養組織片を、カルバペネム系抗生物質を含む除菌培地で培養して、アグロバクテリウム属菌を除菌する除菌工程を含むことを特徴とする遺伝的に改変された植物体を作製するための形質転換植物体の製造方法。 - 前記カルバペネム系抗生物質が、メロペネムである請求項1記載の形質転換植物体の製造方法。
- 前記除菌培地中のカルバペネム系抗生物質の濃度が、10〜500mg/Lである請求項1又は2記載の形質転換植物体の製造方法。
- 前記遺伝子コンストラクトが、選択試薬に対する抵抗性を付与する選択マーカー遺伝子を含み、
前記製造方法が、更に、前記除菌工程で除菌された培養組織片を、前記選択試薬を含む選択培養培地で培養して、前記形質転換工程により形質転換された組織片を選択する選択培養工程を含む請求項1〜3のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法。 - 前記選択試薬が、パロモマイシンである請求項4記載の形質転換植物体の製造方法。
- 前記選択培養培地中の選択試薬の濃度が、25〜300mg/Lである請求項4又は5記載の形質転換植物体の製造方法。
- 前記培養組織片が、シュートである請求項1〜6のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法。
- 前記ゴム産生植物が、Hevea属に属する植物である請求項1〜7のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法。
- 前記培養工程後、更に、該培養工程により得られた培養組織片を採取し、分割した後、該分割された培養組織片を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養することで、培養組織片を得る増殖工程を行い、該増殖工程により得られた培養組織片を形質転換工程に供する請求項1〜8のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法。
- 前記遺伝子コンストラクトが、前記ゴム産生植物のゲノムと同種の遺伝物質を含む請求項1〜9のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法。
- 前記遺伝子コンストラクトが、前記ゴム産生植物のゲノムと異種の遺伝物質を含む請求項1〜9のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法。
- 前記再生工程が、前記形質転換された組織片を発根誘導培地で培養して発根させる発根工程を含む請求項1〜11のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法。
- 請求項1〜12のいずれかに記載の製造方法により作製された、遺伝的に改変された形質転換植物体。
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