DE60024607T2

DE60024607T2 - Pflanzentransformationsverfahren

Info

Publication number: DE60024607T2
Application number: DE60024607T
Authority: DE
Inventors: Thierry Risacher; Melanie Craze
Original assignee: Biogemma SAS
Current assignee: Biogemma SAS
Priority date: 1999-04-19
Filing date: 2000-04-19
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2020-04-20
Also published as: US7285705B1; BG106105A; EP1171621B1; CN1347457A; CZ20013744A3; DK1171621T3; CA2369428C; AU775949B2; US20110078827A1; ATE312183T1; CA2369428A1; US20080047036A1; EP1171621A1; US8115061B2; HUP0200926A2; JP2002541853A; AU5065000A; IL145686A0; AR023576A1; US7803988B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Pflanzen, insbesondere von monokotylen Pflanzen.
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Pflanzentransformation, insbesondere der Transformation von Getreide, genau gesagt der Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder einer beliebigen anderen Agrobacterium-Art (im folgenden mit „Agrobacterium" bezeichnet). Bis vor kurzem konnten zur Herstellung von transgenen Getreidepflanzen nur direkte Transformationsverfahren verwendet werden. Das gängigste Verfahren zu diesem Zweck ist der Beschuß mit der Genkanone. In jüngerer Zeit wurde in der Literatur berichtet, daß einige Getreidearten mit Agrobacterium genetisch modifiziert werden können (Hiei et al., Plant Mol. Biol. (1997) 35: 205–218); Ishida et al., Nature Biotechnol. (1996) 14: 745–750; Cheng et al., Plant Physiol. (1997) 115: 971–980; Tingay et al., The Plant Journal, 11: 1369–1376 (1997)).
Die in der Literatur angegebene Transformationseffizienz schwankt zwischen den unterschiedlichen Getreidearten beträchtlich. Typischerweise wurden für Mais niedrige Zahlenwerte genannt (Ishida, 1996), wobei dieses System stark genotypabhängig ist. Bei Reis wurde ebenfalls über eine niedrige Transformationseffizienz berichtet, und bei Weizen waren die Werte besonders niedrig. Bei all diesen Systemen wird Agrobacterium in vitro auf isoliertes Gewebe, das entweder gerade im Begriff der Entdifferenzierung ist oder bereits entdifferenziert ist, angewendet.
Wie oben beschrieben, wurde über Systeme für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Getreidearten bei Reis (Hiei, 1997), Mais (Ishida, 1996), Weizen (Cheng, 1997) und Gerste (Tingay, 1997) berichtet. Diesen Verfahren ist gemeinsam, daß Explantate, vorzugsweise unreife Embryonen oder davon stammende embryogene Kalli von einer Spenderpflanze isoliert und in vitro mit Agrobacterium inokuliert werden.
Hess und Mitarbeiter (Plant Science 72: 233–244, 1990) haben versucht, Weizen dadurch zu transformieren, daß Agrobacterium in die Ährchen des Weizens pipettiert wurde. Das Ziel der Autoren bei dieser Veröffentlichung bestand darin, einen Gentransfer mittels Pollentransformation zu erzielen und anschließend nach erfolgter normaler Befruchtung transformierten Samen zu gewinnen. Die Entfernung von Gewebe aus dem inokulierten Ährchen für die anschließende Selektion und Regeneration in Kultur wurde nicht versucht oder vorgeschlagen.
Andere Forscher haben über die Agrobacteriumvermittelte Transformation von Mais und Reis durch Inokulation des Wachstumskegels berichtet (Gould J (1991) Plant Physiol. 95: 426–434; Park SH (1996) Plant Molecular Biology 32: 1135–1158). Wiederum bestand die Zielsetzung darin, die Keimlinie zu transformieren und so transformierte Samen zu gewinnen. Dieses Regenerationsprogramm unterscheidet sich von demjenigen, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird: ein dezidiertes Ziel dieser Verfahren besteht nämlich darin, jegliches Pflanzenregenerationsverfahren, bei dem eine Entdifferenzierung des Gewebes und zufällige Regeneration durchlaufen wird, zu vermeiden.
In den US-Patenten 5,177,010 und 5,187,073 (Goldman, et al.) wird ein Verfahren zur Transformation von Getreide bzw. die Gramineae beschrieben, bei dem neu aufgelaufene Keimpflanzen verwundet und mit Agrobacterium inokuliert werden. Wiederum besteht die Zielsetzung dieses Verfahrens darin, in der Keimlingspflanze Keimlinienzellen zu transformieren, aus denen sich anschließend Reproduktionsorgane in der reifen Pflanze entwickeln, wodurch transformierter Pollen aus der Pflanze gewonnen werden kann.
Ein weiteres Verfahren, das dort, wo versucht wurde, die Transformation von Getreide zu entwickeln, untersucht wurde, ist die Agroinfektion. Das US-Patent Nr. 5,569,597 (Grimsley, et al.) beschreibt ein Verfahren zur Einbringung von Virus-DNA in Pflanzen, bei dem Agrobacterium verwendet wird. Im Anschluß an die Inokulation von Maiskeimlingspflanzen mit Agrobacterium, das in seiner T-DNA DNA des Maize Streak Virus aufweist, beobachteten die Erfinder das Auftreten von Krankheitssymptomen, was anzeigte, daß sich das Virus in den Pflanzenzellen vermehrte. Agrobacterium fungiert daher als Überträger zur Einbringung der Virus-DNA in die Pflanze, wonach das Virus eine systemische Infektion hervorrufen kann. Es besteht jedoch kein Nachweis dafür, daß die Agroinfektion zur Transformation der Pflanze, d.h. der Übertragung von Virus-DNA auf das pflanzliche Genom führt. Insofern als sich das Patent mit Transformation befaßt, geschieht dies wiederum mit der Absicht, auf Meristemgewebe abzuzielen, um die Transformation von Keimzellen zu erreichen.
EP 672 752 beschreibt das Baden von unreifen Embryonen in einer Agrobacterium-Suspension.
WO 98/56932 betrifft ein Transformationsverfahren mit Agrobacterium, wobei die Übertragung der DNA in einem mit Sauerstoff versorgten flüssigen Kulturmedium, in dem das Pflanzenmaterial eingetaucht ist, durchgeführt wird.
WO 99/14349 beschreibt eine Transformationsvorschrift für reife Rübsenpflanzen, wobei ein Internodienabschnitt des die Blüte tragenden Stängels einer reifen Rübsenpflanze herausseziert und später in ein mit A. tumefaciens inokuliertes Agar-Kulturmedium eingetaucht wird, wobei 2 Tage cokultiviert wird.
Bei dem vorliegenden neuen Verfahren wird das Zielgewebe mit Agrobacterium inokuliert und cokultiviert, wenn sich das Zielgewebe innerhalb seiner natürlichen Umwelt in der Pflanze befindet. Auf diese Weise entwickelt sich das Zielgewebe nach wie vor gemäß normalen physiologischen und zeitabhängigen Programmen. Das Zielgewebe wird dann aus seiner normalen Umwelt entfernt und einem Entdifferenzierungs- und Regenerationsprogramm unterzogen, um eine transgene Pflanze zu bilden. Vorteilhaft handelt es sich bei der transgenen Pflanze um eine fruchtbare transgene Pflanze.
Bei der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff „innerhalb seiner natürlichen Umwelt in der Pflanze" alle diejenigen Bedingungen, unter denen sich das Zielgewebe gemäß im wesentlichen normalen physiologischen und zeitlichen Programmen entwickeln kann. Zu diesen Bedingungen zählen, daß sich die Zielgewebe in vivo befinden, daß sich das Zielgewebe noch innerhalb, auf oder an der Pflanze befindet (zum Beispiel, daß es sich bei dem Zielgewebe um einen Embryo innerhalb eines Samenkorns auf einem abgeschnittenen Trieb handelt), oder Zielgewebe, das sich noch in der gleichen Zellumwelt befindet, in der es wäre, wenn es sich noch auf der Pflanze befände (zum Beispiel wenn es sich bei dem Zielgewebe um einen Embryo innerhalb eines isolierten Samenkorns oder eines Teils eines isolierten Samenkorns handelt). Zu weiteren Beispielen zählen unreife Blüten, die sich noch innerhalb der Blattscheide oder zumindest noch an der Pflanze befinden, und eine unreife Anthere, die sich noch in der ungeöffneten Blütenknospe befindet.
Unter Entdifferenzierung versteht man Zellverbände wie Kallus, die kein organisiertes Wachstum zeigen.
Zusätzlich dazu, daß sich das Zielgewebe in einer Umwelt befindet, die derjenigen an der Pflanze gleich ist, befindet sich das Agrobacterium in einer Umwelt, die stärker der natürlichen Umwelt des Bakteriums entspricht. Dementsprechend wird die Wirksamkeit des Agrobacteriums, das Zielgewebe zu transformieren, stärker sein, als wenn es, wie dies im Stand der Technik der Fall ist, auf ein isoliertes Gewebe in einer Petrischale einwirken soll.
Eine Folgeerscheinung dieser beiden Faktoren ist die Gelegenheit, zu einer höheren Transformationseffizienz des gewünschten Transgens in die Zielgewebe, und daher einer höheren Transformationseffizienz für die Herstellung von transgenen Pflanzen, zu gelangen.
In einem der ersten Schritte, der bei den meisten Transformationsvorschriften durchgeführt wird, wird das Zielgewebe verwundet. Im Fall von Agrobacterium kann dies aus zwei Gründen geschehen, nämlich um die Zellen, die einer Transformation zugänglich sein sollen und die regenerationsfähig sind, freizulegen (insbesondere bei Gramineen-Arten) und um das Agrobacterium zu veranlassen, seine T-DNA zu übertragen. Bei einem veröffentlichten Verfahren für Weizen, bei dem nicht verwundet wird, wird trotzdem noch ein Netzmittel (Silwet oder Pluronsäure) verwendet bzw. eine Vakuuminfiltration durchgeführt (WO 97/48814). Bei allen diesen Vorgängen wird zwangsweise das Gewebe in gewissem Maß geschädigt und die Regenerationsfähigkeit reduziert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Zielzellen in dem Zielgewebe so wenig wie möglich oder gar nicht geschädigt, und, obwohl ein Netzmittel verwendet werden kann, ist dies nicht unbedingt erforderlich. Obwohl während des Abgabevorgangs eine Grobschädigung von Gewebe auftreten kann, bleiben die regenerierbaren Zellen, die anschließend von Agrobacterium angesteuert werden können, größtenteils ungeschädigt und ihre Regenerationsfähigkeit wird nicht beeinflußt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Inokulation mit Agrobacterium dadurch durchgeführt, daß man eine Agrobacterium-Suspension mittels einer entsprechenden Abgabevorrichtung, wie einer Spritze, z.B. einer Hamilton-Spritze, an das Zielgewebe abgibt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein System für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Pflanzen, vorzugsweise Getreiden, entwickelt, das eine Infektion von Zielgewebe beinhaltet. Es hat sich erwiesen, daß dieses System hocheffizient und in hohem Ausmaß reproduzierbar ist.
Das Zielgewebe kann ein beliebiges Gewebe sein, das anschließend einer Gewebekulturphase unterzogen und eine Pflanze regeneriert werden kann. Besonders geeignete Zielgewebe beinhalten erfindungsgemäß einen Embryo, eine Blüte, ein Ovarium, eine Blattbasis oder eine Anthere. Embryo, Blüte, Ovarium oder Anthere sind vorzugsweise unreif.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, wo es sich bei dem Zielgewebe um einen Embryo handelt, ist das Zielgebiet für die Inokulation die Grenzschicht zwischen zwei Zellschichten, die miteinander in engem Kontakt stehen, d.h. die Oberfläche des sich entwickelnden Schildchens und dem benachbarten Stärkeparenchym des Endosperms. Agrobacterium muß an diese Zwischenschicht mit minimaler Schädigung des Zielgewebes abgegeben werden, so daß dessen Regenerationsfähigkeit nicht negativ beeinflußt wird. Aufgrund des existierenden Wissenstands konnte nicht vorhergesagt werden, daß solch eine effektive und reproduzierbare Technik geschaffen werden konnte.
Bei dem erfindungsgemäßen Transformationsverfahren wird das Zielgewebe mit Agrobacterium inokuliert und cokultiviert. Im Anschluß daran wird durch Entdifferenzierung und Regeneration des Zielgewebes eine transgene Pflanze regeneriert. Es wird also nach der Inokulation und Cokultivierung das Zielgewebe entdifferenzieren gelassen. Aus diesem entdifferenzierten Gewebe wird eine Pflanze nach fachbekannten Standardvorgehensweisen erzeugt. Nach der Inokulation und Cokultivierung wird das Zielgewebe vorzugsweise in eine für die erforderliche Entdifferenzierung und die anschließende Regeneration einer Pflanze besser geeignete Umgebung umgesetzt. So wird die Entdifferenzierung des Zielgewebes (nach der Inokulation und Kultivierung) zumindest teilweise in vitro durchgeführt. Die Regeneration der Pflanze wird ebenfalls vorzugsweise in vitro durchgeführt.
Ein überraschender Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens (zumindest bei unreifen Weizenembryonen) ist das häufige Auftreten von multiplen Transformationsereignissen von einem isolierten Explantat. Im Stand der Technik (Cheng et al., 1997) werden üblicherweise alle von dem gleichen Explantat stammenden Pflanzen als Klone eines gegebenen Ereignisses betrachtet. Bei dem vorliegenden Verfahren kann diese Annahme deshalb nicht getroffen werden, da ein Explantat häufig zu mehreren Pflanzen führt, die gemäß Southern-Blot-Analyse jeweils unterschiedliche Integrationsmuster aufweisen. Eine mögliche Erklärung hierfür, die nicht als erfindungsbegrenzend aufzufassen ist, könnte darin gesehen werden, daß die am stärksten regenerationsfähigen Zellen vor der Behandlung mit Agrobacterium nicht verwundet werden. Die Übertragungen von T-DNA treten mit höherer Wahrscheinlichkeit in Zellen auf, die noch zur Weiterentwicklung befähigt sind.
Ein Aspekt der Getreidetransformation, der häufig als kritisch gilt, ist die Induktion von Agrobacterium unter Mitverwendung eines Agrobacterium-virinduzierenden Mittels im Inokulations- und/oder Cokulturmedium (Hiei et al., 1997, Cheng et al., 1997). Zu solchen Induktionsmitteln zählen Acetosyringon, Vanillin, Ferulasäure, Catechin sowie Syringasäure. Die vorliegende Erfindung zeigt, daß Agrobacterium erfolgreich in Getreide transformiert wurde, ohne daß ein Induktionsmittel erforderlich war. Insbesondere wurde Agrobacterium erfolgreich ohne Induktionsmittel in Weizen transformiert, was zeigt, daß für eine effiziente T-DNA-Abgabe kein Induktionsmittel erforderlich war. Handelt es sich bei dem Zielgewebe der vorliegenden Erfindung um einen unreifen Embryo, und wird die natürliche pflanzliche Umgebung von einem unreifen Samen bereitgestellt, so wird postuliert, daß das Agrobacterium auf natürliche Weise von den Zellen des unreifen Embryos genügend stark induziert wird. Eine mögliche Erklärung hierfür, die nicht als erfindungsbeschränkend aufzufassen ist, könnte darin bestehen, daß die Zellen, die die „natürliche pflanzliche Umgebung" neben dem bzw. um das Zielgewebe bilden, für die Induktion von Agrobacterium verantwortlich sind. Es scheint, daß das Entfernen des Embryos aus seiner natürlichen pflanzlichen Umgebung dem Zielgewebe verfügbare Substanzen, die die Induktion von Agrobacterium möglicherweise unterstützen, entzieht.
Mit der vorliegenden Erfindung läßt sich ein gewünschtes Transgen oder eine heterologe Nukleinsäure in pflanzliches Gewebe einbringen und eine fruchtbare transgene Pflanze erhalten. Sie eignet sich insbesondere für die Herstellung von transgenen monokotylen Pflanzen, da bekannte Transformationsverfahren schwierigkeitsbehaftet sind und ihre Transformationseffizienz niedrig ist. Zu geeigneten monokotylen Pflanzen zählen Spargel, Zwiebel, Ölpalme, Yamswurzel, Banane, insbesondere jede Art aus der Familie der Gramineen, insbesondere Getreide (diejenigen Gräser, deren Früchte als Nahrung für den Menschen verwendet werden) wie Weizen, Gerste, Mais, Reis, Hafer, Roggen, Sorghumhirse und andere Hirsen.
Das Verfahren läßt sich auch auf dikotyle Pflanzen anwenden, insbesondere dort, wo ein Gewebekultursystem, das eine Kallusphase beinhaltet, existiert oder entwickelt werden kann. Zu geeigneten dikotylen Pflanzen zählen Raps, Erbse, Pfeffer/Paprika, Sojabohne, Sonnenblume, Zuckerrübe und Cucurbitaceen sowie Bäume wie Kautschuk, Fichten und Eukalyptus.
Erfindungsgemäß ist die heterologe Nukleinsäure eine Nukleinsäure, die nicht normalerweise in Agrobacterium-T-DNA oder der zu transformierenden Pflanze auftritt. Im vorliegenden Zusammenhang beinhaltet der Begriff heterologe Nukleinsäure alle synthetisch hergestellten und biologisch gewonnenen Gene, die mittels Gentechnik in eine Pflanze eingebracht werden können, darunter auch nichtpflanzliche Gene, modifizierte Gene, synthetische Gene, Genabschnitte sowie Gene von einer beliebigen Pflanzenart, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll. Die heterologe Nukleinsäure enthält vorzugsweise die Codierregion eines interessierenden Proteins oder Polypeptids oder Antisense-Moleküls zusammen mit flankierenden Regulationssequenzen, die seine Expression in der erhaltenen monokotylen Pflanze fördern.
Verfahren zur Konstruktion von heterologen Nukleinsäuren für die erfolgreiche Transformation von Pflanzen sind dem Fachmann gut bekannt, und die gleichen Konstruktionsverfahren können zur Herstellung der heterologen Nukleinsäuren, die sich hierfür eignen, verwendet werden. Weising et al. (1988) (Annual Rev. Genet. 22: 241) beschreiben geeignete Komponenten, zu denen Promoter, Polyadenylierungssequenzen, selektionierbare Markergene, Reportergene, Enhancer, Introns und dergleichen zählen, und geben geeignete Literaturstellen für deren Zusammensetzungen an. Geeignete Konstruktionsverfahren werden von Sambrook et al. (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) angegeben.
Im allgemeinen wird das Plasmid, das das nukleinsäureheterologe Gen umfaßt, relativ klein sein, d.h. weniger als ungefähr 30 kb groß sein, um die Anfälligkeit gegen physikalischen, chemischen oder enzymatischen Abbau, die bekannter Weise mit zunehmender Gengröße steigt, so gering wie möglich zu halten.
Zu den geeigneten transgenen oder heterologen Nukleinsäuren für die vorliegende Verwendung zählen alle diejenigen Nukleinsäuren, die ein positives Merkmal der erhaltenen transgenen Pflanze bilden oder verstärken. So kann die Nukleinsäure zum Beispiel für Proteine oder Antisense-RNA-Transkripte codieren, zur Verbesserung des Nährwerts, höhere Erträge, Schädlings- und Krankheitsresistenz und dergleichen fördern. Zu repräsentativen Nukleinsäuren zählen zum Beispiel ein bakterielles dap-A-Gen für mehr Lysin; Bt-Endotoxin-Gen oder Proteasehemmer für Insektenresistenz; Gene für lytische Peptide für Krankheitsresistenz, bakterielle oder pflanzliche EPSPS für Resistenz gegen Glyphosate-Herbizide ( US 4,940,835 , US 5,188,642 , US 4,971,908 , US 5,145,783 , US 5,312,910 , US 5,633,435 , US 5,627,061 , US 5,310,667 , WO 97/04103); bakterielle oder pflanzliche HPPD (WO 96/38567, WO 98/02562) für Resistenz gegen HPPD-Hemmer-Herbizide (also Diketone, Isoxazole usw.), bar- oder pat-Gene für Resistenz gegen Glufosinate, Chitinase oder Glucan-endo-1,3-B-glucosidase für fungizide Eigenschaften. Die Nukleinsäure kann auch eingeführt werden, um als genetisches Werkzeug zur Erzeugung von Mutanten und/oder zur Unterstützung der Identifikation, der genetischen Markierung bzw. der Isolation von Pflanzengenabschnitten zu dienen.
Gene, die sich für die Modifikation der Qualität eignen, sind zum Beispiel Gene für Stärkebiosyntheseenzyme oder stärkeabbauende Enzyme, z.B. Stärkensynthasen, Stärkenverzweigungsenzyme (zum Beispiel SBEI, SBEII, SSSI und DBEI aus Weizen, beschrieben in WO 99/14314), sowie Kornspeicherproteingene, z.B. Untereinheits-Proteine von Glutenin (siehe zum Beispiel WO 97/25419), Gliadinen und Hordeinen. Zur Erzeugung von Hybridsaatgut eignen sich auch künstliche Pollensterilitätsgene, z.B. Barnase (EP-A-0344029) und PR-Glucanase (WO 92/11379) unter der Kontrolle eines geeigneten Promoters.
Es können auch Gene zwecks der Erzeugung von pharmazeutisch aktiven Verbindungen in Pflanzen oder zur Verbesserung des Nährwerts von Pflanzen eingeführt werden („Biopharming" und funktionelle Nahrungsmittel).
Weitere Beispiele sind aus Weising, oben, ersichtlich.
Das Plasmid, das die heterologe Nukleinsäure, die in die Pflanze eingeführt werden soll, umfaßt, wird im allgemeinen entweder ein selektierbares Markergen oder ein Reportergen oder beide enthalten, um die Identifikation und Selektion der transformierten Zellen zu erleichtern. Der selektierbare Marker kann jedoch auch auf einem separaten Vektor getragen und in einem Cotransformationsvorgang verwendet werden. Sowohl selektierbare Marker als auch Reportergene können von entsprechenden Regulationssequenzen flankiert sein, um eine Expression in Pflanzen zu gestatten. Geeignete selektierbare Marker sind im Stand der Technik gut bekannt; dazu zählen zum Beispiel Gene für Antibiotika- und Herbizidresistenz. Diese Gene sind beispielhaft einzeln in Weising, et al., oben, beschrieben. Ein bevorzugtes selektierbares Markergen ist das sul-Gen, das Resistenz gegen Sulfonamide verleiht (EP-B-0369637). Zu den anderen fachbekannten selektierbaren Markergenen zählen die Sequenz, die für die Hygromycin-B-Phosphotransferase (hpt) codiert und die von E. coli abgeleitet werden kann, das Aminoglycosidphosphotransferasegen des Tn5-Transposons (AphII), das für Resistenz gegen die Antibiotika Kanamycin, Neomycin und G418 codiert, sowie diejenigen Gene, die für Resistenz bzw. Toleranz gegenüber Glyphosate, Bialaphos, Methotrexat, Imidazolinone, Sulfonylharnstoffe, Bromoxynil, Dalapon und dergleichen codieren. Selektierbare Markergene, die Herbizidtoleranz vermitteln, sind auch kommerziell in den entstandenen transformierten Pflanzen von Nutzen.
Reportergene, die für leicht in Assays zu testende Markerproteine codieren, sind in der Fachwelt gut bekannt. Im allgemeinen ist ein Reportergen ein Gen, das in dem Empfängerorganismus oder -gewebe nicht vorliegt bzw. von diesem nicht exprimiert wird und das für ein Protein codiert, dessen Expression sich in einer beliebigen, leicht nachweisbaren Eigenschaft ausprägt, z.B. phänotypische Veränderung oder Enzymaktivität. Beispiele für solche Gene finden sich in Weising et al., oben. Zu bevorzugten Genen zählen das Gen für Chloramphenicolacetyltransferase (cat) aus dem E. coli.-Tn9, das Betagluronidase (gus)-Gen des uidA-Locus von E. coli, das Gen für das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequoria victoria, und das Luciferase (luc)-Gen aus dem Glühwürmchen Photinus pyralis.
Zu den Regulationssequenzen die sich hierfür eignen, zählen beliebige konstitutive, induzierbare, gewebe- oder organspezifische oder entwicklungsstadiumspezifische Promoter, die in der jeweiligen Pflanzenzelle exprimiert werden können. Solche geeigneten Promoter sind bei Weising et al., oben, beschrieben. Es folgt nun eine teilweise repräsentative Aufzählung von Promotern, die sich hierfür eignen: Regulationssequenzen der T-DNA von A. tumefaciens, darunter Mannopinsynthase, Nopalinsynthase und Octopinsynthase; der Alkoholdehydrogenasepromoter aus Mais; lichtinduzierbare Promoter wie das Gen für die kleine Untereinheit der Ribulosebisphosphatcarboxylase aus unterschiedlichen Arten und der Promoter des Gens für das Chlorophyll-a/b-Hauptbindungsprotein; Histonpromoter ( EP 507 698 ), Actinpromoter; der Ubiquitin-1-Promoter aus Mais (Christensen et al. (1996) Transgenic Res. 5: 213); die 35S- und 19S-Promoter des Blumenkohlmosaikvirus; entwicklungsregulierte Promoter wie die „Waxy"-, Zein- oder „Bronze"-Promoter aus Mais; sowie synthetische oder andere natürliche Promoter, die entweder induzierbar oder konstitutiv sind, darunter solche Promoter, die eine organspezifische Expression oder eine Expression zu einem bestimmten Entwicklungsstadium bzw. zu bestimmten Entwicklungsstadien der Pflanze aufweisen, wie der in US 5,635,618 beschriebene alpha-Tubulin-Promoter.
Weitere Elemente wie Introns, Enhancer, Polyadenylierungssequenzen und dergleichen können ebenfalls in der Nukleinsäure vorliegen. Diese Elemente müssen mit dem Rest der Genkonstrukte kompatibel sein. Solche Elemente können für die Funktion des Gens erforderlich sein oder auch nicht, obwohl sie durch Beeinflussung der Transkription, Stabilität der mRNA oder dergleichen zu einer besseren Expression bzw. einem besseren Funktionieren des Gens führen können. Solche Elemente können gewünschtenfalls in der Nukleinsäure mitverwendet werden, um eine optimale Leistung des transformierenden Gens in der Pflanze zu erzielen. So kann z.B. das erste AdhlS-Intron aus Mais zwischen dem Promoter und der Codiersequenz einer bestimmten heterologen Nukleinsäure plaziert werden. Von diesem Intron ist bekannt, daß es, wenn es in einem Genkonstrukt mitverwendet wird, allgemein die Expression eines Proteins in Maiszellen verstärkt. (Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183). Zu weiteren geeigneten Introns zählen das erste Intron des shrunken-1-Gens von Mais (Maas et al. (1991) Plant. Mol. Biol. 16: 199); das erste Intron des Rizinuskatalase (cat-1)-Gens (Ohta et al. (1990) Plant Cell Physiol. 31: 805); das zweite Intron der Kartoffelkatalase des ST-LSI-Gens (Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220: 245); das DSV-Intron des Gelbverzwergungsvirus des Tabaks (Morris et al. (1992) Virology 187: 633; das Actin-1 (act-1)-Intron aus Reis (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163); und das Intron 1 der Triosephosphatisomerase (TPI) (Snowden et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31: 689). Eine ausreichende Expression für ein zufriedenstellendes Funktionieren eines selektierbaren Markers kann jedoch häufig ohne Intron erzielt werden. (Battraw et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 527).
Das Plasmid, das die heterologe Nukleinsäure umfaßt, kann auch Sequenzen, die für ein Transitpeptid codieren, umfassen, um das von dem heterologen Gen codierte Protein in die Chloroplasten der Pflanzenzellen zu leiten. Solche Transitpeptide sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt; dazu können sowohl einzelne Transitpeptide als auch multiple Transitpeptide, die durch das Kombinieren von Sequenzen, die für mindestens zwei Transitpeptide codieren, erhalten werden. Ein bevorzugtes Transitpeptid ist das in US 5,635,618 beschriebene „Optimized Transit Peptide", das in Transkriptionsrichtung eine erste DNA-Sequenz, die für ein erstes Chloroplastentransitpeptid codiert, eine zweite DNA-Sequenz, die für eine N-terminale Domäne eines reifen Proteins, das natürlicherweise in die Chloroplasten geleitet wird, codiert, sowie eine dritte DNA-Sequenz, die für ein zweites Chloroplastentransitpeptid codiert, umfaßt.
Um zu bestimmen, ob sich eine bestimmte Kombination aus heterologer Nukleinsäure und Empfängerpflanzenzellen für die vorliegende Verwendung eignet, kann das Plasmid ein Reportergen beinhalten. Zu einem geeigneten Zeitpunkt, nachdem die heterologe Nukleinsäure in die Empfängerzellen eingebracht worden ist, kann dann ein Assay auf Expression des Reportergens durchgeführt werden. Bei einem solchen bevorzugten Assay wird das von Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6: 3901 beschriebene beta-Glucuronidase (gus)-Gen aus E. coli verwendet.
Eine erfindungsgemäße Verwendung ist die Herstellung einer fruchtbaren transgenen Pflanze, die eine oder mehrere interessierende Transgene umfaßt. Die Samen oder sonstiges Vermehrungsmaterial von solch einer Pflanze können zur Herstellung von Folgegenerationen von transgenen Pflanzen (darunter auch Nachkommenschaft), die das eine Transgen bzw. die mehreren Transgene von dem ursprünglichen Verfahren umfassen, verwendet werden. Solche Folgegenerationen von Pflanzen (darunter auch deren Nachkommenschaft) und Vermehrungsmaterial, darunter auch Samen, können ebenfalls ausgehend von der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird die Verwendung von Agrobacterium bei einem Transformationsverfahren, das die Inokulation und Cokultivierung eines Zielgewebes mit Agrobacterium zu einem Zeitpunkt, zu dem sich das Zielgewebe in seiner natürlichen pflanzlichen Umgebung befindet, und die anschließende Erzeugung von entdifferenziertem Gewebe aus dem Zielgewebe umfaßt, bereitgestellt.
Das entdifferenzierte Gewebe kann gewünschtenfalls zu einer transgenen Pflanze regeneriert werden. Der zweite Aspekt der Erfindung ist jedoch auch in Situationen vorteilhaft, in denen das entdifferenzierte Gewebe (als solches, oder eine aus ihm erzeugte beliebige Teilpflanze) von Nutzen ist. Zu solchen Situationen zählen die Aufbewahrung des entdifferenzierten Gewebes für einen gewissen Zeitraum vor der Weiterverwendung, und die Gewinnung von nützlichen Pflanzenprodukten, wie z.B. von sekundären pflanzlichen Stoffwechselprodukten aus der Zellkultur. Alle oben beschriebenen bevorzugten Merkmale des ersten Aspekts der Erfindung gelten auch für den zweiten.
Gemäß dem ersten und dem zweiten Aspekt der Erfindung kann das erhaltene transformierte entdifferenzierte Gewebe regeneriert werden. Es kann zum Beispiel zu Kallusgewebe, ganzen Pflanzen, fruchtbaren ganzen Pflanzen, Wurzeln, Sprossen, Saatgut und sonstigem Vermehrungsmaterial regeneriert werden.
In einem dritten Aspekt der Erfindung wird die Verwendung von Agrobacterium bei einem Transformationsverfahren, das die Inokulation und Cokultivierung eines Zielgewebes mit Agrobacterium zu einem Zeitpunkt, zu dem sich das Zielgewebe in seiner natürlichen pflanzlichen Umgebung befindet, und die anschließende Erzeugung von transgenem Pflanzenmaterial mittels Entdifferenzierung und gewünschtenfalls Regeneration des Zielgewebes umfaßt, bereitgestellt.
Bei dem gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung erhaltenen transgenen Pflanzenmaterial kann es sich um Kallus, eine ganze (vorzugsweise fruchtbare) Pflanze, Wurzeln oder Sprosse, Saatgut oder sonstiges Vermehrungsmaterial handeln.
Alle bevorzugten Merkmale von Aspekt 1 und Aspekt 2 gelten auch für den dritten Aspekt.
Die Erfindung führt zu transformiertem Pflanzengewebe, das nach einem Verfahren gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung erhalten wird. Zu solch transformiertem Pflanzengewebe zählen Kallus, Wurzelmaterial, Sproßmaterial, ganze Pflanzen, Saatgut oder sonstiges Vermehrungsmaterial. Bei den Pflanzen handelt es sich besonders bevorzugt um fruchtbare Pflanzen.
Es gibt verschiedene Gründe für den Erfolg der vorliegenden Erfindung und dafür, warum das Zielgewebe einer Transformation mittels Agrobacterium stärker zugänglich ist, während es sich noch in einer natürlichen pflanzlichen Umgebung befindet. Ohne die Erfindung auf irgendeine Weise einschränken zu wollen, sollen nun Gründe für den Erfolg der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen werden:

1. In ihrer natürlichen pflanzlichen Umgebung teilen sich die Zielzellen rasch, vermutlich rascher als in Gewebekultur.
2. Dadurch, daß eine Behandlung (also Inokulation und Cokultivierung) nach der Isolation vermieden wird, werden die Fähigkeit zu Kallusbildung und auch die Regenerationsfähigkeit erhöht.
3. Es treten (im Vergleich zum Stand der Technik) andere Zellen des sich entwickelnden Zielgewebes mit Agrobacterium in Kontakt, insbesondere solche, die unter der Epidermis liegen können und die als stärker regenerationsfähig erachtet werden.
4. Fehlende Verwundung (ein Erfordernis für die meisten anderen Vorschriften bei der Transformation von Getreide) befähigt beinahe alle Zellen, die transformiert worden sind, zu einer anschließenden Entwicklung.
5. Durch Vereinigen der beiden Schritte Inokulation und Cokultivierung wird der Streß, dem das Zielgewebe üblicherweise durch diese zwei getrennten Gewebekulturschritte ausgesetzt wird, reduziert.
6. Die natürliche Umwelt des Samens ist günstiger für eine normale Zellentwicklung in Gegenwart von Agrobacterium als die Entfernung in eine Gewebekulturumgebung.
7. Oberflächenzellen sind in jedem Zielgewebe weicher und stellen eine geringere Barriere für Agrobacterium dar, als wenn sie einmal der Luft ausgesetzt worden sind.

Das Transformationsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann nach der folgenden „allgemeinen" Methodik beschrieben werden. Ein genaueres Verfahren wird in den Beispielen angegeben.
Die folgende allgemeine Methodik, die beschrieben wird, wird auf die Embryoinokulation (im Samen) angewandt. Dem Fachmann wird klar, daß das allgemeine Verfahren für andere Zielgewebe abgewandelt werden kann.
Herstellung des Konstrukts und seine Übertragung auf Agrobacterium
Binäre Vektoren, superbinäre Vektoren, pGreen-Vektoren oder Cointegrationsvektoren, die entsprechende Gene und selektierbare Marker und/oder Reportergene enthalten, werden nach einer der verschiedenen vorhandenen Verfahren, z.B. Dreiwegkreuzungen oder Elektroporation in Agrobacterium übertragen. Bei dem verwendeten Agrobacterium kann es sich um einen beliebigen standardmäßig verwendeten, üblicherweise entwaffneten, Stamm von Agrobacterium tumefaciens oder rhizogenes handeln, darunter LBA4404 (Hoekma et al., Nature (1983) 303: 179–180) EHA101 (Hood et al., J Bacteriol. (1986) 168: 1291–1301 entwaffneter C58, zum Beispiel pMP90 (Koncz und Schell, M.G.G. (1986) 204, 383–396 LBA4404, enthaltend pTOK233 (Hiei et al., Plant J (1994) 6: 271–282), was jedoch keine Einschränkung darstellen soll.
Vorbereitung von Agrobacterium für die Versuche
Agrobacterium wird in oder auf Medien mit entsprechenden selektiven Antibiotika 2 oder 3 Tage lang bei 25–30°C inkubiert. Die Bakterien werden dann gewonnen und wiederum in TSIM1 (MS-Medium mit 100 mg/l myo-Inosit, 10 g/l Glucose, 50 mg/l MES-Puffer pH 5,5) oder einem anderen ähnlichen Kulturmedium, das auch Acetosyringon enthalten kann, suspendiert. Ein Netzmittel, z.B. Pluronsäure F68, kann ebenfalls mitverwendet werden, und es können gegebenenfalls andere Induktionsmittel für das Agrobacterium verwendet werden, z.B. Opine oder andere sekundäre Pflanzenmetabolite.
Vorbereitung des Pflanzenmaterials
Bei dem Ausgangsmaterial für diese Vorschrift handelt es sich um die Infloreszenz einer monokotylen Pflanze (üblicherweise einer Gramineenpflanze), und zwar eine Weile nach der Blüte. Alle Inokulations- und Cokultivierungsstadien können an der Infloreszenz, während sie sich noch in der intakten Pflanze befindet, durchgeführt werden. Aus Gründen der Arbeitserleichterung und Nichtverbreitung wird bevorzugt, daß diejenigen Pflanzenteile, die die Infloreszenz tragen, entfernt werden. Die Infloreszenz bleibt trotzdem in ihrer natürlichen pflanzlichen Umgebung, auch wenn der sie tragende Pflanzenteil von der Pflanze entfernt wird.
Zum Beispiel werden Weizen-Bestockungstriebe oder Bestockungstriebe von einem beliebigen sonstigen Getreide ungefähr 8–10 Tage nach der Blüte aus im Glashaus oder im Conviron (Klimaraum) gezogenen Pflanzen geerntet. Die unreifen Samen werden dann, egal wie, freigelegt, jedoch an der Pflanze belassen. So werden zum Beispiel beim Weizen die Hüllspelze jedes Ährchens und die Deckspelze der ersten beiden Einzelblüten vorsichtig entfernt und so der unreife Samen freigelegt. Üblicherweise werden nur diese beiden Samen in jedem Ährchen freigelegt. Auf diese Weise wird entlang der ganzen Infloreszenz vorgegangen.
Inokulation des unreifen Samens
Der unreife Samen wird mit der Agrobacterium-Suspension ungefähr auf der Höhe der Grenzschicht zwischen Schildchen und Endosperm inokuliert, wobei man ein beliebiges Gerät für die Abgabe verwendet, z.B. eine Hamilton-Spritze. Das Volumen der abgegebenen Bakteriensuspension beträgt üblicherweise 1 μl, kann jedoch zum Beispiel in Abhängigkeit von der Samengröße schwanken.
Die Bestockungstriebe werden dann zum Beispiel in Wasser oder in eine Nährlösung gestellt (und gegebenenfalls mit einem Plastikbeutel bedeckt, um ein Austrocknen des Samens zu verhindern) und 2–5 Tage (vorzugsweise 2 oder 3 Tage) in einen Lichtbrutschrank gestellt. Die Temperatur des Brutschranks kann in Abhängigkeit von der Getreideart schwanken, beträgt jedoch üblicherweise im Bereich von 20–25°C.
Isolation und Kultur der Embryonen
Nach der Inokulation werden die unreifen Samen entfernt und oberflächensterilisiert. Die unreifen Embryonen werden isoliert und auf ein geeignetes Kallusbildungsmedium gelegt, wie dies beispielhaft von Weeks et al., Plant Physiol., 102: 1077–1084, 1993; Vasil et al., Biotech. 11: 1553–1558, 1993; Ishida et al., 1996 beschrieben ist. Die Embryonen werden dann durch ein entsprechendes Gewebekulturverfahren passagiert, was gegebenenfalls auch einen Selektionsschritt beinhaltet, der zu der Regeneration einer transgenen Pflanze, vorzugsweise einer transgenen Pflanze führt.
Die vorliegende Erfindung soll nun anhand der folgenden Beispiele erläutert, jedoch nicht eingeschränkt, werden.
In den Beispielen wird auf die folgenden Abbildungen Bezug genommen:
1, in der eine Klonierstrategie für pSCVsulugi dargestellt ist;
2, in der eine Plasmidkarte von pSCVsulugi dargestellt ist;
3, die die transiente GUS-Expression in einem unreifen Embryo, der 4 Tage nach in-vivo-Inokulation und Cokultur histochemisch gefärbt wurde und blaue Flecken und „Striche" aufweist, zeigt;
4, die Areale von einem GUS-exprimierenden Kallus, der einen Monat nach in-vivo-Inokulation und Cokultur histochemisch gefärbt wurde und große Areale mit dunkelblauer Färbung aufweist, zeigt;
5, die einen Ausschnitt aus 4 zeigt, nämlich ein dunkelblau gefärbtes, stark abgegrenztes Kallusareal mit Regenerationspotential;
6, die eine Plasmidkarte von pSB1lSulugi zeigt;
7, die eine Plasmidkarte von pSCV1.2GI. zeigt;
8, die die transiente GUS-Expression in unreifen Kotyledonen von Sojabohne zeigt.
Beispiel 1: Transformation von Weizen nach der Sameninokulationsmethode – transiente Expression und Bildung von transformiertem Kallus
Herstellung der Konstrukte
Die folgenden Konstrukte wurden zwecks Transformation hergestellt (1): Das 4175 Bp große HindIII-Fragmet aus pAHC25 (Christensen et al., Plant Mol. Biol. (1992) 18: 675–689) wurde in mit HindIII geschnittenes pIC19H (Marsh et al, Gene (1984) 32: 481–485) eingeführt (wodurch man zu dem Plasmid pAAA gelangte). Das BamHI, SstI-GUS-Intronfragment aus pUC-Top10-GUS INT (Weinmann et al., Plant J. (1994) 5: 559–569) ersetzt das BamHI, SstI-GUS-Fragment aus pAAA, wodurch man pBBB erhält. Das XhoI, XbaI-Fragment enthaltend Sul^R aus pWP258 (beschrieben in der Patentanmeldung WO 98/49316) wird in das mit SalI, XbaI geschnittene pSCV1 (Firek et al., Plant Mol. Biol. (1993) 22: 129–142) eingeführt, wodurch pEEE erzeugt wird. Das HindIII-pUbi-GUSint-Fragment aus pBBB wird in mit HindIII geschnittenes pEEE kloniert, wodurch pSCVSulugi entsteht (siehe 2).
Dieses Konstrukt wurde in den entwaffneten supervirulenten Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA101, der pEHA101 (Hood et al., J Bacteriol. (1986) 168: 1291–1301) enthält, mittels Elektroporation und anschließende Selektion auf 50 mg/l Kanamycin und 70 mg/l Gentamycin eingeführt.
Vorbereitung von Agrobacterium für die Versuche
Agrobacterium wurde auf verfestigtem YEP-Medium mit 20 mg/l Kanamycinsulfat 2 Tage lang bei 27°C inkubiert. Die Bakterien wurden anschließend geerntet und in TSIM1 (MS-Medium mit 100 mg/l myo-Inosit, 10 g/l Glucose, 50 mg/l MES-Puffer pH 5,5), das 400 μM Acetosyringon enthielt, auf eine optische Dichte von 2,4 bei 650 nm resuspendiert.
Vorbereitung des Pflanzenmaterials
Weizen-Bestockungstriebe von NB1 (eine von Nickerson Seeds Ltd, Rothwell, Lincs., bezogene Sommerweizenart) wurden ungefähr 14 Tage nach der Blüte (Länge der Embryonen ungefähr 1 mm) so von im Glashaus gezogenen Pflanzen geerntet, daß 50 cm Stengel des Bestockungstriebs mitgeerntet wurden (22/15°C Tag/Nacht-Temperatur mit Zusatzlicht für einen 16-Stunden-Tag). Alle Blätter außer dem Fahnenblatt wurden dann entfernt und das Fahnenblatt wurde gereinigt, um kontaminierende Pilzsporen zu entfernen. Die Hüllspelze von jedem Ährchen und die Deckspelze der ersten zwei Einzelblüten wurden dann vorsichtig entfernt, um den unreifen Samen freizulegen. Im allgemeinen wurden nur diese beiden Samen pro Ährchen freigelegt. Auf diese Art und Weise wurde entlang der gesamten Infloreszenz vorgegangen. Die Ähren wurden dann als kurze Oberflächensterilisation mit 70% IMS besprüht.
Inokulation der Bestockungstriebe
Der unreife Samen wurde mit der Agrobacterium-Suspension (1 μl) ungefähr auf der Höhe der Grenzschicht zwischen Schildchen und Endosperm mit einer 10-μl-Hamilton-Spritze so inokuliert, daß alle freigelegten Samen inokuliert wurden. Die Bestockungstriebe wurden dann in Wasser gestellt, mit einem durchsichtigen Plastikbeutel bedeckt, um ein Austrocknen der Samen zu verhindern, und 3 Tage bei 23°C, einem 16-Std.-Tag und 45 μEm^–2s^–1PAR in einen Lichtbrutschrank gestellt.
Isolation und Kultur der Embryonen
Nach 3-tägiger Cokultivierung wurden die inokulierten unreifen Samen entfernt und oberflächensterilisiert (30 Sekunden in 70%igem Ethanol, dann 20 Minuten in 20% Domestos, anschließend gründliches Waschen mit sterilem destilliertem Wasser). Die unreifen Embryonen (insgesamt 136) wurden aseptisch isoliert und mit dem Schildchen nach oben auf W3-Medium (Beschreibung in der Patentanmeldung WO 98/49316) mit einem Zusatz von 150 mg/l Timentin (W3T) gelegt (20 Embryonen pro Platte). Die Kulturen wurden bei 25°C ins Licht gestellt (16-Stunden-Tag, 80 μEm^–2s^–1PAR).
Nach 3-tägiger Kultur auf W3T wurden 50 Embryonen entfernt und 16 Stunden lang bei 37°C in X-gluc-Lösung (Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. (1987) 5: 386–405) gelegt, um die GUS-Expression zu beurteilen. Die Entwicklung der Embryonalachse auf den verbleibenden Embryonen wurde 5 Tage nach der Isolation beurteilt, und die Achse wurde gegebenenfalls entfernt, um die Kallusbildung zu verbessern. Acht Tage nach der Isolation wurden weitere 31 Embryonen entfernt und wie oben gefärbt.
Die verbleibenden 55 Embryonen wurden 4 Wochen lang auf W3T erhalten, wobei sie 2 Wochen nach der Isolation auf frisches Medium umgesetzt wurden.
Ein Monat nach der Isolation der Embryonen wurde der verbleibende von Embryonen abstammende Kallus auf Embryogenität beurteilt und für die GUS-Expression angefärbt.
Ergebnisse
Histochemische Färbung 4 Tage nach der Inokulation Manche der isolierten Embryonen wiesen aufgrund des Inokulationsvorgangs Einstechschäden auf. Diese waren nur sehr selten mit einer histochemisch bestimmten GUS-Expression assoziiert.
Die GUS-Expression in diesen Embryonen war in drei Formen ausgeprägt:

1. Normale blaue GUS-Flecken, wie sie in der Fachwelt dokumentiert sind; siehe 3
2. Kleine blaue Striche, die mehrere miteinander verbundene Zellen umfaßten, die alle anscheinend im gleichen Ausmaß GUS exprimierten; siehe 3
3. Große dunkelblau gefärbte Blöcke am Schildchen und an der Embryonalachse, die als Flecken oder Striche begannen und sich rasch über große Gewebeareale ausbreiteten, so daß eine quantitative Auswertung unmöglich war.

Die Kombination der Boniturwerte von 1. und 2. ergab einen Durchschnitt von 6 Flecken pro Embryo innerhalb einer Variationsbreite von 0–64 Flecken.
Kontrollembryonen (30), die von Inokulationen mit EHA101, das nur pEHA 101 und keinen Vektorplasmidstamm trug, stammten, erzeugten keine Blaufärbung irgendwelcher Art mit X-gluc. Bei EHA101, das SCVsulugi enthielt, wurde ebenfalls keine Färbung beobachtet.
Histochemische Färbung 14 Tage nach der Inokulation Das Färbemuster in diesen Embryonen war zu demjenigen, das nach 4 Tagen zu beobachten war, leicht unterschiedlich. Die Färbung lag üblicherweise in Form von kleinen Flecken oder manchmal kleinen Zonen vor. Die durchschnittliche Anzahl Flecken/Zonen pro Embryo betrug 3, mit einer Variationsbreite von 0–25. Der Embryo mit der maximalen Anzahl von Färbeereignissen wies auch die weniger häufig beobachteten blauen „Zonen" auf dem Schildchengewebe verstärkt auf.
Kallusentwicklung
Nach 4-wöchigem Wachstum wies Kallus, der sich von den inokulierten Embryonen ableitete, eine starke Ähnlichkeit mit Kontrollkallus, der von nicht-inokulierten Embryonen stammte, auf. Das Vorhandensein der Bakterien schien keine wesentlichen negativen Auswirkungen auf die Embryogenität des Kallus, der von den inokulierten Embryonen abstammte, zu haben.
Histochemische Färbung einen Monat nach der Inokulation Von den verbleibenden 55 Kalli, die von unreifen Embryonen abstammten und die mit x-gluc gefärbt worden waren, traten bei 16 Anzeichen einer GUS-Expression in Form von dunkelgefärbten blauen Zellen auf. Bei 6 von diesen Kalli wurden ziemlich große dunkelblaue Färbungsregionen beobachtet, die einen Durchmesser von bis zu 1 mm aufwiesen und als scharfbegrenzte Areale erschienen; siehe 4. Drei von den blauen Regionen wiesen eine dreidimensionale Struktur in Form von Zellvorsprüngen von der Kallusoberfläche auf (wie in 5 dargestellt) und wurden als embryogener Kallus, der eine gute Regenerationsfähigkeit aufweist, eingestuft.
Die Gewinnung von drei stabilen Integrationsereignissen mit guter Regenerationsfähigkeit in diesem Versuch legt nahe, daß dieses Verfahren eine hohe Transformationseffizienz aufweist.
Beispiel 2: Transformation von Weizen mit dem Sameninokulationsverfahren – Transformation und Regeneration von transgenen Pflanzen
Man ging wie im Beispiel 1 vor, nur daß 187 Embryonen inokuliert und isoliert wurden und einem Selektionsschritt unterzogen wurden.
Selektion von transformiertem Kallus
Nach 12-tägiger Kultur auf W3T wurden die embryogenen Kalli auf W3-Medium mit 2 mg/l Asulam und 150 mg/l Timentin (W32AT) umgesetzt. Die Kalli wurden auf diesem Medium noch 2 Wochen erhalten, und anschließend wurde jeder Kallus in 2-mm-Stücke zerteilt und neu auf W32AT ausplattiert.
Nach weiteren 2 Wochen Kultur wurden alle Gewebe auf Entwicklung von embryogenem Kallus beurteilt: jeder Kallus, bei dem Zeichen von Weiterentwicklung nach 4-wöchiger Selektion bestanden, wurde auf Regenerationsmedium umgesetzt (RMT-MS mit 40 g/l Maltose und 150 mg/l Timentin, pH 5,8, verfestigt mit 6 g/l Agarose, Sigma Typ I). Auf diesem Medium wurden innerhalb von vier Wochen Sprosse regeneriert und anschließend für die Sproßverlängerung und Wurzelung auf MS30 mit 150 mg/l Timentin umgesetzt.
Ergebnisse
Die Transformation wurde nach einer oder mehreren der folgenden Methoden bestimmt:

a) Histochemische GUS-Färbung (Jefferson, 1987) an zumindest den Wurzeln und Blättern
b) PCR-Analyse auf das sul-Gen. Die PCR-Analyse wurde an genomischer DNA durchgeführt, die nach der von Stacey und Isaac (Methods in Molecular Biology, Bd. 28: Protocols for nuleic acid analysis by nonradioactive probes [Protokolle für die Nukleinsäureanalyse mit nichtradioaktiven Sonden], 9–15, Humana Press Inc., Totawa, NJ (1994)) beschriebenen Miniprep-Methode aus 1–2 cm² großem frischem Blattmaterial extrahiert worden war. Die PCR-Reaktionen wurden mit Primern durchgeführt, die für die Amplifikation eines 380 Bp großen Sul-Fragments (5' TTGTGCGGTTCTTCGAGGCG 3' und 5' TGCGCTTCGCAGATCTCCAG 3' entwickelt worden waren. Die Reaktionsbedingungen waren folgendermaßen: „Hot Start" (94°C, 3 min), danach 30 Zyklen mit Denaturierung (95°C, 30 s), Annealing (60°C, 30 s), Verlängerung (73°C, 2 min), sowie anschließend ein Zyklus bei 73°C (5 min), dann Halten bei 24°C.
c) Southern Analyse. Die Southern-Analyse wurde mit einer DNA aus einer Vollextraktion (9 ml) von lyophilisiertem gemahlenem Gewebe (Stacey und Isaac, 1994) durchgeführt. Die DNA-Proben wurden auf 0,2 mg/ml eingestellt und mit den Restriktionsenzymen HindIII, EcoRI und KpnI verdaut. Der Verdau mit den Restriktionsenzymen, die Gelelektrophorese und das Vakuum-Blotting wurden wie von Stacey und Isaac (1994) beschrieben durchgeführt. Mit Digoxygenin markierte Sul- und GUS-Sonden wurden mittels PCR nach dem Verfahren von McCreery und Helentjaris (Methods in Molecular Biology, Bd. 28: Protocols for nuleic acid analysis by nonradioactive probes [Protokolle für die Nukleinsäureanalyse mit nichtradioaktiven Sonden], 67–71, Humana Press Inc., Totawa, NJ (1994)) hergestellt. Die Hybridisierung der Sonden an den Southern-Blot und ihr Nachweis mittels Chemilumineszenz wurden nach dem Verfahren von McCreery und Helentjaris (Methods in Molecular Biology, Bd. 28: Protocols for nuleic acid analysis by nonradioactive probes [Protokolle für die Nukleinsäureanalyse mit nichtradioaktiven Sonden], 107–112, Humana Press Inc., Totawa, NJ (1994)) durchgeführt.
d) Spaltungsanalyse der T1-Generation Die Analyse wurde durch histochemische Färbung an gekeimten Keimlingen durchgeführt.

2 Pflanzen, die zwei unterschiedliche Transformationsereignisse (Effizienz: 1,1%) darstellten, wurden regeneriert, und ihre Blatt- und Wurzelproben zeigten gemäß histochemischer Färbung eine starke GUS-Expression. Daß die Transformation stabil war, wurde durch Southern-Analyse und Beurteilung der Genaufspaltung in der Nachkommenschaft bestätigt.
In einem anderen Versuch wurden 116 Embryonen inokuliert und 4 verschiedene GUS-positive transgene Linien regeneriert.
Die erhaltenen Effizienzwerte (1,1 bzw. 3,4%) sind mit denjenigen, die mit anderen Kombinationen von Vektoren und Bakterienstämmen erzielt wurden, vergleichbar (siehe Beispiel 5).
Beispiel 3: Transformation von Mais mit der Sameninokulationsmethode – transiente Expression, Herstellung von transgenem Kallus und Regeneration von transformierten Pflanzen
Herstellung der Konstrukte
Wie in Beispiel 1.
Vorbereitung von Agrobacterium für die Versuche
Agrobacterium wird 2 Tage bei 27°C auf verfestigtem YEP-Medium mit entsprechenden Antibiotika inkubiert. Die Bakterien werden anschließend geerntet und in TSIM1 (MS-Medium mit 100 mg/l myo-Inosit, 10 g/l Glucose, 50 mg/l MES-Puffer pH 5,5), das 100–400 μM Acetosyringon enthält, auf eine Dichte von 2,0–2,4 bei 650 nm resuspendiert.
Vorbereitung des Pflanzenmaterials
Es werden Abschnitte von Maispflanzen der Sorte A188 (im Glashaus bei 20–35°C im 16-Std.-Tag herangezogen) so herauspräpariert, daß sie mindestens den Stengelknoten unterhalb und den Stengelknoten oberhalb eines Kolbens 6–14 Tage nach der Blüte sowie mindestens ein Blatt umfassen. Die Lieschblätter des Kolbens werden vorsichtig heruntergezogen, um den unreifen Samen freizulegen, und die Seide wird vollständig entfernt.
Jede zweite Längsreihe der unreifen Samen wird mit einem scharfen Werkzeug vorsichtig entfernt und verworfen, und das Ganze wird leicht mit 70%igem Ethanol besprüht.
Inokulation der Maiskolben
Bei der Inokulation wird wie in Beispiel 1 vorgegangen. Die Pflanzenabschnitte werden anschließend in Wasser gestellt und die Lieschblätter über dem Kolben wieder zugemacht, um das Austrocknen der Samen zu verhindern – ein Abdecken mit einem Plastikbeutel kann ebenfalls empfehlenswert sein. Das Material wird dann 2–5 Tage in einen Lichtbrutschrank bei 23–25°C gegeben.
Isolation und Kultur der Embryonen
Wie von Ishida et al., 1997, beschrieben. Die Embryonen werden 2 Tage nach der Isolation entfernt, um auf transiente Expression untersucht zu werden, und der Rest wird zur Regeneration von stabiltransformierten Maispflanzen einem Selektionsschritt unterzogen.
Beispiel 4: Transiente Expression in unreifen Weizenembryonen nach der Sameninokulation in Abwesenheit des Induktionsmittels Acetosyringon
Herstellung der Konstrukte
Wie in Beispiel 1.
Vorbereitung von Agrobacterium für die Versuche
Wie in Beispiel 1, nur daß bei dem Inokulationsmedium kein Acetosyringon mitverwendet wurde und eine niedrigere Agrobacterium-Konzentration verwendet wurde (OD 2,1 bei 650 nm).
Vorbereitung des Pflanzenmaterials
Wie in Beispiel 1.
Inokulation der Bestockungstriebe
Wie in Beispiel 1.
Isolation und Kultur der Embryonen
Die Isolation wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Nach 2 Tagen auf W3T wurden 77 Embryonen durch histochemische Analyse in X-gluc auf GUS-Expression beurteilt.
Ergebnisse
Blaue Flecken/Striche waren auf der Ober- und Unterseite des Schildchens erkenntlich und in vielen Fällen schienen die Flecken in die Schildchenstruktur eingebaut zu sein, das heißt, sie befanden sich zwischen der oberen und der unteren Epidermis. Bei einigen wenigen Embryonen trat gar keine GUS-Expression auf. Die mittlere Anzahl Flecken pro Embryo betrug 25,4 mit einer Variationsbreite von 0–252.
Sonstige Ausführungsformen
Obwohl die Erfindung zusammen mit ihrer genauen Beschreibung beschrieben worden ist, soll die obige Beschreibung lediglich der Erläuterung dienen und nicht den Umfang der Erfindung einschränken. Sonstige Aspekte, Vorteile und Abwandlungen sind vom Umfang der unten folgenden Ansprüche umfaßt.
Beispiel 5: Stabile Transformation von Weizen mit dem Sameninokulationsverfahren
Herstellung des Konstrukts und Einbringung in den Agrobacterium-Stamm LBA4404
Das XhoI, XbaI-Fragment, das das Sul^R aus pWP258 (siehe Beispiel 1) enthält, wird in das mit XhoI, XbaI geschnittene pSB11 (Komari et al., Plant J. (1996) 10: 165–174) eingebracht, wodurch man pFFFII erhält. Das HindIII pUbi-GUSint-Fragment aus pBBB (siehe Beispiel 1) wird in das mit HindIII geschnittene pFFFII kloniert, wodurch pSB11Sulugi entsteht (siehe 6).
Durch Einbringen dieses Konstrukts in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBR4404 (pSB1) (Komari et al., 1996) mittels Elektroporation und anschließende Selektion auf 50 mg/l Spectinomycin erhielt man den superbinären Vektor pSB111Sulugi mittels Rekombination.
Vorbereitung der Bakterien für die Inokulation.
Agrobacterium wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 gezüchtet und resuspendiert, wobei jedoch unterschiedliche Mengen Acetosyringon (0–400 μM) in den Inokulationsmedien vorlagen.
Sameninokulation
Verfahren gemäß Beispiel 1, Versuche enthalten 50–300 Embryonen, siehe Tabelle 1.
Gewebekultur der isolierten Embryonen
Siehe Beispiel 2.
Ergebnisse
Siehe Tabelle 1.
Die Werte in Tabelle 1 stellen erfolgreiche Versuche dar – die wenigen Versuche, in denen keine Pflanzen erhalten wurden, wurden nicht miteinbezogen. Die Transformation wurde nach einer oder mehreren der folgenden Verfahren bestimmt:

a) Histochemische GUS-Färbung (Jefferson, 1987) an zumindest den Wurzeln und Blättern
b) PCR-Analyse auf das sul-Gen.
c) Southern-Anaylse.
d) Spaltungsanalyse der T1-Generation.

Transformationseffizienz
Die Werte für die Transformationseffizienz von erfolgreichen Versuchen lagen im Bereich von 0,5–5,8%, wobei das Mittel 1,5% betrug. Die transformierten Pflanzen wurden aus Versuchen regeneriert, die sowohl mit als auch ohne das Induktionsmittel Acetosyringon in den Inokulationsmedien initiiert wurden. Die Vererbung des GUS-Gens in die T1-Generation wurde für mehrere Linien bestätigt; siehe Tabelle 1.
Die für die Transformationseffizienz erhaltenen Werte waren mit jeder veröffentlichten Weizentransformationseffizienz vergleichbar oder sogar höher (Vasil et al., Bio/Technology (1992), 10: 667–674, Weeks et al., Plant Physiol. (1993), 102: 1077–1084, Nehra et al., Plant J. (1994), 5: 285–297, Becker et al., Plant J. (1994) 5: 299–307, Zhou et al., Plant Cell Rep. (1995), 15: 159–163, Cheng et al., (1997)).
Integrationsmuster
Die Genintegrationsmuster der transformierten Linien reichten von Einzelinsertionen mit mendelnder Vererbung bis zu Linien mit mehrfacher Kopienzahl, die bis zu sieben Kopien der T-DNA enthielten.
Beispiel 6: Transformation von Mais mit der Sameninokulationsmethode – transiente Expression und Regeneration der transformierten Pflanzen
Herstellung der Konstrukte
Wie in Beispiel 1.
Oder LBA 4404 (pSB131) gemäß Ishida et al., 1997.
Vorbereitung von Agrobacterium für die Versuche
Agrobacterium wurde 2 Tage bei 27°C auf verfestigtem YEP-Medium mit entsprechenden Antibiotika inkubiert. Die Bakterien wurden anschließend geerntet und in TSIM1 (MS-Medium mit 100 mg/l myo-Inosit, 10 g/l Glucose, 50 mg/l MES-Puffer pH 5,5), das 100–400 μM Acetosyringon und 0–0,5% Pluronsäure F68 enthält, auf eine Dichte von 2,0–2,4 bei 650 nm resuspendiert.
Vorbereitung des Pflanzenmaterials
Abschnitte von Maispflanzen (Zea mays L.) der Sorte Al88 oder Hi II (die im Glashaus bei 20–35°C im 16-Std.-Tag herangezogen worden waren) wurden so herauspräpariert, daß sie mindestens den Stengelknoten unterhalb und den Stengelknoten oberhalb eines Kolbens 6–14 Tage nach der Blüte sowie mindestens ein Blatt umfassten. Die Lieschblätter des Kolbens wurden vorsichtig heruntergezogen, um den unreifen Samen freizulegen, und die Seide wurde vollständig entfernt. Der Kolben wurde leicht mit 70%igem Ethanol besprüht, um ihn zu sterilisieren.
Inokulation der Maiskolben
Bei der Inokulation wurde wie in Beispiel 1 vorgegangen. Die Pflanzenabschnitte wurden anschließend in Wasser gegeben und die Lieschblätter über dem Kolben wieder zugemacht und mit Frischhaltefolie, um das Austrocknen der Samen zu verhindern. Das Material wurde dann 2–5 Tage in einen Lichtbrutschrank bei 22–25°C gegeben.
Isolation und Kultur der Embryonen
Nach der Cokultivierung wurde der Kolben 20 Minuten in einer 20%igen Domestos-Lösung sterilisiert. Die Embryonen wurden dann aseptisch isoliert, zweimal mit LSinf (Ishida et al., 1997) mit einem Zusatz von 250 mg/l Cefotaxim abgespült und 2–10 Tage lang im Dunkeln bei 25°C auf das Kallusinduktionsmedium LSD (Ishida et al., 1997) gesetzt.
Die Embryonen wurden 2 Tage nach der Isolation entfernt, um auf transiente Expression untersucht zu werden, und der Rest wurde zur Regeneration von stabiltransformierten Maispflanzen einem Selektionsschritt unterzogen, wie von Ishida et al., 1997, beschrieben.
Ergebnisse
Wie in Tabelle 2 dargestellt, führte die Inokulation von unreifen Embryonen innerhalb des Samens für Mais bei jedem der verwendeten Stämme und bei beiden Sorten zum Transfer von T-DNA und zur Expression des GUS-Gens. Obwohl nur 3–10% der unreifen Embryonen nach der Cokultivierung GUS exprimierten, wurden phosphinothricinresistente Pflanzen regeneriert, die das GUS-Gen exprimierten. Die Transformationsfrequenzen konnten angesichts der Tatsache, daß die Anzahl Embryonen, die einer Selektion auf stabile Transformation unterzogen worden waren, niedrig war, als relativ hoch eingestuft werden. Es zeigt auch, daß sogar dann, wenn der Transfer der T-DNA weniger stark ausgeprägt als bei einem traditionellen vollständigen in-vitro-System ist (Ishida et al., 1997), die Inokulation des Embryos in seiner natürlichen Samenumwelt Zellen mit einem besseren Regenerationspotential zum Angriffspunkt hat.
Diese Ergebnisse zeigen auch, daß sich dieses Verfahren auf andere Arten von einkeimblättrigen Pflanzen anwenden läßt und bezüglich des Transformationsschritts nicht sortenabhängig ist.
Beispiel 7: Herstellung von transgenen Brassica napus-Pflanzen durch Inokulation von Agrobacterium in die Basis der Keimblattstiele
Herstellung der Konstrukte
Das aus pCAMVNEO (Fromm et al., Nature (1996), 319: 791–793) isolierte P35S-nptII-tNOS Hind III-Fragment wurde in pSCV1 (Firek et al., Plant Mol. Biol. (1993) 22:129–142) insertiert, wodurch man pSCV1.2 erhielt. Das p35S-gus-intron-polyACaMVHind III-Fragment (Vancanneyt et al., M.G.G. (1990), 220: 245–250) wurde in die Sma I-Stelle von pSCV1.2 insertiert, wodurch man zu pSCV1.2GI gelangte (7).
Dieses Konstrukt wurde in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm C58pMP90 (Koncz und Schell, 1986) eingeführt.
Vorbereitung der Keimpflanzen
Samen von Brassica napus RV31, eine Sommersorte, wurden dadurch oberflächensterilisiert, daß man sie 20 Minuten lang mit 15% Domestos behandelte, und anschließend gründlich mit sterilem Wasser gewaschen, um pilzliche und bakterielle Krankheitserreger zu entfernen. Die Samen (110) wurden dann auf Keimungsmedium (MS-Medium mit 20 g/l Saccharose) in Beatson-Gläsern gegeben (10 Samen pro Glas) und 3 Tage bei 25°C unter 16-Std.-Tag-Bedingungen aufbewahrt. So gekeimte Keimpflanzen befinden sich in einem Stadium, in dem die Keimblätter und die damit assoziierten Blattstiele aufgelaufen, jedoch noch nicht vollständig entfaltet sind.
Vorbereitung von Agrobacterium
C58pMP90 SCVI.2GI wurde in 10 ml mg/l Medium mit einer geeigneten Auswahl von Antibiotika inokuliert und ungefähr 24 Stunden lang bei 28°C am Rundschüttler gezüchtet. Die Übernachtkultur wurde dann 20 Minuten lang bei 2000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Das Bakterienpellet wurde in MS30-Flüssigkeit (MS-Medium, das 30 g/l Saccharose enthält) auf eine OD_650nm von ungefähr 2,0 (2,175) resuspendiert.
Inokulation von Agrobacterium
Die Bakteriensuspension (0,5–1,0 μl) wurde mit einer 10-μl-Hamilton-Spritze in das Areal an der Basis jedes Keimblattstiels injiziert. Die Keimpflanzen wurden dann 2 Tage lang bei 20°C aufbewahrt.
Kallusinduktion und Pflanzenregeneration
Die Keimblätter wurden aus der Keimpflanze herauspräpariert und im Prinzip nach dem Verfahren von Moloney et al., Plant Cell Reports (1989) 8: 238–242 kultiviert. Die Oberfläche von so kultivierten herauspräparierten Brassica napus-Keimblattstielen machen eine kurze Kallusentwicklung aus dem herausragenden Gefäßbündelgewebe durch, wonach sich innerhalb 8 Tagen Kultur Sproßmeristeme in diesem Kallus bilden (Ono et al., Plant Cell Reports (1994) 14: 13–17).
Ergebnisse
Aus den 200 herauspräparierten Keimblattstielen wurden gemäß x-gluc-Färbung für das GUS-Gen und PCR-Analyse für das NptII-Gen 6 transformierte Sprosse regeneriert, was einer Transformationseffizienz von 3,0% entspricht. Die PCR-Analyse ergab auch, daß eine weitere Linie das Gen enthielt, jedoch gemäß x-gluc-Färbung keine GUS-Aktivität aufwies. Die Analyse der T1-Generation von 5 der GUS-exprimierenden transformierten Linien mittels x-gluc-Färbung zeigte, daß das GUS-Gen an die nächste Generation vererbt wurde, und zwar mit den folgenden Ergebnissen:
Auf GUS-Aktivität untersuchte T1-Pflanzen
Diskussion
Die Inokulation von Agrobacterium in die Basis von Keimblattstielen, während sich diese noch an der Keimpflanze befinden, stellt eine bedeutende Abweichung von dem veröffentlichen Transformationssystem, bei dem die Blattstiele zuerst herauspräpariert und erst dann mit dem Agrobacterium behandelt werden, dar. Obwohl dieses Verfahren technisch schwierig in der Durchführung ist, hat es sich mit ein wenig Praxis als erstaunlich effizient erwiesen. Mit mehreren Jahren Erfahrung kann man mit der veröffentlichten Standardmethode und dergleichen Brassica napus-Sorte routinemäßig eine Transformationseffizienz von 5–10% erzielen. Daß mit dieser neuen Methode beim zweiten Versuch 3,0% erzielt wurden (bei einem ersten Versuch wurde 1 transformierte Keimpflanze von 80 Explantaten – 1,25% – erhalten), ist überraschend. Dies zeigt erst recht, daß dieses Verfahren der Genabgabe bei jeder Art angewandt werden kann, bei der ein Gewebekultursystem mit einer Kallusphase existiert, egal, ob es sich um eine monokotyle oder dikotyle Art handelt.
Beispiel 8: Transformation von Sojabohnen mit dem Sameninokulationsverfahren – transiente Expression Herstellung des Konstrukts
Der Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA 4404 wurde mit dem superbinären Vektor pVec 035, der das vom CaMV 35S Promoter getriebene GUS-Intron-Gen enthielt (bereitgestellt von B. Pelissier, Aventis Crop Science, Lyon, Frankreich), transformiert.
Vorbereitung von Agrobacterium für die Versuche
Agrobacterium wurde 2 Tage bei 27°C auf verfestigtem YEP-Medium mit geeigneten Antibiotika inkubiert. Die Bakterien wurden dann geerntet und in TSIM1 (MS-Medium mit 100 mg/l myo-Inosit, 10 g/l Glucose, 50 mg/l MES-Puffer pH 5,5), das 0–400 μM Acetosyringon enthielt, auf eine Dichte von 0,5–2,0 bei 650 nm resuspendiert.
Vorbereitung des Pflanzenmaterials
Sojabohnenpflanzen Glycine max der Sorte Jack wurden im Glashaus bei einer Temperatur von 23–25°C mit Zusatzlicht, sodaß ein 14-Stunden-Tag entsteht, herangezogen.
Inokulation der Sojabohnensamen
Unreife Samen wurden inokuliert, als die Embryonen eine Größe von 3–7 mm aufwiesen. Die Injektion von 0,5–1 μl Agrobacterium Suspension wurde wie in Beispiel 1 beschrieben dadurch durchgeführt, daß man die Suspension zwischen die beiden Keimblätter, durch die Hülse und in Längsrichtung in bezug auf den Embryo abgab. Die Pflanzen wurden anschließend 2–5 Tage lang bei 23–25°C inkubiert.
Isolation und Kultur der Embryonen
Nach der Cokultivierung wurden die unreifen Samen entnommen und 20 Minuten in einer 20%igen Domestos-Lösung sterilisiert. Die Embryonen wurden anschließend aseptisch isoliert, auf Kallusinduktionsmedium MSI (MS-Medium und B5-Vitamine mit 60 g/l Saccharose und 40 mg/l 2,4-D, verfestigt mit 3 g/l Phytagel, eingestellt auf pH 7) mit einem Zusatz von 350 mg/l Cefotaxim unter Lichtbedingungen bei 27°C umgesetzt. Nach 2–10 Tagen wurde mit den Embryonen eine histochemische GUS-Färbung durchgeführt, um die Effizienz, mit der die T-DNA übertragen wurde, zu beurteilen.
Ergebnisse
Wie in Tabelle 3 dargestellt führte die Inokulation von unreifen Sojabohnenembryonen innerhalb von Samen und Hülse zur Übertragung von T-DNA und Expression von GUS. GUS-positive Flecken oder Areale waren stark über die unreifen Embryonen ausgebreitet und nicht unbedingt mit den Verwundungsstellen assoziiert (8). Im Gegensatz zur SAAT-Transformation bei der Sojabohnen-Keimblattmethode (Santarem et al., Plant Cell Report (1998), 17: 752–759) stellt die vorliegende Technik ein leichteres Transformationsprotokoll und ein höheres Regenerationspotential zur Verfügung, da die Zielzellen nicht verwundet werden.
Beispiel 9: Transformation von Sonnenblume durch die Sameninokulationsmethode – transiente Expression
Herstellung der Konstrukte
C58C1 (pGV2260) (Simpson et al., Plant Mol. Biol. (1986), 6: 403–416) (pBin 19) (Bevan, Nuc. Acids Res. (1984), 12: 8711–8121)
C58pMP90 (pSCV1.2GI) (siehe Beispiel 7)
Vorbereitung von Agrobacterium für die Versuche
Agrobacterium wurde 2 Tage bei 27°C auf verfestigtem YEP-Medium mit entsprechenden Antibiotika inkubiert. Die Bakterien wurden anschließend geerntet und in TSIM1 (MS-Medium mit 100 mg/l myo-Inosit, 10 g/l Glucose, 50 mg/l MES-Puffer pH 5,5), das 0–400 μM Acetosyringon enthielt, auf eine Dichte von 2,0–2,4 bei 650 nm resuspendiert.
Vorbereitung des Pflanzenmaterials
Sonnenblumenpflanzen Helianthus annuus der Sorte HA300B wurden im Glashaus bei 15–30°C mit Zusatzlicht, so daß man einen 14-Stunden-Tag erhielt, herangezogen.
Inokulation der Sonnenblumensamen
Unreife Samen wurden 10 bis 25 Tage nach der Blüte inokuliert. Eine 1 μl Agrobacterium-Suspension wurde so wie in Beispiel 1 beschrieben durch die Mikropyle injiziert so, daß die Suspension zwischen die beiden Keimblätter abgegeben wurde. Das Capitulum wurde anschließend 2–5 Tage bei 22–25°C inkubiert.
Isolation und Kultur der Embryonen
Nach der Cokultivierung wurden die unreifen Samen entnommen und 20 Minuten in einer 20%igen Domestos-Lösung sterilisiert. Die Embryonen wurden anschließend aseptisch isoliert, auf Kallusinduktionsmedium (MS mit 30 g/l Saccharose, verfestigt mit Agar-Agar 10 g/l, pH 5,7 sowie mit Zusatz von 0,5 mg/l NAA, 0,5 g/l BAP und 500 mg/l Cefotaxim) und bei 21–24°C, 16-Std.-Tag, 30 μEm^–2s^–1 PAR kultiviert. Nach 2–10 Tagen wurde mit den Embryonen eine histochemische GUS-Färbung durchgeführt, um die Effizienz, mit der die T-DNA übertragen wurde, zu beurteilen.
Ergebnisse
Wie in Tabelle 4 dargestellt führte die Inokulation von unreifen Sonnenblumenembryonen innerhalb des Samens bei jeder verwendeten Linie zur Übertragung von T-DNA und Expression des GUS-Gens (5,9%–65,4%). GUS-positive Flecken befanden sich in erster Linie auf den Keimblättern, Transformationsereignisse wurden jedoch auch auf dem Hypokotyl festgestellt. Nur zwei Versuche dienten der Beurteilung der Schlagkräftigkeit der Sameninokulationsmethode für die Transformation von unreifen Sonnenblumenembryonen. Überraschenderweise hat sie sich als sehr schlagkräftig erwiesen, auch wenn die Entwicklung des unreifen Embryos offenbar einen kritischen Parameter darstellt.

Claims

Transformationsverfahren, das die Inokulation und Cokultivierung eines Zielgewebes von einer Zielpflanze mit Agrobacterium zu einem Zeitpunkt, zu dem sich das Zielgewebe in seiner natürlichen pflanzlichen Umgebung befindet, und anschließende Erzeugung einer transgenen Pflanze mittels Entdifferenzierung und Regeneration des Zielgewebes, umfaßt, wobei die Inokulation dadurch durchgeführt wird, daß man Agrobacterium in dieses Gewebe so injiziert, daß man das Gewebe so wenig wie möglich beschädigt.
Transformationsverfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der transgenen Pflanze um eine fruchtbare Pflanze handelt.
Transformationsverfahren, das die Inokulation und Cokultivierung eines Zielgewebes von einer Zielpflanze mit Agrobacterium zu einem Zeitpunkt, zu dem sich das Zielgewebe in seiner natürlichen pflanzlichen Umgebung befindet, und anschließende Erzeugung von entdifferenziertem Gewebe aus dem Zielgewebe, umfaßt, wobei die Inokulation dadurch durchgeführt wird, daß man Agrobacterium in dieses Gewebe so injiziert, daß man das Gewebe so wenig wie möglich beschädigt.
Transformationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zielzellen in dem Zielgewebe so wenig wie möglich oder gar nicht verwundet werden.
Transformationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei mindestens ein Teil der Entdifferenzierung des Zielgewebes in vitro durchgeführt wird.
Transformationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei der Pflanze um eine monokotyle oder dikotyle Pflanze handelt.
Transformationsverfahren nach Anspruch 6, wobei die Zielpflanze aus der Familie der Gramineen stammt.
Transformationsverfahren nach Anspruch 7, wobei die Zielpflanze aus der Gruppe Weizen, Gerste, Mais, Reis, Hafer, Roggen, Sorghumhirse und andere Hirsen stammt.
Transformationsverfahren nach Anspruch 6, wobei die Zielpflanze aus der Gruppe Raps, Pfeffer/Paprika, Sojabohne, Sonnenblume, Zuckerrübe, Cucurbitacee, Spargel, Zwiebel, Ölpalme, Yamswurzel und Banane stammt.
Transformationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei es sich bei dem Zielgewebe um einen Embryo, eine Blüte, ein Ovarium, eine Blattbasis oder eine Anthere handelt.
Transformationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei es sich bei dem Zielgewebe um einen unreifen Embryo, eine unreife Blüte, ein unreifes Ovarium oder eine unreife Anthere handelt.
Transformationsverfahren nach Anspruch 11, wobei die Zielregion für die Inokulation die Grenzfläche zwischen zwei Zellschichten, die miteinander in engem Kontakt stehen, ist.
Transformationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei zum Zeitpunkt der Inokulation mit Agrobacterium kein Agrobacterium vir-induzierendes Agens zugegeben wird.
Transformationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei zum Zeitpunkt der Cokultivierung mit Agrobacterium kein Agrobacterium virinduzierendes Agens zugegeben wird.
Transformationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Inokulation von Agrobacterium dadurch durchgeführt wird, daß man eine Agrobacterium-Suspension mittels einer Spritze in das Zielgewebe injiziert.
Verwendung von Agrobacterium bei einem Transformationsverfahren, das die Inokulation und Cokultivierung eines Zielgewebes aus einer Zielpflanze mit Agrobacterium zu einem Zeitpunkt, zu dem sich das Zielgewebe in seiner natürlichen pflanzlichen Umgebung befindet, und die anschließende Erzeugung von transgenem Pflanzenmaterial mittels Entdifferenzierung des Zielgewebes umfaßt, wobei die Inokulation dadurch durchgeführt wird, daß man Agrobacterium in dieses Gewebe so injiziert, daß man das Gewebe so wenig wie möglich beschädigt.
Verwendung von Agrobacterium nach Anspruch 16, wobei das transgene Pflanzenmaterial entdifferenziert und gegebenenfalls in der Bildung von Kallus-, Wurzel-, oder (vorzugsweise fruchtbarem) Pflanzenmaterial regeneriert wird.
Verfahren zur Herstellung eines transformierten Pflanzengewebes, das den Schritt der Transformation eines Zielgewebes einer Zielpflanze nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei es sich bei transformierten Pflanze um Kallus, Wurzel, Sproß, (vorzugsweise fruchtbare) ganze Pflanze, Saatgut oder sonstiges Vermehrungsmaterial handelt