CZ301610B6

CZ301610B6 - Zpusob transformace rostlin

Info

Publication number: CZ301610B6
Application number: CZ20013744A
Authority: CZ
Inventors: Risacher@Thierry; Craze@Mélanie
Original assignee: Biogemma S.A.S.
Priority date: 1999-04-19
Filing date: 2000-04-19
Publication date: 2010-04-28
Also published as: JP2002541853A; HU228627B1; CN1347457A; EP1171621B1; DE60024607T2; HUP0200926A2; CA2369428A1; DE60024607D1; WO2000063398A1; PL351895A1; BG106105A; US7285705B1; IL145686A0; AU775949B2; US20110078827A1; US20080047036A1; CZ20013744A3; PL202067B1; EP1171621A1; CA2369428C

Abstract

Rešení se týká zpusobu transformace, který obsahuje kroky inokulace a kokultivace cílového pletiva z cílové rostliny s Agrobacterium, a sice v takové dobe, kdy je cílové pletivo ve svém prirozeném rostlinném prostredí, po kterých následuje vytvorení transgenní rostliny cestou dediferenciace a regenerace cílového pletiva, pricemž inokulace se provádí injikováním Agrobacterium do cílového pletiva.

Description

Způsob transformace rostlin

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu transformace rostlin zprostředkované Agrobacterium, kdy se Agrobacterium injikuje do cílového pletiva, a zvláště způsobů transformace jednoděložných rostlin.

Dosavadní stav techniky

Vynález spadá do oboru transformace rostlin, zejména obilovin, a zvláště se týká transformace zprostředkované Agrobacterium tumefaciens nebo jiným druhem Agrobacterium (dále obecně i 5 nazývaným jen rodovým jménem Agrobacterium).

Pro přípravu transgenních obilovin bylo až do nedávná možné použít pouze metody přímé transformace. Ostřelování částicemi je nejrozšířenější metodou tohoto druhu. Nedávno se objevily v odborné literatuře zprávy o tom, že některé obiloviny byly geneticky modifikovány (trans20 formovány) užitím Agrobacterium (Hiei et al., Plant Mol. Biol. (1997) 35:205-218); Ishida et al.,

Nátuře Biotechnol. (1996) 14:745-750; Cheng etaí, Plant Physiol. (1997), 115:971:980; Tingay etaí, The Plant Journal, 11: 1369-1376 (1997)).

Transformační účinnost popisovaná v odborné literatuře pro různé obiloviny vykazuje značnou variabilitu. Typicky nízké hodnoty byly publikovány pro kukuřici (Ishida 1996), užitím systému, který je navíc silně závislý na genotypu. Také pro rýži byly popsány nízké hodnoty účinnosti a zvláště nízké účinnost byla popsána pro pšenici. Ve všech těchto systémech se Agrobacterium aplikovalo in vitro na izolované pletivo, které bylo buďto v procesu dedifirenciace nebo již bylo dediferenciováno.

Jak bylo již zmíněno výše, systémy pro Agrobacterium - zprostředkovanou transformaci obilovin byly popsány pro rýži (Hiei, 1997), kukuřici (Ishida, 1996), pšenici (Cheng, 1997) a ječmen (Tingay, 1997). Společným rysem těchto metod bylo to, že explantáty, výhodně nezralá embrya nebo z nich odvozené embryogenní kalusy, byly izolovány z donorové rostliny a in vitro inoku35 lovány Agrobacterium.

Hess a spolupracovníci (Plant Science 72: 233-244, 1990) zkusili transformovat pšenici pipetováním Agrobacterium do klásků pšenice. Cílem podle této publikace bylo dosáhnout přenosů genů transformací pylu a následně izolovat transformovaná semena po normální fertilizaci.

Vyjmutí pletiva z ínokulovaných klásků pro následnou selekci a regeneraci však nebylo ani vyzkoušeno ani navrženo.

Jiní pracovníci popsali ^groóactenwm-zprostředkovanou transformaci kukuřice a rýže inokulací vzrostlých vrcholů (Gould J (1991) Plant Physiol. 95: 426-434; Park SH (1996) Plant Molecular

Biology 32: 1135-1158). Ale i zde byla objektem transformace zárodečná linie byla tak získána transformovaná semena. Tento postup regenerace byl zcela odlišný od postupu podle předkládaného vynálezu: ve skutečnosti specifickým cílem těchto metod bylo vyhnout se metodě regenerace rostlin, která by procházela fází dediferenciace pletiva a náhodné regenerace.

Patenty Spojených Států 5,177,010 a 5,187,073 (Goldman, et aí) popsaly způsob transformace a kukuřice, resp. trav (Gramineae) založený na poranění nově vyrašených semenáčků a jejích inokulací Agrobacterium . A zde opět bylo cílem transformovat zárodečné buňky, které pak poskytnou ve zralé rostlině reproduktivní orgány a bude tak možné získat z rostliny transformovaný pyl.

-1CZ 301610 B6

Jiný proces, který byl studován ve snaze o vývoj transformace obilovin je tzv. Agroinfelce.

Patent Spojených Států 5,569,597 (Grimsley, et al) popsal způsob vnesení vírové DNA do rostlin prostřednictvím Agrobacterium. Po inokulaci semenáčků kukuřice Agrobacterium obsahujícím DNA z viru skvrnitosti kukuřice vložený do T-DNA původci pozorovali výskyt symptomů choroby, což ukazovalo na proliferaci viru v rostlině. Agrobacterium tedy působilo jako nosič pro vnesení virové DNA do rostliny, po kterém byl virus schopen způsobit systémovou infekci. Avšak chybí důkazy o tom, že agroinfekce vede k transformaci rostliny, tj. ke skutečnému vnesení DNA do genomu rostliny. Pokud jde v tomto patentu o transformaci, pak opět o zaměřenou na meristemová pletiva s cílem transformovat zárodečné buňky.

Podstata vynálezu

V předkládané nové metodě je cílové pletivo inokulováno a kokultivováno 3 Agrobacterium v podmínkách, kdy cílové pletivo je ve svém přirozeném prostředí, přičemž inokulace se provádí injikováním Agrobacterium do cílového pletiva. Cílové pletivo se vyvíjí normálním fyziologickým způsobem. Cílové pletivo je pak vyjmuto ze svého normálního prostředí a směrováno k dediferenciační dráze a pak regenerováno, aby vytvořilo transgenní rostlinu. Výhodně transgenní rostlina je fertilní rostlina.

V předkládané přihlášce vynálezu termín „ve svém přirozeném prostředí“ označuje veškeré podmínky, kdy je cílové pletivo schopno se vyvíjet v podstatě normálním fyziologickým a časovým způsobem. V takových podmínkách patří, kdy cílové pletivo je v podmínkách in vivo, kdy je cílové pletivo stále ještě v rostlině nebo spojené s rostlinou (např. cílové pletivo je embryo v semeni na odříznutém výhonu) neboje cílové pletivo stále ještě ve stejném buněčném prostředí, v jakém by bylo, kdyby stále ještě bylo na rostlině (např. cílové pletivo je embryo v izolovaném semeni nebo části izolovaného semena), K dalším příkladům patří nezralé květy dosud v listových pochvách nebo alespoň spojené s rostlinou a nezralé prašníky v dosud neotevřených květních pupenech.

Dediferenciace znamená vytváření buněčných shluků, jako jsou např, kalusy, které vykazují neorganizovaný růst.

Kromě toho, že cílové pletiv jev prostředí, které je shodné s původní rostlinou, Agrobacterium je v prostředí, které je v prostředí, které se více blíží přirozenému prostředí, kde se Agrobacterium vyskytuje. Tudíž Agrobacterium bude působit při transformaci cílového pletiva mnohem účinnější, než když je inokulováno do izolovaného pletiva na Petriho misce, což je běžné při postupech podle stavu techniky.

Jedním z důsledků těchto dvou faktorů je příležitost dosáhnout vyšší transformační účinnosti při přenosu požadovaného transgenu do cílového pletiva a tudíž vyšší účinnost pro produkci transgenních rostlin.

Jedním z primárních kroků v téměř každém transformačním protokolu je poranění cílového pletiva. Při transformaci Agrobacterium je to ze dvou důvodů - aby se exponovaly buňky, o kterých se má za to, že jsou vnímavé k transformaci a které jsou schopné regenerace (zejména u druhů trav, Gramineae) a aby se indukovalo Agrobacterium k přenosu své T-DNA. Jedna publikovaná metoda neobsahující poranění pletiva obsahovala alespoň použití smáčedla (Silwet nebo kyselina pluronová) nebo vakuové infiltrace (WO 97/48814). Všechny uvedené postupy obsahují určité inherentní poškození pletiva a jsou spojeny se sníženou regenerační schopností.

Při realizaci předkládaného vynálezu je poranění cílových buněk v cílovém pletivu buď minimalizováno nebo zcela eliminováno, a může být použito i smáčedlo, i když to není nezbytné. K nějakému hrubému poškození pletiva může dojít v průběhu přenosu, ale i tak je valná většina

-2CZ 301610 B6 buněk, které jsou regenerovatelné a které jsou pak zaraženy Agrobacterium, nepoškozena a jejich regenerační kapacita zůstává neovlivněna.

Podle předkládaného vynálezu je inokulace Agrobacterium provedena tak, že se suspenze

Agrobacterium aplikuje na cílové pletivo pomocí vhodného zařízení, jako je např. injekční stříkačka, např. stříkačka typu Hamilton.

Podle předkládaného vynálezu byl vyvinut systém pro transformaci rostlin zprostředkovanou Agrobacterium, výhodně pro transformaci obilovin, které zahrnuje infekci cílového pletiva. Bylo i o ukázáno, že tento systém je vysoce účinný a plně reprodukovatelný.

Cílové pletivo může být jakékoliv pletivo, které je následně možné vložit do tkáňové kultury a regenerovat rostlinu. Ke zvláště výhodným cílovým pletivům podle předkládaného vynálezu patří embryo, květ, semeník, báze listu a prašník. Pokud jde o květ, semeník a prašník, pak jsou výhodně nezralé.

V jiném výhodném provedení předkládaného vynálezu, kdyžje cílovým pletivem embryo, pak cílovou oblastí pro inokulaci je rozhraní mezí dvěma vrstvami buněk, které jsou v těsném kontaktu, tj. vyvíjející se skutelum (scutellum, štítek) a přilehlý škrobový parenchym v endosper20 mu. Agrobacterium se musí přenést na toto rozmezí pletiv s co nejmenším poškozením cílového pletiva, aby nebyla nevhodně zeslabena jeho regenerativní schopnost. Ze stavu techniky však nebylo možné předpovědět, že by bylo možné takovouto účinnou a reprodukovatelnou metodu vyvinout.

Ve způsobu transformace podle předkládaného vynálezu se cílové pletivo inkuluje Agrobacterium a dále se s ním společně kultivuje (tzv. kokultivuje). Pak se regenerují transgenní rostliny dediferenciací a regenerací cílového pletiva. Takže po inokulaci a koku 1tivaci se cílové pletivo „donutí“ k dediferenciací. Z dediferenciovaného pletiva se pak získá regenerovaná rostlina standardním postupem, který je odborníkům znám. Po inokulaci a kokultivaci se výhodně cílové pletivo přenese do prostředí, které je vhodné pro požadovanou dediferenciací a následnou regeneraci rostlin. Takže alespoň část procesu dediferenciace cílového pletiva (po inokulaci a kokultivaci) je prováděna in vitro. Následná regenerace rostlin je také výhodně provedena in vitro.

Jednou z překvapujících vlastností způsobu podle předkládaného vynálezu (alespoň v případě nezralých embryí pšenice) je to, že často dochází k vícenásobným transformacím na jednom izolovaném explantátu. Dosud byly v oboru (Cheng et al. 1997) všechny rostliny z téhož explantátu považovány za klony pocházející z jedné transformační události. V metodě podle předkládaného vynálezu toto nelze předpokládat, neboť z jednoho explantátu Často vzniká více rostlin, každá s odlišným integračním profilem, jak ukázaly analýzy Southern přenosem (Southern biot). Jedním zmožných vysvětlení (aniž by tím byl vynález nějak omezen) by mohla být absence poranění u většiny regenerovatelných buněk před tím, než se aplikuje Agrobacterium. Většina přenosů T-DNA se zřejmě odehraje v buňkách, které si uchovávají schopnost dalšího vývoje.

Důležitým rysem transformace obilovin, často označovaným dokonce za klíčový, je indukce Agrobacterium tím, že se do inokulačního a/nebo kokultivačního média přidá činidlo indukující vir v Agrobacterium (Hiei et al„ 1997, Chent et al., 1997). K takovým indukčním činidlům patří acetosyringon, vanilin, kyselina ferulová, katechol a kyselina syringová. Avšak předkládaný vynález ukázal, že je možné úspěšně transformovat obiloviny bez použití takového indukčního činidla. Zejména úspěšné transformace pšenice zprostředkované Agrobacterium bylo dosaženo bez užití indukčního činidla, což dokázalo, že pro účinný přenos T-DNA není indukční činidlo nutné. Když cílovým pletivem pri způsobu podle vynálezu bylo nezralé embryo a jeho přirozené prostředí bylo tvořeno nezralým semenem, pak se zdá, že Agrobacterium je dostatečně indukováno přirozenou cestou buňkami nezralého embrya. Možným vysvětlením tohoto jevu je to (avšak bez jakéhokoliv omezení vynálezu), že buňky v okolí cílového pletiva vytvářející „priro-3CZ 301610 B6 zené prostředí rostliny“ jsou zodpovědné za indukci Agrobacterium. Vyjmutí embrya z jeho přirozeného prostředí zřejmě způsobí, že se cílovému pletivu pak nedostává jinak dostupných látek, které napomáhají indukci Agrobacterium.

Předkládaný vynález umožňuje vnášet požadovaný transgen nebo heterologní nukleovou kyselinu do rostlinného pletiva a dovoluje získat fertilní transgenní rostliny. Vynález je zvláště užitečný pro produkci transgenních jednoděložných rostlin, u kterých je často transformace spojena s obtížemi a má velmi nízkou účinnost. K vhodným jednoděložným rostlinám patří chřest (asparagus), cibule, olejová palma, yam a banánovník, a zejména jakýkoliv botanický druh z čeledi io Gramineae, zvláště pak obiloviny (trávy, jejichž semena se užívají jako potraviny) jako např.

pšenice, ječmen, kukuřice, rýže, oves, žito, čirok a proso.

Způsob podle předkládaného vynálezu je použitelný také pro dvouděložné rostliny, zejména takové, pro které existuje systém tkáňové kultury nebo může být vyvinut, který zahrnuje fázi kalusového pletiva. K vhodným dvouděložným rostlinám patří řepka, hrách, paprika, sója, slunečnice, cukrová řepa a dýně, a také stromy jako je např. gumovník, borovice a eukalypt.

Podle předkládaného vynálezu je heterologní nukleová kyselina taková nukleová kyselina, která se normálně nevyskytuje v T-DNA z Agrobacterium ani v rostlině, která má být transformována.

Termín heterologní nukleová kyselina v kontextu předkládaného vynálezu zahrnuje všechny synteticky připravené nebo biologicky odvozené geny, které mohou být vneseny do rostliny metodami genového inženýrství, jako jsou (aniž by výčet byl limitující) např. jiné než rostlinné geny, modifikované nebo syntetické geny, části genů a geny z libovolných jiných rostlinných druhů. Heterologní nukleová kyselina výhodně obsahuje úsek kódující požadovaný protein nebo polypeptid nebo „antisense“ molekulu, s příslušnými regulačními sekvencemi, které obklopují kódující sekvenci a která umožňují a podporují její expresi v jednoděložných rostlinách.

Způsoby konstrukce heterologní nukleové kyseliny pro úspěšnou transformaci rostlin jsou odborníkům dobře známy a tyto metody lze užít i pro konstrukci heterologních molekul vhodných pro předkládaný vynález. Tak např. Weising et al. (1988) (Annual Rev. Genet. 22:241) popisuje vhodné složky, což jsou promotory, polyadenylační sekvence, selektovatelné markerové geny, reportérové geny, enhanceiy, introny a další, a poskytuje také vhodné literární odkazy (publikace je zahrnuta formou odkazu). Dále Sambrook et al. (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY), popisují vhodné metody pro takové konstrukce.

Obecně plazmid obsahující nukleovou kyselinu heterologního genu je relativně malý, tj. menší než 30 kb, aby byla co nejmenší jeho citlivost k fyzikální, chemické nebo enzymatické degradaci, o které je známo, že se zvětšuje s velikostí genu.

K vhodným transgenům nebo heterologním nukleovým kyselinám pro předkládaný vynález patří všechny nukleové kyseliny, které poskytují nebo zesilují prospěšné vlastnosti výsledných transgenních rostlin. Tak např. nukleové kyseliny mohou kódovat proteiny nebo „antisense“ RNA transkrintv které 7vv$nií nutriční hodnotou nlodin 7vvšnií ννηηςν odolnost nroti škůdcům ι ·* ' ď j ....... ....... i · ' 9 - - j - ----j 7 .......· · · i---* ' odolnost proti chorobám a podobně. K reprezentativním příkladům takových nukleových kyselin patří Bakteriální gen dap A pro zvýšení obsahu lysinu, gen Bt-endotoxinu nebo inhibitoru proteázy pro rezistenci k hmyzu, geny lytických peptidů pro rezistenci k chorobám, bakteriální nebo rostlinný gen EPSP pro rezistenci ke glyfosatovým herbicidům (viz patenty US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,312,910, US 5,633,435, US 5,627,061, US 5,310,667 a mezinárodní přihláška WO 97/04103); WO 96/38567, WO 98/02562) pro rezistenci k herbicidům - inhibitorům HPPD (tj. diketony, isoxazoly apod.), geny bar a pat pro rezistenci ke glufosinatu, gen chitinázy nebo glukanendo-l,3-J3-glukosidázy pro fungicidní vlastnosti. Nukleové kyseliny mohou být také vneseny s cílem napomáhat identifikaci, genetickému značkování nebo izolaci segmentů rostlinných genů.

-4CZ 301610 B6

K příkladům genů vhodných pro modifikace kvality patří geny enzymů podílejících se na biosyntéze nebo degradaci škrobu, např. syntéza škrobu, větvicí enzymy (jako jsou např. SBEI,

SBEII, SSSI a DBEI pšenice popsané v mezinárodní přihlášce WO 99/14314), a geny pro zásobní proteiny v zrnu, např. proteinové podjednotky gluteninu (viz např, WO97/25419), gliadi5 ny a hordeíny. Také geny umělé samčí sterility, jako je např. gen bamázy (viz EP-A0344029) a gen PR-glukanázy (WO 92/11379) pod kontrolou vhodného promotoru jsou také vhodné pro přípravu hybridního osiva.

Mohou se také vnášet geny s cílem produkovat farmaceuticky účinné látky v rostlinách nebo io s cílem zlepšit nutriční vlastnosti plodin (biologické zemědělství a funkční potraviny).

Další příklady lze nalézt ve výše citované publikaci Weisinga.

Plazmidy obsahující heterologní nukleové kyselin, které se mají vnášet do rostlin, dále obecně obsahují buďto selekční markér nebo reportérový gen nebo oboje, aby byla možná identifikace a také selekce transformovaných buněk. Alternativně je selekční markér nesen na zvláštním samostatném vektoru, který je vnesen kotransformací (současnou transformací dvěma nebo více vektory). Jak geny pro selekční markér tak i reportérové geny jsou obklopeny vhodnými regulačními sekvencemi, které umožňují jejich expresi v rostlinách. Užitečné selekční markéry jsou odborníkům známy a patří k nim např. geny rezistence k antibiotikům nebo herbicidům. Specifické příklady těchto genů byly popsány ve výše citovaném dokumentu Weisinga et al. Výhodným selekčním markérem je gen sul, poskytující rezistenci k sulfonamidům (viz EP-B0369637). K dalším genům selekčních markérů, které jsou odborníkům známy, patří sekvence kódující hygromycin B fosfotransferázu (hpt), kterou lze získat zE, coli, gen aminoglykosidfosfo25 transferázy z transposonu Tn5 (AphII) kódující rezistenci k antibiotikům kanamycinu, neomycinu a G418, a také geny kódující rezistenci nebo toleranci ke glyfosatu, biolafosu, methotrexatu, imidazolinonům, sulfomočovině, bromoxynilu, daloponu apod. Geny selekčních markérů, které kódují toleranci k herbicidům, jsou také užitečné ve výsledných transformovaných rostlinách.

Reportérové geny, které kódující snadno testovatelné markerové proteiny, jsou odborníkům dobře známy. Obecně je reportérový gen takový gen, který není přítomen nebo není exprimován v cílovém organismu nebo tkáni a který kóduje protein, jehož exprese, se manifestuje nějakou snadno detekovatelnou vlastností, např. fenotypovou změnou nebo enzymatickou aktivitou. Příklady takových genů popsali Wising et al. (viz výše). K výhodným genům patří gen chloram35 fenikolacetyltransferázy (cat) z Tn9 E. coli, gen betaglukoronidázy (gus) z lokusu uidA E. coli, gen kódující zelený fluoreskující protein (GFP) zAequoria victoria a gen luciferázy (Zwc) ze světlušky Photinus pyralis.

K regulačním sekvencím užitečným ve vynálezu patří jakékoliv konstitutivní, indukovatelné, tká40 ňové, orgánově nebo vývojově specifické promotory, které mohou být exprimovány v konkrétních rostlinných buňkách. K vhodným promotorům patří promotory popsané ve výše citované práci Weising et al. Dále je uveden částečný seznam příkladů promotorů vhodných v předkládaném vynálezu: regulační sekvence zT-DNA A, tumefaciens, vč. mannopínsyntázy, nopalinsyntázy a oktapinsyntázy; promotor alkoholdehydrogenázy z kukuřice; světlem indukovatelný promotor jako je promotor genu pro malou podjednotku ribuózabisgfosfátkarboxylázy z různých rostlinných druhů a gen hlavního vazebného proteinu pro chlorofyl a/b, promotor histonu (EP 507 698), promotor aktinu, promotor ubiquitinu 1 z kukuřice (Christensen et al. (1996) Transgenic Res. 5:213); promotory 35S a 19S z viru mosaiky květáku; vývojově regulované promotory jakoje např. „voskový“ (waxy) a bronzový („bronze“) promotor nebo zeinový promotor kukuři50 ce, a také syntetické nebo další přírodní promotory, které jsou buďto indukovatelné nebo konstitutivní, včetně promotorů vykazujících orgánově specifickou expresi nebo expresi ve specifickém vývojovém stádiu rostliny, jako je např. promotor alfa-tubulinu popsaný v patentu US 5,635,618.

-5CZ 301610 B6

V nukleové kyselině mohou být přítomny i další elementy jako jsou introny, enhancery, polyadeny lační sekvence apod. Tyto elementy musí být kompatibilní s ostatními elementy genového konstruktu. Tyto elementy mohou ale nemusejí být nezbytné pro funkci genu, avšak mohou poskytnout lepší expresi nebo funkci genu tím, že ovlivní transkripci, stabilitu mRNA apod..

Takové elementy mohou být vloženy do nukleové kyseliny podle potřeby, aby bylo dosaženo optimálního chování transgenu v rostlině. Tak např. první intron genu AshlS z kukuřice může být umístěn mezi promotor a kódující sekvenci určené heterologní nukleové kyseliny. Tento intron, když je vložen do genového konstruktu, je znám tím, že zvyšuje expresi protein v buňkách kukuřice (Callis et al. (1987) Genes Dev 1:1183). K dalším vhodným intronům patří první intron io genu Shrunken-I z kukuřice (Maas et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:199); první intron genu katalázy (cat-1) zRicinus (Ohta et al. (1990) Plant Cell Physiol. 31:805); druhý intron genu ST-LSI katalázy z bramboru (Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen Genet. 220:245); intron genu žluté zakrslosti tabáku, DSV (Morris et al, (1992) Virology 187:633; intron aktinu-1 (act-1) z rýže (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163); a intron i triosofosfátisomerázy (TPI) (Snowden et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31:689). Avšak velmi často lze postačující exprese selekčního markéru dosáhnout bez intronu (Battraw et al (1990) Plant Mol. Bio., 15:527),

Plazmid obsahující heterologní nukleovou kyselinu může dále obsahovat sekvenci kódující tranzitní peptid, aby byl protein kódovaný heterologním genem směrován do chloroplastu v cílové rostlinné buňce. Tranzitní peptidy jsou odborníkům dobře známy a patří k nim např. jednoduché tranzitní peptidy a také vícenásobné tranzitní peptidy získané kombinací sekvencí kódujících alespoň dva tranzitní peptidy. Jeden výhodný tranzitní peptid je např. „Optimalizovaný tranzitní peptid“ popsaný v patentu US 5,636,618, který obsahuje ve směru transkripce první sekvenci DNA kódující první chloroplastový tranzitní peptid, druhou sekvenci DNA kódující N-koncovou doménu zralého proteinu přirozeně směrovaného do chloroplastu, a třetí sekvencí DNA kódující druhý chloroplastový tranzitní peptid,

Pro stanovení toho, zda určitá kombinace heterologní nukleové kyseliny a příjemcovské rostlinné buňky jsou vhodné pro použití podle předkládaného vynálezu, může plazmid obsahovat reporté30 rový gen. Pak se ve vhodný okamžik pro vnesení heterologní nukleové kyseliny do příjemcovské buňky provede test na expresi reportérového genu. K výhodným testům patří použití genu beta-glukoronidázy (gus) zE. coli popsaného v publikaci Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6.3901, která je zahrnuta formou odkazu.

Předkládaný vynález se prakticky využije pro produkci fertilních transgenních rostlin, které obsahují jeden nebo více požadovaných transgenů. Semena nebo další rozmnožovací materiál těchto rostlin lze využít k získání dalších generací transgenních rostlin (včetně jejich dalšího potomstva), které obsahují jeden nebo více transgenů vnesených do původních rostlin způsobem podle předkládaného vynálezu. Tyto následné generace (včetně jejich dalšího potomstva) a rozmnožo40 vací materiál těchto rostlin, včetně semen, představují také předmět předkládaného vynálezu.

Druhým aspektem předkládaného vynálezu je použití Agrobacterium tumefaciens ve způsobu transformace, který obsahuje inokulaci a kokultivací cílového pletiva s Agrobacterium, a sice v době, kdy je cílové pletivo ve svém přirozeném rostlinném prostředí, následované vytvořením dediferenciovaného pletiva z cílového pletiva. Inokulace se přitom provádí injikováním Agrobacterium do cílového pletiva.

Dediferenciované pletivo se pak volitelně regeneruje na celou transgenní rostlinu.

Avšak druhý aspekt předkládaného vynálezu je také výhodný v situaci, kdy se užívá dediferenciované pletivo (samotné nebo v podobě nikoliv úplné rostliny regenerované z původního pletiva.). K takovým situacím patří: skladování dediferenciovaného pletiva po určitou dobu před dalším použitím, získávání jiných užitečných produktů, např. sekundárních metabolitů, z buněčných nebo tkáňových kultur. Všechny výhodné vlastnosti prvního aspektu předkládaného vynálezu platí také pro jeho druhý aspekt.

-6CZ 301610 B6

Podle prvního a druhého aspektu vynálezu může být transformované dediferenciované pletivo regenerováno. Může být regenerováno tak, že vytváří např. kalusové pletivo, celé rostliny, fertilní celé rostliny, kořeny, nadzemní výhony nebo semena či jiný rozmnožovací materiál.

Třetí aspekt předkládaného vynálezu poskytuje použití Agrobacterium ve způsobu transformace, který obsahuje inokulaci a kokultivaci cílového pletiva s Agrobacterium, a sice v době, kdy je cílové pletivo ve svém přirozeném rostlinném materiálu cestou dediferenciace a případně regenerací cílového pletiva. Inokulace se přitom provádí injikováním Agrobacterium do cílového pleti10 va.

Transgenní rostlinný materiál získaný podle třetího aspektu předkládaného vynálezu je kalus, celá rostlina (výhodně fertilní), kořen, nadzemní část, semena nebo další rozmnožovací materiál.

Všechny výhodné vlastnosti prvního nebo druhého aspektu vynálezu platí stejně i pro třetí aspekt předkládaného vynálezu.

Čtvrtý aspekt předkládaného vynálezu poskytuje transformované rostlinné pletivo získané způsobem podle prvního nebo druhého aspektu vynálezu. K transformovanému pletivu podle vynálezu patří kalus, kořeny, nadzemní část rostliny, celá rostlina, semena nebo jiný rozmnožovací materiál. Pokud jde o celou rostlinu, nejvýhodněji je to fertilní rostlina.

Je celá řada důvodů, proč je postup podle předkládaného vynálezu úspěšný a proč cílové pletivo je citlivější k transformaci Agrobacterium pokud je ve svém přirozeném rostlinném prostředí.

Dále jsou uvedeny některé předpokládané důvody toho, proč je postup podle vynálezu úspěšný (aniž by však jakkoliv omezovaly rozsah vynálezu):

1. Cílové buňky se ve svém přirozeném rostlinném prostředí rychleji dělí nežje tomu v tkáňové kultuře.

2. Vyhnutí se ošetřování po izolaci (tj. inokulace a kokultivace) zvyšuje potenciál pro tvorbu kalusu a schopnost regenerace.

3. Různé buňky vyvíjejícího se pletiva jsou vystaveny Agrobacterium (na rozdíl od stavu tech35 niky), zejména subepidermální buňky, kteréjsou zřejmě lépe regenerovatelné.

4. Absence poranění (které je nutným předpokladem u většiny transformačních metod pro obiloviny dle stavu techniky) zajišťuje, že téměř všechny transformované buňky jsou schopny dalšího vývoje.

5. Spojení dvou kroků, a sice inokulace a kokultivace, do jednoho, redukuje stres, kterému je vystaveno cílové pletivo pri dvou izolovaných krocích.

6. Přirozené prostředí, kde se nachází semeno, je příznivější pro normální vývoj buňky v pří45 tomnosti Agrobacterium, než prostředí tkáňové kultury.

7. Povrchové buňky jsou měkčí v jakémkoliv cílovém pletivu a představují tudíž pro Agrobacterium menší bariéru než když jsou vystaveny vzduchu.

Způsoby transformace podle předkládaného vynálezu lze popsat následným ''obecným popisem metody, podrobnější popis je uveden v příkladech.

Následující obecný postup platí pro inokulaci embrya (v semenu). Odborníkovi je jasné, že tento obecný postup lze adaptovat i pro jiná cílová pletiva.

-7CZ 301610 B6

Příprava konstruktu ajeho přenos do Agrobacterium

Binární nebo super-binámí vektory, vektory pGreen nebo ko-integrační vektory obsahující požadované geny a selekční markéry a/nebo reportérové geny byly vneseny do Agrobacterium jednou z mnoha dostupných metod jako je např, triparentální konjugace nebo elektroporace. Použité Agrobacterium může být standardní kmen Agrobacterium tumefaciens, obvykle zbavený infekčnosti, nebo kmen Agrobacterium rhizogenes, jako jsou např. kmeny (avšak tento výčet není omezující):

to LBA4404 (Hoekma et al, Nátuře (1983) 303:179-180),

EHA101 (Hood etalj. Bacteriol. (1986) 168:1291-1301,

Neinfekční C58, např. pMP90 (Koncz a Schell, M.G.G. (1986) 204, 383-396,

LBA4404 obsahující pT0K233 (Hiei etal, Plant J (1994) 6:271-282).

Příprava Agrobacterium pro experimenty

Agrobacterium se inkubuje v médiu s vhodným selekčním antíbiotikem při 25 až 30 °C po 2 až 3 dny. Pak se bakterie odeberou a resuspendují v médiu TSIM1 (což je MS médium se 100 mg/1 myoinositolu, 10 g/1 glukózy, 50 mg/1 MES pufru s pH 5,5) nebo podobném kultivačním médiu, které může navíc obsahovat acetosyringon. Může se případně také přidat smáčedlo, např. kyselina pluronová F68, a další indukční činidla pro Agrobacterium, např. opiny nebo jiné rostlinné sekundární metabolity.

Příprava rostlinného materiálu

Výchozím materiálem pro tento protokol jsou květyjednoděložných rostlin (obvykle trav), a sice určitou dobu po antezi. Všechna stádia inokulace a kokultivace se provádějí na květech, když jsou na intaktní rostlině. Avšak pro účely snadné manipulace opatrného zacházení je výhodné část rostliny, která nese květy, od rostliny oddělit. Nicméně i tak květy zůstávají ve svém přirozeném prostředí rostliny, i když je část rostliny nesoucí květy odstraněna z původní celé rostliny. Tak napr. odnože pšenice nebo jiné obiloviny, přibližně 8 až 16 dnů po antezi jsou ode35 brány ze skleníku nebo kultivační komory s řízenými podmínkami Conviron. Nezralá semena, ponechaná na rostlině, jsou vystavena potřebnému ošetření. Tak např. u pšenice pluchy každého klásku a lemma z prvních dvou kvítků se opatrně odstraní, aby se obnažila nezralá semena. V každém klásku se obecně odkryjí pouze tato dvě semena. Tato procedura se provede po celé délce květu (klasu).

Inokulace nezralých semen

Suspenze Agrobacterium se inckuluje dc nezralých semen přibližně v místě rozhraní skutela a endospermu pomocí vhodného zařízení, napr. injekční stříkačky typu Hamilton. Objem podané suspenze bakterií je obvykle 1 μΐ, ale může se měnit např. v závislosti na velikosti semene.

Odnože se např. vloží do vody nebo do živného roztoku (a případně vloží do plastového vaku, aby se zabránilo dehydrataci semen) a umístí do osvětleného inkubátoru na 2 až 5 dnů (výhodně 2 až 3 dny). Teplota v inkubátoru je závislá na druhu obiloviny, avšak obvykle je 20 až 25 °C.

Izolace kultivace embryí

Po inokulaci se nezralá semena odeberou z rostliny a povrchově sterilizují. Pak se izolují nezralá embrya a umístí se do vhodného média, které stimuluje tvorbu kalusu (např. jak popsali Weeks et al., Plant Physiol., 102:1077-1084, 1993; Vasil et al., Biotech. 11: 1553-1558, 1993; Ishida et

-8CZ 301610 B6 al., 1996). Embrya pak postupují vhodnou procedurou tkáňové kultury, obsahující potřebné selekční kroky, která nakonec vede k regeneraci rostliny, výhodně transgenní rostliny.

Předkládaný vynález bude dále podrobněji a úplněji popsán formou příkladů výhodných prove5 dění vynálezu, které však vynález nijak neomezují. Příklady se také odvolávají na následující obrázky.

Přehled obrázků io

Obr. I ukazuje schéma klonovací strategie pSCVsulugi Obr. 2 je plazmidová mapa pSCVsulugi Obr. 2 je plazmidová mapa pSCVsulugi

Obr. 3 ukazuje přechodnou expresi GUS v nezralém embryu, histochemicky obarveném 4 dny po in vivo inokulaci a kokultivaci, viditelnou jako modré skvrny a čárky”.

Obr. 4 ukazuje oblasti kalusu exprimující GUS, histochemicky obarvené jeden měsíc po in vivo inokulaci a kokultivaci, viditelnou jako velké modré skvrny.

Obr, 5 ukazuje detail z obr. 4: tmavě modře zbarvenou a jasně vymezenou oblast kalusu s možností regenerace.

Obr. 6 ukazuje plazmidovou mapu pSBl lSulugi.

Obr. 7 ukazuje plazmidovou mapu pSCVI.2GI.

Obr. 8 ukazuje dočasnou expresi GUS v nezralých dělohách sóji.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Transformace pšenice metodou inokulace semena - dočasná exprese a tvorba transformovaného kalusu

Příprava konstruktu

Pro transformace byly připraveny následující konstrukty (viz obr. 1):

HindlII fragment z pAHC2S (Christensen et al, Plant Mol. Biol. (1992) 18:675-689) velikosti 4175 bp byl vložen do pIC19H (Marsh et aí, Gene (1984) 32:481-485) naštěpeného HindlII (výsledkem byl plazmid pAAA). BamHI, Sstl GUS-intronový fragment z pUCToplO-GUS ΓΝΤ (Weinmann et al, Plant J. (1994) 5:559-569) nahradil BamHI, Sstl GUS fragment z pAAA a vznikl tak pBBB. Xhol, Xbal fragment obsahující Sul^R z pWP258 (popsán v patentové přihlášce W0 98/49316) byl vložen do pSCVI (Firek et al, Plant Mol. Biol.(l993) 22:129-142) naštěpeného Sáli, Xbal, čímž vznikl pEEE. HindlII pUbi-GUSint fragment z pBBB byl so klonován do pEEE naštěpeného HindlII, čímž vznikl pSCVSuíugi (viz obr. 2).

Tento konstrukt byl vnesen do neinfekčního (disarmed) supervirulentního kmenu Agrobacterium tumefaciens EHA101, obsahujícího pEHAÍOl (Hood et al, J Bacteriol. (1986) 168:1291-1301) elektroporací a následně selektován na 50 mg/1 kanamycinu a 70 mg/1 gentamycinu.

-9CZ 301610 B6

Příprava Agrobacterium pro experimenty

Agrobacterium bylo inkubováno na zpevněném médiu YEP s 20 mg/1 kanamycinsulfátu při

27 °C po 2 dny. Baktérie byly odebrány a resuspendovány v médiu TSIM1 (MS médium se

100 mg/1 myoinositolu, 10 g/l glukózy a 50 mg/1 MES pufru pH 5,5) obsahujícím 400 μΜ acetosyringon až do dosažení optické hustoty 2,4 při 650 nm.

Příprava rostlinného materiálu io

Odnože pšenice NB 1 (odrůda jarní pšenice získaná od Nickerson Seeds Ltd, Rothwell, Lines.), přibližně 14 dní po antezi, (embrya byla přibližně délky 1 mm) byly sklizeny ze skleníku (22/15 °C teplota den/noc, s přisvětlováním na 16 hodinovou světelnou periodu denně). Všechny listy až na praporcový list byly odstraněny a praporcový list byl očištěn od kontaminujících spor plísní. Pluchy z každého klásku a lemma z prvních dvou kvítků byly opatrně odstraněny, aby se obnažila nezralá semena. Pouze tato dvě semena v každém klásku byla odkryta. To bylo provedeno po celé délce klasu. Všechny klasy pak byly povrchově sterilizovány postříkáním 70% IMS. Inokulace výhonů

Suspenze Agrobacterium (1 μ!) byla inokulována do embryí přibližně v úrovni rozhraní skutela a endospermu užitím 100 μΙ injekční stříkačky Hamilton, tak, aby všechna odkrytá semena byla inokulována. Stébla pak byla umístěna do vody a ještě zakryta průsvitným plastovým sáčkem, aby se zabránilo dehydrataci semen, a pak umístěna do osvětleného inkubátoru na 3 dny pri

23 °C, lóhodinovém dnu a ozářenosti 45 μπι m^-2 s“¹ PAR.

Izolace a kultivace embryí

Po 3 dnech kokultivace byla inokulovaná nezralá semena vyjmuta a povrchově sterilizována (30 sekund v 70% ethanolu, pak 20 minut ve 20% Domestosu, pak byla důkladně opláchnuta sterilní destilovanou vodou). Nezralá embrya (celkem 136) pak byla asepticky izolována a umístěna na médium W3 (jak bylo popsáno v patentové přihlášce W098/49316) s přídavkem 150 mg/1 Timentinu (W3T) skutelem nahoru (20 embryí na 1 misku). Kultury pak byly umístěny ve 25 °C na světle (16 hodin, 80 μΕ m'² s“¹ PAR).

Po 3 dnech kultivace na W3T bylo 50 embryí odebráno a přeneseno na roztok X-gluc (Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep, (1987) 5:386-405) ve 37° C na 16 hodin, aby se vyhodnotila exprese GUS. Vývoj embryonální osy u zbývajících embryí byl hodnocen 5 dnů po izolaci a osa byla odstraněna, pokud to bylo nutné pro zlepšení tvorby kalusu. Osm dnů po izolaci bylo odebráno dalších

31 embryí a byla obarvena stejně jako před tím.

Zbývajících 55 embryí se udržovalo na médiu W3T po 4 týdny, přičemž 2 týdny po izolaci byl proveden přenos na eersivé médium.

Jeden měsíc po izolaci byly kalusy ze zbývajících embryí vyhodnoceny z hlediska jejich embryogenní schopnosti a obarveny na expresi GUS.

Výsledky

Histochemické barvení 4 dny po inokulaci

Některá izolovaná embrya vykazovala známky poškození jehlou při inokulaci. To bylo jen zřídka spojeno s expresí GUS stanovenou histochemicky.

Exprese GUS v embryích měla tri základní podoby:

-10CZ 301610 B6

1. Standardní modré skvrny typické pro GUS, jak jsou v oboru známy, viz obr. 3.

2. Malé modré čárky” zahrnující několik spojených buněk, které všechny zjevně exprimují

GUS ve stejné míře, viz obr. 3.

3. Velké bloky tmavě modrého zbarvení na skutelu a embryonální ose, které začínají jako skvrny nebo čárky a rychle se rozšiřují na velké oblasti pletiva, takže není možná jejich kvantifikace.

Kombinace skóre z bodu 1 a 2 dala v průměru 6 skvrn na embryo s rozsahem 0 až 64 skvrn.

Kontrolní embrya (30) pocházející z inokulace s EHA101 nesoucím pouze pEHAlOl a žádný vektorový plazmid nevytvářela s X-gluc žádné modré zabarvení. Ani s EHA101 obsahujícím

SCVsulugi nebylo pozorováno žádné modré zbarvení.

Histochemické barvení 14 dnů po inokulaci

Profil zbarvení embryí byla mírně odlišný od profilu pozorovaného 4 dny po inokulaci. Zbarvení 20 bylo obvykle ve formě malých skvrn nebo někdy malých zón. Průměrný počet skvm/zón na embryo byl 3, s rozmezím 0 až 25. Embryo s největším počtem zabarvených míst mělo také modré zóny v pletivu skutela.

Vývoj kalusového pletiva

Po 4 týdnech růstu byl kalus pocházející z inokulovaných embryí velmi podobný kalusu pocházejícímu z neinokulovaných embryí. Přítomnost baktérií zjevně významně neredukovala embryogenní schopnost kalusu pocházejícího z inokulovaných embryí.

Histochemické barvení měsíc po inokulaci

Ze 55 zbývajících kalusů pocházejících z nezralých embryí, které byly obarveny X-gluc, 16 jevilo důkazy exprese gUS ve formě tmavě modře zbarvených buněk. V 6 z těchto kalusů byly pozorovány velké tmavě modré oblasti o průměru až 1 mm, které se vyskytovaly jako přesně ohraničené plochy, viz obr. 4. Tři z těchto modrých oblastí měly trojrozměrnou strukturu ve formě buněk vyčnívajících z povrchu kalusu (viz obr. 5) a byly vyhodnoceny jakožto embryogenní kalusy s dobrým potenciálem pro regeneraci.

Výskyt tří událostí trvalé integrace s dobrým regeneračním potenciálem v tomto experimentu ukázal, že postup podle vynálezu má vysokou transformační účinnost.

Příklad 2

Transformace pšenice metodou inokuíace semen - transformace a regenerace transgenních rostlin

Transformace byla provedena stejně jako v příkladu 1, až na to, že bylo inokulováno a izolováno 18 7 embryí a ty byly dále podrobeny selekci.

Selekce transformovaného kalusu

Po 12denní kultivaci na médiu W3T byly embryogenní kalusy přeneseny na médium W3 s 2 mg/l Asulamu a 150 mg/l Timentinu (W32AT). Kalusy byly udržovány na tomto médiu po další dva týdny a pak byl každý kalus rozdělen na 2mm kousky a ty byly znovu umístěny na W32AT,

-11 CZ 301610 B6

Po dalších dvou týdnech kultivace byla pletiva hodnocena z hlediska vývoje embryogenního kalusu: jakýkoliv kalus vykazující známky dalšího pokračování vývoje po 4 týdnech selekce byl přenesen na regenerační médium (RMT - MS médium s 40 g/1 maltózy a 150 mg/l Timentinu, pH 5,8, zpevněné 6 g/1 agarózy typu I, Sigma). Výhonky byly regenerovány během 4 týdnů na tomto médiu a pak byly přeneseny na médium MS30 se 150 mg/I Timentinu pro stimulaci dlouži vého růstu a zakořenění.

Výsledky io Transformace byla hodnocena jednou nebo více metodami z následujících metod:

a) GUS histochemické barvení (Jefferson, 1987) provedené alespoň na kořenech a listech

b) PCR analýza přítomnosti genu sul

Analýza PCR (polymerázovou řetězovou reakcí) byla provedena na genomické DNA extrahované z 1 až 2 cm² listového materiálu metodou, kterou popsali Stacey a Isaac (Methods in Molecular Biology, Vol.28: Protocols for nucleic acid analysis by nonradioactive probes, 9-15, Humana Press Inc., Totawa, NJ (1994)). PCR reakce byla provedena s olígonukleotidovými při* mery konstruovanými tak, aby byl v PCR amplifikován Sul fragment velikosti 380 bp: 5-TTGTGCGGTTCTTCGAGGCG-3' a 5-TGCGCTTCGCAGATCTCCAG-3', Reakční podmínky byly následující: horký start (94 °C, 3 minuty), pak 30 cyklů denaturace (95 °C, 30 sekund), annealing, tj. nasednutí primerů (60 °C, 30 sekund), extenze, tj. prodlužování DNA (73 °C, 2 minuty), a nakonec následoval 1 cyklus 73 °C (5 minut) a pak stálá teplota 24 °C.

c) Southern analýza

Southern analýza byla provedena na DNA z extrakce DNA v plném měřítku (9 ml) lyofilizovaného pletiva, které bylo rozdrceno (Stacey and Isaac, 1994). DNA vzorky byly upraveny na

0,2 mg/ml a pak naštěpeny restrikčními enzymy HindlII, EcoRJ a KpnI. Štěpení restrikčními enzymy, gelová elektroforéza a vakuový blotting (přenos na membránu pomocí vakua) byly provedeny postupem, který popsali Stacey and Isaac (1994). Digoxygeninem značené sondy Sul a gUS byly připraveny pomocí PCR metodou, kterou popsali McCreery a Helentjaris (Methods in Molecular Biology, Vol.28: Protocols for nucleic acid analysis by nonradioactive probes, 67-71,

Humana Press Inc., Totawa, NJ (1994)). Hybridizace sond na Southern blot (membránu s nanesenou DNA) a detekce chemilutninescenční metodou byly provedeny postupem, který popsali McCreery a Helentjaris (Methods in Molecular Biology, Vol.28: Protocols for nucleic acid analysis by nonradioactive probes, 107-112, Humana Press Inc., Totawa, NJ 1994)).

d) Segregační analýza TI generace

Tato analýza byla provedena histochemickým barvením klíčících semenáčků.

Byly regenerovány 2 rostliny reprezentující 2 odlišné transformační události (účinnost 1,1 %), listy a kořeny těchto rostlin vykazovaly silnou expresi GUS při histochemickém barvení. Stabilní transformace těchto rostlin byla potvrzena Southern analýzou a hodnocením segregace v potomstvu.

V samostatném experimentu bylo inokulováno 116 embryí a byly regenerovány 4 separátní trans50 genní linie pozitivní na GUS. Získané účinnosti (1,1 a 3,4 %) byly srovnatelné s účinnostmi dosaženými při jiných kombinacích vektorů a bakteriálních kmenů (viz příklad 5).

-12CZ 301610 B6

Příklad 3

Transformace kukuřice metodou inokulace semen exprese, produkce transgenních kalusů a transformovaných rostlin.

Příprava konstruktů

Konstrukty byly připraveny stejně jako v příkladu 1. i o Příprava Agrobacterium pro experiment

Agrobacterium se inkubovalo na zpevněném médiu YEP s vhodnými antibiotiky při 27 °C po 2 dny. Baktérie pak byly odebrány a resuspendovány v TSIM1 (MS médium se 100 mg/1 myoinositolu, 10 g/1 glukózy, 50 mg/1 MES pufru pH 5,5) obsahujícím 100 až 400 μΜ aceto15 syringon až do dosažení optické hustoty 2,0 až 2,4 při 650 nm.

Příprava rostlinného materiálu

Sekce rostlin kukuřice odrůdy AI 88 (pěstované ve skleníku, 20 až 35 °C, lóhodinový den) byly 20 vyříznuty tak, aby obsahovaly alespoň část stébla s jednou uzlinou pod a jednou uzlinou nad klasem (palicí), 6 až 14 dnů po antezi, a s alespoň jedním listem. Obalové listy klasu byly opatrně staženy, aby se obnažila nezralá semena a všechna vlákna byla odstraněna.

Ostrým nástrojem byla každá druhá podélná řada semen opatrně odstraněna zbylý klas byl lehce 25 postříkán 70% ethanolem.

Inokulace klasů kukuřice

Inokulace byla provedena stejně jako v příkladu 1. Sekce rostlin pak byly umístěny do vody 30 a obalové listy vráceny zpět na místo kolem klasu, aby se zabránilo dehydrataci semen, přičemž lze doporučit ještě dodatečné zakrytí plastovým sáčkem. Materiál byl pak umístěn do osvětleného inkubátoru při 23 až 25 °C na 2 až 5 dnů.

Izolace a kultivace embryí

Izolace a kultivace embryí byly provedeny postupně, který popsali Ishida et at., 1997. Embrya byla vyjmuta 2 dny po izolaci a byla analyzována na dočasnou expresi, zbytek byl podroben selekci, aby se regenerovaly trvale transformované rostliny kukuřice.

Příklad 4

Dočasná exprese v nezralých embryích pšenice po inokulaci semen v nepřítomnosti acetosyringonu jakožto induktoru

Příprava konstruktu

Příprava konstruktu byla provedena stejně jak bylo popsáno v příkladu 1.

Příprava Agrobacterium pro experiment

Ptýprava Agrobacterium byla provedena stejně jak bylo popsáno v příkladu 1, s výjimkou toho, že z inokulačního média byl vyloučen acetosyringon a byla užita nižší koncentrace Agrobacterium (OD 2,1 při 650 nm).

-13CZ 301610 B6

Příprava rostlinného materiálu

Příprava rostlinného materiálu byla provedena stejně jak bylo popsáno v příkladu 1.

Inokulace

Inokulace byla provedena stejně jak bylo popsáno v příkladu 1.

Izolace a kultivace embryí io

Izolace a kultivace embryí byly provedeny stejně jak bylo popsáno v příkladu I. Po dvou dnech na médiu W3T bylo 77 embryí vyhodnoceno na expresi GUS histochemickou analýzou s X-gluc.

Výsledky

Modré skvmy/čárky byly viditelné na horní a spodní straně skutela, a v mnohých případech se skvrny objevily také ve vnitřní struktuře skutela, tj. byly mezi vrchní a spodní epidermis. Jen několik málo embryí nejevilo žádné známky exprese GUS. Průměrný počet skvrn na jedno embryo byl 2 5,4 s rozpětím 0 až 252.

Další příklady provedení vynálezu

Je třeba rozumět, že zatímco vynález byl popsán s využitím výše uvedených podrobných příkladů, následující příklady slouží pouze k ilustraci vynálezu a nijak neomezují jeho rozsah. Také další aspekty, výhodná provedení a modifikace vynálezy spadají do rozsahu vymezeného připojenými patentovými nároky.

Příklad 5

Trvalá transformace pšenice metodou inokulace semen

Příprava konstruktu a jeho vnesení do kmenu Agrobacterium LBA4404

Xhol, Xbal fragment obsahující Sul^R z pWP258 (viz příklad 1) byl vnesen do pSBIl naštěpeného Xhol, Xbal (Komáři et al, Plant J. (1996) 10:165-174), čímž byl vytvořen pFFFII. HindlII pUbi-GUSint fragment z pBBB (viz příklad 1) byl klonován do pFFFII naštěpeného HindlII a vytvořil se tak pSBl 1 Sulugi (viz obr. 6).

Tento konstrukt byl vnesen do kmenu Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pSBl) (Komáři etaí, 1996) metodou elektroporace a pak byl selektován na 50 mg/l Spectinomycimt s cílem vytvořit rekombinaci super-binámí vektor pSBUlSulugi.

Příprava baktérií pro inokulaci

Agrobacterium bylo kultivováno a resuspendováno jak bylo popsáno v příkladu 1, avšak s různým množstvím acetosyringonu (0 až 400 μΜ) v inokulačním médiu.

Inokulace semen

Inokulace semen byla provedena stejně jako v příkladu 1, experiment zahrnoval 50 až 300 embryí, viz tabulka 1.

Tkáňové kultury z izolovaných embryí

- 14CZ 301610 B6

Tkáňové kultury z izolovaných embryí byly provedeny stejně jako v příkladu 2.

Výsledky

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1. Data v tabulce 1 představují úspěšný experiment - několik málo neúspěšných experimentů bylo vyloučeno.

Transformace byla hodnocena jednou nebo více metodami z následujících metod: to a) GUS histochemické barvení (Jefferson, 1987) provedené alespoň na kořenech a listech

b) PCR analýza přítomnosti genu sul

c) Southern analýza

d) Segregační analýza Tl generace

Transformační účinnost

Transformační účinnost v úspěšných experimentech byla v rozmezí 0,5 až 5,8 %, průměr byl 1,5 %. Transformované rostliny byly regenerovány z experimentů buďto s indukčním činidlem acetosyringonem v indukčním médiu nebo bez něho.

Přenos genu GUS do generace TI byl potvrzen u několika linií, viz tabulka 1.

Transformační účinnosti dosažené v těchto experimentech byly srovnatelné nebo dokonce vyšší než dosud publikované účinnosti transformace pšenice (Vasil et al., Bio/Technology (1992), 10:667-674. Weeks et al, Plant Physiol. (1993), 102:1077-1084, Nehra et al., Plant J. (1994), 5:285-297, Becker et al., Plant J. (1994), 5:299-307. Zhou et al., Plant Celí Rep. (1995),

1 5: 159-163, ChengeZ a/., (1997))

Integrační profily

Profily integrace genu u transformovaných linií byly v rozpětí od inzerce jediné kopie genu s Mendelovskou dědičností až po linie s větším počtem kopií, a sice až T kopií T-DNA.

Příklad 6

Příprava konstruktů

Konstrukty byly připraveny stejně jako v příkladu 1 nebo byl užit LBA 4404 (pSB131) popsaný v IshidaeZa/,, 1997.

Příprava Agrobacterium pro experiment

Agrobacterium se inkubovalo na zpevněném médiu YEP s výhodnými antibiotiky při 27 ^ĎC po 2 dny. Baktérie pak byly odebrány a re suspendovány v TS1M1 (MS médium se 100 mg/1 myoinositolu, 10 g/1 glukózy, 50 mg/1 MES pufru pH5,5) obsahujícím 100 až 400 μΜ acetosyringon s 0 až 0,5% pluronovou kyselinou F68 až do dosažení optické hustoty 2,0 až 2,4 při 650 nm.

-15CZ 301610 B6

Příprava rostlinného materiálu

Sekce rostlin kukuřice (Zea mays L.) odrůdy A188 nebo Hill (pěstované ve skleníku, 20 až °C, lóhodinový den) byly vyříznuty tak, aby obsahovaly alespoň část stébla s jednou uzlinou 5 pod a jednou uzlinou nad klasem (palicí), 6 až 14 dnů po antezi, a s alespoň jedním listem.

Obalové listy klasu byly opatrně staženy, aby se obnažila nezralá semena a všechna vlákna byla odstraněna, klas byl pak sterilizován lehkým postříkáním 70% ethanolem.

Inokulace klasů kukuřice

Inokulace byla provedena stejně jako v příkladu 1. Sekce rostlin pak byly umístěny do vody a obalové listy vráceny zpět na místo kolem klasu, přičemž byly dodatečné zakryty fólií, aby se zabránilo dehydrataci semen. Materiál byl pak umístěn do osvětleného inkubátoru při 22 až 25 °C na 2 až 5 dnů.

Izolace a kultivace embryí

Po kokultivaci byl klas (palice) sterilizován 20 minut ve 20% roztoku Domestosu. Embrya pak byla asepticky izolována, opláchnuta dvakrát LSinf (Ishida et al., 1997) s přídavkem 250 g/l

Cefotaximu a pak přenesena na médium LSD indukující tvorbu kalusu (Ishida et al. 1997) na až 10 dnů ve tmě a 25 °C Embrya byl vyjmuta 2 dny po izolaci a byla analyzována na dočasnou expresi, zbytek byl podroben selekci, aby se regenerovaly trvale transformované rostliny kukuřice, jak popsali Ishida et al., 1997.

Výsledky

Jak je ukázáno v tabulce 2, inokulace nezralých embryí v semenu kukuřice vedla k přenosu

T-DNA a expresi genu GUS u obou odrůd a s oběma užitými kmeny baktérií. Ačkoliv jen 3 až % nezralých embryí exprimovalo GUS po kokultivaci, byly regenerovány transgenní rostliny 30 rezistentní k fosfinotricinu, které exprimovaly GUS. Frekvenci transformace lze považovat za relativně vysokou vzhledem k tomu, že počet embryí podrobených selekci na trvalou transformaci byl nízký. To ukazuje, že dokonce i když přenos T-DNA je nižší než v tradičním plně in vitro systému (Ishida et al, 1997), inokulace embryí v jejich přirozeném rostlinném prostředí zasahuje buňky, které mají lepší regenerační schopnost.

Tyto výsledky také ukázaly, že způsob podle vynálezu je použitelný í pro jiné jednoděložné rostliny a pokud jde o transformační krok, je nezávislý na odrůdě.

Příklad 7

Příprava transgenních rostlin Brassica napus inokulaci Agrobacterium do báze řapíku děložního lístku

Příprava konstruktu

Hind III fragment P35S-nptII-tNOS izolovaný z pCaMVNEO (Fromm et al., Nátuře (1996),

319: 791-793) byl vložen do pSCVl (Firek et al, Plant Mol. Biol. (1993) 22:129-142), čímž vznikl pSCVI.2. Hind III fragment p35S-gus-intron-po!yACaMV (Vancanneyt et al., M.G.G. so (1990), 220: 245-250) byl pak vložen do místa Srna v pSCV 1.2, čímž vznikl pSCV 1.2GI (obr. 7),

Tento konstrukt byl vnesen do kmenu Agrobacterium tumefaciens C58pMP90 (Koncz a Schell,

1986),

- 16CZ 301610 B6

Příprava klíčních rostlin

Semena Brassica napus RV31, což je jarní odrůda, pro odstranění všech houbových nebo bakteriálních patogenů byla povrchově sterilizována užitím 10 % Domestosu po 20 minut, pak důkladně opláchnuta sterilní vodou. Pak byla semena (110) položena na médium pro klíčení (MS médium s 20 g/1 saeharózy) v Beatsonových lahvičkách (10 semen na lahvičku) a umístěny v teplotě 25 °C se lóhodinovou světelnou periodou po dobu 3 dnů. Takto naklíčené semenáčky jsou ve stádiu, kdy se již objevily děložní lístky s řapíky, ale nejsou ještě plně rozvinuty.

Příprava Agrobacterium

C58pMP90 SCV1.2GI bylo inokulováno do 10 ml média s příslušným selekčním antibiotikem kultivováno při 28 °C na rotační třepačce přibližně 24 hodin. Po kultivaci přes noc byla kultura stočena 20 minut při 2000 rpm a supematant odstraněn. Peletované baktérie byly resuspendovány v tekutém médiu MS30 (médium MS obsahující 3 0 g/1 saeharózy) až do dosažení OD₆50nm přibližně 2,0 (2,175).

Inokulace Agrobacterium

Bakteriální suspenze (0,5 až 1,0 μΐ) byla injikována do báze řapíku děložního lístku pomocí 10 μΐ injekční stříkačky Hamilton. Semenáčky pak byly přeneseny na 2 dny do 20 °C.

Indukce kalusu a regenerace rostlin

Děložní lístky byly z rostlinek odříznuty a samostatně kultivovány postupem, který popsali Moloney et aí, Plant Cell Reports (1989) 8: 238-242. Povrch odříznutých řapíků děložních lístků Brassica napus takto kultivovaných prošel během 8 denní kultivace krátkým obdobím vývoje kalusu z pletiva obnažených cévních svazků před tím, než se v kalusu začaly tvořit meristémy nadzemní části (Ono et aí, Plant Cell Reports (1994) 14: 13-17).

Výsledky

Z 200 explantováných děložních řapíků bylo získáno 6 transformovaných výhonů, jak bylo určeno barvením X-gluc na expresi genu GUS a také PCR analýzou genu NptlI, což odpovídá transformační účinnosti 3 %. 1 další linie podle analýzy PCR obsahovala gen, avšak v testu s X-gluc neprojevila žádné zbarvení. Analýza TI generace z 5 transformovaných linií exprimujících GUS užitím barvení X-gluc ukázala přenos genu GUS do další generace s následujícími výsledky

Vyhodnocení aktivity GUS v rostlinách TI generace

Linie	Pozitivní	Negativní	Poměr
1	10	10	1:1
2	9	0	9:0
3	21	0	21:0
4	19	0	19:0
5	14	1	14:1

Diskuse

Inokulace Agrobacterium do řapíků děložních lístků, pokud jsou stále ještě součástí celých klíčních rostlinek představuje významnou odchylku od dosud známých transformačních systémů, kdy se nejdříve řapíky odřezaly a pak se provedla aplikace Agrobacterium. Ačkoliv je nový postup fyzicky obtížněji proveditelný, prokázal se po krátkém zacvičení jako výrazně účinnější.

Po několikaleté zkušenosti se pomocí standardních postupů u stejné odrůdy Brassica napus

-17CZ 301610 B6 rutinně dosahovalo transformační účinnosti 5 až 10 %. Dosažení účinnosti 3,0 % na druhý pokus (a první pokus měl účinnost 1,25 % - jedna transformanta z 80 explantátů) je proto u zcela nové metody překvapující. To navíc dále demonstruje využitelnost této metody genového přenosu do libovolných druhů rostlin, u kterých existuje fáze kalusu - ač jde o jednoděložné nebo dvou5 děložné rostliny.

Příklad 8 io Transformace sóji inokulaci semen - dočasná exprese Příprava konstruktu

Agrobacterium tumefaciens kmen LBA 4 404 byl transformován super-binámím vektorem ts pVec035 obsahujícím intron genu GUS řízený promotorem CaMV 35S (získáno od B. Pelissier,

Aventis Crop Science, Lyon, Francie).

Příprava Agrobacterium pro experiment

Agrobacterium se inkubovalo na zpevněném médiu YEP s vhodnými antibiotiky při 27 °C po 2 dny. Baktérie pak byly odebrány a resuspendovány v TSIM1 (MS médium se 100 mg/1 myoinositolu, 10 g/1 glukózy, 50 mg/1 MES pufru pH 5,5) obsahujícím 100 až 400 μΜ acetosyringon až do dosažení optické hustoty 0,5 až 2,0 pri 650 nm.

Příprava rostlinného materiálu

Sója gíycine max cv. Jack se pěstoval ve skleníku pri teplotě 23 až 25 °C, s přisvětlováním na 14hodinový den.

Inokulace semen sóji

Nezralá semena byla inokulována, když embrya byla 3 až 7 mm velká. 0,5 až 1 μί suspenze Agrobacterium bylo injikováno stejně jako v přikladu 1 skrze lusk mezi dělohy v podélném směru k embryu. Rostliny pak byly inkubovány při 23 až 25 °C po 2 až 5 dnů.

Izolace embryí a jejich kultivace

Po kokultivaci byla nezralá semena vyjmuta a sterilizována po 20 minut ve 20% roztoku Domestosu. Embrya pak byla asepticky izolována a přenesena na médium MSI indukující tvorbu kalusu (MS médium s B5 vitamíny a 60 g/1 sacharózy a 40 mg/1 2,4—D, zpevněné 3 g/1 Phytagelu, upraveno na pH 7) s přídavkem 350 mg/1 Cefotaximu na světle ve 27 ^C. Po 2 až 10 dnech byla embrya užita pro histochemický test na GUS pro vyhodnocení účinnosti přenosu T-DNA.

Výsledky

Jakje ukázáno v tabulce 3, inokulace nezralých embryí sóji v semenu a lusku vedla k účinnému přenosu T-DNA a expresi GUS. Skvrny a oblasti pozitivní na gUS byly široce rozšířeny po celém embryu a nebyly spojeny jen s místem poranění (obr. 8). Na rozdíl od transformace metodou SAAT (Santarém et aí, Plant Cell Report ( 1998), 17: 752-759) tento způsob poskytuje jednoduší transformační protokol a vyšší regenerační potenciál, jelikož cílové buňky nejsou poraněny.

- 18CZ 301610 B6

Příklad 9

Transformace slunečnice metodou inokulace semen - dočasná exprese

Příprava konstruktů Byly užity konstrukty:

- C58Cl(pGV2260) (Simpson et aí, Plant Mol. Biol. (1986), 6: 403-416) (pBinl9) (Bevan,

Nuc. Acids Res. (1984), 12: 8711-8121) io - C58pMP90(pSCV1.2GI) - viz příklad 7 Příprava Agrobacterium

Agrobacterium se inkubovalo na zpevněném médiu YEP s vhodnými antibiotiky při 27 °C po

2 dny. Baktérie pak byly odebrány a resuspendovány v TSIM1 (MS médium se 100 mg/1 myoinositolu, 10 g/1 glukózy, 50mg/l MES pufru pH5,5) obsahujícím 100 až 400 μΜ acetosyringon až do dosažení optické hustoty 2,0 až 2,4 pri 650 nm.

Příprava rostlinného materiálu

Slunečnice Helianthus atmuus cv. HA300B se pěstovala ve skleníku pri teplotě 15 až 30 °C, s přisvětlováním na 14hodinový den.

Inokulace semen

Nezralá semena byla inokulována 10 až 25 dnů po antezi. Injekce 1 μΙ suspenze Agrobacterium byla aplikována jako v příkladu 1 skrze mikropyle (otvor klový) mezi dělohy. Vrchol se pak inkuboval 2 až 5 dnů při 22 až 25 °C.

Izolace embryí a kultivace

Po kokultivaci byla nezralá semena vyjmuta a sterilizována 20 minut ve 20% roztoku Domestosu. Embrya pal byla asepticky izolována a umístěna na médium indukující kalus (MS médium s 30 g/1 sacharózy, zpevněné 10 g/1 agar-agaru, s pH 5,7, a s přídavkem 0,5 mg/1 NAA, 0,5 g/1

BAP a 500 mg/1 Cefotaximu) a pak kultivována pri 21 až 24 °C, při lóhodinovém dnu a ozářenosti 30 μΕ m'² s^_l PAR. Po 2 až 10 dnech byla embrya užita pro histochemické barvení GUS k vyhodnocení účinnosti přenosu T-DNA.

Výsledky

Jak ukazuje tabulka 4 inokulace nezralých embryí slunečnice přítomných v semenech vedla k přenosu T-DNA a expresi genu GUS s oběma užitými kmeny (5,9 % až 65,4%) . Skvrny pozitivní na GUS byly lokalizovány hlavně na dělohách, ale transformační události byly patrné i na hypokotylu. Pouze dva experimenty byly uskutečněny k vyhodnocení možností metody pro transformaci nezralých embryí slunečnice. Překvapivě bylo ukázáno, že metoda podle vynálezu byla velmi účinná, i přesto, že se vývoj nezralého embrya zdál být kritickým parametrem.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob transformace rostlin, vyznačující se tím, že obsahuje kroky inokulace a kokultivace cílového pletiva z cílové rostliny s Agrobacterium v takové době, kdy je cílové pletivo ve svém přirozeném rostlinném prostředí, a následně obsahuje přípravu transgenní rostliny cestou dediferenciace a regenerace z cílového pletiva, přičemž inokulace se provádí injii o kováním Agrobacterium do cílového pletiva.
2. Způsob transformace podle nároku 1, vyznačující se tím, že transgenní rostlina je fertilní rostlina.

15
3. Způsob transformace, vyznačující se tím, že obsahuje kroky inokulace a kokultivace cílového pletiva z cílové rostliny s Agrobacterium v takové době, kdy je cílové pletivo ve svém přirozeném rostlinném prostředí, následně obsahuje vytvoření dediferencovaného pletiva z cílového pletiva, přičemž inokulace je provedena přímým a aktivním přenosem Agrobacterium do cílového pletiva.
4. Způsob transformace podle kteréhokoliv z nároků laž 3, vyznačující se tím, že poranění cílových buněk v cílové tkáni je udržováno na minimu neboje zcela vyloučeno.
5. Způsob transformace podle kteréhokoliv z nároků laž4, vyznačující se tím, že

25 alespoň část dediferenciace cílového pletiva se provádí in vitro.
6. Způsob transformace podle kteréhokoliv z nároků laž 5, vyznačující se tím, že cílová rostlina patří k jednoděložným nebo dvouděložným rostlinným druhům.

30
7. Způsob transformace podle nároku 6, vyznačující se tím, že rostlina patří do čeledi gramineae.
8. Způsob transformace podle nároku 7, vyznačující se tím, že cílová rostlina je vybrána ze skupiny sestávající z rostlin: pšenice, ječmen, kukuřice, rýže, oves, žito, Čirok a proso.
9. Způsob transformace podle nároku 6, vyznačující se tím, že cílová rostlina je vybrána ze skupiny sestávající z rostlin: řepka, paprika, sója, slunečnice, cukrová řepa, dýně, chřest, cibule, palma olejová, sladký brambor a banánovník.

40
10. Způsob transformace podle kteréhokoliv z nároků laž 9, vyznačující se tím, že cílové pletivo je embryo, květ, semeník, báze listu nebo prašník.
11. Způsob transformace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, v y z n a č u j í c í s e t í m , že cílové pletivo je nezralé embryo, nezralý květ, nezralý semeník, nezralá báze listu nebo nezralý

45 prašník.
12. Způsob transformace podle nároku 11, vyznačující se tím, že cílovou oblastí pro inokulaci je rozhraní mezi dvěma vrstvami buněk, které jsou v těsném kontaktu.

50
13. Způsob transformace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že po dobu inokulace Agrobacterium se nepřidává žádné Činidlo indukující vir v Agrobacterium.
14. Způsob transformace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že po dobu kokultivace s Agrobacterium se nepřidává žádné činidlo indukující vir v Agro55 bacterium.

-20CZ 301610 Bó
15. Způsob transformace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že inokulace Agrobacterium je provedena injikováním suspenze Agrobacterium do cílového pletiva užitím injekční stříkačky.
16. Použití Agrobacterium při způsobu transformace rostlin, který obsahuje kroky inokulace a kokultivace cílového pletiva z cílové rostliny s Agrobacterium v takové době, kdy je cílové pletivo ve svém přirozeném rostlinném prostředí, a následně obsahuje přípravu transgenního rostlinného materiálu cestou dediferenciace a regenerace z cílového pletiva, přičemž inokulace se proi o vádí inj ikováním Agrobacterium do cílového pletiva.
17. Použití Agrobacterium podle nároku 16, kdy transgenní rostlinný materiál se dediferencuje a případně regeneruje pro vytvoření kalusu, kořenu, nadzemní části rostliny nebo celé rostliny, výhodně fertilní rostliny.
18. Způsob přípravy transformovaného rostlinného pletiva, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy se cílové pletivo cílové rostliny transformuje způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13.
20 19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že transformované rostlinné pletivo je kalus, kořen, nadzemní část rostliny, celá rostlina, výhodně celá fertilní rostlina, semeno nebo jiný rozmnožovací materiál.