CN100360677C - 一种植物转基因方法 - Google Patents

Abstract

一种植物转基因方法，涉及一种植物转基因方法，以农杆菌介导转化刚受精完毕而形成的合子胚；转化的合子胚在植株上成熟为种子；对种子进行筛选；获得转化子，本技术适合玉米、大豆、水稻等可对子房进行操作的受粉结实植物。该技术优点是，不用组织培养，不依赖基因型，不依赖实验室条件，效率高。

Description

一种植物转基因方法

技术领域：

本发明涉及一种植物转基因方法，尤其涉及一种将目的基因转至受体植物的方法。

背景技术：

利用转基因技术可以冲破物种的界限，实现物种间的基因传递，并能改良现有物种的生物性状，最大限度为人类服务。不仅如此，转基因技术还提供了科学的研究手段，使人类科技实现新的飞跃成为可能。但植物转基因方法有很多种，在进行植物转基因时应选择什么方法才最有效，这是一个十分关键的问题。目前用于外源基因导入植物细胞的方法和技术很多，总的来说可分为直接和间接法。

1.DNA直接导入法。DNA直接导入法可分为：化学物质诱导法、电穿孔法、脂质体法、微注射法、基因枪法(微弹轰击法)和花粉管通道法等等。DNA直接导入法用得最多的植物材料是原生质体，另外可用植物材料包括器官分生组织、未成熟的胚、愈伤组织、悬浮细胞、花粉、卵细胞等等。

1.1化学物质诱导法现在用得最多的物质是聚乙二醇，它能与原生质体融合，影响原生质体膜的通透性，致使原生质体较好地吸收外源DNA。一般PEG浓度较低时，不会对原生质体造成伤害，而获得的转基因植株来自同1个细胞，避免了产生嵌合转化体，转化稳定性和重复性好，但对原生质体培养和再生困难的植物难以利用，且转化率低，一般在10^-5～10^-6。

1.2.电穿孔是植物细胞膜在外界高压电脉冲下造成的非对称穿孔，这种孔孔径较小(8.4nm左右)，并可在很短时间内(200ns)恢复到0.5nm，因此外源基因可以进入细胞。电穿孔法对细胞没有害处，但需要有特殊的设备，对不同的材料需要有严格的参数控制。由于对原生质体再生的依赖，在应用上也受到了很大的限制。

1.3.脂质体法就是将包含外源基因的带负电的脂质体与植物原生质体融合，从而达到转基因的目的。

1.4.微注射法是使用毛细管(一般针尖的直径为0.5nm)，在显微镜下将外源DNA注射入植物细胞或原生质体的一种直接转化方法。

1.5.基因枪法又称高速微弹法或微弹轰击法，即用钨或金粒(直径1～2μm)包裹外源DNA，而后以一定的方法加速这种微粒去穿透植物细胞壁和细胞膜，使外源DNA能进入到植物细胞中。基因枪法在使用过程中有它的局限性，如转化效率不高，基因插入往往是多拷贝的，常造成转基因的失活或沉默，轰击过程中可能造成外源基因的断裂，使插入的基因成为没有活性的片段，出现非转化体或嵌合体的可能性较高，可能导致植物本身的某些基因非正常表达，还有可能发生共抑制现象。

2.载体介导法

2.1农杆菌介导法农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。它是利用根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中，T-DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因组中。用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性，可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获得稳定的表达。根癌农杆菌质粒Ti转化系统是目前研究最多、技术方法相对成熟的转化途径。但长期以来，用农杆菌介导的基因转移都局限在双子叶植物范围内。直到近年来，用农杆菌转化单子叶植物才取得了重大突破。

2.2病毒介导法病毒载体是最近新出现的一种用于植物转化的载体。植物病毒转基因系统是将外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒对植物细胞的感染而将外源基因导入植物细胞。病毒载体比较小，便于在实验中操作，而且这类载体只要与植物细胞共培养就可以较高地感染植物细胞，外源基因能在植物细胞中快速复制和高水平表达。但是病毒载体的容量有限，不能包装大片段的外源DNA基因，寄主范围窄，复制稳定性差，转录和复制机理复杂。故至今还没有确定的证据表明，植物病毒是否可以整合进植物细胞的基因组中。有人认为转入的外源基因稳定遗传的可能性不大。因此，目前植物病毒载体系统还未得到广泛使用。

3.其他方法  除上述的一些主要方法外，还有离子束介导法、超声波介导法、激光微束穿孔法、萌发种子的电泳法、花粉管通道和种子浸泡法等。它们各有其优缺点及适用范围，对于特定的植物或在一定的条件下被证明是有效的。

DNA直接导入法，对于稳定的植物或在一定的条件下被证明是有效的，但它的一个主要不足之处是存在多变的DNA整合方式，DNA直接导入法导入外源基因的拷贝数较多，转入频率低。而多拷贝的外源基因在受体植物基因组上的排列方式大多是串联，遗传性状的表现形式是单个基因，有时，多拷贝的外源基因可散布在受体植物基因组的不同位点，使整合方式非常复杂，也为确定有效的整合带来困难。这些变化或修饰发生的频率远远大于土壤农杆菌的载体介导法。自1993年以来，农杆菌介导的基因转化在一些重要的禾谷类作物上相继获得成功，农杆菌转化法有着明显的优势，表现为：转入的外源基因多是单拷贝或低拷贝数插入，并且先插入活性区域，转化效率高，转入的外源基因通常呈预期的孟德尔遗传，转化再生的植株通常是可育的，而且方法简单、有效。因此，农杆菌介导的转化愈来愈成为各种植物转基因的主要方法，已得到广泛应用。农杆菌介导转化的受体包括幼胚、幼胚产生的愈伤组织、茎、叶、茎尖分生组织、子叶节等。

上述的方法都依赖于组织培养，都需要建立一套植株高频再生的体系，这样，有很多种材料存在基因型依赖，很多种植物和品种无法成功建立这个体系，也就无法用这些技术做转化。这些方法的很多工作要在试验室操作，需要一定条件支持。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种不依赖组织培养的新的植物转基因方法。

本发明的技术方案是这样实现的：先在植株临近受精后形成的合子胚的子房部位造成创伤；再用农杆菌浸染伤口，让农杆菌内的基因载体质粒转化活体植株上的合子期幼胚；转化的幼胚在活体植株上长大成种子；对种子进行筛选，从而获得转基因植株。

具体可采用以下步骤进行：

1、将欲转化的受体植物培育至开花；

2、在转化操作之前，将含有基因载体的农杆菌培养至对数期，以植物组织培养转化用共培养培养基重悬至0.D600＝0.5-1.5浓度，作为转化菌液；

3、在受体植物受精后合子期使子房上端造成创伤；

4、将转化菌液与子房上伤口处接触，与子房在植株上共培养；

5、看护，培育至长成种子；

6、收获种子，对种子进行筛选，获得转基因植株。

本发明的优点是：

本发明不用组织培养，不依赖基因型，不依赖实验室条件，适用于各种授粉结实、子房可以人为创伤的植物，包括禾本科的玉米、稻、麦；豆科的大豆、豌豆、豇豆、蚕豆、绿豆、小豆、菜豆；茄科的蕃茄、茄子、辣椒；葫芦科的黄瓜、西瓜、南瓜、冬瓜；十字花科的萝卜、油菜、白菜、甘蓝、芥菜、芜箐以及棉花可以对子房进行人工创伤处理的植物。

具体实施方式：

本发明在具体应用时，根据受体植物的不同，采用不同方法使子房造成创伤，并根据花器特点用涂、抹、沾、滴等不同方法使转化菌液与子房上伤口处接触。对种子进行筛选时，根据所用载体含有的筛选基因，对种子苗在培养基上或营养钵中筛选，选择剂初选后，用PCR、Southern blot筛选鉴定。下面结合具体实施例进行说明：

实施例1：

玉米转化。材料：自交系8902；基因及载体：半夏凝集素(PTA)pCAMBIA3300PTA，菌种EHA101。于春季种植玉米自交系8902，待长至受粉期，上午10:00授粉，第二天下午4:00进行转化操作。操作前一天准备菌液，从平板划取单菌落，培养一夜，第二天操作前，用植物转化共培养培养基重悬，浓度0.D600＝1.0-1.5，作为转化液。转化时，先对雌穗进行处理，剥开包叶，将花丝，即花的雌蕊垂直由上至下从根扯断，由上至下是指雌穗尖端至穗底部，然后用细毛刷蘸取菌液刷涂。之后，合上包叶，用塑料袋罩好，外再套上纸袋，秋季收获种子。共得2255粒种子，播于小营养钵内，一钵一粒，再将其置入能盛水的盘中，使营养土一次浸透，等待发芽。发芽长出两片叶时，用Basta除草剂(载体含Bar基因)100-200ppm均匀喷洒，几天后再喷一次，未转化的苗死亡，最终获得109株活苗，移栽于田间。待缓苗后，取叶片做PCR进行进一步鉴定筛选，从中获得转化株。

实施例2：

大豆转化。材料：大豆品种吉育25号；基因及载体pBI121pta.待长至受粉期，上午8:00-10:00自花受粉，下午4:00进行转化操作。操作前一天准备菌液，从平板划取单菌落，培养一夜，第二天操作前，用植物组织培养转化共培养培养基重悬，浓度O.D.600＝0.5-1.0，作为转化液。用移液枪吸取菌液滴在子房伤口处，用棉花球蘸菌液盖在操作的花序上，等待收获。共得112粒种子，播于小营养钵内，一钵一粒，再将其置入能盛水的盘中，使营养土一次浸透。待萌发两片真叶平展时，用卡那霉素(载体含NPTII基因)500ppm均匀喷洒，几天后再喷一次，未转化的苗死亡，最终获得5株活苗，移栽于花盆中。待缓苗后，取叶片做PCR进行进一步鉴定筛选。从中获得转化株，Southern blot结果证明是阳性。

Claims (4)

1、一种植物转基因方法，其特征在于：先在植株临近受精后形成的合子胚的子房部位造成创伤；再用含农杆菌的转化液浸染伤口，让农杆菌内的基因载体质粒转化活体植株上的合子胚；转化的幼胚在活体植株上长大成种子；对种子进行筛选，从而获得转基因植株，其中，所述的植物是各种授粉结实、子房能够人为创伤的植物。

2、根据权利要求1所述的植物转基因方法，其特征在于：所述的转化液是将含有基因载体的农杆菌培养至对数期，以植物组织培养转化用共培养培养基重悬至0.D600＝0.5-1.5。

3、根据权利要求1所述的植物转基因方法，其特征在于对于玉米植株的方法为剥开雌穗包叶，使其子房暴露在外，垂直向下扯下花丝，用细毛刷蘸取菌液从上至下刷至穗底部，合上包叶，套上塑料袋，再套一纸袋，共培养。

4、根据权利要求1所述的植物转基因方法，其特征在于对于大豆植株的方法为用移液枪吸取菌液滴于子房伤口上，用棉花蘸菌液扣在操作花上，共培养。