FI104907B - Rypsin Agrobacterium-välitteinen transformaatio - Google Patents

Description

104907

Rypsin Agrobacterium-välitteinen transformaatio 5 Keksinnön ala Tämä keksintö liittyy kasvibiotekniikkaan ja erityisesti uuteen transformaatiomenetelmään, jolla aikaansaadaan siirtogeenisiä rypsikasveja.

10

Keksinnön taustaa

Rypsi (Brassica rapa ssp. oleifera, syn. B. campestris) on yleinen öljyä tuottava satokasvi Pohjois-Euroopassa, 15 Kanadassa ja Intian niemimaalla. Canola-tyyppisellä rypsiöljyllä on korkea ravinnollinen laatu. Rypsin siemenet sisältävät runsaasti varastoproteiineja, mikä tekee mahdolliseksi niiden käytön rehuna. Tärkeän teollisen arvonsa takia rypsi on usein siirtogeenisen tutkimuksen koh-20 teenä. Rypsin onnistuneesta geneettisestä transformaatiosta ei kuitenkaan ole olemassa montaakaan raporttia.

Transformaatiomenetelmiä, joissa käytetään agrobakteeri-infektiota, on kehitetty rypsin, B. rapa ssp. oleifera « · a 25 (Radke ym. 1992) ja lajin B. campestris (brown sarson) · '·· (Mukhopadhyay ym. 1992) alkeisvarren siirroksille. Muu- ·’·.. tamat muut raportit agrobakteerivälitteisestä rypsin {·1: transformaatiosta (Knutzon ym. 1992; Shiba ym. 1995) • · ;·,(i perustuvat Radken ym. 1992 (supra) menetelmään. Rypsin 30 siirrostettujen versojen uusiutuminen on ollut erittäin • · · ongelmallista, mikä on ollut esteenä transformaatiomene- ... telmien kehittämiselle 1980-luvulla. Äskettäin B. rapa » · ’···’ ssp. oleiferan uppiniskaisuus voitettiin, kun versojen • · *·.♦1 uusiutumisen aikana alkeisvarsien ja sirkkalehtien siir- 35 rosten kasvatusalustaan lisättiin hopeanitraattia (Chi ym. 1990; Hachey ym. 1991; Palmer 1992).

« « ·

Transformaatiomenetelmiä on menestyksellisesti kehitetty '··' rypsin lähisukuisten kasvien täysin kehittyneistä yksi- 2 104907 loista otetuille siirroksille, nimittäin rapsille (Fry ym. 1987; Pua ym. 1987). US-patentin No. 5,188,958 vaatimukset kohdistuvat Brassica-lajien transformaatioon. Selityksessä ainoa onnistunut transformaatio on osoitettu 5 lajille Brassica napus (lajike Westar).

Keksinnön yhteenveto

Nimenomainen tavoitteemme on käyttää kehittynyttä kasvi-10 kudosta, erityisesti kukkiavarren kappaleita siirrosten lähteenä, mikä mahdollistaa menestyksekkäästi saman genotyypin lisäämisen ja transformoimisen. Olemme alustavissa kokeissa tutkineet eri tekijöitä, joilla voisi olla vaikutusta kehittyneen kasvin eri kohdista lähtöisin ole-15 vien siirrosten uusiutumis- ja transformaatiokapasiteet-tiin. Kokeiden tuloksena olemme kehittäneet uuden trans-formaatiomenetelmän kehittyneen rypsikasvin kukkavarren osalle, käyttäen hyväksi Agrobacterium tumefaciens -infektiota.

20 Tämä keksintö siis luo rypsin kehittyneille kasviyksi-: : loille uuden ja tehokkaan transformaatiomenetelmän, jossa kehittyneen rypsikasvin kukkavarren nivelvälistä leika- « 4 taan osa, joka steriloidaan ja jaetaan pienempiin osiin, 25 jotka asetetaan vaakasuoraan asentoon agar-kasvatusalus- ··. talle (MS-elatusaine) , johon on lisätty hopeanitraattia • ♦» *... ja hormonia. Kaikki MS-elatusaineet sisältävät sakkaroo- » · « * siä. Leikkeitä kasvatetaan kyseisellä kasvatusalustalla 1 vrk (24 tuntia), ja sitten ne upotetaan MS-liuokseen, • » · *·' ’ 30 jossa on Agrobacterium tumefaciens -bakteereita, joissa • · » V * on ainakin yksi kyseiselle rypsille vieras geeni. Ylimää- j·.·. räinen neste poistetaan upotetuista leikkeistä suodatin- • * .···, paperilla ja leikkeet asetetaan vaakasuoraan asentoon MS- ·' yhteiskasvatusalustalle, johon on lisätty hormoneja ja ‘ “ 35 haluttaessa asetosyringonea, ja jossa niitä kasvatetaan yhdessä agrobakteerin kanssa 2 vrk (48 tuntia) transformaation suorittamiseksi. Agrobakteeri pestään pois yh- 3 104907 teiskasvatetuista leikkeistä ja ne asetetaan välittömästi pystysuoraan asentoon alapuoli alaspäin MS-agarille anti-bioottiselektiota varten. Selektiota jatketaan kolmesta kuuteen viikkoa käyttäen kanamysiiniä tai hygromysiiniä.

5 Myöhemmin varsileikkeet asetetaan uusiutumisalustalle, johon on lisätty hormoneja ja siirtogeeniset versot erotetaan ja niitä kasvatetaan noin kuukauden ajan MS-alus-talla ilman hormoneja. Keksinnön mukaisen transformaatio-menetelmän päävaiheet on esitetty kuvassa l.

10

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Edellytykset rypsin varren siirrännäisten onnistuneelle transformaatiolle ovat seuraavat: 15

Transformaatioon käytettävien kasvihuonekasvien hyvä kunto. Kasvien pitäisi kasvaa nopeasti, olla vihreitä ja kontaminaatiovapaita. Otettaessa varren palasia kasvien tulisi olla oikeassa kasvuvaihees-20 sa, so. kukkavarren kasvaessa, ennen ensimäisen ku kan avautumista.

• t>>: Varrenpalaset leikataan kahdesta ylimmäisestä 2-5 cm pituisesta nivelvälistä, steriloidaan ja käyte-tään transformaatioon.

25 Nivelvälit leikataan 4-8 mm pituisiksi leikkeiksi « · :·. ja asetetaan MS-agarille vaakasuoraan asentoon • ♦ · [...# es ikasva tus vaihetta varten (yksi vuorokausi) ja • · · myöhemmin yhteiskasvatusvaiheeseen Agrobacterium tumefaciens -bakteerin kanssa (kaksi vuorokautta).

• * ♦ *·* * 30 Kolmen vuorokauden kuluttua siirrokset pestään »»« • · « *.* · agrobakteerista ja asetetaan pystysuoraan asentoon ·*·*: (alapuoli alaspäin) MS-agarille selektiota varten, • ♦ sillä versojen uusiutuminen tapahtuu pääasiassa

• M

varrenpalasten alapuolella.

: 35 Transformoitujen kudosten selektio tulisi aloittaa * ‘ välittömästi yhteiskasvatuksen jälkeen.

4 104907

Kasvatusten eri vaiheiden hormonikäsittely riippuu lajikkeesta seuraavien vaihteluvälien sisällä: 3-6 vrk 0,5-3 mg/1 2,4-D:tä»l-2 viikkoa 2-3 mg/1 BAP:ia ja 0-0,1 mg/1 NAA:ta»uusiutuneiden 5 versojen erottaminen» 1 kk ilman hormoneja» juurtuminen 0-0,5 mg/1 NAA:ta.

15-90 μΜ (2,5-15 mg/1) hopeanitraattia MS-alus-tassa, kuten myös huokoinen paperiteippi maljojen sulkemista varten on tarpeen, jotta saadaan 10 pienennetyksi etyleenipitoisuutta maljoilla, joilla leikkeitä kasvatetaan, ja että saadaan tehokas ilmanvaihto, sekä transformaation että selektion/uusiutumisen aikana.

15 Kokeellinen osa

Lyhenteet BAP 6-bentsyyliaminopuriini 20 2,4-D 2,4-dikloorifenoksietikkahappo GUS β-glukuronidaasi (uidA reportterigee- ni)

Hyg Hygromysiini IAA indolyyli-3-etikkahappo 25 Kan Kanamysiini ··.1 MS Murashige-Skoog elatusaine tai agar * · · NAA a-naftaleenietikkahappo • · · ' 1 YEB agrobakteerisolujen kasvatukseen tar koitettu elatusaine

Ml v : 30 • · · • · · • ♦ · • · · • « · • « • · ♦ · · • 4 · 5 104907

Murashige-Skoog (HS) kasvielatusaineen koostumus:

Suolat: g/1 vitamiinit mg/1 5 NH4N03 1,65 tiamiini 0,1 KNO, 1,9 pyridoksiini 0,1

MgS0,x7H20 0,37 nikotiinihappo 0,5 KH2POj 0,17 myoinositoli 100

CaCl2x2H20 0,44 glysiini 2,0 10 mg/l g/l h3bo3 6,2 sakkaroosi 2,0

MnS0,x4H20 22,3 agar 7

ZnS0,x7H20 8,6 15 KJ 0,83 pH 5,6

Na2Mo0,x2H20 0,25

CuS04x5H20 0,025

CoC12x2H20 0,025 20 Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuva 1. Esittää keksinnön mukaisen transformaatiomenetel-: -.: män vaiheet. A. Kasvisiirrosten luovuttaja transformaa-

I I

tiota varten. Kaksi ylintä nivelväliä merkitty. B. Trans- 25 formaatioon käytetyt varrenpalaset asetettuna vaakasuo- ··/ raan asentoon. C. Yhteiskasvatuksen jälkeen varrenpalaset • · · *... asetetaan MS-agarille pystysuoraan asentoon alapuoli « · · ’ alaspäin selektiota varten. D. ja E. Ensimmäisen kuukau den aikana uusiutuneet versot erotetaan ja kasvatetaan ««« • · · *.* * 30 ilman hormoneja.

• · · • · » • · »

Kuva 2. Esittää siirtogeenisten rypsilajikkeiden Valtti • · ,···. ja Sisu Southern blot -analyysin tulokset. Lyhenteet: M - • · "·* molekyylipainovakio; V1-V6 - siirtogeeninen lajike Valt- : “ 35 ti; S2-S6 - siirtogeeninen lajike Sisu; C - negatiivinen *·**· kontrolli (=DNA:ta ei-transformoidusta rypsistä) . Kasvin 6 104907 DNA-näytteet oli leikattu EcoRI- ja BamHI-katkaisuentsyy-meillä.

Materiaalit ja menetelmät: 5

Kasvimateriaali. Suomalaisten rypsilajikkeiden Valtti ja Sisu siemeniä idätettiin ja kasvatettiin kasvihuoneolois-sa 3-4 viikkoa. Varren kasvuvaiheessa ennen ensimmäisten kukkien avautumista kaksi ylintä 2-5 cm pitkää nivelväliä 10 kukkavarresta leikattiin irti ja steriloitiin 90 sekunnin ajan 70% etanolissa ja 10 minuuttia Na-hypokloriitissa (2% aktiivista Cl") , johon oli lisätty Tween 20 ja pestiin kolme kertaa steriilissä vedessä. Sitten nivelväli leikattiin 4-8 mm pituisiksi leikkeiksi, joita käytettiin 15 transformaatiossa.

Agrobacterium tumefaciens -kanta C58C1, joka sisälsi pGV3850-plasmidin (Zambryski ym. 1983), kanta C58C1, joka sisälsi pGV2260-plasmidin (Deblaere ym. 1985), kanta 20 EHA105 (Hood ym. 1993) ja kanta LBA4404, jotka sisälsivät pAL4404-plasmidin (Hoekema ym. 1983), testattiin rypsin transformaatiossa. uidA (GUS) geeni, joka sisältää ei-koodaavan alueen (uidA-int) (Vancanneyt ym. 1990) kloo-ti nättiin kaikkiin T-alueen sisältäviin vektoreihin ja 25 käytettiin transformaatiossa. Tämä ei-koodaavan alueen :·. sisältävä geenikonstrukti estää GUS-geenin ilmentymisen

• »I

*... bakteereissa ja mahdollistaa kasvitransformaation etene- ♦ ♦ ♦ J • · « ‘ misen seuraamisen varhaisessa vaiheessa. C58C1 kantojen transformoinnissa käytettiin kointegratiivista pHTT294 • · « *·* ’ 30 -vektoria, joka on oleellisesti samanlainen kuin pHTT370 • · · *.* * (Elomaa ym. 1993); se sisältää uidA-geenin, jossa on ei- ·*♦*: koodaava alue ja se on 35:35S-AMV promoottorin alaisena • · (Datla ym. 1993). uidA-geeni poistettiin binäärivekto-reista pGPTV-KAN ja pGPTV-HPT (Becker ym. 1992) ja kor-: " 35 vattiin uidA-geenillä, joka sisältää ei-koodaavan alueen * ’· ja joka on fuusioitu CaMV 35S -promoottoriin. Saadut vek- 7 104907 torit siirrettiin kaikkiin edellä mainittuihin kantoihin.

Agrobakteeria kasvatettiin yön yli ravistelussa YEB-lie-messä (Lihtenstain ja Draper, 1985), johon oli lisätty 5 sopivat antibiootit. Sen jälkeen 1/100 tilavuudesta lisättiin tuoreeseen YEB-liemeen (samat antibiootit), jossa joko oli tai ei ollut 100 μΜ asetosyringonea ja kasvatettiin toisen yön yli ravistelussa. Agrobakteeria, jonka ODioo=1.0 käytettiin transformaatioon.

10

Kasvitransformaatio. Rypsin kukkavarren leikkeitä (4-8 mm pituisia) kasvatettiin 24 tuntia vaakasuorassa asennossa 0,7% MS-agarilla (Murashige ja Skoog, 1962), johon oli lisätty hopeanitraattia. Kaikissa MS-kasvatusalustoissa 15 käytettiin 2-3% sakkaroosia ja kaikki in vitro kasvatukset tehtiin 16 tunnin ajan päivänvalossa, 25°C päivälämpötilassa ja 18°C yölämpötilassa. Sitten siirrokset upotettiin 1-3 minuutiksi MS-liuokseen, johon oli siirros-tettu yli yön kasvatetun Agrobacterium tumefaciens -vil-20 jelmän laimennosta (esim. 1/10 til./til.). Sen jälkeen ylimääräinen neste poistettiin varrenpalasista suodatinpaperilla ja sitten siirrokset asetettiin vaakasuoraan v asentoon MS-agarille yhteiskasvatukseen bakteerien kanssa :·. kahdeksi päiväksi. Kasvatusalustaan oli lisätty asetosy- 25 ringonea (3,5-dimetoksi-4-hydroksiasetofenoni (Aldrich))

• I

ja hormoneja. Siirrokset pestiin klaforan- (cefotaxim) • · · *... tai karbenisilliini-vesiliuoksessa (700 mg/1) . Sitten • · · ’** * niiden pinnat kuivattiin suodatinpaperilla ja ne asetet tiin pystysuorasti alapuoli alaspäin kasvatusalustalle ··· *.* * 30 selektiota varten.

··· • · · • · ·

Selektio ja uusiutuminen. Lopulta siirrosten kasvatus 3-6 • · .···. päivää käyttäen 0,5-1,5 mg/1 2,4-D:tä, sen jälkeen 7-14 *1' päivää 2-3 mg/1 BAPria ja 0-0,5 mg/1 NAA:ta (pitoisuus ja « · : *" 35 aika riippuvat lajikkeesta) huomattiin parhaaksi vihrei- den alkioasteella olevien kyhmyjen ja kantasolukkojen muodostumiselle. Sen jälkeen koko siirros tai leikatut 8 104907 kalluspalat vihreine kyhmyineen ja kantasolukkoineen siirrettiin horxnonivapaalle MS-alustalle, missä kyhmyistä kehittyi kantasolukkoja ja versoja. Siirtogeenisten kasvien transformaatiossa ja uusiutumisessa käytettiin 5 hopeanitraattia 0-90 μΜ (0-15 mg/1) konsentraatiossa ja huokoista paperiteippiä petrimaljojen sulkemiseen.

Uusiutuneet siirtogeeniset versot oli kasvatettu hormo-nivapaalla MS-alustalla tai alustalla, jossa oli 0,1-0,2 10 mg/1 NAA:ta juurtumisen stimuloimiseksi, varren pidentymiseksi, mikrolisääntymiseksi ja kukinnon muodostumisen ehkäisemiseksi.

Selektioon kanamysiinillä tai hygromysiinillä ryhdyttiin 15 välittömästi siirrosten agrobakteerin kanssa suoritetun yhteiskasvatuksen jälkeen; kolme päivää käsittelyn aloittamisen jälkeen. Antibiootteja käytettiin pitoisuuksissa 20-25 mg/1 kaikkien vaiheiden ajan siirtogeenisten kasvien uusiutumisessa ja kasvatuksessa.

20

Siirtogeenin ilmentymisen analyysi. Histologinen GUS- testi tehtiin transformoidulle kallus- ja lehtikudoksel- le. Käytimme kasvitransformaatioon vain uidA-geeniver- siota, jossa on ei-koodaava alue, estääksemme GUS-geenin I'. 25 ilmentymisen agrobakteerissa. Tämä mahdollistaa GUS-akti- :·. viteetin testaamisen transformaation varhaisissa vaiheis- • ·· .···, sa, jopa välittömästi yhteiskasvatuksen jälkeen. Opti- • · mointikokeissa teimme tavallisesti GUS-testin neljä päi- ... vää agrobakteeri-yhteiskasvatuksen jälkeen.

V ! 30 • · · • · · *·* * Seuraava taulukko 1. esittää parhaimpina pidetyt olosuh- :*·*: teet transformoitaessa lajikkeita Sisu ja Valtti kysei- • · sellä transformaatiomenetelmällä.

I « I • · : ''· 35 • · · I * • · 9 104907

Taulukko 1.

Esikosv. 1 Yhteiskosv. Valinta Volinta Juurtu- vrk 2 vrk 1 —2 viikkoa 2-4 viikkoa minen 5 Sisu Hormonit 1,5 mg/l 1.5 mg/l 3 mq/l BAP + ilman 0,2 mq/l

2.4— D 2,4-D 0.005 mg/l NM NM

Hopeanit- 30 pM 0-30pM 30 pM 30 pM 15 pM

raotti

Volinto - - 20 mg/l kon/hyg 20 mg/l kon/hyg

Valtti Hormonit 0,5 mg/l 0,5 mg/l 3 vrk 0,5 mg/l ilmon 0,2 mg/l

2.4- D 2,4-D 2,4-D ->-> NM

3 mg/l BAP + 0,05 mg/l NM (tai 2 mg/l BAP)

Hopeonit- 30 pM 0-30 pM 30 pM 30 pM 15 pM

rootti

Volinto - - 25 kan, 20 hyg 20-25 kon/hyg _

Ne siirtogeeniset kasvit, jotka osoittivat vakaata posi-10 tiivistä GUS-geenin ilmentymistä ja kasvoivat hyvin ';··] selektio-olosuhteissa, kasvatettiin kasvihuoneessa ja II· valittiin Southern blot -analyysiin vahvistamaan trans- • · : *" formaatiotapahtuma DNA-tasolla ja kasvigenomiin asettu- : *.·' neiden kopioiden lukumäärä.

15 • :T: Southern -analyysi .·;·. Southern-analyysi tehtiin käyttäen PCR-reaktiolla digok- sigeniinileimattua uidA -geeniä koettimena Boehringer • · · 20 Mannheimin kehittämän menetelmän mukaan. GUS-positiivi- t« * i sesta rypsistä leikattiin 3 μg DNA:ta EcoRI- ja BamHI- • · ·

katkaisuentsyymeillä. Nämä entsyymit leikkaavat kahden :·. kiloemäksen kokoisen uidA-geenifragmentin pGPTV-KAN

• · I

’t<>: (-HPT) -plasmidin T-alueesta, joka on insertoitunut kasvin • · 25 genomiin. Koska T-alue sisältää yhden ylimääräisen BamHI-leikkauskohdan ja koska kasvi-DNA-näytteet on epätäydel- 10 104907 lisesti leikattu, oli joissakin raidoissa kuuden ja neljän kiloemäksen kokoiset positiiviset vyöhykkeet. Tyypillinen Southern blot on esitetty kuvassa 2. Siirtogeeniset linjat V2, V5 ja V6 lajikkeesta Valtti ja S5 lajikkeesta 5 Sisu oli transformoitu käyttäen pGPTV-KAN-pohjäistä vektoria ja ne olivat sen mukaisesti vastustuskykyisiä kana-mysiinille. Linjat VI, V3, S2, S3 ja S6 oli transformoitu pGPTV-HPT-pohjäisellä vektorilla ja ilmensivät vastustuskykyä hygromysiinille. Southern-analyysi kasvi-DNA:s-10 ta, joka on katkaistu vain yhdellä entsyymillä, osoittaa että noin 1/10-1/3 transformoiduista kasveista sisältää vain yhden siirtogeenin genomia kohden. 5 μg ei-transfor-moitua rypsin kontrolli-DNA:ta oli myöskin leikattu samoilla katkaisuentsyymeillä ja ajettu samoissa geeleissä 15 näytteiden kanssa. (Raita c kuvassa 2.).

Transformaatiomenetelmän kehittämisen alustavien kokeiden tulokset 20 Kasvit, joista otettiin siirroksia. Yksi menetelmän kriittisiä tekijöitä on alkuperäiset transformaatioon tarvittavat kasvit. Nopeasti kasvava kasvusolukko on sijoittunut kukkavarren ylimpien nivelvälien alueelle ennen kukkavarren pidentymistä ja kukintaa. Sopivimpia versojen 25 uusiutumiseen ja agrobakteeritransformaatioon ovat osat, jotka saadaan ylimmistä 20-50 mm pituisista nivelväleis- • · · tä. Niiden uusiutumis- ja transformaatiokapasiteetti • · « * yltää joskus 90-100%:iin yksittäisissä kasviyksilöissä. Kasvin kunnollinen kasvuvaihe, tummanvihreä tukeva varsi • t · • · · V * 30 ja kontaminaatiovapaus olivat ehdottomia edellytyksiä

IM

V * onnistuneelle transformaatiolle.

« M * • · · « · • · ,··. Kasvitransformaatio. Kolme eri A. tumefaciens -kantaa, • · ’·’ nimittäin C58C1, EHA105 ja LBA4404 testattiin niiden • · i *** 35 transformaatiokapasiteetin suhteen. C58ClpGV2260 pitää sisällään kointegratiivisen vektorin pHTT ja C58ClpGV3850 pitää sisällään sekä kointegratiivisen vektorin pHTT että 11 104907 binäärivektorin pGPTV-KAN. Kantaan EHA105 lisättiin bi-näärivektori pGPTV-KAN ja LBA4404 lisättiin vektorit pGPTV-KAN ja pGPTV-HPT. UidA (GUS) reportterigeeni, joka sisältää ei-koodaavan alueen, kloonattiin pGUS-int:stä 5 kaikkiin binääri- ja kointegratiivisiin vektoreihin, jotta voitiin sulkea pois ne virheet, jotka geenin ilmentyminen agrobakteerissa GUS-testin aikana voisi aiheuttaa. UidA-int geeni asetettiin CaMV 35S promoottorin säätelyn alaiseksi. Eri agrobakteerikantojen transfor-10 maatiotehokkuus mitattiin kalluksen sinisten alueiden osuutena neljä päivää transformaation jälkeen. Kolmen transformaatiokokeen tulokset, yhteenveto taulukossa 2, osoittavat, että kannalla LBA4404 on korkein siirrostus-kapasiteetti, mikä vaihteli 40-90 % riippuen transfor-15 moidusta kasviyksilöstä. Tämä kanta on melkein kaksi kertaa niin tehokas rypsin transformoija kuin C58C1 tai EHA105. Näiden tulosten perusteella A. tumefaciens -kantaa LBA4404 käytettiin keksinnön mukaisessa transformaa-tiomenetelmässä.

20

Taulukko 2. Eri A. tumefaciens -kantojen transforxnaa-tiotehokkuudet 4 « « i 4

i I « · I

I I I

« I --—

I I

; Agrobakleerikonnot. joisso Sisu Valtti Keskiarvo i'*'; 25 auttojoplosmidi ! . % • · sininen kallus/koikki kallus sininen kallus/koikki kollus : *” % % • · · f · · - _ _ _______ C58C1pGV2260pHTT 16/56 29 19/61 31 30 C58C1pGV3850pHTT 23/54 43 21/64 33 38 • · · 11 1 ^1 : C58C1 pGV3850pGPTV 5/55 9 7/60 12 10.5 • * « 1 1 ^I »Hl n -i - : EHA105pGPTV 5/61 8 11/61 18 13 i « < *" 30 LBA4404pGPTV 40/61 66 33/62 53 59,5 • · « » ______________ t · * · · • · 12 104907

Versojen uusiutuminen. Alustavissa kokeissa testattiin eri hormonien vaikutuksia eri täysikasvuisilla rypsiyksi-löillä, jotta saataisiin versot uusiutumaan riittävän tehokkaasti. Kinetiinillä on samanlainen positiivinen vai-5 kutus versojen uusiutumiseen kuin BAP:11a. Myös IAA:lla on vaikutusta kudosten erilaistumiseen, kuten myös NAA:1-la. Kinetiini ja IAA olivat vähemmän tehokkaita kuin BAP ja NAA (tietoja ei esitetty).

10 Uusiutumistestiin sisällytettiin myös lehden palasia, lehtiruotia ja kukkavarren osia, alkeisvarsia ja sirkkalehtiä. Sekä alkeisvarsien että kukkavarren palasten ja myöskin lehtiruotien uusiutumiskapasiteetti näyttivät olevan paremmat kuin lehden palasten ja sirkkalehtien.

15 Kaksi erilaista versojen uusiutumismenetelmää kehitettiin rypsin alkeisvarsille ja kukkavarren osille. Ensimmäinen on versojen aikaansaaminen kasvattamalla siirroksia samalla hormonikoostumuksella koko transformaatiomenetelmän ajan. Toisessa vaihdetaan hormonitasapainoa auksiineista 20 sytokiniineihin. Yksivaiheinen regeneraatio oli paras 2 mg/1 BAP:a ja 0,5 mg/1 NAArta sisältävällä alustalla.

,,, Regeneroituneet versot kärsivät kuitenkin vitrifikaatios- ta tai versojen alkiot muodostuivat siirrosten pintaan ilman kalluksen muodostumista, mikä vähensi siirtogeeni-: 25 sen kudoksen valintamahdollisuutta. Korkein keskimäärä!- M * : V nen versojen uusiutumistaso kukkavarren osille oli n. 40- 60%.

«I· • · · • · ·

Meidän kokeissamme kaksivaiheinen regeneraatio oli lupaa-30 vampi. Kasvatus 1,5-0,5 mg/1 2,4-D 3-6 päivän ajan (aika • · · 4*..# ja pitoisuus riippuvainen lajikkeesta) ja sitten 1-2 vii- • · · kon ajan 3 mg/1 BAP:ia ja 0,05 mg/1 NAA:ta sisältävällä * · · : alustalla johti nopeaan kalluksen ja vihreiden alkioiden • « · ·..,· muodostumiseen. Eri lajikkeiden ihanteellinen hormonikä- ;·. 35 sittely esitetään taulukossa 3. Paras alkion ja kantaso- lukon muodostumisaste kukkavarren osille vaihteli 40-80 % • | välillä. Alkiot, joissa on kehittynyt kantasolukko ja 13 104907 pienet kalluksen osat, pitäisi siirtää MS-alustalle ilman hormoneita, jotta voitiin estää seuraava vitrifikaatio ja hormonialustan hajoaminen. Vihreät pahkurat ja kantasolu-kot kehittyivät versoiksi ja juuriksi 2-3 viikossa MS-5 alustalla ilman hormoneja. Uusiutuneilla versoilla oli usein taipumusta muodostaa kukinto. Tämän välttämiseksi ja juurten muodostumisen indusoimiseksi muodostuneet versot ja leikkeet kasvatettiin sen jälkeen MS-alustalla, johon oli lisätty 0,2 mg/1 ΝΆΆ:ta. Tämä kaksivaiheinen 10 versojen uusiutuminen (2,4-D:stä BAP:iin) näytti olevan hyödyllisempi menetelmä transformaatiota varten paremman valintamahdollisuutensa ansiosta kalluksen muodostumisvaiheessa. Tämän jälkeen tätä menetelmää käytettiin keksinnön mukaisena transformaatiomenetelmänä.

15

Taulukko 3. Optimaalinen hormonikäsittely versojen re-generoimiseksi rypsilajikkeiden Sisu ja Valtti kukkavar-ren paloista 20 Lojike Auksiinikö- Sytokiniini- Versojen Juurtumi- Volinto mg/l sittely (en- käsittely muodostu- nen, verso- simmöinen (toinen voi- minen, hor- jen piden- vaihe) he), 1-2 monivopao tyminen Kon Hyq : ": viikkoo : Sisu 1,5D 3 vrk 3B + 0.05N 2-6 viikkoo 0-0.2N 20 20

Voltti 0,5D 6 vrk 2B toi 3B + 2-6 viikkoo 0.1-0.2N 25 20

1. . 0.05N

• · · I

• · • · : *·· * Lyhenteet: D - 2,4-D; B - BAP; N - NAA, hormonipitoi- • · · •V · 25 suudet: mg/1.

Monien eri tekijöiden vaikutuksia versojen uusiutumiste-hokkuuteen testattiin. Optimaaliset arvot olivat pH - 5,5-5,6, sakkaroosipitoisuus - 2%, kiinteytysaineet - * · · 30 0,7% agar. Poikkeavuuksilla standardi Murashige-Skoog- alustan NH/, NOj', K* ja Ca** ionikonsentraatioista tai glukoosin pitoisuuden lisäämisellä tai kasvatuksella B5-• alustalla ei näyttänyt olevan vaikutusta versojen uusiu tumiseen.

14 104907

Hopeanitraatin käyttö ja ilmastus. Hopeanitraatin käyttö rypsin in vitro -kasvatuksissa on usein raportoitu olevan välttämätön tekijä versojen uusiutumiselle (Chi ym. 1990; Hachey ym. 1991; Mukhopadhyay ym. 1992; Radke ym. 1992).

5 Sekä hopeanitraatin käytön että huokoisen paperiteipin käytön petrimaljojen sulkemisessa on osoitettu vähentävän etyleenipitoisuutta ja kosteutta viljelyastiassa kasvatuksen aikana. Olemme tutkineet hopeanitraatin vaikutusta rypsin siirrosten uusiutumiskapasiteettiin. Ihanteellisin 10 pitoisuus versojen uusiutumiseksi oli kokeissamme 5-10 mg/1 (30-60 μΜ) AgN03. Olemme huomanneet, että 5 mg/1 ho-peanitraattia on riittävä varren siirrosten yhtäjaksoiseen kasvatukseen ja versojen uusiutumiseen. Hopeanitraatin korkea konsentraatio (10 mg/1 tai enemmän) saattaa 15 kuitenkin johtaa kasvatetun kalluksen ruskettumiseen tai osittaiseen kuolioon.

Hopeanitraatilla on negatiivinen vaikutus agrobakteerin kasvuun. Hopeanitraatin lisäys 5 mg/1 (30 μΜ) pitoisuu- 20 dessa tukahduttaa agrobakteerin kasvua MS-alustalla yhteiskasvatuksessa kasvin siirrosten kanssa. Olemme transformoineet rypsin kukkavarren osia käyttäen erilai- siä pitoisuuksia hopeanitraattia ja sulkeneet kasvisiir- ".**· ros-maljat parafilmillä tai huokoisella paperiteipillä.

: 25 Transformaatiotehokkuus mitattiin histologisella GUS- ·*·*: testillä 4 päivää yhteiskasvatuksen jälkeen. Transformaa- • · ·*· tiotehokkuus esitetään taulukossa 4 kaikkien sinisiä • · · inkluusioita kalluksessa sisältävien siirrosten suhteena • · · kaikkiin siirroksiin (myös prosentteina). Kasvatusalustan ... 30 hopeanitraatilla ei meidän kokeissamme ole negatiivista • · · vaikutusta transformaatioon. Hopeanitraatilla on ilmei- • · · ’·’ ’ sesti jopa positiivinen vaikutus transformaatiotehokkuu- teen. Oletamme, että kukkavarren palaset ovat niin suuria :***: että hopeanitraatilla ei ole suurtakaan haitallista ..* 35 vaikutusta agrobakteeriin, jos siirrokset on asetettu ’ ] vaakasuoraan. Vain siirrosten alapuoli ei transformoidu kun MS-alustalla on hopeanitraattia. Hopeanitraatilla 15 104907 näyttää olevan jonkinasteinen positiivinen vaikutus transformaatioon vähentämällä etyleenin vastakkaista vaikutusta ja näin lisäämällä siirrosten elinkykyä. Tämä olettamus voi auttaa selittämään taulukossa 4 esitetyn 5 kokeen tuloksia.

Huokoisella paperiteipillä (3M huokoinen paperiteippi saatavana lääketieteellisiin sovelluksiin) sulkeminen lisää ilmastusta ja vähentää etyleenin pitoisuutta ver-10 rattaessa parafilmiin. Huokoisella paperiteipillä sulkeminen lisää uusiutumiskapasiteettia kokeissamme 0-5%:sta 60-80%:iin eikä sillä ole ainakaan haitallista vaikutusta transformaatioon (ks. taulukko 4).

» • · · • 1 a • · • · • · • · * · · • · · • · · • · · • · · • · « • · · • · · • · · • · $ « • · • · · » » · • · · · 16 104907

Taulukko 4. Hopeanitraatin, asetosyringonen ja huokoisella paperiteipillä sulkemisen vaikutukset rypsin kukkavar-ren palasten transformaatioon agrobakteerikannalla LBA4 4 04pGPTV-KAN-GUSint.

5

Lajike: Sisu Lajike: Valtti Keskiarvo

KoSWteliiSt CUS+/ I S GUS+/ I % % kaikki kaikki 0 mq/l AqNOj 17/58 29,3 20/61 32,8 31,5 5 mq/l AgNOj 19/70 27,1 14/37 37,8 29,5 10 10 mq/l AqNOj 15/53 28,3 15/32 46,9 37,6 15 mq/l AgNOj 17/40 42,5 14/43 32,6 37,6

OpMAS' 28/65 43,1 27/72 37,5 40,3 100pMAS" 24/65 36,9 36/78 46,2 41,6 100 μ M AS”' 29/65 44,6 35/72 48.6 46,6 15 poraiilmillä sulj. 6/24 25 6/10 60 42,5 paperiteipillä sulj. 13/21 61,9 7/12 58,3 60,1 • · · 1-— I .-.1.- · __l _ • « * AS tarkoittaa, että asetosyringonea lisättiin YEB- • · alustaan, jolla agrobakteeri kasvaa 20 ** Asetosyringonea lisättiin MS alustaan siirrostuksen • · ;·. ja agrobakteerin kanssa tapahtuvan yhteiskasvatuksen • · · *... aikana • · · • · · ’ *** AS lisättiin MS-alustaan ja agrobakteeria kasva tettiin yhden yön ajan 100 μΜ asetosyringonelisäyksellä.

* · · 25 • · · *.· * Selektio. Estääksemme agrobakteerin kasvun kasvatusalus- ·*·*; talla käytimme klaforania (cefotaxim) 500 mg/1 tai kar- .···. benisilliiniä 200 mg/1 pitoisuuksina. Klaforan kuitenkin • « · vähensi versojen uusiutumistiheyttä 2-5-kertaisesti ver-" 30 rattuna karbenisilliiniin, millä ei tunnu olevan haital- : : lista vaikutusta regeneraatioon (tietoja ei esitetty).

17 104907 Tämä klaforanin haitallinen vaikutus johtaa täydelliseen siirtogeenisten versojen uusiutumisen estymiseen sen jälkeen kun niihin on siirrostettu agrobakteeria. Tämän vuoksi käytämme karbenisilliiniä keksinnön mukaisessa 5 transformaatiomenetelmässä.

Kun transformaatiokonstrukteissa käytetään nptll- ja hpt-geenejä, antavat ne kasville vastustuskyvyn kanamysiiniä ja vastaavasti hygromysiiniä vastaan. Alustavissa kokeis-10 sa huomattiin, että kumpikin näistä antibiooteista 10-15 mg/1 pitoisuuksina estää siirrosten morfogeneesin. Koska morfogeneesi tapahtuu pääosin varrenpalasten alapinnalla, siirrokset asetetaan alapuoli alaspäin selektioalustalle. Se tekee selektion tehokkaammaksi ja vähentää huomatta-15 vasti ei-siirtogeenisten karkulaisten määrää. Huomasimme, että selektio tulee aloittaa välittömästi kun agrobaktee-ri on pesty pois kasvisiirroksista. Ensimmäiset vihreät regeneratiiviset pahkurat muodostuvat kallukseen noin 7-10 päivän kuluttua varren palasten leikkaamisen jälkeen, 20 ja transformoitujen kudosten selektio tulee tehdä ennen tätä. Emme ole saaneet yhtään transformoitua versoa, kun olemme aloittaneet selektion myöhemmin kuin välittömästi i 1 t yhteiskasvatuksen jälkeen.

< * l i i

< I I

25 Transformoitujen kudosten valinta ei ollut tarpeeksi te- ·’·*· hokasta kummallakaan antibiootilla 10 mg/1 pitoisuudessa, • · eikä mikään uusiutuneista versoista ilmentänyt GUS-gee- • * .·;·. niä. Valinnalle ihanteelliset pitoisuudet olivat 20-25 • · · mg/1. Taulukossa 5 esitetään siirtogeenisten versojen ... 30 uusiutumistulokset kanamysiinillä ja hygromysiinillä pi- • · · toisuudessa 20 mg/1. Rypsilajikkeet Valtti ja Sisu trans-v : formoitiin LBA4404 pGPTV-KAN-GUSint ja LBA4404 pGPTV-HPT- GUSint -kannoilla. Kokeittemme tulosten perusteella huo-masimme, että valinta hygromysiinillä oli suositeltavam-35 paa, sillä karkulaisten osuus hygromysiinillä oli noin 10 • · • ’’ % ja kanamysiinillä 80-90%. Kummankin antibiootin 40-50 mg/1 pitoisuus vaikuuttaa haitallisesti siirtogeenisten 18 104907 versojen uusiutumiseen. Varren palaset kuolivat muutamassa viikossa ja siirtogeeninen kallus ei tuottanut versoja. Sen seurauksena hygromysiiniä ja kanamysiiniä käytettiin transformaatiossa 20-25 mg/1 konsentraatiossa. 5

Taulukko 5. Siirtogeenisten versojen regeneraatiofre-kvenssi kahdessa eri valintasysteemissä (lajikkeet Sisu ja Valtti) 10 Valinta Vihreät versot/kaikki siir- GUS-positiiviset/koikki siir- Karkulaiset/vihreät versot rokset % rokset % %

Kanamysiini 59/182 32 7/182 4 52/59 88

Hygromysiini 13/131 10 12/131 9 1/13 8 15 Transformaation analysointi. Vihreät uusiutuneet versot tarkastettiin GUS-aktiviteetin suhteen. Lehdet tai leh-denpalaset valmistettiin histologista GUS-testiä varten kuten edellä on kuvattu.

20 Seuraava esimerkki kuvaa edullista transformaatiomenetel-mää Sisu-rypsilajikkeelle.

Esimerkki 1: Sisu-rypsilajikkeen (Brassica rapa var.

• · · • ·* oleifera, syn. B. campestris) transformaatiomenetelmä • · :*·· 25 Agroba et eri um tumefaciens-kannalla LBA4404, jossa on * · · · binääriplasmidi pGPTV-HPT, jossa on ei-koodaavan alueen sisältävä uidA-geeni.

• · · * · · • · «

Rypsikasveja kasvatettiin kasvihuoneolosuhteissa noin 30 kuukauden ajan. Ennen kukinnon pidentymistä ja ensimmäis- « · « ten kukkien avautumista kaksi ylintä nivelväliä kukkavar- • · *···* resta leikattiin irti. Nivelvälit steriloitiin 90 sekun- nin ajan 70%:isessa etanolissa ja 10 min. Na-hypoklorii-·;·.] tissa (2% aktiivista Cl), johon oli lisätty kolme pisa- 35 raa Tween 20, ja pestiin kolme kertaa steriloidussa ve- 19 104907 dessä. Siirroksista poistettiin ylimääräinen vesi steriloidulla suodatinpaperilla.

Vioittuneet ylä- ja alapinnat poistettiin leikkaamalla.

5 Nivelvälit leikattiin 4-8 mm pituisiksi paloiksi, jotka asetettiin vaakasuoraan asentoon MS-agarmaljoille (ks. Materiaalit ja menetelmät), joilla oli 30 μΜ (5 mg/1) AgNOj, 3 mg/1 2,4-D ja 100 μΜ asetosyringonea. Maljat, joilla varren siirrokset olivat, suljettiin huokoisella 10 3M-paperiteipillä ja kasvatettiin 24 tuntia.

YEB-agaralustalla kasvatettiin Agrobacterium tumefaciens -kantaa LBA4400, jossa oli auttajaplasmidi pLA4404 ja binäärinen plasmidi pGPTV-HPT, jossa on uidA (GUS) ei-15 koodaavan alueen sisältävä geeni, joka on CaMV 35S -promoottorin säätelyn alaisena. Yhdestä pesäkkeestä otettuja agrobakteerisoluja siirrostettiin YEB-liemeen, jossa oli 25 mg/1 rifampisiinia ja 50 mg/1 kanamysiiniä ja kasvatettiin ravistellen yön yli +28°C. Näin luotu agrobak-20 teeriviljelmä siirrostettiin 1/100 ( v/v) laimennoksena tuoreeseen YEB-liemeen ja kasvatettiin toisen yön yli ravistelijassa +28°C. Tämä YEB-liemi sisälsi samat anti-.···. biootit kuin edellinen kasvatusalusta ja siihen oli lisätty 100 μΜ pitoisuudessa asetosyringonea. Tätä solu- * « « ' 25 viljelmää käytettiin kasvien transformaatioon.

• · · · • · · • · · : ·* Nestemäiseen MS-alustaan siirrostettiin edellä saatua • · : *·· agrobakteeriviljelmää laimennoksena 1/10 (v/v) ja 24 • « · · tuntia kasvatetut rypsin varren palasten siirrokset 30 upotettiin tähän liuokseen. 1-3 minuutin kuluttua siir-rokset asetettiin steriloitujen suodatinpaperien päälle ylimääräisen nesteen poistamiseksi niiden pinnalta.

• · ·

• · I

Siirrokset asetettiin vaakasuoraan MS-agaralustalle, ’···* 35 jossa oli 30 μΜ (5 mg/1) AgN03, mg/1 2,4-D ja 100 μΜ asetosyringonea. Siirroksia kasvatettiin yhdessä agrobak- • ·;··· teerin kanssa 48 tuntia maljoilla, jotka oli suljettu 20 104907 huokoisella 3M-paperiteipillä. Yhteiskasvatuksen jälkeen agrobakteerisolut pestiin pois upottamalla siirrokset karbenisilliinin vesiliuokseen (500 mg/1). Siirroksia pidettiin liuoksessa 3-5 minuuttia. Sitten ne asetettiin 5 steriloidulle suodatinpaperille ylimääräisen nesteen poistamista varten.

Siirrokset asetettiin pystysuoraan asentoon, alapuoli alaspäin MS-agarmaljoille, jotka sisälsivät 30 μΜ (5 10 mg/1) hopeanitraattia, 3 mg/1 BAP:ia, 0,05 mg/1 NAA:ta, 200 mg/1 karbenisilliinia ja 20 mg/1 hygromysiiniä, siirtogeenisen kudoksen valintaa varten ja versojen uusitumisen stimuloimiseksi 1-2 viikon ajaksi. Jos käytettiin yli 10 päivän kasvatusaikaa, maljat vaihdettiin 15 tuoreisiin. Maljat suljettiin huokoisella 3M-paperitei-pillä.

Seurattiin vihreiden regeneratiivisten kyhmyjen ja kan-tasolukon syntymistä ja kokonaiset siirrokset tai kallus-20 palat, joissa oli vihreitä regeneratiivisia kyhmyjä ja kantasolukkoa, asetettiin MS alustalle ilman hormoneja, mutta jossa oli 30 μΜ (5 mg/1) hopeanitraattia, 200 mg/1 karbenisilliiniä ja 20 mg/1 hygromysiiniä. Vihreät kyhmyt ja kantasolukot kehittyivät vihreiksi siirtogeenisiksi 25 versoiksi 2-6 viikossa.

v 4 • · · · • · i V Kehittyneet siirtogeeniset versot kasvatettiin samalla • · • *·· alustalla alennetulla hopeanitraattipitoisuudella 15 μΜ (2,5 mg/1). Siinä tapauksessa, että versot eivät muodos-30 taneet juuria tai kukintoa, ne leikattiin ja palaset ;·:·. asetettiin MS-agarille, jossa oli 0,2 mg/1 NAA:ta, 15 μΜ (2,5 mg/1) hopeanitraattia, 200 mg/1 karbenisilliinia • · · mutta ei hygromysiiniä. Kasvatusalustat suljettiin aina .* .* huokoisella 3M-paperiteipillä. Rypsiä lisättiin in vitro • * · 35 samalla MS-agaralustalla.

• * 21 104907

Siirtogeeniset juurta muodostaneet kasvit testattiin histologisella GUS-testillä ja siirrettiin multaan kasvi-huoneoloihin. Noin 5 grammaa kasvihuoneessa kasvatettua kasvia käytettiin DNA:n eristämiseen Southern blot - ana-5 lyysiä varten (katso kuva 2).

• 1 · ·· » • · · • · • · • · • · • · · • · · • · · • 1 · ·»» • · · • · · • · · • · · • · · • 1 i • · · • ♦ • » · 22 104907 LÄHDELUETTELO:

Becker D., Elke K., Schell J., Masterson R. (1992) New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left T-DNA border. Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197

Chi G.-L., Barfield D.G., Sim G.-E., Pua E.-C. (1990) Effect of AgNOj and aminoethoxyvinylglycine on in vitro shoot and root organogenesis from seedling explants of recalcitrant Brassica genotypes. Plant Cell Reports 9: 195-198

Datla R.S.S., Bekkaoui F., Hammerlind J.K., Pilate G., Dunstan D.J., Crosby W.L. (1993) Improved high-level constitutive foreign gene expression in plants using an AMV RNA4 untranslated leader sequence. Plant. Sci., 94: 139-149

Deblaere R., Bytebier B., De Greve H., Deboeck F., Shell J., Van Montagu M., Leemans J. (1985) Efficient octopine Ti plasmid - derived vectors for Agrobacterium -mediated gene transfer to plants. Nucl. Acids Res. 13: 4777-4788

Elomaa P., Honkanen J., Puska R., Seppänen P, Helariutta Y., Mehto M., Kotilainen M., Nevalainen L., Teeri T.H. (1993) Agrobacterium -mediated transfer of antisense chaleone synthase cDNA to Gerbera Hybrida inhibits flower pigmentation. Bio/Technol. 11: 508-511

Fry J., Barnason A., Horsch R.B. (1987) Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens based vectors. Plant Cell Reports 6: 321-325

Hachey J.E., Sharma K.K., Moloney M.M. (1991) Efficient shoot regeneration of Brassica campestris using cotyledon explants cultured in vitro. Plant Cell Reports, 9: 549-554 • · · • · · • *,·* Hoekema A., Hirsch P.R., Hooykaas P. J. J. , Schilperoort ;·. R.A. (1983) A binary plant vector strategy based on • ” separation of vir and T-region of the A. tumefaciens Ti- plasmid. Nature (London) 303: 179-180

Hood E.E., Gelvin S.B., Melchers L. S., Hoekema A. (1993) New Agrobacterium helper plasmid for gene transfer to ’ plants. Transgenic research 2: 208-218 »·· • · · ♦ · · *. Knutzon D.S., Thompson G.A., Radke S.E., Johnson W.B., j*.*. Knauf V.C., Kridl J.C. (1992) Modification of Brassica

seed oil by antisense expression of a stearol-acyl car-: rier protein desaturase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

*·’ 89: 2624-2628 • · 104907 23

Lihtenstain C., Draper J. (1985) Gene engineering of plants. In: DNA cloning - a practical approach, v. 2, part 4, ed. Glover D.M., IRL Press.

Mukhopadhyay A., Arumugam N., Nandakumar P.B.A., Pradhan A.K., Gupta V., Pental D. (1992) Agrobacterium mediated genetic transformation of oilseed Brassica campestris: Transformation frequency is strongly influenced by the mode of shoot regeneration. Plant Cell Reports 11: 506-551

Murashige T., Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 472-493

Palmer C.E. Enhanced shoot regeneration from Brassica campestris by silver nitrate. Plant Cell Reports 11: 541-545

Pua E.C., Mehra-Palta A., Nagy F., Chua N.H. (1987) Transgenic plants of Brassica napus L. Bio/Technology 5: 815-817

Radke S.E., Andrews B.M., Moloney M.M., Crouch M.L.,

Kridl J.C., Knauf V.C. (1988) Transformation of Brassica napus L. using Agrobacterium tumefaciens: developmentally regulated expression of a reintroduced napin gene. Theor. Appi. Genet. 75: 685-694

Radke S.E., Turner J.C., Facciotti D. (1992) Transformation and regeneration of Brassica rapa using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports 11: 499-505

Shiba H., Hinata K., Suzuki A., Isogai A. (1995) Breakdown of self-incompatibility in Brassica by the antisense RNA of the SLG gene. Proc. Japan Acad. 71, Ser. B: 81-83 . ., Vancanneyt G., Schmidt R., O'Connor-Sanchez A., Willinit- I. . zer L., Rocha-Sosa M. (1990) Construction of an intron- : V containing marker gene: Splicing of the intron in trans- genic plants and its use in monitoring early events in Agrobacterium-mediated plant transformation. Mol. Gen. Genet. 220: 245-250.

Zambryski P., Joos H., Genetello C., Leemans J., Van Montagu M., Shell J. (1983) Ti plasmid vector for the ' introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity. EMBO J. 2: 2143-2150 • · · • · • · · • ·

Claims (7)

104907 l. Menetelmä täysikasvuisten rypsiyksilöiden transformoi-miseksi, tunnettu siitä, että 5 - leikataan kehittyneen rypsin kukkavarren nivelväli, - steriloidaan mainittu nivelväli ja leikataan se 4-8 mm:n paloiksi, - asetetaan siirros vaakasuoraan asentoon agar-esikasva-tusalustalle, jossa on hopeanitraattia ja 2,4-dikloori- 10 fenoksietikkahappo (2,4—D) hormonia, - esikasvatetaan siirrosta kyseisellä alustalla yhden päivän ajan, - upotetaan siirros MS-liuokseen, johon on siirrostettu Agrobacterium tumefaciens -bakteeria, joka sisältää 15 ainakin yhden kyseiselle rypsille vieraan geenin, - asetetaan upotettu siirros vaakasuoraan asentoon MS-yh-teiskasvatusalustalle, - kasvatetaan siirrosta yhdessä agrobakteerin kanssa kahden päivän ajan, 20. pestään siirros agrobakteerista, - asetetaan siirros pystysuoraan asentoon alapuoli alaspäin MS-agarkasvatusalustalle antibiooteilla tapahtuvaa selektiota varten, niin että alustassa on sytokiniinihor-moneja ja hopeanitraattia, ja 25. asetetaan siirros, jossa on uusiutunutta kantasolukkoa *· ja alkioita muodostavia vihreitä kyhmyjä, hormonivapaalle ·· · • V regeneraatioalustalle, ja • · • - otetaan talteen uusiutuneet siirtogeeniset versot. ·»* • · · • · ♦ «

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu ·*:. siitä, että selektioalusta sisältää karbenisilliinia • · · ' agrobakteerikontaminaation poistamiseksi.

• · · : 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 35 siitä, että kaikki maljat on suljettu huokoisella paperi-teipillä ylimääräisen ilmastuksen aikaansaamiseksi. 104907

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kukkavarren nivelvälin osa on pala, joka leikataan kukkavarren yhdestä kahteen nivelväliä sisältävästä 2-5 cm pituisesta yläosasta. 5

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että esikasvatus- ja valintavaiheiden kasvatus-alusta on 0,7% MS-agaralusta, jossa on 2-3% sakkaroosia, johon on lisätty 15-90 μΜ hopeanitraattia. 10

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että esikasvatus- ja valintavaiheiden kasvatus-alustat sisältävät 0,5-1,5 mg/1 2,4-dikloorifenoksietik-kahappoa. 15

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä on ensimmäinen auksiinikäsittelyvaihe, jossa käytetään 0,5-1,5 mg/1 2,4-D-hormonia, jota seuraa 1-2 viikon kasvatusvaihe sytokiniinejä sisältävällä kas- 20 vatusalustalla versojen uusiutumisen käynnistämiseksi. • · · • · · • · · • · • 1 • · • I • · · • · · • · • · · • « · • · · • · · • · · • · · • · t • I · 2S 104907