JPH09322667A - パックブンの遺伝子導入方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 水生植物パックブンへの外来遺伝子の導入と
再生方法の提供。 【解決手段】 パックブン（Ipomoea aquatica）の再生
方法において、（ａ）パックブンの節部を約１mg／ｌの
α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）及び約１mg／ｌのベンジ
ルアデニン（ＢＡ）を含有する培地で培養することによ
りカルスを形成し、（ｂ）前記カルスを、ＮＡＡを含有
せず且つ５〜１０mg／ｌのＢＡを含有する培地で培養す
ることにより不定芽を誘導し、そして（ｃ）前記不定芽
を、植物ホルモンを含有しない培地で培養することによ
り不定根を誘導する、ことを特徴とする方法並びに前記
段階（ａ）の前にパックブンの節部と、外来遺伝子を有
するアグロバクテリウムとを共培養することを特徴とす
る。パックブン植物への外来の導入方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は水性植物パックブン
（Ipomoea aquatica）への外来遺伝子導入方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】パックブン（Ipomoea aquatica）は熱帯
性の水性植物であり、汚れに強く、窒素やリンの吸収除
去にすぐれていることから汚水処理への応用が期待され
る。さらに、パックブンは蛋白質やビタミン類を多く含
む栄養価の高い野菜としての特性をも有している。この
様なそれ自体有用性の高い植物に外来性遺伝子を導入し
て有用な特性を付与することにより、さらに価値の高
い、例えば環境浄化能の向上した、植物が得られると期
待される。しかしながら、パックブンに外来遺伝子を導
入する方法は知られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、パ
ックブンへの外来遺伝子の導入方法を提供するものであ
り、そしてその前提となる技術として、パックブンをカ
ルス化し、さらに植物体に再生する方法を提供するもの
である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】パックブンのカルス化は
極めて困難とされていたが、本発明者らは種々検討の結
果、パックブンの節部を用いることによりカルス化が可
能となることを見出した。さらに、特定の植物ホルモン
濃度のもとにはじめてカルスからの植物体の再生が可能
であることを見出した。

【０００５】従って本発明は、パックブンの再生方法に
おいて、（ａ）パックブンの節部を約１mg／ｌのα−ナ
フタレン酢酸（ＮＡＡ）及び約１mg／ｌのベンジルアデ
ニン（ＢＡ）を含有する培地中で培養することによりカ
ルスを形成し、（ｂ）前記カルスを、ＮＡＡを含有せず
且つ５〜１０mg／ｌのＢＡを含有する培地で培養するこ
とにより不定芽を誘導し、そして（ｃ）前記不定芽を、
植物ホルモンを含有しない培地で培養することにより不
定根を誘導する、ことを特徴とする方法を提供する。

【０００６】本発明者らはまた、上記のパックブンの再
生方法において、段階（ａ）の前に、パックブンの節部
を、外来遺伝子を有するアグロバクテリウム・ツメファ
シエンスと共培養することによって、再生した植物に外
来遺伝子を導入することができることを見出した。従っ
て本発明は、パックブンに外来遺伝子を導入する方法に
おいて、前記の方法における段階（ａ）の前に、パック
ブンの節部と、目的とする遺伝子を含んで成るＴｉプラ
スミドを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス
とを共培養することを特徴とする方法を提供する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の方法においてはパックブ
ンの茎の節部を出発材料として用いる。その他の部分か
らカルスを誘導するのは非常に困難である。節部はまず
殺菌した後、ＮＡＡを約１mg／ｌ及びＢＡを約１mg／ｌ
含有する基礎培地中で培養する。基礎培地としては、Ｍ
Ｓ培地、表１に示す組成を有する１／２修正ＭＳ培地等
が使用される。

【０００８】

【表１】

【０００９】約５日〜１週間の培養によりカルスが生成
する。次にこのカルスを、ＮＡＡを含有せず且つ５〜１
０mg／ｌのＢＡを含有する培地中で約８日間培養するこ
とにより不定芽が生成する。次に、この不定芽を、植物
ホルモンを含有しない培地で培養することにより不定根
が生成する。これを固体培地に移植することにより再生
したパックブンが得られる。

【００１０】前記の方法において、カルスの誘導の前
に、外来遺伝子を含有するアグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスと共培養することにより、目的とする外来遺
伝子をパックブンの細胞中に導入することができる。外
来遺伝子としては、芳香複化合物分解酵素をコードする
遺伝子、リンや窒素の吸収を促す遺伝子など目的に応じ
て任意の遺伝子を用いることができる。目的とする遺伝
子は、Ｔｉプラスミド中のライトボーダー部とレフトボ
ーダー部との間に挿入される。このようなプラスミドの
作製方法、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞
へのプラスミドの導入は、常法に従って行えばよく、本
発明の特徴を構成するものではない。なお、Ｔｉプラス
ミドは選択マーカー遺伝子を有する必要があり、例えば
カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子
等が用いられる。

【００１１】アグロバクテリウム・ツメファシエンスで
処理した後、植物の再生までの間に、選択圧をかけて、
外来遺伝子を取り込んだ細胞の増殖を促進し、他方処理
後のアグロバクテリウムや雑菌の増殖を防止する必要が
ある。選択圧をかけるためには、例えば、選択マーカー
としてカナマイシン耐性遺伝子を使用する場合、不定芽
形成培地にカナマイシンを１００mg／ｌ程度添加する。
また、ハイグロマイシンの場合は約５mg／ｌ程度であ
る。細菌の増殖を防止するためには、例えば、２５０〜
５００mg／ｌのカルベニシリンをカルス形成培地に添加
すればよい。

【００１２】再生した植物体に目的とする外来遺伝子が
挿入されていることを確認するためには、例えば、目的
とする遺伝子を特異的に増幅することができるプライマ
ーを用いてＰＣＲにより増幅を行い、目的とする遺伝子
が増幅されたことを確認するなど、植物体中の特定の遺
伝子を検出するために使用される常法を用いればよい。

【００１３】

【実施例】次に本発明を実施例によりさらに具体的に説
明する。実施例１ ．カルスの形成 無菌パックブンの作製 まずパックブンの種を７０％エ
タノールに３分間浸して洗浄した後、水道水４５mlに塩
素消毒液としてキッチンハイター（花王製）５mlと界面
活性剤としてトリトンＸ−１００を２５μｌ混ぜ合わせ
た水溶液に移しかえ、２分おきにゆっくり撹拌させなが
ら３０分間浸し、種表面を滅菌した。このように滅菌し
たパックブンの種を滅菌ビーカーに移し、滅菌水で３回
十分に洗浄した後、ＭＳ培地に置床して、２５℃、１６
時間明（３０００lx）、８時間暗の条件下で培養して無
菌パックブンを得た。

【００１４】節部組織からのカルス誘導 無菌で培養したパックブンから切り出した節部を基本培
地（１／２修正ＭＳ培地、pH５．８）にＮＡＡ １mg／
ｌ、ＢＡ １mg／ｌ添加したカルス誘導培地に置床し、
２５℃、１６時間明（３０００lx）、８時間暗の条件下
で培養したところ、５日ほどで透明な水分含有量の高い
カルスが誘導された。

【００１５】実施例２．不定芽の形成 パックブンから誘導した節部カルスを、１／２修正ＭＳ
培地（pH５．８）を基本培地として、これに表２に示す
２０通りの植物ホルモン濃度の組み合わせを持つ培地に
それぞれ置床し、２５℃、１６時間明（３０００lx）、
８時間暗の条件下で培養して、不定根ならびに不定芽の
分化を行った。

【００１６】

【表２】

【００１７】パックブン節部由来カルスからの不定芽の
分化に、植物ホルモンであるＮＡＡとＢＡがおよぼす影
響を検討したところ、図１に示す結果が得られた。その
結果、節部カルスからの不定芽の分化にはＢＡが有効に
働き、ＮＡＡは阻害的に働くことが判明した。パックブ
ン節部由来カルスからの芽の分化率が最も高かった植物
ホルモン濃度は、ＢＡのみを５mg／ｌ加えた場合であっ
た。しかし、パックブンの節部由来カルスからは、植物
ホルモンを添加しない場合にも不定芽の分化がみられ
た。

【００１８】この理由として、内生ホルモンの影響や置
床した節部にすでに芽の原基が形成されている可能性が
考えられる。このような植物ホルモンを加えていない培
地で形成される不定芽は、茎部の発達がよく、長い茎を
持ち、１カルスから１つの不定芽が分化した。培地に添
加した植物ホルモンの影響を受け分化した不定芽は、茎
部よりも葉部の発達がよく、１カルスから多数の葉部が
分化する傾向が見られた。添加した植物ホルモンの影響
を受け、パックブンの節部由来カルスから分化した不定
芽のこのような形態的特徴は、ＢＡのみを１０mg／ｌ添
加した場合が最も顕著であった。以上の結果より、パッ
クブン節部由来カルスから不定芽を分化させるための培
地は、ＢＡのみを５mg／ｌ、または１０mg／ｌ含む１／
２修正ＭＳ培地が最適であると判断した。

【００１９】実施例３．不定根の形成による植物体の再
生 不定根の分化条件を検討したところ、図２に示す結果が
得られた。これによると、培地中のＮＡＡ濃度に関係な
く、ＢＡを培地から除去することで節部カルスから容易
に不定根を形成することが分かった。

【００２０】実際の操作としては、節部由来のカルスか
ら分化した不定芽を滅菌したメスで切り取り、植物ホル
モンを含まない１／２修正ＭＳ培地（pH５．８）に置床
し、２５℃、１６時間明（３０００lx）、８時間暗の条
件下で培養したところ、１週間でほぼすべての不定芽か
ら不定根が分化し、その後幼植物体を形成した。この再
生植物は、種から発芽した植物体に比べて形態的な差異
はなく、生長速度にも違いは認められなかった。以上の
ことから不定芽からの不定根の分化、ならびに植物体の
再生には植物ホルモンを含まない１／２修正ＭＳ培地
（pH５．８）が最適であると判断した。

【００２１】以上の通り、パックブンの節部由来カルス
から最高で約７０％強の不定芽の分化率が、また分化し
た不定芽を植物ホルモンを含まない１／２修正ＭＳ培地
に置床することでほぼ１００％の不定根の分化率が得ら
れた。このことから、本発明で確立した再分化系を用い
ることにより、置床したカルスから７０％強の分化率で
植物体を再生できることが分かった。しかし、パックブ
ンの節部からは元来腋芽が分化され、本研究においても
植物ホルモンを添加しない条件下でも不定芽を分化する
ことがあった。

【００２２】この理由として、植物体から切り出した節
部が有する内生ホルモンの影響や、芽の原基が切り出し
た節部組織内にすでに形成されている可能性が考えられ
る。この現象のために、形質転換植物を再分化させる場
合に、キメラ（一部の細胞に導入遺伝子を持つ）やエス
ケープ（導入遺伝子を持たない）植物体が生育する比率
が高くなる可能性が考えられる。しかし、節部由来カル
スからの不定芽の分化はＢＡの濃度によって分化形態の
違いが認められた。ＢＡを全く含まない、または低濃度
で含む条件では茎部の発達のよい不定芽の分化が、高濃
度条件下では葉部の発達のよい不定芽の分化がみられ
た。

【００２３】このことから、前者の茎部が発達した不定
芽は、節組織に元来形成されていた芽の原基が生長した
不定芽であることが示唆される。よって形質転換体作成
のための組織培養において、カルスから不定芽を分化す
る際にはキメラを防ぐためにＢＡ濃度を１０mg／ｌとす
る方が良いと判断した。また、この不定芽の形態的特徴
を、形質転換植物を選抜する指標に利用できよう。

【００２４】実施例４．外来遺伝子の導入 パックブンの抗生物質耐性 植物の形質転換体を選別するための抗生物質として、カ
ナマイシンとハイグロマイシンが一般的である。抗生物
質濃度が適正でなければ、エスケープ株が増加したり、
また逆に形質転換体の生長を妨げることになるため、形
質転換体のみが適正に生長できる濃度の選択が必須であ
る。本研究においても、カナマイシンとハイグロマイシ
ンの利用を考え、各薬剤の濃度とパックブンの生長阻害
の関係を調べ、形質転換体を作成する際に用いる選択圧
としての最適濃度を検討した。

【００２５】また、アグロバクテリウムとパックブン細
胞を共培養した後にアグロバクテリウムを除菌する際の
抗生物質として、カルベニシリンが一般的である。そこ
で、パックブンに対しても使用可能であることを確認す
るために、パックブン節部のカルベニシリンに対する耐
性を調べた。

【００２６】●パックブン節部のカナマイシン耐性
パックブン節部のカナマイシン耐性を調べたところ表３
に示す結果が得られた。カナマイシン濃度が１０mg／ｌ
で生長阻害が見られ、５０mg／ｌでは発根や発芽が抑制
された。２００mg／ｌ以上の濃度では、カルスの生長も
ほとんど認められなくなった。これらの結果から、５０
mg／ｌの濃度で明らかに生長が阻害されており、形質転
換細胞の選抜は、５０mg／ｌのカナマイシン濃度が最適
であると考えた。

【００２７】

【表３】

【００２８】●パックブン節部のハイグロマイシン耐性
パックブン節部のハイグロマイシン耐性を調べたと
ころ、表４に示す結果が得られた。ここでは、ハイグロ
マイシン濃度が５mg／ｌですでに生長阻害が見られ、１
０mg／ｌではカルスの生長も微弱で、一部変色し、枯死
したものも見られた。５０mg／ｌ以上の濃度ではカルス
の生長が全くみられず、完全に枯死する結果となった。
ハイグロマイシンを選択圧として用いる場合、１０mg／
ｌ〜２０mg／ｌの濃度で使用されることが多く、本実験
の結果からも、選択圧としてハイグロマイシンを用いる
場合には１０mg／ｌが適当であると判断した。

【００２９】

【表４】

【００３０】以上の結果から、以後行う形質転換体の選
抜培地には、選択圧として５０mg／ｌのカナマイシン、
１０mg／ｌハイグロマイシンを添加した。 ●パックブン節部のカルベニシリン耐性 パックブン
節部のカルベニシリン耐性について調べた結果を表５に
示す。アグロバクテリウムを除菌する際のカルベニシリ
ンの濃度は、タバコ等を参考にすると２５０mg／ｌ以上
の濃度が適切であると考えられた。表５に示すように、
パックブンにおいては５００mg／ｌのカルベニシリン濃
度においても生長の阻害は見られなかった。よってアグ
ロバクテリウムの除菌にカルベニシリンを用いることが
可能であることが分かった。形質転換パックブンの作成
においては、不定芽の分化の阻害をできるだけ避けるた
めに、カルベニシリンの濃度は、アグロバクテリウムの
除菌に最低限必要な２５０mg／ｌの濃度が最適であると
判断した。

【００３１】

【表５】

【００３２】アグロバクテリウム・ツメファシエンスの
調製 β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子又はＧＵＳ遺伝
子にイントロンを含むものをＧａＭ３５Ｓプロモーター
の下流に連結し（ｐＢＩ１２１中）（Ｊｅｆｆｅｒｓｏ
ｎ，Ｒ．Ａ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：３９０１−３９０
１（１９８７））、バイナリーベクターｐＢＩ１０１Ｈ
ｍＢ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．ら、ＥＭＢＯ
Ｊ．６：３９０１−３９０７）に組み込んだもの（ｐＢ
Ｉ１０１ＨｍＢ−３５Ｓ ＧＵＳ、又はｐＩＧ１２１−
Ｈｍ（ｐＢＩＨ−１Ｇ）（構造については図３を参照の
こと）を作製し、これをアグロバクテリウム・ツメファ
シエンスＥＨＡ１０１（Ｋｍ^r ，Ｃｍ^r ）に導入した。
プラスミドの作製は、遺伝子組換えの常法に従って大腸
菌ＨＢ１０１において行い（培地：Ｓｏｃ培地；表６に
示す）、大腸菌からアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスへのプラスミドの移行は、供与菌としての前記バイ
ナリープラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１、受容菌と
してのアグロバクテリウム・ツメファシエンス、及びヘ
ルパー株としての大腸菌ＨＢ１０１（ｐＲＫ２０１３）
を用いる三親接合伝達法により行った（培地：ＬＢ、バ
クトペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣ
ｌ １０ｇ／ｌ）。なお、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスの培養はＹＥＰ培地（バクトペプトン１０ｇ
／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ）に
おいて行った。

【００３３】

【表６】

【００３４】アグロバクテリウム・ツメファシエンスと
パックブンの節部との共培養 パックブンの節部の調整は、実施例１に記載した方法
（無菌パックブンの作製の項参照）により行った。調製
した節部を、１mg／ｌのＮＡＡを入れた滅菌シャーレに
入れ、これに培養したアグロバクテリウム・ツメファシ
エンスの培養液を注加し、３分間保持した。次に、過剰
のアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌体を紙ナプ
キンでふき取った。

【００３５】植物の再生 前記のようにしてアグロバクテリウムにより処理した節
部からのカルスの誘導及び植物体の再生は、実施例１〜
３に記載した方法により行った。但し、節部からのカル
スの誘導においては、１mg／ｌのＮＡＡ、１mg／ｌのＢ
Ａ、及び２５０mg／ｌのカルベニシリン（Ｃｂ）を含有
する１／２修正ＭＳ培地中で行い、不定芽の形成は、１
０mg／ｌのＢＡ、２５０mg／ｌのＣｂ、５０mg／ｌのカ
ナマイシン又は１０mg／ｌのハイグロマイシンを含有す
る１／２修正ＭＳ培地中で行い、そして不定根の形成
は、２５mg／ｌのＣｂを含有し、ホルモンを含有しない
１／２修正ＭＳ培地中で行った。

【００３６】カルスへのＧＵＳ遺伝子の導入の確認 上記の工程で、ＧＵＳ遺伝子がカルスに導入されたこと
を、ＧＵＳ染色により確認した。すなわち、カルスを容
器に入れ、これにリン酸緩衝液（５０mM ＫＨ₂ Ｐ
Ｏ₄ 、５０mM Ｋ₂ ＨＰＯ₄ 、pH７．０）を注ぎ、次
に、Ｘ−Ｇｌｕｃ溶液（５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）を
２０mg／ｌと濃度でジメチルホルムアミドに溶解したも
の）と前記のリン酸緩衝液とを４０：１になるように加
え、よく混合した。３０分間減圧脱気した後、３７℃の
ヒートバスで一晩反応させた。次に７０％エタノールに
よりクロロフィルを除去した。この結果、カルス中に青
色の組織が観察され、ＧＵＳ遺伝子の発現が確認され
た。

【００３７】パックブン細胞に導入した融合遺伝子は、
ＧＵＳ構造遺伝子上にイントロンが挿入されているた
め、アグロバクテリウム細胞では翻訳されず、植物細胞
内でのみＧＵＳタンパク質が生成される。よってこの青
色のスポットはアグロバクテリウムの混入によるもので
はなく、パックブン細胞内に導入されたＧＵＳ遺伝子が
発現したことを示している。このことから、アグロバク
テリウム法によりパックブン細胞に外来遺伝子を導入で
きることが判明した。

【００３８】再生した植物体中のＧＵＳ遺伝子の確認 植物組織を切り出し、乳鉢に入れ、液体窒素に凍結した
後破砕した。これに２×ＣＴＡＢ（セチルメチルトリア
ンモニウムブロミド）溶液（２％ ＣＴＡＢ、０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．０、１．４Ｍ ＮａＣｌ、
１％ ＰＶＰ）を加え転倒撹拌によりよく撹拌し、５５
℃〜６５℃にて１０分間静置し染色体を抽出した。

【００３９】次に、ＣＨＣｌ₃ ／ｉｓｏ．ａ（クロロホ
ルムとイソアミアルコールとの２４：１混合液）を加
え、ゆっくりと転倒撹拌した後５〜１０分間静置し、室
温にて遠心分離して上清を得た。この操作を繰り返し
た。１／１０量の１０％ ＣＴＡＢ（１０％ ＣＴＡ
Ｂ、０．７Ｍ ＮａＣｌ）を加えてよく混合し、等量〜
少し多めのＣＨＣｌ₃ ／ｉｓｏ．ａを加えてよく混合
し、遠心分離により上清を回収した。等量のイソプロパ
ノールを加え、ゆっくりと混合し遠心分離して沈澱を得
た。この沈澱を１００μｌの１Ｍ ＮａＣｌ／ＴＥ ５
Ｍ ＮａＣｌ（１０ml）、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ８．０，０．５ml）、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（０．１m
l）を水で５０mlとしたもの）により溶解し、等量のイ
ソプロパノールを添加して混合し、遠心分離して沈澱を
得た。

【００４０】これを７０％エタノールにより洗浄し、真
空乾燥し、５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。これに１
０μｌの１０mg／ｌ ＲＮａｒｅを添加し、３７℃にて
１時間又は５５℃にて０．５〜１時間インキュベートす
ることによりＲＮＡを除去し、ＤＮＡサンプルを得た。

【００４１】こうして得たＤＮＡサンプル２０μｌ（Ｄ
ＮＡとして１μｇ）、４μｌのｄＮＴＰ、１μｌのプラ
イマーＩ（５′−TGGGCATTCAGTCTGGATCGCGAA−３′）、
１μｌのプライマーII（５′−ATGTTCATCTGCCCAGTCGAGC
AT−３′）、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、（１００mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，５０mM ＫＣｌ，１
５mM ＭｇＣｌ₂ ，０．０１％（ｗ／ｗ）ゼラチン）１
９μｌの滅菌水及び０．２５μｌのｔａｑＤＮＡポリメ
ラーゼから成るＰＣＲ反応液を調製し、９４℃で１分間
の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング及び７５℃
で１．５分間の伸長から成るサイクルを２５サイクル行
った。

【００４２】常法に従って、ＰＣＲ産物をアガロースゲ
ル電気泳動にかけ、アルカリにより変性した後、ニトロ
セルロースフィルターに移した。プローブを調製するた
め、プラスミドｐＢＩ２２１をＢａｍＨＩとＳａｌＩに
より切断し、ＧＵＳ遺伝子を含有する１．８kbのＢａｍ
ＨＩ−ＳａｃＩ ＤＮＡ断片を得、ノンラジオシステム
ＤＮＡ標識および検出キット（ベーリンガーマンハイ
ム）を用いてジゴキシゲニン標識した。

【００４３】サザン・ハイブリダイゼーションを次のよ
うにして行った。１００cm² のフィルターに対し２０ml
の割合で、フィルターとハイブリダイゼーション溶液
（５×ＳＳＣ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ブロッキング試薬
（Ｖｉａｌ １１）０．１％（Ｗ／Ｖ）Ｎ−ウラロイル
サルコシンＮａ、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ）をポリ
エチレン袋に入れ、気泡が入らないように密封して６８
℃で２時間保持した。フィルターと、直前に変性させた
ＤＮＡプローブを１ml当たり５μｌ（２６ng）含むハイ
ブリダイゼーション溶液を、１００cm² のフィルターに
対し約２．５mlの割合になるようポリエチレン袋に入
れ、気泡が入らないように密封して６８℃で一晩保持し
た。

【００４４】室温で１００cm² のフィルターに対し最低
５０mlの洗浄液Ｉ（２×ＳＳＣ、０．１％（Ｗ／Ｖ）Ｓ
ＤＳ）を用いて、５分間２回洗浄した。６８℃で１００
cm²のフィルターに対し最低５０mlの洗浄液II（０．１
×ＳＳＣ、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ）を用いて、１５
分間２回洗浄した。フィルターはハイブリダイズしたＤ
ＮＡの検出に直接使用するか、後で検出するために空気
乾燥して保存した。

【００４５】サザンハイブリダイゼーションにより形成
されたＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを酵素標識抗体（抗
ジゴキシゲニン、アルカリ・ホスファターゼ標識）を使
用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により、５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル酸（Ｘ−リン酸）と
ニトロブルーテトラゾリウム塩（ＮＢＴ）の発色反応に
よって検出した。共培養条件及び前培養条件を変えて数
回の実験を行った結果の１例を次の表７に示す。この場
合、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＬＢＡ４
４０４株にバイナリーベクターｐＢＩ１２１を組込んだ
株を用いた。

【００４６】

【表７】

【００４７】この表において、ＧＵＳ⁺ は、再生植物の
ＧＵＳ染色において＋であったことを示す。また、前記
のようにしてＧＵＳ遺伝子をＰＣＲにより増幅した後に
サザンハイブリダイゼーションにより検出した結果の１
例を図４に示す。この図において、（ａ）はＰＣＲ反応
物の電気泳動パターン（アガロ−スゲル電気添動：エチ
ジウムブロミドによる染色により検出）を示し、（ｂ）
はサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。レーン
１はλＤＮＡのＨｉｎｄIII 消化物の結果、レーン２は
パックブン野生株染色体のＰＣＲ反応物の結果、４〜８
は形質転換パックブン染色体のＰＣＲ反応物の結果、９
はプラスミドｐＢＩ１０１ＨｍＢのＰＣＲ反応物の結果
を示す。

【００４８】ＧＵＳ遺伝子を持たない対照を除く全ての
パックブンにおいて、増幅された１．０kb ＤＮＡとＧ
ＵＳプローブの結合を示すバンドが確認された。この結
果より、ＧＵＳ染色陽性株、陰性株に関係なく、選択培
地で増殖し、ＰＣＲ検定に供した全ての形質転換パック
ブンでＧＵＳ遺伝子の導入が確認された。このことから
選択圧下で再分化した植物体はＧＵＳ染色が陰性であっ
ても形質転換体である可能性が高いと考えられる。以
上、アグロバクテリウム法を用いることによって、ＧＵ
Ｓ遺伝子を染色体上に保持する形質転換パックブンを作
成することに成功した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、パックブンのカルスからの不定芽の分
化に与えるＮＡＡとＢＡの濃度の影響を示すグラフであ
る。

【図２】図２は、パックブンの不定芽からの不定根の分
化に与えるＮＡＡとＢＡの濃度の影響を示すグラフであ
る。

【図３】図３は、本発明で用いたプラスミド中のＧＵＳ
遺伝子周辺の構造を示す模式図である。

【図４】図４は、本発明の方法によりパックブンの染色
体に導入されたＧＵＳ遺伝子の検出を示す電気泳動図で
あり、図面代用写真である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 パックブン（Ipomoea aquatica）の再生
   方法において、 （ａ）パックブンの節部を約１mg／ｌのα−ナフタレン
   酢酸（ＮＡＡ）及び約１mg／ｌのベンジルアデニン（Ｂ
   Ａ）を含有する培地で培養することによりカルスを形成
   し、 （ｂ）前記カルスを、ＮＡＡを含有せず且つ５〜１０mg
   ／ｌのＢＡを含有する培地で培養することにより不定芽
   を誘導し、そして （ｃ）前記不定芽を、植物ホルモンを含有しない培地で
   培養することにより不定根を誘導する、ことを特徴とす
   る方法。
2. 【請求項２】 パックブンに外来遺伝子を導入する方法
   において、請求項１に記載の段階（ａ）の前に、パック
   ブンの節部と、目的とする遺伝子を含んで成るＴｉプラ
   スミドを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス
   （Agrobacterium tumefaciens ）と共培養することを特
   徴とする方法。