DE60133807T2

DE60133807T2 - Promotoren des cestrum yellow leaf curling virus

Info

Publication number: DE60133807T2
Application number: DE60133807T
Authority: DE
Inventors: Thomas Hohn; Livia Stavolone; Petrus Theodorus De Haan; Hope Thompson Apex LIGON; Maria Raleigh KONONOVA
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2000-03-27
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2009-06-25
Anticipated expiration: 2021-03-27
Also published as: NZ521412A; BR0109530B1; ATE393829T1; DE60133807D1; HUP0300570A3; CN100457913C; JP2003529353A; JP4739634B2; AR044724A1; WO2001073087A8; EA200200960A1; HUP0300570A2; CA2406191A1; HU225788B1; PL358790A1; EA006761B1; PL204327B1; AU2001242516B2; EP1268826B1; KR20020086724A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue DNA-Sequenzen, die als Promotoren für die Transkription damit verbundener Nucleotidsequenzen in Pflanzen dienen. Genauer betrifft diese Erfindung neue Promotoren, die einer damit verbundenen Nucleotidsequenz von Interesse eine konstitutive Expression verleihen.
Im Gebiet der Landwirtschaft gibt es einen ständigen Bedarf, Pflanzen nach Wunsch zu verändern. Ein Weg, dies zu erzielen, ist die Verwendung moderner gentechnischer Verfahren. Beispielsweise kann durch Einschleusung eines Gens von Interesse in eine Pflanze, diese Pflanze spezifisch modifiziert werden, um einen gewünschten phänotypischen Marker zu exprimieren. Hierfür werden Pflanzen am häufigsten mit einem heterologen Gen transformiert, welches eine Promotorregion, eine kodierende Region und einen Beendigungsbereich umfasst. Wenn ein heterologes Gen für die Expression in Pflanzen genetisch hergestellt wird, ist die Auswahl eines Promotors ein kritischer Faktor. Während beabsichtigt werden kann, bestimmte Gene nur in Reaktion auf bestimmte Stimuli zu exprimieren oder diese auf spezifische Zellen oder Gewebe zu beschränken, werden andere Gene wünschenswerterweise konstitutiv exprimiert, d. h. in der ganzen Pflanze zu allen Zeitpunkten und in den meisten Geweben und Organen. In der Vergangenheit ist der 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV 35S Promotor) verbreitet für die konstitutive Expression heterologer Gene in Pflanzen verwendet worden. Es gibt jedoch Umstände, unter denen es wünschenswert ist, alternative Promotoren zu verwenden. Daher ist es ein Hauptziel der vorliegende Erfindung, solche alternativen Promotoren für die Expression einer Nucleotidsequenz von Interesse in Pflanzen bereitzustellen. Die Erfindung stellt auch rekombinante DNA-Moleküle, Expressionsvektoren und transgene Pflanzen bereit, die die Vektoren der vorliegenden Erfindung umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt daher bereit: eine DNA-Sequenz, die in der Lage ist, die Expression einer damit verbundenen Nucleotidsequenz zu steuern, wobei die DNA-Sequenz aus dem Genom von Cestrum yellow leaf curling virus (CmYLCV) erhältlich ist. Bevorzugt ist eine DNA-Sequenz, die aus den CmYLCV-Promotor-Transkript vollständiger Länge erhältlich ist und die Nucleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID Nr. 1 wiedergegeben ist.
Insbesondere sind DNA-Sequenzen bereitgestellt, worin

– diese DNA-Sequenz die Nucleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID Nr. 2 wiedergegeben ist
– diese DNA-Sequenz die Nucleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID Nr. 3 wiedergegeben ist
– diese DNA-Sequenz die Nucleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID Nr. 4 wiedergegeben ist
– diese DNA-Sequenz die Nucleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID Nr. 5 wiedergegeben ist
– diese DNA-Sequenz die Nucleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID Nr. 6 wiedergegeben ist
– die DNA-Sequenz unter stringenten Bedingungen mit irgendeiner der SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 hybridisiert, insbesondere worin die DNA-Sequenz, die oben erwähnt worden ist, die Nucleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID Nr. 19 oder SEQ ID Nr. 20 wiedergegeben ist.

Die Erfindung stellt ferner DNA-Sequenzen bereit, die eine konsekutive Abfolge von mindestens 50 Nucleotiden umfassen, vorzugsweise ungefähr zwischen 400 Basen und ungefähr 650 Basen, mehr bevorzugt zwischen ungefähr 200 Basen und ungefähr 400 Basen und am meisten bevorzugt von ungefähr 350 Basen Länge der SEQ ID Nr. 1, worin diese DNA-Sequenzen in der Lage sind, die Expression einer damit verbundenen Nucleotidsequenz zu steuern.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat diese konsekutive Abfolge von mindestens 50 Nucleotiden, vorzugsweise von zwischen ungefähr 400 Basen und ungefähr 650 Basen, mehr bevorzugt von zwischen ungefähr 200 Basen und ungefähr 400 Basen und am meisten bevorzugt von ungefähr 350 Basen Länge mindestens 75%, vorzugsweise 80%, mehr bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95% Sequenzidentität mit einer entsprechenden konsekutiven Abfolge von mindestens 50 Nucleotiden, vorzugsweise zwischen ungefähr 400 Basen und ungefähr 650 Basen, mehr bevorzugt zwischen ungefähr 200 Basen und ungefähr 400 Basen, und am meisten bevorzugt ungefähr 350 Basen Länge von SEQ ID Nr. 1 aufweist. Die Erfindung stellt ferner rekombinante DNA-Moleküle bereit, die einen Transkriptionspromotorbereich voller Länge umfassen, welcher aus Cestrum yellow leaf curling virus isoliert wurde. Zusätzlich stellt die Erfindung rekombinante DNA-Moleküle und DNA-Expressionskassetten bereit, die eine DNA-Sequenz gemäß der Erfindung umfassen, die operativ mit einer Nucleotidsequenz von Interesse verbunden ist. Die Erfindung stellt auch DNA-Expressionsvektoren bereit, die diese rekombinante DNA bzw. Expressionskassetten umfassen.
Insbesondere werden rekombinante DNA-Moleküle und DNA-Expressionskassetten bereitgestellt, wobei die Nucleotidsequenz von Interesse eine kodierende Sequenz umfasst, insbesondere worin

– die kodierende Sequenz eine gewünschte phänotypische Eigenschaft kodiert
– die kodierende Sequenz ein selektierbares oder screenfähiges Markergen kodiert
– die kodierende Sequenz ein Protein kodiert, das eine Antibiotika-Resistenz, Virusresistenz, Insektenresistenz, Krankheitsresistenz oder Resistenz gegenüber anderen Seuchen, Herbizidtoleranz, verbesserten Nährwert, verbesserte Leistungsfähigkeit in einem industriellen Verfahren oder veränderte reproduktive Fähigkeiten kodiert.
– die kodierende Sequenz ein Protein kodiert, welches einen positiven Selektionsvorteil an Zellen verleiht, die mit dieser kodierenden Sequenz transformiert worden sind
– die kodierende Sequenz ein Protein kodiert, welches Zellen einen metabolischen Vorteil verleiht, die mit dieser kodierenden Sequenz transformiert worden sind, welcher darin besteht, dass sie in der Lage sind, eine Verbindung zu metabolisieren, wobei die Verbindung Mannose oder Xylose oder ein Derivat oder ein Vorläufer davon ist, oder ein Substrat des Proteins, oder das in der Lage ist, durch Zellen, die mit dieser kodierenden Sequenz transformiert worden sind, in ein solches Substrat metabolisiert werden zu können
– die kodierende Sequenz ein Enzym kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Xyloisomerasen, Phosphomannoisomerase, Mannose-6-phosphat-Isomerase, Mannose-1-phosphat-Isomerase, Phosphomannomutase, Mannoseepimerase, Mannose- oder Xylosephosphatase, Mannose-6-phosphatase, Mannose-1-phosphatase oder Mannose- oder Xylosepermease besteht
– die kodierende Sequenz eine Phosophomannoisomerase kodiert
– die kodierende Region nicht translatierbar ist
– die nicht translatierbare kodierende Region aus einem viralen Gen stammt, insbesondere aus TSWV, genauer gesagt aus dem TSWV NP-Gen
– die kodierende Sequenz kommerziell wertvolle Enzyme oder Metabolite in der Pflanze kodiert
– die kodierende Sequenz in Gegensinn-Richtung vorliegt.

Die Erfindung stellt auch DNA-Expressionsvektoren bereit, die eine DNA-Sequenz umfassen, oder ein rekombinantes DNA-Molekül, das oben erwähnt worden ist. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist dieser DNA-Expressionsvektor pNOV2819 oder pNOV2819. Des Weiteren werden DNA-Expressionsvektoren bereitgestellt, die eine erste DNA-Sequenz gemäß der Erfindung umfassen, die operativ mit einer Nucleotidsequenz von Interesse verbunden ist, und eine zweite DNA-Sequenz gemäß der Erfindung, operativ verbunden mit einer Nucleotidsequenz von Interesse. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung sind die oben erwähnten DNA-Expressionsvektoren in der Lage, die Expression eines viralen Genoms zu verändern.
In einer noch spezifischeren Ausführungsform umfasst der oben erwähnte DNA-Expressionsvektor eine erste DNA-Sequenz, die in der Lage ist, ein Sinn-RNA-Fragment dieses viralen Genoms oder ein Teil davon zu exprimieren, und eine zweite DNA-Sequenz, die in der Lage ist, in einer Zelle ein Gegensinn-DNA-Fragment dieses viralen Genoms oder einen Teil davon zu exprimieren, worin dieses Sinn-RNA-Fragment und das Gegensinn-RNA-Fragment in der Lage sind, eine doppelsträngige RNA zu bilden.
Es werden Expressionvektoren, die oben erwähnt worden sind, bereitgestellt, worin

– das Virus ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Tospoviren, Potyviren, Potexviren, Tobamoviren, Luteoviren, Cucumoviren, Bromoviren, Closteoviren, Tombusviren und Furoviren besteht,
– die DNA-Sequenzen eine Nucleotidsequenz umfassen, die von einem viralen Hüllproteingen, einem viralen Nucleocapsidproteingen, einem viralen Replicasegen oder einem viralen Bewegungsproteingen oder Teilen davon stammt,
– die DNA-Sequenz aus dem Tomatenbronzefleckenvirus (TSWV) stammt,
– die DNA von einem Nucleocapsid-Proteingen stammt.

Die Erfindung stellt ferner bereit Wirtszellen, die stabil mit einer DNA-Sequenz, einem rekombinanten DNA-Molekül oder einem DNA-Expressionsvektor gemäß der Erfindung transformiert worden sind. Insbesondere, worin

– die Wirtszelle ein Bakterium ist,
– die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist,
– die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zellen von Reis, Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Süßkartoffeln, Süßmais, Bohnen, Erbsen, Chicoree, Salat, Kohl, Blumenkohl, Brokkoli, Rüben, Radieschen, Spinat, Spargel, Zwiebel, Knoblauch, Paprika, Sellerie, Squash-Kürbis, Hanf, Zucchini, Äpfel, Birnen, Quitten, Melonen, Pflaumen, Kirschen, Pfirsischen, Nektarinen, Aprikosen, Erdbeeren, Trauben, Himbeeren, Brombeeren, Ananas, Avocado, Papaya, Mango, Bananen, Sojabohnen, Tomaten, Hirse, Zuckerrüben, Zuckerrohr, Sonnenblumen, Raps, Klee, Tabak, Karotten, Baumwolle, Alfalfa, Kartoffeln, Auberginen, Gurken, Kresse (Arabidopsis thaliana) und Gehölzpflanzen, wie beispielsweise Koniferen und Laubbäumen, aber insbesonder Reis, Mais, Weizen, Gerste, Kohl, Blumenkohl, Paprika, Kürbis, Melone, Sojabohnen, Tomaten, Zuckerrüben, Sonnenblumen oder Baumwolle, Reis, Mais, Weizen, Sorgum bicolor, Knaulgras, Zuckerrüben und Sojabohnenzellen
– die Wirtszelle ist eine Pflanzenzelle einer dicotyledonen Pflanze
– die Wirtszelle ist eine Pflanzenzelle einer dicotyledonen Pflanze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sojabohne, Baumwolle, Tabak, Zuckerrübe und Ölsaatraps
– die Wirtszelle ist eine Pflanze ausgewählt aus monocotyledonen Pflanzen
– die Wirtszelle ist eine Pflanze ausgewählt aus einer Monocotyledonenpflanze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Weizen, Hirse, Roggen, Hafer, Rasengras, Reis und Gerste.

Zusätzlich werden Pflanzen und deren Nachkommen, einschließlich Samen, bereitgestellt, die stabil mit einer DNA-Sequenz, einem rekombinanten DNA-Molekül oder einem DNA-Expressionsvektor gemäß der Erfindung transformiert sind. Insbesondere, worin die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Reis, Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Süßkartoffel, Süßmais, Bohnen, Erbsen, Chicoree-Salat, Kohl, Blumenkohl, Brokkoli, Rüben, Radieschen, Spinat, Spargel, Zwiebeln, Knoblauch, Paprika, Sellerie, Kürbis, Hanf, Zucchini, Apfel, Birne, Quitte, Melone, Pflaume, Kirsche, Pfirsisch, Nektarine, Aprikose, Erdbeeren, Trauben, Himbeeren, Brombeeren, Ananas, Avocado, Papaya, Mango, Bananen, Sojabohnen, Tomaten, Hirse, Zuckerrohr, Zuckerrüben, Sonnenblumen, Raps, Klee, Tabak, Karotten, Baumwolle, Alfalfa, Kartoffeln, Auberginen, Gurken, Arabidopsis thaliana und Gehölzpflanzen wie Koniferen und Laubbäumen, aber insbesondere Reis, Mais, Weizen, Gerste, Kohl, Blumenkohl, Paprika, Kürbis, Melonen, Sojabohnen, Tomaten, Zuckerrüben, Sonnenblumen oder Baumwolle, Reis, Mais, Weizen, Sorghum bicolor, Knaulgras, Zuckerrüben und Sojabohnen.
Die vorliegende Erfindung offenbart ferner

– die Verwendung der DNA-Sequenz gemäß der Erfindung, um eine Nucleotidsequenz von Interesse zu exprimieren.
– ein Verfahren zum Herstellen einer DNA-Sequenz gemäß der Erfindung, worin die DNA durch eine Polymerase-Kettenreaktion hergestellt wird, worin mindestens ein Oligonucleotid, das verwendet wird, eine Sequenz aus Nucleotiden umfasst, welche eine konsekutive Abfolge von 15, 18, 20, 22, 24 oder mehr Basenpaaren der SEQ ID Nr. 1 darstellen.

Um eine klares und konsistentes Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche sicherzustellen, werden die folgenden Definitionen bereitgestellt:
CmYLCV: Cestrum yellow leaf curling virus.
DNA-Shuffling: DNA-Shuffling ist ein Verfahren, um schnell, leicht und wirksam Rearrangements, vorzugsweise zufallsgemäß in einem DNA-Molekül einzuführen, oder um Austausche von DNA-Sequenzen zwischen zwei oder mehr DNA-Molekülen, vorzugsweise zufallsgemäß zu erzeugen. Das DNA-Molekül, das aus DNA-Shuffling resultiert, ist ein geshuffeltes DNA-Molekül, das ein nicht natürlich auftretendes DNA-Molekül ist, welches von mindestens einem Matrizen-DNA-Molekül stammt.
Expression: betrifft die Transkription und/oder Translation eines endogenen Gens oder eines Transgens in Pflanzen. Im Fall von Gegensinn-Konstrukten kann Expression beispielsweise allein die Transkription der Gegensinn-DNA betreffen.
„Funktional äquivalente Sequenz" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die eine Promotoraktivität besitzt, die im Wesentlich ähnlich der des CmYLCV-Transkriptpromotors vollständiger Länge oder Teilen davon ist und welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit diesen Promotorsequenzen hybridisiert.
Gen: betrifft eine kodierende Sequenz und assoziierte regulatorische Sequenz, wobei die kodierende Sequenz in RNA umgeschrieben wird, wie beispielsweise in mRNA, rRNA, rRNA, snRNA, Sinn-RNA oder Gegensinn-RNA. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind Promotorsequenzen, 5'- und 3'-nichttranslatierte Sequenzen und Beendigungssequenzen. Weitere Elemente, die vorhanden sein können, sind beispielsweise Introns.
Gen von Interesse: bezieht sich auf jedes Gen, welches, wenn es in eine Pflanze überführt wird, der Pflanze eine gewünschte Charakteristik verleiht, wie beispielsweise eine Antibiotika-Resistenz, Virusresistenz, Insektenresistenz, Krankheitsresistenz oder Resistenz gegenüber anderen Seuchen, Herbizidtoleranz, verbesserte Nährwert-Gehalte, verbesserte Leistungsfähigkeit in einem industriellen Verfahren oder veränderte Reproduktionsfähigkeit. Das „Gen von Interesse" kann auch eines sein, das in Pflanzen zur Herstellung kommerziell wertvoller Enzyme oder Metabolite in die Pflanze eingeschleust worden ist.
„Heterolog" bedeutet, so wie es hier verwendet wird, von unterschiedlichem natürlichem oder von synthetischem Ursprung. Beispielsweise, wenn eine Wirtszelle mit einer Nucleinsäuresequenz transformiert ist, die in einer nicht transformierten Wirtszelle nicht auftritt, wird von dieser Nucleinsäuresequenz, bezogen auf die Wirtszelle als heterolog gesprochen. Die transformierende Nucleinsäure kann einen heterologen Promotor, eine heterologe kodierend Sequenz, oder eine heterologe Beendigungssequenz umfassen. Alternativ dazu kann die transformierende Nucleinsäure vollständig heterolog sein oder sie kann irgendeine mögliche Kombination aus heterologen und endogenen Nucleinsäuresequenzen umfassen.
Leader-Bereich: ein Bereich in einem Gen zwischen der Transkriptions-Startstelle und der Translations-Startstelle.
Markergen: bezieht sich auf ein Gen, welches eine selektierbare oder screenfähige Markierung kodiert.
Operativ gebunden an/verbunden mit: eine regulatorische DNA wird als „operativ gebunden an" oder „verbunden mit" einer DNA-Sequenz beschrieben, die für eine RNA oder ein Protein kodiert, wenn die zwei Sequenzen so angeordnet sind, dass die regulatorische DNA-Sequenz die Expression der kodierenden DNA-Sequenz beeinflusst.
Pflanze: bezieht sich auf irgendeine Pflanze, insbesondere auf Samenpflanzen.
Pflanzenzelle: strukturelle und physiologische Einheit der Pflanze, umfassend einen Protoplasten und eine Zellwand. Die Pflanzenzelle kann in Form einer isolierten Einzelzelle oder einer kultivierten Zelle vorliegen, oder als Teil einer höheren organisierten Einheit, wie beispielsweise einem Pflanzengewebe oder einem Pflanzenorgan.
Pflanzenmaterial: bezieht sich auf Blätter, Stämme, Wurzeln, Blüten oder Blütenteile, Früchte, Pollen, Pollenröhrchen, Eier, Embryosäcke, Eierzellen, Zygoten, Embryonen, Samen, Stecklinge, Zellen oder Gewebekulturen oder irgendeinen anderen Teil oder Produkt einer Pflanze.
Promotor: bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die die Transkription einer damit verbundenen DNA-Sequenz initiiert. Die Promotorregion kann auch Elemente einschließen, die als Regulatoren der Genexpression dienen, wie beispielsweise Aktivatoren, Enhancer und/oder Repressoren und kann alles oder einen Teil der 5' nicht-translatierten Leadersequenz einschließen.
Rekombinantes DNA-Molekül: eine Kombination aus DNA-Sequenzen, die unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie miteinander verbunden sind.
Rekombinante DNA-Technologie: Verfahren, die verwendet werden, um DNA-Sequenzen, wie beispielsweise in Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, miteinander zu verbinden.
Screenfähiges Markergen: bezieht sich auf ein Gen, dessen Expression einer transformierten Zelle keinen Selektionsvorteil verleiht, aber dessen Expression die transformierte Zelle von nicht transformierten Zellen phänotypisch unterscheidet.
Selektierbares Markergen: bezieht sich auf ein Gen, dessen Expression in einer Pflanzenzelle der Zelle einen Selektionsvorteil verleiht. Der Selektionsvorteil, der von den Zellen besessen wird, die mit dem selektierbaren Markergen transformiert sind, kann auf deren Fähigkeit zurückzuführen sein, in Gegenwart eines negativen Selektionsmittels zu wachsen, wie beispielsweise einem Antibioticum oder einem Herbizid, verglichen mit dem Wachstum nicht transformierter Zellen. Der Selektionsvorteil, den transformierte Zellen besitzen, verglichen mit den nicht transformierten Zellen, kann auch auf ihrer verstärkten oder neuen Fähigkeit beruhen, eine zusätzliche Verbindung zu verwenden, wie beispielsweise einen Nährstoff, einen Wachstumsfaktor oder eine Energiequelle. Ein selektierbares Markergen verleiht einem Gen oder einer Kombination von Genen, deren Expression in einer Pflanzenzelle in Gegenwart des Selektionsmittels, verglichen mit der Abwesenheit des Selektionsmittels, der transformierten Pflanzenzelle eine positive Wirkung verleiht und der nicht transformierten Pflanzenzelle negative Wirkung, beispielsweise bezüglich des Wachstums und verleiht so der transformierten Pflanzenzelle einen positiven Selektionsvorteil.
Sequenzidentität: der Prozentsatz der Sequenzidentität wird unter Verwendung von Computerprogrammen bestimmt, die auf dynamischen Programmalgorithmen beruhen. Computerprogramme, die im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind, schließen das BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)-Rechercheprogramm ein, welches entworfen worden ist, um alle erhältlichen Sequenzdatenbanken zu nutzen, unabhängig davon, ob der Suchbegriff ein Protein oder eine DNA betrifft. Die Version BLAST 2.0 (Gaped BLAST) dieses Recherchewerkzeugs ist über das Internet öffentlich zugänglich gemacht worden (gegenwärtig http:://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Es verwendet einen heuristischen Algorithmus, welcher lokal sucht, im Gegensatz zu globalen Anlagerungen, und ist daher in der Lage, Verwandtschaften zwischen Sequenzen nachzuweisen, die nur isolierte Bereiche teilen. Die in einer BLAST-Recherche zugeordneten Werte besitzen eine gut definierte statistische Interpretierbarkeit. Diese Programme werden vorzugsweise mit optionalen Parametern laufen gelassen, die den vorgegebenen Werten hinzugefügt werden.
Transformation: bezieht sich auf die Einschleusung einer Nucleinsäure in eine Zelle. Insbesondere betrifft es die stabile Integration eines DNA-Moleküls in das Genom eines Organismus von Interesse.
TSWV: Tomatenbronzefleckenvirus
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die aus dem Genom des Cestrum yellow leaf curling virus (CmYLCV) erhältlich sind. Bevorzugt sind DNA-Sequenzen, die aus dem CmYLCV Transkriptpromotor vollständiger Länge gewinnbar sind, welche in der Lage sind, die Expression einer damit verbundenen Nucleinsäure von Interesse anzutreiben. DNA-Sequenzen, die funktionale und/oder strukturelle Äquivalente davon umfassen, sind ebenfalls durch die Erfindung eingeschlossen. Die vorliegende Erfindung betrifft daher DNA-Sequenzen, die als Promotoren der Transkription von damit verbundenen Nucleotidsequenzen dienen. Die Promotorregion kann ebenfalls Elemente einschließen, die als Regulatoren der Genexpression dienen, wie beispielsweise Aktivatoren, Enhancer und/oder Repressoren und kann die 5' nicht-translatierte Leadersequenz der transkribierten mRNA einschließen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verleiht diese DNA-Sequenz einer damit verbundenen Nucleotidsequenz eine konstitutive Expression. Die konstitutive Expression bedeutet, dass die Nucleotidsequenz von Interesse zu allen Zeitpunkten und in den meisten Geweben und Organen exprimiert wird. Wenn sie mit GUS- oder einem CAT-Reportergen in transienten Expressionsassays getestet wird, verleiht die erfindungsgemäße DNA-Sequenz ein hohes Niveau der Expression des GUS- oder CAT-Reportergens. Daher ist die DNA-Sequenz gemäß der Erfindung nützlich für die Expression einer damit verbundenen Nucleotidsequenz von Interesse auf hohem Niveau, welche vorzugsweise eine kodierende Sequenz ist. Es ist dem Fachmann bekannt, dass die damit verbundene kodierende Sequenz von Interesse in Sinn- oder Gegensinnrichtung exprimiert werden kann. Des Weiteren kann die kodierende Sequenz von Interesse heterologen oder homologen Ursprungs sein, bezogen auf die zu transformierende Pflanze. Im Fall einer homologen kodierenden Sequenz ist die DNA-Sequenz gemäß der Erfindung nützlich für die ectopische Expression dieser Sequenz. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung unterdrückt die kodierende Sequenz von Interesse unter Kontrolle einer DNA-Sequenz gemäß der Erfindung dessen eigene Expression und die der Originalkopie des Gens durch einen Prozess, der als Co-Suppression bezeichnet wird.
Die Promotoren der vorliegenden Erfindung können aus genomischer DNA des Cestrum yellow leaf curling virus (CmYLCV) gewonnen werden, welches beispielsweise aus infizierten Chilenischen Hammerstrauch-Pflanzen isoliert werden kann. CmYLCV infizierte Chilenischer Hammerstrauch-Pflanzen werden durch ihre mosaikartigen Blätter und eine Missbildung in Form von zerknitterten Blättern identifiziert. Diese DNA wird dann sequenziert und analysiert. Ein Sequenzvergleich mit Sequenzen in der Datenbank zeigt, dass die genomische Organisation von CmYLCV mit der eines Mitglieds der Caulimovirus-Familie verwandt ist. CmYLCV enthält 8 offene Leseraster. Ein Sequenzvergleich der CmYLCV-Genprodukte zeigt, dass das Gen I-Produkt in intrazelluläre Bewegungen involviert ist: Gen A kodiert ein kleines Protein unbekannter Funktion, Gen B kodiert den Aphid-Transmissionsfaktor; Gen C kodiert ein Virion-assoziiertes Protein; das Gen IV ist das Haupt-Capsidprotein; Gen V kodiert eine Reverse Transkriptase und das Gen VI aktiviert in trans die Translation viraler Gene des Transkripts vollständiger Länge. Von besonderem Interesse ist der sogenannte CmYLCV Transkript-Promotor voller Länge.
Es ist dem Fachmann bekannt, dass verschiedene Bereiche des CmYLCV-Transkriptpromotors voller Länge erfindungsgemäß verwendet werden können. Eine besondere Ausführungsform der Erfindung ist der CmYLCV-Transkriptpromotorbereich vollständiger Länge, welcher in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, welcher als CmpD-Promotor bezeichnet wird. Diese Sequenz enthält 350 bp des CmYLCV-Transkriptpromotors vollständiger Länge und 320 bp des CmYLCV-Transkript 5' nicht-translatierten Leadersequenz vollständiger Länge. Diese Sequenz wird durch Sequenzieren der genomischen CmYLCV-DNA gewonnen. Der Promotor und die Leadersequenzen werden jeweils durch einen Vergleich der Sequenzen in der Datenbank identifiziert. Eine Variante der SEQ ID Nr. 1, die als CmpE bezeichnet wird, in der die CmYLCV-Transkript 5' nicht-translatierte Leadersequenz 318 bp anstelle 320 bp lang ist, ist in SEQ ID Nr. 19 gezeigt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 2 wiedergegeben ist, die als CmpC-Promotor bezeichnet wird. Der CmpC-Promotor ist ein Fragment der Sequenz, welches in SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird, und er enthält 346 bp des CmYLCV-Transkriptpromotors vollständiger Länge, was der Base 5 bis 350 der SEQ ID Nr. 1 entspricht. Diese DNA-Sequenz ist durch PCR mit genomischer DNA von Cestrum yellow leaf curling virus oder von Cestrum yellow leaf curling virus-infizierten Chilenischen Hammerstrauch-Pflanzen unter Verwendung des Vorwärtsprimers Cmp1 (SEQ ID Nr. 13) und des Umkehrprimers CmpC2 (SEQ ID Nr. 14) erhältlich. Die vermutete TATA-Box des CmpC-Promotors reicht von der Base 308 bis zur Base 315 der SEQ ID Nr. 2. Der CmpC-Promotor enthält mindestens 3 vermutete Enhancer-Bereiche. Enhancer-Bereich 1 mit der Nucleotidsequenz CAAT reicht von Base 232 bis zur Base 235 der SEQ ID Nr. 2 und Verstärkerbereich 2 ebenfalls mit der Nucleotidsequenz CAAT reicht von der Base 243 bis Base 246 der SEQ ID Nr. 2. Enhancer-Bereich 3 reicht von der Base 246 bis Base 253 der SEQ ID Nr. 2 und hat die Nucleotidsequenz TGACGTAA.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die DNA, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, welche als CmpS-Promotor bezeichnet wird. Der CmpS-Promotor ist ebenfalls ein Fragment der Sequenz, welche in SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird und enthält 346 bp der SEQ ID Nr. 2 plus 54 bp des Leaderbereichs des CmYLCV-Transkriptpromotors voller Länge. Der Leaderbereich ist eine Nucleotidsequenz, die der kodierenden Region vorangeht, welche transkribiert wird, aber nicht in Protein translatiert wird. Es ist dem Fachmann bekannt, dass der Leaderbereich regulatorische Elemente mit wichtigen Funktionen der Genexpression enthalten kann. Der CmpS-Promotor ist durch PCR mit genomischer DNA des Cestrum yellow leaf curling virus oder aus Cestrum yellow leaf curling virus-infizierten Chilenischen Hammerstrauch-Pflanzen unter Verwendung des Vorwärtsprimers Cmp1 (SEQ ID Nr. 13) und des Umkehrprimers CmpS2 (SEQ ID Nr. 15) erhältlich. Der CmpS-Promotor enthält mindestens 2 vermutete Enhancer-Bereiche in den Leaderbereich. Enhancer-Bereich 4 (GAGAGA) liegt zwischen Base 354 und Base 359 der SEQ ID Nr. 3 und Enhancer-Bereich 5 (GAGAGAGA) liegt zwischen Base 368 und Base 375 der SEQ ID Nr. 3.
Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung sind die Sequenzen, die in SEQ ID Nr. 4 wiedergegeben sind, welche als CmpL-Promotor bezeichnet wird. Wie die oben genannten Promotoren ist der CmpL-Promotor ein Fragment der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, und enthält die 346 bp der SEQ ID Nr. 2 plus 288 bp des CmYLCV-Transkript 5' nicht-translatierten Leadersequenz vollständiger Länge. Der CmpL-Promotor ist durch PCR mit genomischer DNA von Cestrum yellow leaf curling virus oder aus Cestrum yellow leaf curling virus-infizierten Chilenischen Hammerstrauch-Pflanzen unter Verwendung des Vorwärtsprimers Cmp1 (SEQ ID Nr. 13) und des Umkehrprimers CmpL2 (SEQ ID Nr. 16) erhältlich. Eine Variante von SEQ ID Nr. 4, welche als CmpF bezeichnet wird, in dem die CmYLDV-Transkript 5' nicht-translatierte Leadersequenz vollständiger Länge 286 pb anstelle von 280 bp Länge beträgt, ist in SEQ ID Nr. 20 gezeigt.
Es ist dem Fachmann bekannt, dass die Nucleotidsequenzen, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19 und 20 gezeigt sind, an ihren 5'- und 3'-Enden mit homologen oder heterologen Nucleotidsequenzen verlängert werden können. Beispielsweise kann das 5'-Ende der SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19 und 20 durch alle oder einen Teil der Nucleotide verlängert werden, die in SEQ ID Nr. 6 gezeigt sind. SEQ ID Nr. 6 wird natürlich stromaufwärts der SEQ ID Nr. 2, 3, 4 und 20 gefunden und enthält einen Teil des ORF VI von CmYLCV (Base 1 bis Base 100 der SEQ ID Nr. 6), wie auch des CmYLCV-Transkriptpromotors vollständiger Länge (Base 101 bis Base 104 der SEQ ID Nr. 6). Gleichermaßen können die 3'-Enden der SEQ ID Nr. 2, 3, 4 und 20 durch alle oder einen Teil der Nucleotide verlängert werden, die SEQ ID Nr. 5 gezeigt sind, welche die Nucleotidsequenz darstellen, die natürlicherweise am 3'-Ende der SEQ ID Nr. 4 und 20 gefunden wird, und einen Teil der CmYLCV-Transkript-Leadersequenz vollständiger Länge umfasst.
Wie oben beschrieben worden ist, können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen beispielsweise durch PCR mit genomischer DNA aus Cestrum yellow leaf curling virus oder aus Cestrum yellow leaf curling virus-infizierten Chilenischen Hammerstrauch-Pflanzen gewonnen werden. Alternativ dazu können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen aus irgendeinem anderen Virus der Caulimovirus-Familie gewonnen werden, welche Homologe der DNA-Sequenz der Erfindung umfassen, indem Sequenz-spezifischer Primer verwendet werden. Es ist dem Fachmann klar, dass auf Grundlage der Nucleotidsequenzen, die in SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 6 gezeigt sind, und in SEQ ID Nr. 19 und 20 jede Primerkombination von Interesse ausgewählt werden kann, um mittels PCR DNA-Fragmente verschiedener Längen zu amplifizieren, die erfindungsgemäß verwendet werden können. Die Erfindung schließt Fragmente ein, die von den CmYLCV-Transkriptpromotoren vollstäniger Länge stammen, welche erfindungsgemäß arbeiten, d. h. sie sind in der Lage, eine damit verbundene Nucleotidsequenz einer Expression zu ermöglichen.
Dies kann durch Herstellen von Promotorfragmenten getestet werden, indem sie mit einem selektierbaren oder screenfähigen Markergen fusioniert werden und indem die fusionierten Konstrukte auf die Bewahrung der Promotoraktivität hin untersucht werden. Solche Untersuchungen liegen innerhalb des Allgemeinwissens eines Fachmanns auf dem Gebiet. Bevorzugte DNA-Fragmente der Erfindung haben mindestens ungefähr 50 Basen, vorzugsweise ungefähr 400 Basen bis ungefähr 650 Basen, mehr bevorzugt ungefähr 200 Basen und ungefähr 400 Basen und am meisten bevorzugt ungefähr 350 Basen Länge.
Es ist dem Fachmann auf dem Gebiet auch bekannt, dass Mutationen, Insertionen, Deletionen und/oder Substitutionen einer oder mehrerer Nucleotide in die DNA-Sequenzen der SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 oder längeren oder kürzeren Fragmenten, die aus dieser Sequenzinformation stammen, indem bekannte Verfahren in dem Gebiet verwendet werden, eingeschleust werden können. Zusätzlich kann eine nicht modifizierte oder modifizierte Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung durch Shuffling der erfindungsgemäßen Sequenz variiert werden. Um einen Funktionstest einer von varianten DNA-Sequenzen gemäß der Erfindung durchzuführen, wird die Sequenz von Interesse operativ mit einem selektierbaren oder screenfähigen Markergen verbunden, und die Expression des Markergens wird in transienten Expressionstests mit Protoplasten getestet, oder in stabil transformierten Pflanzen. Es ist dem Fachmann bekannt, dass DNA-Sequenzen in der Lage sind, die Expression einer damit verbundenen Nucleotidsequenz anzutreiben, welche in modularer Form aufgebaut ist. Demgemäß können die Expressionsniveaus von kürzeren DNA-Fragmenten verschieden sein als die vom längsten Fragment, und sie können untereinander auch verschieden sein. Beispielsweise wird die Deletion eines herunterregulierenden stromaufwärts gelegenen Elements zu einem Anstieg der Expressionsmengen der damit verbundenen Nucleotidsequenz führen, während die Deletion eines heraufregulierenden Elements die Expressionsniveaus der damit verbundenen Nucleotidsequenz absenken wird. Es ist dem Fachmann auch bekannt, dass die Deletion von entwicklungsspezifischen oder gewebespezifischen Elementen zu zeitlich oder räumlich veränderten Expressionsprofilen der damit verbundenen Nucleotidsequenz führen. Von der vorliegenden Erfindung sind auch funktionale Äquivalente der Promotoren der vorliegenden Erfindung umfasst, d. h. Nucleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit irgendeiner der SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 hybridisieren, beispielsweise die Sequenzen, die in SEQ ID Nr. 19 und SEQ ID Nr. 20 gezeigt sind. Eine stringente Hybridisierung wird bei einer Temperatur von 65°C, vorzugsweise 60°C und am meisten bevorzugt 55°C in Zitrat-gepufferter Salzlösung (SSC) doppelter Stärke (2×) durchgeführt, welche 0,1% SDS enthält, gefolgt vom Spülen des Trägers bei der gleichen Temperatur mit einem Puffer, welcher eine reduzierte SSC-Konzentration hat. Eine derartig reduzierte Konzentration von Puffern ist typischerweise SSC mit einem Zehntel der Stärke (0,1 × SSC), welche 0,1% SDS enthält, vorzugsweise 0,2 × SSC enthaltend 0,1% SSC, und am meisten bevorzugt SSC halber Stärke (0,5 × SSC), welche 0,1% SDS enthält. So können funktionale Äquivalente des gesamten oder eines Teils des CmYLCV Transkriptpromotors der vollständigen Länge aus anderen Organismen durch Hybridisieren irgendeiner der SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 19 oder SEQ ID Nr. 20 mit genomischer DNA isoliert werden, welche aus einem Organismus von Interesse isoliert worden ist, insbesondere aus einem anderen Caulimovirus. Der Fachmann weiß, wie vorzugehen ist, um solche Sequenzen zu finden, da es viele Wege gibt, die in dem Fachgebiet bekannt sind, um homologe Sequenzen in anderen Organismen zu identifizieren. Solche neuen identifizierten DNA-Moleküle können dann sequenziert werden und die Sequenz kann mit irgendeiner von SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 19 oder SEQ ID Nr. 20 verglichen werden und bezüglich der Promotoraktivität getestet werden. Innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung sind DNA-Moleküle mit mindestens 75%, vorzugsweise 80%, mehr bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95% Sequenzidentität mit der Nucleotidsequenz in irgendeiner der SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4 oder 6 über eine Länge von mindestens 50 Nucleotiden. Der Prozentsatz an Sequenzidentität wird unter Verwendung von Computerprogrammen bestimmt, die auf dynamischen Programmalgorithmen beruhen. Computerprogramme, die innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung bevorzugt sind, schließen die BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)-Rechercheprogramme ein, die entworfen worden sind, um alle verfügbaren Sequenzdatenbanken, unabhängig davon, ob die Suche ein Protein oder eine DNA ist, zu nutzen. Die Version BLAST 2.0 (Gapped BLAST) dieses Recherchetools ist öffentlich übers Internet zugänglich gemacht worden (gegenwärtig http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). ES verwendet einen heuristischen Algorithmus, welcher lokal sucht, statt in globalen Anlagerungen, und ist daher in der Lage, Verwandtschaften zwischen Sequenzen nachzuweisen, die nur isolierte Bereiche teilen. Die durch eine BLAST-Recherche zugeschriebenen Werte ermöglichen eine wohl definierte statistische Interpretation. Diese Programme werden vorzugsweise mit optionalen Parametern, die für die vorgegebenen Werte eingesetzt werden, laufen gelassen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, rekombinante DNA-Moleküle bereitzustellen, die eine DNA-Sequenz gemäß der Erfindung umfassen, welche operativ mit einer Nucleotidsequenz von Interesse verbunden ist. Die Nucleotidsequenz von Interesse kann beispielsweise eine ribosomale RNA, eine Gegensinn-RNA oder irgendeine andere Art von RNA kodieren, welche nicht in ein Protein translatiert wird. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Nucleotidsequenz von Interesse in ein Proteinprodukt translatiert. Die Nucleotidsequenz, die mit der Promotorsequenz assoziiert ist, kann homologen oder heterologen Ursprungs sein, bezogen auf die zu transformierende Pflanze. Die Sequenz kann auch vollständig oder teilweise synthetisch sein. Unabhängig vom Ursprung wird die damit verbundene DNA-Sequenz in der transformierten Pflanze gemäß den Expressionseigenschaften des Promotors exprimiert, mit dem sie verbunden ist. Im Falle homologer Nucleotidsequenzen, die mit der Promotorsequenz assoziiert sind, ist der Promotor gemäß der Erfindung für die ectopische Expression dieser homologen Sequenz nützlich. Ectopische Expression bedeutet, dass die Nucleotidsequenz, die mit der Promotorsequenz assoziiert ist, in Geweben und Organen exprimiert wird, und/oder zu Zeitpunkten, an denen diese Sequenz nicht exprimiert wird, unter Kontrolle ihres eigenen Promotors. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird die Expression einer Nucleotidsequenz, die mit der Promotorsequenz assoziiert ist, ihre eigene Expression unterdrücken und das der Originalkopie des Gens, durch ein Verfahren, welches durch einen Prozess, der als Co-Suppression bezeichnet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die vorhandene Nucleotidsequenz auch ein Protein kodieren, von dem man wünscht, dass es in der Pflanze zu allen Zeitpunkten und in den meisten Geweben und Organen exprimiert wird. Solche Nucleotidsequenzen kodieren vorzugsweise Proteine, die eine gewünschte phänotypische Markierung an die verbundene Pflanze verleihen. Beispiele sind Nucleotidsequenzen, die Proteine kodieren, die eine Antibiotikaresistenz verleihen, eine Virusresistenz, Insektenresistenz, Krankheitsresistenz oder Resistenz gegenüber anderen Seuchen, Herbizidtoleranz, verbesserte Nährwerte, verbesserte Leistungsfähigkeit in einem industriellen Verfahren oder veränderte reproduktive Eigenschaften. Die verbundene Nucleotidsequenz kann auch eine sein, die in Pflanzen zu Herstellung kommerziell wertvoller Enzyme oder Metabolite in der Pflanze eingeschleust worden ist. Von der vorliegenden Erfindung umfasst sind auch selektierbare oder screenfähige Markergene, d. h. Gene, die eine DNA-Sequenz der Erfindung umfassen, welche operativ mit einer kodierenden Region verbunden ist, die eine selektierbare oder screenfähige Markierung kodiert.
Beispiele selektierbarer oder screenfähiger Markergene sind unten beschrieben. Für einige Zielarten können verschiedene Antibiotika- oder Herbizidselektionsmarker bevorzugt sein. Die Selektionsmarker, die routinegemäß in der Transformation verwendet werden, schließen das nptII-Gen ein, welches gegenüber Kanamycin, Paromomycin, Geneticin oder verwandten Antibiotika Resistenz verleiht (Vieira and Messing, 1982, Gene 19: 259-268; Bevan et al., 1983, Nature 304: 184-187) das bakterielle aadA-Gen (Goldschmidt-Clermont, 1991, Nucl. Acids Res. 19: 4083-4089), welches eine Aminoglycosid 3'-Adenylyltransferase kodiert, und Resistenz gegenüber Streptomycin und Spectinomycin verleiht, das hph-Gen, welches eine Resistenz gegenüber dem Antibioticum Hygromycin verleiht (Blochlinger and Diggelmann, 1984, Mol. Cell. Biol. 4: 2929-2931), und das dhfr-Gen, welches gegenüber Methotrexat (Bourouis and Jarry, 1983, EMBO J. 2: 1099-1104) Resistenz verleiht. Andere Marker, die zu verwenden sind, schließen ein Phosphinothricinacetyltransferasegen ein, welches Resistenz gegenüber dem Herbizid Phosphinothricin verleiht (White et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18: 1062; Spencer et al., 1990, Theor. Appl. Genet. 79: 625-631), eine mutiertes EPSP-Synthasegen, welches ein Glyphosatresistenz kodiert (Hinchee et al., 1988, Bio/Technology 6: 915-922), eine mutierte Acetolactatsynthase (ALS)-Gen, welches Imidazolion- oder Sulonylharnstoffresistenz verleiht (Lee et al., 1988, EMBO J. 7: 1241-1248), ein mutiertes psbA-Gen, welches eine Atrazinresistenz verleiht (Smeda et al., 1993, Plant Physiol. 103: 911-917), oder ein mutiertes Protoporphyrinogenoxidasegen, das in EP 0 769 059 beschrieben ist. Die Identifizierung der transformierten Zellen kann ebenfalls durch die Expression eines screenfähigen Markergens, wie beispielsweise Genen erzielt werden, die für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), β-Glucuronidase (GUS) Luciferase (LUC) und grünes fluoreszierendes Protein (GFP) oder irgendein anderes Protein, das der transformierten Zelle ein phänotypisch eindeutiges Merkmal verleiht. Selektionsmarker, die zur positiven Selektion führen, wie beispielsweise Phosphomannoseisomerasegen, wie in Patentanmeldung WO 93/05163 beschrieben, werden ebenfalls verwendet. Andere Gene, die für die positive Selektion verwendet werden, sind beschrieben in WO 94/20627 und kodieren Xyloisomerasen und Phosphomanno-Isomerasen, wie Mannose-6-phosphatisomerase und Mannose-1-phosphatisomerase; Phosphomannomutase; Mannoseepimerasen, wie solche, die Kohlenhydrate umwandeln in Mannose oder Mannose in Kohlenhydrate, wie z. B. Glucose oder Galactose; Phosphatasen wie Mannose oder Xylosephosphatase, Mannose-6-phosphatase und Mannose-1-phosphatase, und Permeasen, die an dem Transport von Mannose beteiligt sind oder einem Derivativ, oder einem Vorläufer davon in die Zelle. Das die Toxizität der Verbindung gegenüber Zellen reduzierende Mittel ist typischerweise en Glucosederivat, wie Methyl-3-O-glucose oder Phloridizin. Transformierte Zellen werden ohne Beschädigung oder Abtöten der nicht transformierten Zellen der Population und ohne gleichzeitige Einschleusung von Antibiotika- und Herbizidresistenzgenen hergestellt. Wie in WO 93/05163 beschrieben, ist zusätzlich zur Tatsache, dass der Bedarf für Antibiotika- und Herbizidresistenzgene eliminiert worden ist, gezeigt worden, dass das positive Selektionsverfahren häufig viel effizienter ist als die traditionelle Negativselektion.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Promotoren operativ mit der kodierenden Region des E. coli manA-Gens (Joersbo and Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16: 219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803) verbunden, welche eine Phosphomannoseisomerase (PMI) kodiert, und mit einem Nos (Nopalinsynthetase)-Terminator, welcher aus Agrobacterium tumefaciens T-DNA (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573 (1982)) gewonnen wird. Der Fachmann auf dem Gebiet weiß, dass der Nos-Terminator durch irgendeinen anderen Terminator substituiert werden kann, welcher in Pflanzen funktioniert. Der Promotor der Erfindung kann ein CmpD-, CmpC-, CmpS-, CmpL-, CmpB-, CmpA-, CmpE- oder CmpF-Promotor sein, welcher in den SEQ ID Nr. 1 bis 6 und 19 bis 20 wiedergegeben ist, oder irgendeinen Promotor, der davon abstammt. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Promotor der CmpS-Promotor, welcher in SEQ ID Nr. 3 wiedergegeben ist.
Die erfindungsgemäßen Promotoren können ebenfalls verwendet werden, um durch operative Verbindung der Promotoren der Erfindung mit kodierenden Regionen an Genen von Viren, die kontrolliert werden sollen, eine Resistenz oder Toleranz gegenüber Viren zu verleihen.
Für die Viruskontrolle von negativ-strängigen Viren, wie beispielsweise dem Tomatenbronzefleckenvirus (TSWV), können für Gensequenzen das virale Nucleocapsidprotein (NP) und das Bewegungsprotein (MP) verwendet werden, und bei Viren, die zur Alpha-artigen Übergruppe an Viren gehören, wie beispielsweise TMV und CMV, können für die Gensequenzen RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp) und Bewegungsprotein (MP) verwendet werden. Für Viren, die zur Picorna-artigen Gruppe an Viren gehören, einschließlich Potyviren, kann jede virale Sequenz mit den Promotoren der Erfindung verbunden werden. Schließlich können bei allen anderen einschließlich DNA-Viren, RNA-abhängige RNA-Polymerase-/(RdRp) und Replicase-assoziierte Gensequenzen verwendet werden. Derartige Konstrukte für die Viruskontrolle können hergestellt werden, wie in Beispiel 8 und Beispiel 9 der WO 00/68374 exemplarisch angegeben, konstruiert werden. Es liegt innerhalb der allgemeinen Kenntnisse eines Fachmanns auf dem Gebiet, die Promotoren, die in WO 00/68374 offenbart sind, durch Promotoren der vorliegenden Erfindung auszutauschen. Nach der Lehre der WO 00/68374 weiß der Fachmann ebenfalls, wie Konstrukte herzustellen sind, die Promotoren der Erfindung umfassen, welche operativ mit viralen Sequenzen, die oben erwähnt worden sind, verbunden werden, um eine Resistenz oder Toleranz gegenüber dem Virus zu verleihen.
Statt doppelsträngige virale RNA in transgenen Pflanzen zu exprimieren, wie in WO 0068374 offenbart ist, kann die virale RNA auch als nicht translatierbare RNA in Form eines plus-Strang einer viralen RNA-Moleküls exprimiert werden, wie beispielsweise beschrieben in US 558302 oder in den Beispielen 12 und 13 der vorliegenden Erfindung.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, rekombinante Expressionsvektoren bereitzustellen, die eine DNA-Sequenz der Erfindung umfassen, welche mit einer verbundenen Nucleotidsequenz von Interesse fusioniert ist. In diesen Vektoren kann die fremde DNA in einen Polylinkerbereich inseriert werden, so dass diese exogenen Sequenzen in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden können, welche beispielsweise bakteriellen oder pflanzlichen Ursprungs sind. Beispielsweise erlaubt das Plasmid pBI101, welches aus dem binären Agrobacterium tumefaciens Vektor pBIN19 stammt, die Klonierung und das Testen von Promotoren unter Verwendung des beta-Glucuronidase (GUS)-Expressionssignal (Jefferson et al., 1987, EMBO J. 6: 3901-3907). Die Größe des Vektors beträgt 12,2 kb. Er hat einen Niedrigkopie-RK2-Replikationsursprung und verleiht sowohl an Bakterien als auch an Pflanzen Kanamycinresistenz. Es gibt zahlreiche andere Expressionsvektoren, die dem Fachmann bekannt sind, die erfindungsgemäß verwendet werden können.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, transgene Pflanzen bereitzustellen, welche die erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Sequenzen umfassen. Die Erfindung betrifft daher Pflanzenzellen, Pflanzen, die aus solchen Zellen stammen, Pflanzenmaterial, die Nachkommen und die Samen, die aus solchen Pflanzen stammen, und landwirtschaftliche Produkte mit verbesserten Eigenschaften, die durch irgendeines der Transformationsverfahren, die unten beschrieben sind, gewonnen werden. Pflanzen, die erfindungsgemäß transformiert sind, können monocotyledon oder dicotyledon sein und schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, Reis, Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Süßkartoffeln, Süßmais, Bohnen, Erbsen, Chicoree, Salat, Kohl, Blumenkohl, Brokkoli, Zuckerrübe, Radieschen, Spinat, Spargel, Zwiebeln, Knoblauch, Paprika, Sellerie, Kürbis, Kürbis, Hanf, Zucchini, Apfel, Birne, Quitte, Melone, Pflaume, Kirsche, Pfirsisch, Nektarine, Aprikose, Erdbeere, Traube, Himbeere, Brombeere, Ananas, Avocado, Papaya, Mango, Banane, Soyabohne, Tomate, Hirse, Zuckerrohr, Zuckerrübe, Sonnenblumen, Raps, Klee, Tabak, Karotten, Baumwolle, Alfalfa, Kartoffeln, Auberginen, Gurken, Arabidopsis thaliana und Holzpflanzen wie Koniferen und Laubbäume. Bevorzugte Pflanzen, die transformiert werden sollen, sind Reis, Mais, Weizen, Gerste, Kohl, Blumenkohl, Paprika, Kürbis, Melone, Soyabohnen, Tomaten, Zuckerrüben, Sonnenblumen oder Baumwolle, aber insbesondere Reis, Mais, Weizen, Zuckerhirse, Knaulgras, Zuckerrüben und Soyabohnen. Die rekombinanten DNA-Sequenzen der Erfindung können in eine Pflanzenzelle durch eine Anzahl wohl bekannter Verfahren eingeschleust werden. Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass die Auswahl eines solchen Verfahrens von der Art der Pflanze, die für die Transformation ins Visier genommen wird, abhängt, d. h. von Monocotyledonen oder Dicotyledonen. Geeignete Verfahren zur Transformierung von Pflanzenzellen schließen die Mikroinjektion (Crossway et al., 1986, Bio Techniques 4: 320-334), die Elektroporation (Riggs and Bates, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83: 5602-5606), Agrobacterium-vermittelte Transformation (Hinchee et al., 1988, Bio/Technology 6: 915-922; EP 0 853 675 ), direkten Gentransfer (Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2717-2722) und ballistische Partikelbeschleunigung unter Verwendung von Vorrichtungen, die von Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin und Dupont, Inc., Wilmington, Delaware erhältlich sind (siehe z. B. US Patent Nr. 4,945,050 und McCabe et al., 1988, Bio/Technology 6: 923-926). Die zu transformierenden Zellen können differenzierte Blattzellen, embryogene Zellen oder irgendeine andere Art von Zelle sein. Bei der direkten Transformation von Protoplasten kann die Aufnahme von exogenem genetischen Material in einen Protoplasten durch die Verwendung eines chemischen Mittels oder eines elektrischen Felds verstärkt werden. Das exogene Material kann dann in das nukleäre Genom integriert werden. Die vorhergehende Arbeit wurde an dicotyledonen Tabakpflanzen durchgeführt, was dazu führte, dass die fremde DNA in Nachkommenpflanzen eingebaut und transferiert wurde (Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2712-2722; Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet 199: 169-177). Monocotyledonen-Protoplasten, z. B. von Einkorn, einjähriges Weidelgras, Mais und schwarzen mexikanischen Süßmais werden durch dieses Verfahren transformiert. Eine zusätzliche bevorzugte Ausführungsform ist die Protoplastentransformationsmethode für Mais, wie offenbart in EP 0 292 435 , und in EP 0 846 771 . Für die Maistransformation siehe auch Koziel et al., 1993, Bio/Technology 11: 194-200. Die Transformation von Reis kann durch direkte Gentransfer-Techniken unter Verwendung von Protoplasten oder durch Partikelbombardierung durchgeführt werden. Die Protoplasten-vermittelte Transformation wird für Japonica-Arten und Indica-Arten (Zhang et al., 1988, Plant Cell Rep., 7: 379-384; Shimamoto et al., 1989, nature 338: 274-276; Datta et al., 1990, Bio/Technology 8: 736-740) beschrieben. Beide oben beschriebenen Typen sind auch routinegemäß unter Verwendung von Partikelbombardierung transformierbar (Christou et al., 1991, Bio/Technology 9: 957-962). Die Patentanmeldung Nr. EP 0 332 581 beschreibt Techniken für die Erzeugung, Transformation und Regeneration von Süßpflanzen-Protoplasten. Diese Techniken ermöglichen die Transformation aller Pooideae-Pflanzen einschließlich Knäuelgras und Weizen. Außerdem wird die Weizentransformation in der Patentanmeldung Nr. EP 0 674 715 und von Weeks et al., 1993 (Plant Physiol. 102: 1077-1084) beschrieben. Der so konstruierte Pflanzen-Expressionsvektor kann beispielsweise in die Calli von Reis gemäß einem konventionellen Pflanzen-Transformationsverfahren eingeschleust werden, und die Differenzierung von Wurzeln und Blättern wird daraus induziert, und dann kann sie in einen Blumentopf zur Kultivierung überführt werden, wodurch der transformierte Reis gewonnen wird.
Die Pflanzen, die aus der Transformation mit den DNA-Sequenzen oder Vektoren der vorliegenden Erfindung gewonnen werden, exprimieren eine Nucleotidsequenz von Interesse in der ganzen Pflanze und in den meisten Geweben und Organen.
Die genetischen Eigenschaften, die in die transgenen Pflanzen durch Rekombination eingeführt werden, welche oben beschrieben wurden, werden durch sexuelle Reproduktion oder vegetatives Wachstum weitergegeben und können dadurch in den Nachkommenpflanzen bewahrt und propagiert werden. Im Allgemeinen macht diese Bewahrung und Propagierung von bekannten landwirtschaftlichen Methoden Gebrauch, die entwickelt wurden, um spezifische Zwecke zu erfüllen, wie beispielsweise die Bodenbearbeitung, das Säen oder Ernten. Spezialisierte Verfahren wie Hydrokulturen oder Treibhaustechnologien können ebenfalls angewandt werden. Von den vorteilhaften genetischen Eigenschaften der transgenen Pflanzen gemäß der Erfindung kann ferner in der Pflanzenzucht Gebrauch gemacht werden, die auf die Entwicklung von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften, wie beispielsweise Toleranz gegenüber Seuchen, Herbiziden oder Stress, auf verbesserte Nährwerte, erhöhte Ausbeute oder verbesserte Struktur, welche einen geringeren Verlust aufgrund Lagerung oder Bruch zielen. Die verschiedenen Zuchtschritte werden durch gut definierte menschliche Eingriffe gekennzeichnet, wie beispielsweise die Auswahl der zu kreuzenden Linien, die direkte Bestäubung der Parentallinien oder die Auswahl geeigneter Nachkommenpflanzen. Abhängig von den gewünschten Eigenschaften werden verschiedene Zuchtmaßnahmen durchgeführt. Die relevanten Techniken sind in dem Fachgebiet gut bekannt und schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Hybridisierung, Inzucht, Rückkreuzungszüchtung, Multilinienzüchtung, Mischung von Sorten, Interspezies- Hybridisierung, Aneuploidie-Techniken, etc. Hybridisierungstechniken schließen auch die Sterilisierung von Pflanzen ein, um sterile männliche oder weibliche Pflanzen hervorzubringen, indem mechanische, chemische oder biochemische Mittel verwendet werden. Eine Kreuzbestäubung einer männlichen sterilen Pflanze mit Pollen einer anderen Linie sichert, dass das Genom der männlichen sterilen, aber der weiblichen fruchtbaren Pflanze gleichmäßig die Eigenschaften beider Parentallinien gewinnt. So können die transgenen Pflanzen nach der Erfindung für die Zucht verbesserter Pflanzenlinien verwendet werden, beispielsweise den Anstieg der Wirksamkeit konventioneller Verfahren, wie beispielsweise die Herbizid- oder Pestizidbehandlung, oder ermöglichen, auf dieses Verfahren, aufgrund ihrer modifizierten genetischen Eigenschaften zu verzichten. Alternativ dazu können neue Futterpflanzen mit verbesserter Stresstoleranz gewonnen werden, die aufgrund ihrer optimierten genetischen „Ausrüstung" ein Ernteprodukt von besserer Qualität hervorbringen als Produkte, die nicht in der Lage waren, vergleichsweise ungünstige Entwicklungsbedingungen zu tolerieren.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, DNA-Sequenzen bereitzustellen, die verwendet werden können, um eine Nucleotidsequenz von Interesse in einem gewünschten Organismus zu exprimieren. Dieser Organismus kann ein Bakterium, eine Pflanze oder irgendein anderer Organismus von Interesse sein.

Des Weiteren ermöglicht die Offenbarung der SEQ ID Nr. 1 bis 6 einem Fachmann auf dem Gebiet, Oligonucleotide für die Polymerase-Kettenreaktion zu entwerfen, welche versucht, DNA-Fragmente aus Matrizen zu amplifizieren, welche eine Sequenz von Nucleotiden umfassen, die durch irgeneine kontinuierliche Sequenz von 15, und vorzugsweise 20 bis 30 oder mehr Basenpaaren in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 gekennzeichnet ist. Diese Nucleotide umfassen eine Sequenz von Nucleotiden, die 15 und vorzugsweise 20 bis 30 oder mehr Basenpaare der SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 darstellen. Polymerase-Kettenreaktion, die unter Verwendung mindestens eines solchen Oligonucleotids durchgeführt werden, und ihre Amplifikationsprodukte bilden andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Kurze Beschreibung der Sequenzen in der Sequenzliste

SEQ ID Nr. 1	CmpD
SEQ ID Nr. 2	CmpC
SEQ ID Nr. 3	CmpS
SEQ ID Nr. 4	CmpL
SEQ ID Nr. 5	CmpB
SEQ ID Nr. 6	CmpA
SEQ ID Nr. 7	S1 Vorwärtsprimer
SEQ ID Nr. 8	S2 Umkehrprimer
SEQ ID Nr. 9	GUS Vorwärsprimer
SEQ ID Nr. 10	GUS Umkehrprimer
SEQ ID Nr. 11	CAT Vorwärtsprimer
SEQ ID Nr. 12	CAT Umkehrprimer
SEQ ID Nr. 13	Cmp1 Vorwärsprimer
SEQ ID Nr. 14	CmpC2 Umkehrprimer
SEQ ID Nr. 15	CmpS2 Umkehrprimer
SEQ ID Nr. 16	CmpL2 Umkehrprimer
SEQ ID Nr. 17	PA Vorwärtsprimer
SEQ ID Nr. 18	PA Umkehrprimer
SEQ ID Nr. 19	CmpE
SEQ ID Nr. 20	CmpF
SEQ ID Nr. 21	Nos-Terminator Vorwärtsprimer
SEQ ID Nr. 22	Nos-Terminator Umkehrprimer
SEQ ID Nr. 23	TSWV NP-Gen Vorwärtsprimer
SEQ ID Nr. 24	TSWV NP-Gen Umkehrprimer
SEQ ID Nr. 25	CmYLCV-Promotor Vorwärtsprimer
SEQ ID Nr. 26	CmYLCV-Promotor Umkehrprimer
SEQ ID Nr. 27	AGLINK Multiklonierungsstelle
SEQ ID Nr. 28	BIGLINK Multiklonierungsstelle
SEQ ID Nr. 29	Cmpf-B-Primer
SEQ ID Nr. 30	CmpS-B-Primer
SEQ ID Nr. 31	pNOV2803; binärer Vektor, enthält eine Promotor-lose PMI-nos-Terminator-Expressions-Kassette
SEQ ID Nr. 32	pNOV2803; Vektor für die Transformation mittels Biolistic, enthält eine Promotorlose PMI-nos-Terminator-Expressions-Kassette
SEQ ID Nr. 33	CmpMr Umkehrprimer
SEQ ID Nr. 34	CmpMf Vorwärtsprimer
SEQ ID Nr. 35	CmpMrs Umkehrprimer
SEQ ID Nr. 36	CmpMfs Vorwärtsprimer
SEQ ID Nr. 37	synGFPI; Pflanze, die ein optimiertes GFP-Gen mit Intron hat
SEQ ID Nr. 38	GIG; GUS-Gen mit Intron
SEQ ID Nr. 39	Cmp-C Umkehrprimer
SEQ ID Nr. 40	CmpS-synGFPI-nos Expressions-Kassette
SEQ ID Nr. 41	CmpS-GIG-nos Expressions-Kassette
SEQ ID Nr. 42	CmpC-synGFPI-nos Expressions-Kassette
SEQ ID Nr. 43	CmpC-GIG-nos Expressions-Kassette
SEQ ID Nr. 44	pNOV2117-Vektor
SEQ ID Nr. 45	pNOV4200-Vektor
SEQ ID Nr. 46	ZmUbi-GFP-35S Term Expressions-Kassette
SEQ ID Nr. 47	ZmUbi-GIG-nos Expressions-Kassette
SEQ ID Nr. 48	Ubg3(At)-synGFPI-nos Expressions-Kassette
SEQ ID Nr. 49	Ubg3(At)-GIG-nos Expressions-Kassette

Beispiele
Standard-Verfahren für die DNA-Rekombination und molekulare Klonierungstechniken, die hier verwendet werden, sind im Gebiet gut bekannt und werden beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., 1989, „Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, und von Ausubel et al., 1994, „Current protocols in molecular biology", John Wiley and Sons, New York.
Beispiel 1: Virus-Klonierung
1. DNA Extraktion.
Virus-Genom-DNA wird aus Cestrum yellow leaf curling virus-infizierten Chilenischen Hammerstrauch-Pflanzen extrahiert. Fünf Gramm der infizierten Blätter werden in 30 ml Mahlpuffer (0,2 M Tris, pH 7,0, 0,02 M EDTA, 2 M Harnstoff) für 60 sec. bei maximaler Geschwindigkeit in einem Brinkman Polytron Homogenisator mit einer PT10-Probe homogenisiert und leicht bei 4°C über Nacht mit Triton X-100 (2% Endkonzentration) geschüttelt. Virus wird aus dem rohen Homogenat durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (10.000 UpM für 20 min. in einem Sorvall SS-34-Rotor) gereinigt und aus dem gewonnenen Überstand mit Hilfe der Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation (27.000 UpM für 2 h in einem Beckman SW-28-Rotor) durch ein Saccharosekissen (3 ml 15% Saccharose). Das Virus-haltige Pellet wird dann in 0,1 M Tris, pH 7,4, 2,5 mM MgCl₂ resuspendiert. DNase I (Sigma) und RNase A (Sigma) werden bis zu einer Konzentration von jeweils 10 mg/ml zugegeben. Nach 30 min. bei 37°C wird die Reaktion durch die Zugabe von EDTA zu 10 mM gestoppt. Virus-DNA wird aus CmYLCV-Partikeln durch Behandlung mit Protease K isoliert (E. Merck, 0,5 mg/ml Endkonzentration) in Gegenwart von 1% SDS bei 65°C für 15 min. Die virale DNA wird dann durch Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt. Die Virus-DNA, die in dem ersten Ethanolpräzipitat enthalten ist, wird in Wasser gelöst.
2. DNA-Amplifizierung und Klonierung.
100 ng der erhaltenen DNA werden als Matrize für die PCR-Amplifikation in einem 50 μl Reaktionsvolumen enthaltend 10 μM jedes Primers, 25 mM jedes dNTPs, 5 μl des pfu-Reaktionspuffers (Stratagene) und 2,5 Einheiten der pfu-Turbo-DNA-Polymerase (Stratagene) verwendet. Der S1-Vorwärtsprimer (gaccacaaacatcagaag, SEQ ID Nr. 7) und der S2-Umkehrprimer (caaacttattgggtaatc, SEQ ID Nr. 8) werden für die PCR-Reaktion verwendet. Die Zyklusparameter der PCR sind: 1 × (94°C für 1 min.); 30 × (94°C für 1 min., 50°C für 1 min., 72°C für 1 min.), 1 × (72°C für 10 min.). Jedes einzelne DNA-Fragment wird in pPCR-Script^TM Amp SK (+) Plasmid (Stratagene) nach den Anweisungen des Herstellers kloniert.
Beispiel 2: DNA-Sequenzierung
Die Sequenzierung der DNA-Virusklone wird unter Verwendung des automatisierten ABI PRISM 377-DNA-Sequenziergeräts (Perkin Elmer) und des ABI PRISM dRhodaminterminator-Zyklus-Sequenzierkits (Perkin Elmer) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Der beschriebene Si-Primer und S2-Primer (Beispiel 1) wie auch der universale M13-20 und die Umkehrprimer werden für die Sequenzierungsreaktionen verwendet.
Beispiel 3: Herstellung von Plasmiden für die transiente Expression
Alle PCR-Reaktionen, die mit der Pfu-Polymerase (Stratagene) durchgeführt werden, sind wie in Beispiel 1 beschrieben.
1. Amplifizierung der Reportergene.
Die beta-Glucuronidase (GUS) und die Chloramphenicolacetlytransferase (CAT)-Reportergene werden amplifiziert. Für die GUS-Gen-Amplifikation werden GUS-Vorwärts (cagggtaccactaaaatcacc, SEQ ID Nr. 9) und GUS-Umkehr (aggggatccccaattcccc, SEQ ID Nr. 10)-Oligonucleotide bei der Anlagerungstemperatur von 60°C verwendet. CAT-Vorwärts (aggggtaccatcgatatggag, SEQ ID Nr. 11) und CAT-Umkehr (ttaggatccgccctgccac, SEQ ID Nr. 12)-Oligonucleotide werden bei 62°C angelagert. Die Vorwärtsprimer werden so entworfen, dass sie eine KpnI-Erkennungssequenz und die Umkehrprimer eine BamHI-Erkennungssequenz enthalten.
2. CmYLCV-Promotor-Amplifikation.
Drei verschiedene Promotorfragmente werden ausgewählt. CmpC (SEQ ID Nr. 2), CmpS (SEQ ID Nr. 3) und CmpL (SEQ ID Nr. 4). Cmp1-Vorwärtsprimer (cttctagacaaagtggcagac, SEQ ID Nr. 13) wird für alle drei Amplifikationen bei der Anlagerungstemperatur von 52°C verwendet. Er ist gegenüber der Originalsequenz modifiziert (in fett gezeigt), so dass er eine XbaI-Erkennungsstelle enthält. Der CmpC2-Umkehrprimer (ttggtaccttaacaatgaggg, SEQ ID Nr. 14) wird für die CmpC-Fragment-Amplifizierung verwendet und der CmpS2-Umkehrprimer (ctacttctaggtaccttgctc, SEQ ID Nr. 15) wird für das CmpS-Fragment verwendet. Beide sind modifiziert, so dass sie eine KpnI-Erkennungsstelle enthalten. Der CmpL2-Umkehrprimer (ttggtaccttaacaatgaggg, SEQ ID Nr. 16) wird für die CmpL-Fragment-Amplifizierung verwendet und ist so modifiziert, dass er eine ClaI-Erkennungsstelle enthält.
3. Polyadenylierungs-Signal-Amplifizierung.
Die Polyadenylierungs-Signalfragmente werden aus dem infektiösen Klon des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) (Franck et al., Cell 21 (1), 285-294, 1980) amplifiziert. PA (Polyadenylierungs-Signal-Amplifizierung) Vorwärts-(ggggatccccagtctctctc, SEQ ID Nr. 17) und PA-Umkehr (gtgaatcgagctcggta, SEQ ID Nr. 18)-Oligonucleotide werden in der PCR verwendet und bei 60°C angelagert. Der Vorwärtsprimer ist so entworfen, dass er eine BamHI-Erkennungsstelle und der Umkehrprimer eine EcoRI-Erkennungsstelle enthält.
4. Hergestellte Konstrukte

– pCmpCG (CmpC Promotorfragment + GUS-Gen + polyA)
– pCmpSG (CmpS Promotorfragment + GUS-Gen + polyA)
– pCmpCC (CmpC Promotorfragment + CAT-Gen + polyA)
– pCmpSC (CmpS Promotorfragment + CAT-Gen + polyA)
– pCmpLC (CmpL Promotorfragment + CAT-Gen + polyA)

Die Kassetten, die das Promotorfragment, die Reportergene und das Polyadenylierungssignal enthalten, werden in den pUC19- Vektor (Stratagene) inseriert, der mit XbaI und EcoRI geschnitten ist.
5. Konstrukte, die für einen Vergleich verwendet werden

– pCapG (Cap-Promotorfragment + GUS-Gen + polyA)
– pCapSG (CapS-Promotorfragment + GUS-Gen + polyA)
– pCapC (Cap-Promotorfragment + CAT-Gen + polyA)

Promotorfragmente, die in diesem Konstrukten enthalten sind, werden aus CaMV (Franck et al., Cell 21 (1), 285-294, 1980, siehe GenBank Zugangsnummer V00141) gewonnen. GUS-, CAT- und polyA-Fragmente sind identisch mit denen, die für die CmYLCV-Konstrukte verwendet werden. Cap entspricht dem Fragment von der Base –227 bis zur Base +33 der TATA-Box (Base 7175 bis Base 7438 des CaMV-Genoms, siehe GenBank Zugangsnummer V00141) und CapS entspricht dem Fragment von der Base –227 bis zur Base +82 von der TATA-Box (Base 7175 bis Base 7486 des CaMV-Genoms, siehe GenBank Zugangsnummer V00141). Diese Positionen entsprechen ungefähr denen, die für die CmYLCV-Fragmente ausgewählt werden.
Beispiel 4: Transiente Expressionsexperimente
1. Suspensionskulturen und Protoplastenpräparierung
Orychophragmus violaceus.
Suspensionskulturen werden in 40 ml MS-Medium (Murashige and Skoog, Physiol Plant 15, 474-497, 1962) einschließlich 100 mg/ml Inositol, 2% Saccharose und 0,1 mg/ml 2,4 D aufbewahrt. Die Protoplasten werden aus 4 bis 5 Tage alten Kulturen isoliert. Die Zellwände werden bei 26°C für 1 h in 0,1% Pectolyase Y23 (Seishin Pharmaceutical Co., Japan), 1% Zellulase Onozuka R10 (Yakult Honsha Co., Japan), 0,4 M D-Mannitol und 0,1% MES, pH 5,5, verdaut. Die Protoplasten werden durch ein 50 um Sieb gefiltert und zweimal mit Electroporationslösung (EP) (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 0,2 M Mannitol, pH 7,1) gewaschen.
Nicotiana plumbaginifolia.
Die Pflanzen werden keimfrei auf RPM2-Medium (Blonstein et al., Mol Gen Genet 211, 252-259, 1988) plus 7 g/l Bacto Agar, pH 5,6, gehalten. Für die Protoplasetenpräparation werden die Blätter abgeschnitten und über Nacht bei 26°C in einer Lösung aus 0,5% Driselase (Fluka), 0,25 mM PVP 10 (Polyvinylpyrrolidon MW 10000), 3,85 mM CaCl₂, 6 mg/l NAA, 2 mg/l BAP, und 0,5 M Saccharose, pH 5,7, inkubiert. Die Protoplasten werden durch ein 100 μm Sieb filtriert. Eine Saccharoselösung (0,6 M Saccharose, 0,1 MES und 15 mM CaCl₂, pH 5,7) wird zu der Protoplastesuspension für den ersten Reinigungsschritt zugegeben, und die Suspension wird mit W5-Lösung (150 mM NaCl, 125 mM CaCl₂, 5 mM KCl, 6 mM Glucose; Menczel et al., Theor Appl Genet 59, 191-195, 1981) überlagert. Protoplasten werden dann einmal mit W5-Lösung und schließlich mit der EP-Lösung gewaschen.
Oryza sativa.
Protoplasten werden aus einer morphogenen Reissuspensionskultur hergestellt, die aus O. sativa cv. Nipponbare etabliert wurde (Datta et al., 1990, Bio/Technology 8: 736-740) wie beschrieben hergestellt.
2. Transientes Expressionsexperiment.
Die Transfektion durch Electroporation von 2 × 10⁶ Orychophragmus violaceus-Protoplaseten in 0,66 ml EP-Puffer wird durch Entladen eines 960 μF Kapazitätsgeräts über einen Weg von 4 mm einer Protoplastensuspension durchgeführt. Der Kondensator wird mit 450 Volt beladen. Die Electroporation wird in Gegenwart von 5–10 μg Plasmid-DNA durchgeführt, und dann werden die Protoplasten 16 bis 24 Stunden bei 25°C kultiviert. Die Transfektion von 2 × 10⁶ Nicotiana plumbagenifolia-Protoplasten in einer 0,3 ml Suspension wird in Gegenwart von 0,3 ml PEG (40% Polyetylenglycol 6000) und 5–10 μg Plasmid-DNA durchgeführt. Die Protoplasten werden in 0,4 ml K3-Medium (Godall et al., Methods Enzymol 181, 148-161, 1990) für 16 bis 24 Stunden bei 25°C durchgeführt, und hierzu wird 10 ml W5-Puffer vor der Ernte zugegeben.
Die Proteinextrakte werden durch mindestens drei Zyklen aus Einfrieren und Auftauen hergestellt und durch Zentrifugieren gereinigt.
Beispiel 5: CAT- und GUS-Tests
Zum Nachweis der CAT-Genexpression wird ein Doppel-Antikörper-Sandwich (DAS)-ELISA unter Verwendung eines CAT-ELISA-Kits (Boehringer) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die CAT-Aktivität wird durch einen Dynex MRXII-Apparat gemessen. Proben für den GUS-Test werden in GUS-Puffer (0,5 M NaPO₄, pH 7, 0,01 M EDTA, 0,1% Triton-X-100, 0,1% Sarkosyl) verdünnt. Die Reaktion wird in Gegenwart einer gleichen Menge GUS-Reaktionspuffers (100 ml/l 10 × GUS-Puffer, 200 mg/l BSA, 705 mg/l 4-Methylumbelliferylglucuronid) bei 37°C durchgeführt und mit 2 M Ammediol gestoppt. Die Aktivität wird in einem Titertek Fluoroskan II gemessen.
Sowohl die CAT als auch die GUS-Testergebnisse werden auf einen Standard-Klonwert normalisiert. Die Ergebnisse, die aus zehn verschiedenen Experimenten gewonnen wurden, zeigen, dass die verschiedenen CmYLCV-Promotorfragmente als stark aktive Promotoren dienen. Transiente Expression in N. plumbaginifolia-Protoplasten GUS-Reportergen

CmpCG 100

CmpSG 86,9 +/– 20%

CapG 9 +/– 20%

CaSG 38,9 +/– 15%

CAT-Reportergen

CmpCC 100

CmpSC 78 +/– 20%

CapSC 89,5 +/– 20%

CmpLC 9 +/– 15%

Transiente Expression in O. violaceus-Protoplasten GUS-Reportergen

CmpCG 100

CmpSG 84,6 +/– 15%

CapG 9,6 +/– 15%

CapSG 40,7 +/– 15%

CAT-Reportergen

CmpCC 100

CmpSC 255 +/– 20%

CapSC 546 +/– 15%

CmpLC 10 +/– 20%

Transiente Expression in O. sativa-Protoplasten GUS-Reportergen

CmpCG 100

CmpSG 84,6 +/– 15%

CapG 9,6 +/– 15%

CapSG 40,7 +/– 15%
Beispiel 6: Herstellung von Lösungen und Medien für die Pflanzenregenerierung und Transformation
Die Kulturmedien GM, CIM und SIM sind die Medien, die von Valvekens et al. beschrieben werden (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 5536-5540).
Das Kulturmedium GM enthält die Mineralsalze nach Murashige und Skoog (1962, Physiol. Plant. 15: 473-497), 1,0 mg/l Thiamin (Stock 1 mg/ml) 0,5 mg/l Pyridoxin HCl (Stock 1 mg/ml), 0,5 mg/l Nicotinsäure (Stock 1 mg/ml), 0,5 g/l 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), 10 g/l Saccharose, 8 g/l Agar, wobei der pH-Wert mit 1 N KOH auf 5,8 eingestellt ist. CIM enthält die Mineralsalze und Vitamine des B5-Mediums (Garnborg et al., 1968, Exp. Cell Res. 50: 151-158), 0,5 g/l 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), 20 g/l Glucose, 0,5 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) (Stock 10 mg/ml in DMSO), 0,5 mg/l Kinetin (Stock 5 mg/ml in DMSO), pH 5,8. Festes CIM-Medium enthält 8 g/l Agar. SIM enthält die Mineralsalze und Vitamine von B5-Medium (Garnborg et al., 1968, siehe oben), 0,5 g/l 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), 20 g/l Glucose, 5 mg/l N6-(2-Isopentenyl)adenin (2iP) (Stock 20 mg/ml in DMSO), 0,15 mg/l Indol-3-essigsäure (IAA) (Stock 1,5 mg/ml in DMSO), 8 g/l Agar, pH 5,8. SIM V750 K100 ist SIM-Medium, das mit 750 mg/l Vancomycin und 100 mg/l Kanamycin ergänzt ist. SIM V500 K100 ist SIM-Medium, das mit 500 mg/l Vancomycin und 100 mg/l Kanamycin supplementiert ist. GM K50 ist GM-Medium, das mit 50 mg/l Kanamycin supplementiert ist.
Die Kulturmedien werden alle durch Autoclavieren (20 min., 121°C) sterilisiert. Die Vitamine werden in Wasser gelöst und vor dem Autoclavieren zum Medium zugegeben. Die Hormone werden in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Die Antibiotica werden in Wasser gelöst und durch Filtrieren sterilisiert (0,22 μm). Die Hormone und Antibiotica werden nach dem Autoclavieren und Abkühlen des Mediums auf 65°C zugegeben. In allen Fällen werden 9 cm Petrischalen (Falcon, 3003) verwendet, außer für GM und GM K50, welche für gewöhnlich in 15 cm Petrischalen (Falcon, 3025) geschüttet werden.
Platten mit festem Medien werden vor der Verwendung in einer Sterilbank (Laminar-flow) getrocknet, um das Kondensat zu entfernen.
Beispiel 7: Kresse-Stamm und Wachstumsbedingungen
Arabidopsis thaliana-Samen Ecotype Columbia (Co1-o) Wildtyp werden von Lehle Seeds, USA (1102 South Industrial Blvd. Suite D, Round Rock TX 78681, USA) bezogen. Die Pflanzen werden bei 22°C in einem 16/8 Stunden Licht/Dunkel-Zyklus in Töpfen in der Mischung aus 4 Teilen Sand, 4 Teilen Gartenboden und 1 Teil Agrilit gezüchtet.
Beispiel 8: Agrobacterium-Stamm und Kultur
Vektorplasmide werden in den Empfänger-Agrobacterium tumefaciens Stamm LBA4404 (Clontech) durch triparentales Kreuzen gemäß dem Protokoll, das von Walkerpeach and Velten beschrieben ist („Agrobacterium-mediates gene transfer to plant cells: Cointegrate and binary vector systems” in: Plant Molecular Biology Manual, B1: 1-19, 1994. Eds.: S. B. Gelvin, R. A., Schilperoort, Kluvers Acad. Publishers) eingeschleust. Der Mobilisierungsstamm, der verwendet wird, ist E. coli HB101, welcher das Konjugationsplasmid pRK2013 (Ditta et al., 1980, Broad host range DNA cloning system from Gram-negative bacteria. Construction of gene bank of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351). Agrobacterien, die für die Wurzeltransformation verwendet werden, werden auf LB-Medium (Sambrock et al., 1989, „Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY), ohne Antibiotica bei 28°C und 200 UpM gezüchtet.
Beispiel 9: Samensterilisierung
Die Samen werden in 70% EtOH/0,05% Tween 20 für 1 Minute in ein 2 ml Eppendorfröhrchen gegeben. 70% EtOH/0,05% Tween 20 wird mit einer Pipette entfernt und für 15 Minuten durch 5% NaOCl/0,05% Tween 20 ersetzt. Die Samen werden regelmäßig geschüttelt. Die Lösung wird unter sterilen Bedingungen entfernt und die Samen werden in sterilem destilliertem Wasser 3 Mal für 10 Minuten jeweils gewaschen. Bei dem letzten Waschschritt werden die Samen in 0,5–1 ml Wasser gelassen. Die Samen können direkt verwendet werden oder für zwei bis drei Wochen bei 4°C gelagert werden. Sterilisierte Samen (20–30) werden mit Pinzetten auf GM-Medium in 15 cm Petrischalen transferiert. Die Sämlinge werden auf vertikal platzierten Platten in einer Wachstumskammer (22°C; 16/8 Stunden Licht-/Dunkel-Zyklus) gezüchtet.
Beispiel 10: Transformation von Wurzelexplantaten von Arabidopsis thaliana
Wurzeln der drei Wochen alten Sämlinge werden in dem Transformationsverfahren verwendet. Die Wurzeln sollten nicht grün oder braun sein. Grüne Teile der Sämlinge werden mit einem Skalpell und Pinzetten entfernt. Die verbleibenden Wurzeln werden gesammelt und ungefähr 5 gesamte Wurzelsysteme werden pro Platte festes CIM-Medium platziert. Die Wurzeln werden vorsichtig auf die Oberfläche der Platte gepresst, um einen vollständigen Kontakt mit dem Medium zu gewährleisten, aber sie sollten nicht in den Agar getaucht werden. Die Wurzeln werden für drei Tage in einer Wachstumskammer (22°C; 16/8 Stunden Licht-/Dunkel-Zyklus) inkubiert. Die Wurzeln werden dann auf eine sterile Petrischale mit Filterpapier überführt, welches mit flüssigem CIM-Medium angefeuchtet ist, und mit einem Skalpell in 0,5–1 cm Stücke zerschnitten. Die Wurzelexplantate werden dann in ein steriles 50 ml Falconröhrchen überführt, welches 10 ml flüssiges CIM-Medium enthält. Hierzu werden 0,5 ml einer über Nacht gezüchteten Agrobacterium-Kultur (OD 0,6–1) hinzugegeben und für 1–2 Minuten unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Flüssigkeit wird aus dem Röhrchen durch sterile Metallrahmen geschüttet (50-er Netz, Sigma, S-0895), welche mit Pinzetten festgehalten werden. Die Wurzeln bleiben für gewöhnlich an der Wand des Röhrchens, nahe dem Rand. Dann werden die Wurzelexplantate in eine sterile Petrischale mit einem Filterpapier überführt und kurz trocken getupft, um den Überschuss an Flüssigkeit zu entfernen. Die Wurzelexplantate werden auf Platten mit festem CIM-Medium gegeben und für 2 Tage unter gedämpftem Licht (1,5–2 Klux) in einer Wachstumskammer inkubiert. Leichte Spuren von Überwachsen mit Agrobacterium sollten nach dem Cokultivierungszeitraum sichtbar sein. Wurzelexplantate werden dann in sterile 50 ml Falconröhrchen mit 20 ml flüssigem CIM-Medium überführt, welches mit 1.000 mg/l Vancomycin ergänzt ist. Die Falconröhrchen werden dann leicht gevortext, um die Agrobacterien zu entfernen. Die Flüssigkeit wird wie oben erwähnt aus dem Röhrchen ausgeschüttet und die Explantate werden kurz auf Filterpapier trocken getupft. Die Explantate werden dann auf Platten überführt, die SIM V750 K100 Medium enthalten. Die Wurzeln sollten mit dem Medium in engem Kontakt sein. Die Explantate werden in einer Wachstumskammer unter normalen Bedingungen für 1 Woche inkubiert und dann auf SIM V500 K100 Medium überführt und für eine weitere Woche inkubiert. Dann wird die Menge an Vancomycin auf 250 mg/l reduziert. Die ersten Schösslinge sollten am Ende der dritten Woche der Kultivierung auf SIM-Medium auftreten. Die Wurzeln werden abgeschnitten, wenn sie 0,3–0,5 cm lang sind, und alle restlichen Calli werden entfernt, und die Schösslinge werden auf 15 cm Platten überführt, die GM K50-Medium enthalten. Maximal 3 Schösslinge werden auf jede Platte gesetzt. Um mehr Schösslinge zu erhalten, können die verbleibenden Wurzelexplantate auf frische SIM-Platten überführt werden, die mit 125 mg/l Vancomycin und 100 mg/l Kanamycin ergänzt sind, für zusätzliche zwei Wochen. Schösslinge mit Wurzeln können in Boden überführt werden und es kann ihnen ermöglicht werden, dass sich der Samen festsetzt. Die Schösslinge, die keine Wurzeln entwickeln, werden in Magentagefäße überführt (einer pro Gefäß), welches GM-Medium enthält, um in vitro Samen zu produzieren.
Die Samen individueller transgener Pflanzen werden auf GM K50-Medium in einer Wachstumskammer für 2 Wochen keimen gelassen. Phänotypisch normale Kanamycin-resistente Sämlinge, die echte grüne Blätter und ein verzweigtes Wurzelsystem bilden, werden für weitere Analysen ausgewählt.
Beispiel 11: Histochemischer β-Glucuronidase (GUS)-Test
In vitro gezüchtete Sämlinge oder Pflanzen, die in Boden gezüchtet werden, werden in GUS-Tests verwendet. Entweder gesamte Sämlinge oder herausoperierte Organe werden in eine GUS-Färbelösung getaucht. Die GUS-Färbelösung enthält 1 mM 5-Brom-4-chlor-3-indoylglucuronid (X-Gluc, Duchefa, 20 mM Stock in DMSO), 100 mM Na-Phosphatpuffer pH 7,0, 10 mM EDTA, pH 8,0, und 0,1% Triton X100. Die Gewebeproben werden bei 37°C für 1–16 Stunden inkubiert. Falls notwendig können Proben durch mehrere Waschschritte mit 70% Ethanol geklärt werden, um Chlorophyll zu entfernen.
Beispiel 12: Konstruktion des Tabak-Transformationsvektors pZU627
Alle PCR-Reaktionen werden mit Platin Pfx DNA-Polymerase (Life Technologies) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
1. NOS-Terminator-Amplifizierung und Klonierung
Der NOS-Terminator wird aus pBIN19 (Bevan et al. 1984) unter Verwendung des NOS-Terminator-Vorwärtsprimers (SEQ ID Nr. 21) und des NOS-Terminator-Umkehrprimers (SEQ ID Nr. 22) amplifiziert. Der Vorwärtsprimer wird modifiziert, um eine PstI-Schnittstelle zu enthalten, und der Umkehrprimer wird modifiziert, um eine HindIII-Schnittstelle zu enthalten. Das NOS-Terminator-Amplifikationsprodukt wird in ein PstI/HindIII-Fragment an die gleichen Stellen von pBluescript (Stratagene) kloniert, welches zum Plasmid pZU400A führt.
2. Amplifizierung des Tomatenbronzefleckenvirus Nucleocapsidproteins (TSWV NP)-Gens, Amplifikation und Klonierung
Um ein nicht-translatierbares TSWV NP-Gen zu gewinnen, werden modifizierte TSWV NP-Genprimer verwendet, um das TSWV NP-Gen zu amplifizieren. Der TSWV NP-Gen-Vorwärtsprimer führt BamHI, eine SphI ein und einen Start- und einen Stopkodon (SEQ ID Nr. 23) ein. Der Umkehrprimer ist modifiziert, um eine PstI-Schnittstelle (SEQ ID Nr. 24) einzuschleusen. Das Amplifikationsprodukt wird als BamHI/PstI-Fragment in die BamHI/PstI-Schnittstelle von pZU400A stromaufwärts von und in gleicher Richtung wie der NOS-Terminator kloniert. Im resultierenden Klon pZU400b wird die PstI-Schnittstelle zwischen dem TSWV NP-Gen und dem NOS-Terminator unter Verwendung einer T4 DNA-Polymerase-Behandlung entfernt (Life Technologies), indem die Anweisungen des Herstellers befolgt werden. Vom resultierenden Klon, welcher als pZU400C bezeichnet wird, werden das TSWV NP-Gen und der NOS-Terminator als ein SphI-/HindIII-Fragment in die SphI-/HindIII-Schnittstelle des Shuttle-Vektors pZO1560 kloniert, was zum Plasmid pZU400 führt. pZO1560 ist ein Derivat von pBluescript, bei dem die ursprüngliche Multiklonierungsschnittstelle durch die AGLINK-Multiklonierungsstelle ersetzt ist (SEQ ID Nr. 27).
3. CmYLCV-Promotor-Amplifizierung und Klonierung
Der CmYLCV virale Promotor wird unter Verwendung des CmYLCV-Promotor-Vorwärtsprimers (SEQ ID Nr. 25) und des CmYLCV-Promotor-Umkehrprimers (SEQ ID Nr. 26) amplifiziert. Der Vorwärtsprimer wird modifiziert, um so eine SstI-Schnittstelle zu enthalten, und der Umkehrprimer wird modifiziert, um eine PstI-Schnittstelle zu enthalten. Der amplifizierte virale Promotor von CmYLCV wird als SstI-/PstI-Fragment in gleiche Richtung wie und stromaufwärts des TSWV-N-Gens, in die SstI-/PstI-Schnittstelle von pZU400 kloniert. Dies führt zum Klon pZU625, welcher eine virale Genkassette enthält, die eine nicht translatierbare TSWV NP-RNA herstellt.
4. Klonierung der viralen Genkassette in pVictorHiNK
Die virale Kassette wird als AscI-/PacI-Fragment aus pZU625 in die AscI-/PacI-Schnittstelle von pVictorHiNK-Vektor pZU494 kloniert. Dies führt zu Pflanzentransformations-Vektor pZU627. pVictorHiNK ist ein binärer Vektor, welcher einen Replikationsursprung (ORI) umfasst, der aus Pseudomonas aeruginosa-Plasmid pVS1 stammt, welches dafür bekannt ist, in A. tumefaciens sehr stabil zu sein (Itoh et al., 1984. Plasmid 11: 206-220; Itoh and Haas, 1985. Gene 36; 27-36). Der pVS1 ORI ist nur in Agrobacterium funktional und kann durch das Helferplasmid pRK2013 von E. coli in A. tumefaciens mit Hilfe einer triparenteralen Kreuzungsprozedur mobilisiert werden (Ditta et al., 1980. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351). Diese binäre Vektor umfasst einen ColEI-Replikationsursprung, welche in E. coli funktional ist und aus pUC19 (Yannisch-Perron et al., 1985. Gene 33: 103-119) stammt. Für die Bewahrung in E. coli und A. tumefaciens enthält dieser Vektor ein bakterielles Resistenzgen gegenüber Spectomycin und Streptomycin, welche durch ein 0,93 kb-Gen des Transposons Tn7 (Fling et al., 1985. Nucl. Acid Res. 13: 7095) kodiert wird, welches als Selektionsmarker für die Bewahrung des Vektors in E. coli und A. tumefaciens dient. Das Gen wird für effiziente bakterielle Expression mit dem tac-Promotor fusioniert (Amman et al., 1983. Gene 25: 167-178). Die rechten und linken T-DNA Grenzfragmente von 1,9 kb und 0,9 kb, die jeweils die 24 bp Grenzwiederholungen umfassen, stammen aus dem Ti-Plasmid des Nopalin-artigen A. tumefaciens-Stamms pTil37 (Yadev et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 6322-6326). Anschließend wird die T-DNA- Region zwischen den Grenzen durch Deletieren der von M13 stammenden Sequenzen modifiziert, und um die Klonierungs-Flexibilität zu verbessern, wird die BIGLINK-Multiklonierungsstelle (SEQ ID Nr. 28) eingeschleust, welche zu pVictorHiNK führt.
PvictorHiNK enthält eine NPTII-Genkassette zur Selektion von Transformanten während des Pflanzen-Transformationsprozesses. Diese Genkassette enthält einen NOS-Promotor, das NPTII-Gen und den NOS-Terminator, welcher aus A. tumefaciens gewonnen ist.
Beispiel 13: Pflanzentransformation und Durchmusterung der Resistenz
1. Transformation der binären Vektoren in Pflanzenmaterial
Verfahren zum Transfer binärer Vektoren in Pflanzenmaterial sind gut etabliert und einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Variationen in den Verfahren sind vorhanden, beispielsweise aufgrund der Unterschiede der verwendeten Agrobacterienstämme, der verschiedenen Quellen des Explantatmaterials, der Unterschiede der Regenerationssysteme, die davon abhängen und aufgrund des Cultivars der verwendeten Pflanzenspezies. Der binäre Vektor pZU627 wird in Pflanzentransformationsexperimenten gemäß den folgenden Verfahren verwendet. pZU627 wird durch triparenterales Kreuzen auf einen Acceptor-Agrobacterium tumefaciens-Stamm überführt, gefolgt von einer Southern-Blot-Analyse der Ex-Conjuganten zur Überprüfung des richtigen Transfers des Konstrukts in den Acceptorstamm, die Inoculierung und die Co-Kultivierung von axenischem Explantatmaterial mit dem rekombinanten Agrobacterium tumefaciens-Stamm, dem selektiven Abtöten des Agrobacterium tumefaciens-Stamms unter Verwendung der geeigneten Antibiotika, die Auswahl transformierter Zellen durch Züchten auf Selektionsmedien, die Kanamycin enthalten, den Transfer von Pflänzchen in den Boden, das Untersuchen hinsichtlich der Unversehrtheit der integrierten T-DNA durch Southern-Blot-Analyse an isolierter chromosomaler DNA der Pflanze.
2. Resistenz von Pflanzen gegen TSWV-Infektionen
Transformierte Pflanzen werden im Treibhaus unter Standard-Quarantäne-Bedingungen gezüchtet, um jegliche Infektion durch Pathogene zu verhindern. Im Vier-Blatt-Stadium werden die Pflanzen mit TSWV durch mechanische Inokulation infiziert. Gewebe aus Pflanzen, die systemisch mit TSWV infiziert sind, werden in 5 Volumen eiskaltem Inokulationspuffer gemahlen (10 mM Phosphatpuffer ergänzt durch 1% Na₂SO₃) und in Gegenwart von Carborundumpulver auf die ersten zwei voll ausgedehnten neuen Blätter gerieben. Die inokulierten Pflanzen werden auf die Entwicklung von Symptomen während der drei Wochen nach der Inokulation überwacht. Pflanzen, die pZU627-Sequenzen enthalten, zeigen keine TSWV-Symptome, während nicht transformierte Kontrollpflanzen innerhalb von 7 Tagen nach Inokulation schwere systemische TSWV-Symptome zeigen. Resistente Pflanzen werden selbst bestäubt und die Samen geerntet. Die Pflanzennachkommen werden hinsichtlich der Segregierung des inserierten Gens analysiert und anschließend hinsichtlich der Resistenz gegen TSWV-Infektion, wie oben beschrieben, erneut durchmustert.
Beispiel 14: Konstruktion von CmpS-Phosphomannoseisomerase-nos-Konstrukten für die Pflanzentransformation
Der CmpS-Promotor wird PCR-amplifiziert, indem die Cmpf-B (cgc gga tcc tgg cag aca aag tgg cag a; SEQ ID Nr. 29) und CmpS-B (cgc gga tcc tac ttc tag gct act tg, SEQ ID Nr. 30) Primer mit flankierendem BamHI-Schnittstellen verwendet werden. Das erhaltene PCR-Fragment wird in die BamHI-Schnittstelle des pBluescript KS (+) kloniert, um pNOV4211 zu bilden.
Um einen binären Vektor für die Transformation über Agrobacterium tumefaciens zu kreieren, wird der CmpS-Promotor aus pNOV4211 unter Verwendung von BamHI ausgeschnitten und stromaufwärts des PMI-Gens in ein mit BamHI verdautes pNOV2804 (SEQ ID Nr. 31) inseriert, und der erhaltene Vektor wird als pNOV2819 bezeichnet. pNOV2804 (SEQ ID Nr. 31) ist ein binärer Vektor mit einem VS1-Replikationsursprung, einer Kopie des Agrobacterium virG-Gens im Hintergrund und einer promotorlosen PMI-Nos-Terminator Expressionskassette, welche zwischen den linken und rechten Grenzen der T-DNA liegt. PMI (Phosphomannosisomerase) ist die kodierende Region des E. coli manA-Gens (Joersbo and Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16: 219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803). Der Nos (Nopalinsynthase)-Terminator wird aus Agrobacterium tumefaciens T-DNA (Depicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573) gewonnen. Die Phosphomannoseisomerase kodierende Region und der Nos-Terminator sind in den Nt 290 bis Nt 1465 und Nt 1516 bis Nt 1789 von pNOV2804 (SEQ ID Nr. 31) lokalisiert. Um einen Vektor für die biolistische Transformation zu erzeugen, wird der CmpS-Promotor aus pNOV4211 unter Verwendung von BamHI ausgeschnitten und in ein mit BamHI verdautes pNOV3604 (SEQ ID Nr. 32) inseriert, um pNOV2820 zu bilden, wodurch eine PMI-Epressionskassette erzeugt wird, die durch den CmpS-Promotor angetrieben wird. pNOV3604 ist ein Vektor zum Herstellen biolistischer Fragmente und beruht auf pUC19 mit einem ColEI-Replikationsursprung und einem beta-Lactamasegen, welches eine Ampicillin-Resistenz verleiht. Wie pNOV2804, enthält auch pNOV3604 eine promotorlose PMI-Nos-Terminator-Expressionskassette (siehe oben). Die Phosphomannoseisomerase kodierende Region und der Nos-Terminator sind in den Nt 42 bis Nt 1217 und Nt 1268 bis Nt 1541 von pNOV3604 (SEQ ID Nr. 32) lokalisiert.
Der binäre Vektor pNOV2819 wird für die Transformation über Agrobacterium tumefaciens verwendet, und der Vektor pNOV2820 wird für die biolistische Transformation verwendet.
Beispiel 15: Konstruktion von CmpC-GUS-Plasmid für die stabile Expression in planta.
1. Konstruktion des binären Vektors
Der Vektor pCambia 1302 (Cambia, Canberra, Australia; Roberts, C. S., Rajagopal, S., Smith, L., Nguyen, T., Ynag, W., Nugroho, S., Ravi, K. S. Cao, M. L., Vijayachandra, K., et al. A comprehensive set of modular vectors for advanced manipulation and efficient transformation plants. Presented at the Rockefeller Foundation Meeting of the International Program an Rice Biotechnology, Malacca, Malaysia, 15.-19. September 1997) wird ausgewählt und für die Experimente modifiziert: Der CaMV 35S-Promotor vor dem GFP-Gen wird durch Verdau der Position 9788 mit HindIII-Endonuclease entfernt und an der Position 1 durch NcoI-Endonuclease und der Vektor wird an den zwei kompatiblen Enden relegiert. Der Verdau mit XhoI-Endonuclease an den Positionen 7613 und BstXI an der Position 9494 schneiden das Hygromycin-Gen und den CaMV 35S-Promotor davor aus. Die 35S-Promotorsequenzen werden aus dem Vektor eliminiert, um jedes Risiko einer auf Homologie beruhenden Genabschaltung auszuschließen. Das bar-Gen, welches durch den 1'-Promotor angetrieben wird (Mengiste et al., Plant J, 1997, 12 (4): 945-948) wird in die EcoRI-Schnittstelle an Position 9737 als Selektionsmarker eingeschleust. Der erhaltene Vektor wird als pCamBar bezeichnet.
2. Hergestellte Konstrukte
Die Kassetten CmpCG und CapG, die in Beispiel 3 beschrieben sind, werden in den pCamBar-Vektor zwischen der XbaI-Schnittstelle an Position 9764 und der EcoRI-Schnittstelle an Position 9737 inseriert, um pCamBarCmpCG zu erhalten bzw. das pCamBarCapG-Plasmid. Die zwei Konstrukte werden verwendet, um Agrobacterium tumefaciens-Zellen zu transformieren.
Beispiel 16: Stabile Expression in Arabidopsis thaliana
1. Pflanzenproduktion und Transfektion
Arabidopsis thaliana (Columbia 0) wt-Samen werden ausgesät, für 3 Tage bei 4°C in der Dunkelheit Kälte-behandelt, um die Keimung zu synchronisieren und in den Zuchtraum überführt (22°C/24 h Licht). Gekeimte Pflanzen werden infiltriert, wenn sie eine maximale Anzahl an nicht geöffneten Knospen produziert haben. Die Infiltration wird gemäß dem Protokoll durchgeführt, das beschrieben ist in Clough and Bent, Plant J. 16: 735-743, 1987.
2. Auswahl der transgenen Pflanzen
Sämlinge, die aus Samen der T1-Generation gewonnen werden, werden ausgewählt, indem sie mit dem BASTA-Herbizid (Plüss-Staufer AG/SA) (150 mg/l) fünf Tage dreimal besprüht werden. Zwanzig pCamBarCmpCG und neun pCamBarCapG-resistente Pflanzen werden nach Selektion eingesammelt. Sie werden unter den beschriebenen Bedingungen gezüchtet, um die Samen der T2-Generation zu gewinnen. Diese Samen werden dem gleichen Verfahren unterzogen, wie oben für die wt beschrieben wurde, und die T2-Sämlinge werden durch BASTA-Besprühen ausgewählt, und die resistenten Mutanten werden hinsichtlich der GUS-Genexpression analysiert.
3. Histochemische GUS-Expression in stabil transformierten Arabidopsis-Pflanzen
Histochemische GUS-Färbung wird wie im Beispiel 11 beschrieben, durchgeführt. Die Analyse wird in 15 ml Kultur-Röhrchen durch Tränken der transformierten Sämlinge in X-gluc-Lösung, die Ausübung von einem Druck von 130 mBar für 10 min. und Inkubation bei 37°C über Nacht durchgeführt. Die Ergebnisse, die mit Arabidopsis-Pflanzen gewonnen werden, die mit dem pCamBarCmpCG-Promotor transformiert sind, weisen eine konstitutive Expression des GUS-Reportergens an, welches vom CmpC-Promotor in allen vegetativen Organen angetrieben wird.
4. Quantitative enzymatische GUS-Tests in stabil transformierten Arabidopsispflanzen
A. Probenpräparierung
Vier Pflanzen der transgenen Linie und ein Blatt jeder dieser Pflanzen werden für den Test ausgewählt. Die vier Blätter werden im gleichen Eppendorfröhrchen eingesammelt, mit flüssigem Stickstoff eingefroren und in ein feines Pulver mit einmal Mörsern gemahlen. Dieses wird mit 150 μl GUS-Puffer (0,05 M NaPO₄, pH 7,0, 0,01 M EDTA, 0,1% Triton-X-100, 0,1% Sarkosyl), 5 min. bei 37°C inkubiert und in einer Microzentrifuge für 5 min. bei maximaler Geschwindigkeit heruntergeschleudert. Der Überstand wird in ein neues Eppendorf-Röhrchen überführt und diese Proben werden für den Enzymtest verwendet. Das Protein in diesen Pflanzenextrakten wird gemäß dem Bradford-Verfahren (Bradford, M. M. Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976) unter Verwendung von BSA als Standard abgeschätzt. Das Vorhandensein des Promotors und des GUS-Gens in den mutierten Linien wird mittels PCR-Analyse unter Verwendung der extrahierten Proben als Matrize durchgeführt.
B. Fluorometrischer GUS-Test
sDer fluorometrische GUS-Test wird wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt. Zur Detektion der GUS-Genexpression werden Proben in GUS-Puffer verdünnt. Die Reaktion wird in Gegenwart des gleichen Volumens an GUS-Reaktionspuffer bei 37°C durchgeführt und mit 2 M Ammediol gestoppt. Die Aktivität wird in einem Titertek Fluoroskan II gemessen.
Fünfzehn von zwanzig ausgewählten Linien, die mit pCamBarCmpCG transformiert sind und acht von neun Linien, die mit pCamBarCapG transformiert sind, zeigen GUS-Enzymaktivität in den Blättern. Das Niveau der Aktivität in mehreren CmpCG-transformierten Linien ist vergleichbar mit CapG. Jedoch sind die Ergebnisse bei verschiedenen transgenen Linien aufgrund der Verschiedenheit ihrer Genotypen variabel (Anzahl an Loci und Anzahl an transgenen Insertionen pro Locus).
Beispiel 17: Konstruktion von CmpC-Promotorvarianten
Alle PCR-Reaktionen werden mit Pfu-Polymerase (Stratagene), wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
1. DNA-Amplifizierung und Klonierung.
Zwei Varianten, pCmpMG und pCmpMsG des pCmpCG-Plasmid (Beispiel 3) werden hergestellt. Die zuerst genannte mit deletierter Sequenz „GTGGTCCC" in dem CmpC-Promotor und letztere ist mutiert und hat die Sequenz „GTGCTCGC".
Um pCmpMG zu gewinnen, werden drei PCR-Produkte amplifiziert:
CmpM1 unter Verwendung des Cmp1-Vorwärtsprimers (siehe Beispiel 3, SEQ ID Nr. 13), der CmpMr-Umkehrprimer (CCATCGTGGTATTTGGTATTG, SEQ ID Nr. 33) und das pCmpCG-Plasmid als Matrize.
CmpM2 unter Verwendung des CmpMf-Vorwärtsprimers (CAATACCAAATACCACGATGG; SEQ ID Nr. 34), des CmpC2-Umkehrprimers (siehe Beispiel 3; SEQ ID Nr. 14) und von pCmpCG-Plasmid als Matrize.
CmpM unter Verwendung des Cmp1-Vorwärtsprimers, des CmpC2-Umkehrprimers und einer äquimolaren Mischung von CmpM1 und CmpM2 PCR-Produkten als Mischung.
Um pCmpMsG zu gewinnen, werden drei PCR-Produkte amplifiziert:
CmpMs1 unter Verwendung des Cmp1-Vorwärtsprimers, des CmpMrs-Umkehrprimers (CGTGGTAGCGAGCACTTTGGT, SEQ ID Nr. 35) und des pCmpCG-Plasmids als Matrize.
CmpMs2 unter Verwendung von CmpMfs-Vorwärtsprimer (AAGTGCTCGCTACCACGATGG, SEQ ID Nr. 36), des Cmp2-Umkehrprimers und des pCmpCG-Plasmids als Matrize.
CmpsM unter Verwendung des Cmp1-Vorwärtsprimers, des Cmp2-Umkehrprimers und einer äquimolaren Mischung von CmpMs1 und CmpMs2-PCR-Produkten als Matrize.
Um die pCmpMG- und die pCmpMsG-Plasmide zu gewinnen, wird das ursprüngliche pCmpCG-Plasmid mit XbaI- und BamHI-Endonucleasen geschnitten, um das CmpC-Fragment zu eliminieren, und um an dessen Stelle CmpM und die CmpMs PCR-Produkte zu inserieren.
Beispiel 18: Transiente Expressionsexperimente mit pCmpM- und pCmpMs-Konstrukten
1. Suspensionskulturen und Protoplastenpräparation
Suspensionskulturen und Protoplasten werden wie im Beispiel 4 beschrieben, hergestellt.
2. GUS-Tests
Die Transfektion und Proteinextrakt-Präparierung wird wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt, und der GUS-Test wird wie in Beispiel 5 beschrieben, durchgeführt.
Die GUS-Testergebnisse werden aus dem Durchschnitt von zehn verschiedenen Experimenten gewonnen und mit dem Standard- Klonwert normalisiert. Die Deletion der „GTGGTCCC"-Sequenz im CmpCG-Konstrukt reduziert die Expression des GUS-Reportergens um ungefähr 50% der GUS-Reportergenexpression von CmpC in allen Protoplastenspezies (siehe unten). Die Wirkung, die durch die „GTGCTCGC"-Mutation eingeführt wird, hängt von der Pflanzenspezies ab. In O. violaceus- und O. sativa-Protoplasten ist das Niveau der GUS-Genexpression auf 65,2% bzw. 73,6% gesenkt. In N. plumbaginifolia-Protoplasten ist die CmpMs-Promotoraktivität ähnlich der des CmpM-Promotors. N. plumbaginifolia

CmpCG 100

CmpMG 52 +/– 12%

CmpMsG 53,7 +/– 16%

CapG 28,3 +/– 14%

O. violaceus

CmpCG 100

CmpMG 55,2 +/– 12%

CmpMsG 73,6 +/– 10%

CapG 5 +/– 1%

O. sativa

CmpCG 100

CmpMG 59,6 +/– 21%

CmpMsG 65,2 +/– 20%

CapG 42,5 +/– 16%
Beispiel 19: Konstruktion von Pflanzen-Transformationsvektoren, die 5'-Promotorfragmente enthalten, die operativ mit GFP oder GUS-Reportergenen verbunden sind
1. Promotoramplifikation und Klonierung
Ein chimäres Gen wird konstruiert, das eine DNA-Sequenz vom CmYLCV Transkriptpromotor voller Länge (SEQ ID Nr. 1) einschließt, welches mit dem Pflanzen-optimierten GFP mit Intron (synGFPI, SEQ ID Nr. 37) oder dem GUS-Reportergen mit Intron (GIG; SEQ ID Nr. 38)-Sequenz fusiert ist. Das GIG-Gen enthält das ST-LS1-Intron aus Solanum tuberosum in den Nucleotiden 385 bis Nucleotid 576 der SEQ ID Nr. 38 (erhalten von Dr. Stanton Gelvin, Purdue University, und beschrieben in Narasimhulu et al., 1996, Plant Cell, 8: 873-886). SynGFPI ist ein Pflanzen-optimiertes GFP-Gen, in das das ST-LS1-Intron eingeschleust ist (Nt 278 bis Nt 465 der SEQ ID Nr. 37). Bezüglich der Promotoren wird CmYLCV Genom-DNA als Matrize für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet. Genspezifische Primer werden entworfen, um die DNA-Sequenz zu amplifizieren. Ein Genfragment, das CmpC entspricht (SEQ ID Nr. 2) wird unter Verwendung des Cmpf-B Vorwärtsprimers (SEQ ID Nr. 29) in Kombination mit dem 5'- bis 3'-Primer CGCGGATTGCTCCCTTAACAATGAGG (SEQ ID Nr. 39) als Umkehrprimer isoliert. Ein Genfragment, das dem CmpS (SEQ ID Nr. 3) entspricht, wird unter Verwendung des Cmpf-B (SEQ ID Nr. 29)-Vorwärtsprimers in Kombination mit dem CmpS-B Umkehrprimer (SEQ ID Nr. 30) isoliert. Alle drei Primer enthalten die BamHI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle CGCGGA an ihrem 5'-Ende. Alle PCR-Reaktionen werden mit Pfu-Polymerase nach Empfehlungen der Hersteller (Stratagene) durchgeführt. Ein Thermocycler (DNA Engine, MJResearch, Inc. Waltham, MA USA) wird verwendet, um die Promotorfragmente unter Verwendung der folgenden PCR-Bedingungen zu amplifizieren [(94°C:10 s):(94°C:10 s/56°C:30 s/72°C:1 min) × 20]:(72°C:1,5 m).
Nach dem Restriktionsverdau mit BamHI werden die Promotorfragmente in die auf pUC basierenden Vektoren mit dem GIG-Gen oder mit synGFPI-Gen ligiert, um die Promotor-Reporter-Genfusionen zu erzeugen, die operativ mit einem Nos-Terminator verbunden sind.
2. Hergestellte Promotor-Reporterkassetten

– CmpS-Promotorfragment + synGFPI-Gen + nos (SEQ ID Nr. 40)
– CmpS-Promotorfragment + GIG-Gen + nos (SEQ ID Nr. 41)
– CmpC-Promotorfragment + synGFPI-Gen + nos (SEQ ID Nr. 42)
– CmpC-Promotorfragment + GIG-Gen + nos (SEQ ID Nr. 43)

SEQ ID Nr.

Promotor

Gen (synGFPI oderG) GIG)

Terminator

40

Nt 1 bis Nt 402

Nt 411 bis Nt 1331

Nt 1343 bis Nt 1618

41

Nt 1 bis Nt 405

Nt 425 bis Nt 2425

Nt 2479 bis Nt 2751

42

Nt 1 bis Nt 354

Nt 380 bis Nt 1292

Nt 1304 bis Nt 1577

43

Nt 1 bis Nt 354

Nt 399 bis Nt 2399

Nt 2453 bis Nt 2725

3. Subklonierung in einen Agrobacterium-Binärvektor
Die Promotor-Reporterkassetten (SEQ ID Nr. 40 bsi 43), die das Promotorfragment, das Reportergen und den Nos-Terminator enthalten, werden in den binären Vektor pNOV2117 für Mais und den binären Vektor pNOV4200 für die Tomatentransformation inseriert. pNOV2117 (SEQ ID Nr. 44) ist ein binärer Vektor mit einem VS1-Replikationsursprung, einer Kopie des Agrobacterium virG-Gens im Hintergrund, und einer Mais-Ubiquitin-Promotor-PMI-Gen Nos-Terminator Expressionskassette, zwischen den linken und rechten Grenzen der T-DNA. PMI (Phosphomannoseisomerase) liegt die kodierende Region des E. coli manA-Gens (Joersbo and Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16: 219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803). Der Nos (Nopalinsynthase)-Terminator wird aus Agrobacterium tumefaciens T-DNA (Depicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573) gewonnen. Der Mais-Upiquitin-Promotor, die Phosphomannoseisomerase kodierende Region und der Nos-Terminator liegen bei Nt 31 bis Nt 2012, Nt 2109 bis Nt 3212 bzw. Nt 3273 bis 3521 von pNOV2117 (SEQ ID Nr. 44). Die Reporter-Promotorkassetten werden nahe dem rechten Rand inseriert. Die selektierbare Marker-Expressionskassette in den binären Vektoren liegt am nächsten am linken Rand. Für die Tomatentransformation wird pNOV4200 SEQ ID Nr. 45) als binärer Vektor verwendet, welcher den VS1-Replikationsursprung enthält, eine Kopie des Agrobacterium virG-Gens im Hintergrund, und eine Hygromycin-selektierbare Markerkassette zwischen den linken und rechten Randsequenzen. Die Hygromycin-selektierbare Markerkassette umfasst den Arabidopsis-Ubiquitin 3-Promotor (Ubq3(At), Callis et al., J. Biol. Chem. 265: 12486-12493 (1990)), welcher operativ mit dem Gen verbunden ist, welches die Hygromycin-Resistenz kodiert (hier bezeichnet als "HYG", synthetisches Hygromycin B Phosphotransferasegen aus E. coli, Patent: JP 1986085192-A1 30. April 1986) und den Nos-Terminator (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573 (1982). Der Arabidopsis-Ubiquitin-Promotor, das HYG-Gen und der Nos-Terminator liegen an Nt 162 bis Nt 11494, Nt 1897 bis NT 2939 bzw. Nt 2939 bis Nt 3236 von pNOV4200 (SEQ ID Nr. 45). Die Reporter-Promotorkassetten (SEQ ID Nr. 40 bis 43) werden nahe dem rechten Rand inseriert. Die selektierbare Marker-Expressionskassette in den binären Vektoren ist nahe dem linken Rand.
Unten gezeigt sind die Richtungen des selektierbaren Markers und der Promtor-Reporterkassetten in den binären Vektorkonstrukten.
4. Binäre Vektorkonstrukte:

– NOV 4215 (RB CmpS Promotorfragment + synGFPI-Gen + Nos – ZmUbi + PMI-Gen + Nos LB)
– NOV 4216 (RB Nos + synGFPI-Gen + SmpS Promotorfragment – ZmUbi + PMI-Gen + Nos LB)
– NOV 4217 (RB CmpS Promotorfragment + synGFPI-Gen + Nos – Ubq3(At) + HYG-Gen + Nos LB)
– NOV 4220 (RB CmpS Promotorfragment + GIG-Gen + Nos – Ubq3(At) + HYG-Gen + Nos LB)
– NOV 4224 (RB CmpS Promotorfragment + GIG-Gen + Nos – ZmUbi + HYG-Gen + Nos LB)
– NOV 4226 (RB CmpS Promotorfragment + synGFPI-Gen + Nos – ZmUbi + PMI-Gen + Nos LB)

Zusätzliche Kassetten werden mit bekannten Promotoren hergestellt, die zum Vergleich verwendet werden. Hierfür wird eine Promotorkassette ZmUbi-GFP-35S Term (SEQ ID Nr. 46), welche den Mais-Ubiquitin-Promotor (Christensen et al. Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989)) operativ verbunden mit synGFP und dem 35S-Terminator (35S Term) umfasst, hergestellt und eine Promotorkassette, die den Mais-Ubiquitin-Promotor umfasst, der operativ mit dem GIG-Gen und dem Nos-Terminator verbunden ist (NOV 3612, SEQ ID Nr. 47), wird ebenfalls hergestellt. Der ZmUbi-Promotor, das GFP-Gen und der 35S-Terminator liegen bei Nt 1 bis Nt 2019, Nt 2020 bis Nt 2751 bzw. Nt 2876 bis Nt 2949 der SEQ ID Nr. 46. Der ZmUbi-Promotor, das GIG-Gen und der Nos-Terminator liegen an Nt 1 bis Nt 1982, Nt 2015 bis Nt 4015 bzw. Nt 4069 bis Nt 4341 der SEQ ID Nr. 47. Die ZmUbi-GIG-Nos-Kassette (SEQ ID Nr. 47) wird in einen auf pUC basierenden Vektor kloniert. Die ZmUbi-GFP-Nos-Kassette (SEQ ID Nr. 46) wird in den binären Vektor pNOV2117 für die Transformation von Mais, der oben beschrieben wurde, kloniert. Promotorkassetten, die den Arabidopsis-Ubiquitin-3-Promotor (Ubq3(At)), operativ verbunden mit dem synGFPI und dem Nos-Terminator (SEQ ID Nr. 48) und den Arabidopsis-Ubiquitin-3-Promotor operativ mit dem GIG-Gen und dem Nos-Terminator (SEQ ID Nr. 49) umfassen, werden hergestellt. Der Ubiquitin-3-Promotor, synGFPI und der Nos-Terminator sind lokalisiert bei Nt 1 bis Nt 1332, Nt 1738 bis Nt 2658 bzw. Nt 2670 bis Nt 2943 der SEQ ID Nr. 48. Der Ubiquitin-3-Promotor, das GIG-Gen und der Nos-Terminator sind von Nt 1 bis Nt 1335, Nt 1746 bis Nt 3746 bzw. Nt 3800 bis Nt 4072 der SEQ ID Nr. 49 zu finden. Wie oben beschrieben wurde, werden die Promotorkassetten in den binären Vektor pNOV4200 kloniert, welcher eine durch Hygromycin selektierbaren Markerkassette für die Transformation von Tomaten enthält. Unten sind die Richtungen des selektierbaren Markers und der Promotor-Reporterkassetten in den binären Vektorkonstrukten gezeigt.
5. Binäre Vektorkonstrukte

– NOV2110 (RB ZmUbi-Promotor + synGFP-Gen + 35S Term – ZmUbi + PMI-Gen + Nos LB)
– NOV4209 (RB Ubq3(At)-Promotor + synGFPI-Gen + Nos – Ubq3(At) + HYG-Gen + Nos LB)
– NOV4208 (RB Ubq3(At)-Promotor + GUS-Intron – GUS-Gen + Nos – Ubq3(At) + HYG-Gen + Nos LB)

Beispiel 20: Agrobacterium-vermittelte Transformation von Mais
Die Transformation unreifer Maisembryonen wird im Wesentlichen, wie in Negrotto et al. (2000) Plant Cell Reports 19: 798-803 beschrieben, durchgeführt. In diesem Beispiel sind alle Medienbestandteile, wie in Negrotto et al., siehe oben, beschrieben. Jedoch können verschiedene Medienbestandteile, die in der Literatur beschrieben sind, substituiert werden.
1. Transformationsplasmide und Selektionsmarker
Die Gene, die für die Transformation verwendet werden, werden in einen Vektor kloniert, der für die Transformation von Mais geeignet ist, wie in Beispiel 19 beschrieben. Vektoren, die verwendet werden, enthalten das Phosphomannoseisomerase (PMI)-Gen (Negrotto et al. (2000) Plant Cell Reports 19: 798-803).
2. Herstellung von Agrobacterium tumefaciens
Der Agrobacteriumstamm LBA4404 (pSB1), welcher das Pflanzentransformationsplasmid enthält, wird auf YEP (Hefeextrakt (5 g/l), Pepton (10 g/l), NaCl (5 g/l), 15 g/l Agar, pH 6,8) Festmedium für 2 bis 4 Tage bei 28°C gezüchtet. Ungefähr 0,8 × 10⁹ Agrobacterien werden in LS-inf Medium, das mit 100 μM Acetosyringon (As) (Negrotto et al., (2000) Plant Cell Rep 19: 798-803) ergänzt ist, suspendiert. Die Bakterien werden in diesem Medium für 30–60 Minuten prä-induziert.
3. Inokulierung
Unreife Embryonen von A188 oder anderen geeigneten Mais-Gentypen werden aus den 8–12 Tage alten Kolben in Flüssig-LS-inf + 100 μM As ausgeschnitten. Die Embryonen werden einmal mit frischem Infektionsmedium gespült. Die Agrobacteriumlösung wird dann zugefügt und die Embryonen werden für 30 Sekunden gevortext und es wird ihnen ermöglicht, sich für 5 Minuten mit den Bakterien zu setzen. Die Embryonen werden dann mit der Scutellum-Seite aufwärts auf LSAs-Medium überführt und in der Dunkelheit für zwei bis drei Tage kultiviert. Anschließend werden zwischen 20 und 25 Embryonen pro Petrischale auf LSDc-Medium überführt, welches mit Cefotaxim (250 mg/l) und Silbernitrat (1,6 mg/l) ergänzt ist und in der Dunkelheit für 10 Tage bei 28°C kultiviert.
4. Selektion der tranfsformierten Zellen und Regenerierung transformierter Pflanzen
Unreife Embryonen, die embryogene Calli herstellen, werden auf LDS1MO.5S-Medium überführt. Die Kulturen werden auf diesem Medium für 6 Wochen mit einem Subkulturschritt nach 3 Wochen ausselektioniert. Überlebende Calli werden entweder auf LSD1MO.5S-Medium oder in Reg1-Medium überführt, um aufgestockt zu werden. Nach der Kultivierung im Licht (16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkel-Rhythmus), werden die grünen Gewebe dann auf Reg2-Medium ohne Wachstumsregulatoren überführt und für 1–2 Wochen inkubiert. Die Pflänzchen werden in Magenta GA-7-Kästen überführt (Magenta Corp, Chicago III.), welche Reg3-Medium enthalten, und im Licht gezüchtet. Pflanzen, die PCR-positiv für die Promotor-Reporterkassette sind, werden in den Boden überführt und im Treibhaus gezüchtet.
Beispiel 21: Stabile Transformation von Tomaten
Die Transformation von Tomaten wird im Wesentlichen wie in Meissner et al., The Plant Journal 12: 1465-1472, 1997, durchgeführt.
1. Transformationsplasmide und Selektionsmarker
Die Gene, die für die Transformation verwendet werden, werden in den binären Vektor kloniert, der für die Tomatentransformation geeignet ist, wie in Beispiel 19 beschrieben. Vektoren enthalten das Hygromycin-Resistenzgen zur Selektion.
2. Herstellung von Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium-Stamm GV3101, welcher das Pflanzentransformations-Plasmid enthält, wird auf LB-(Hefeextrakt (5 g/l), Pepton (10 g/l), NaCl (5 g/l), 15 g/l Agar, pH 6,8) Flüssigmedium für 2 Tage bei 22°C gezüchtet. Ungefähr 0,8 × 10⁹ Agrobacterien werden in KCMS Inoculationsmedium (MS-Salze (4,3 g/l), Myo-Inositol, Thiamin (1,3 μg/ml), 2,4-D (0,2 μg/ml), Kinetin 0,1 μg/ml und 3% Saccharose, pH 5,5), welches mit 100 μM Acetocyringon ergänzt ist, suspendiert. Die Bakterien werden in diesem Medium für 60 Minuten prä-induziert.
3. Sterilisierung von Samen und Keimung
Die Samen des Micro-Tom-Cultivars der Tomate (Meissner et al., The Plant Journal 12: 1465-1472, 1997) und der ZTV-840-Cultivar werden mit einer 20% Bleichelösung mit Tween für 20 min. getränkt. Die Samen werden dann dreimal mit sterilem Wasser gewaschen und auf TSG-Medium ausplattiert (1/2 MS-Salze, 1% Saccharose, 1% PhytoAgar, pH 5,8) in Magentakästen (Magenta Corp, Chicago III) zur Keimung. die Cotyledonen werden ausgeschnitten und die Cotyledonenpetiolen werden 7 bis 10 Tage nach der Keimung in 5 mm Segmente zerschnitten.
4. Inoculierung
Sieben bis zehn Tage alte Codyledonen und Cotyledonenpetiolensegmente werden für 24 h auf Tabak BY-2 Feederzellplatten (MS-Salze, Myo-Inisitol 0,1 mg/ml, Caseinhydrosylat 0,2 mg/ml, Thiamin-HCl 1,3 μg/ml, 3% Saccharose, pH 5,5) vor der Inoculierung mit Agrobacterium inkubiert.
Die Cotyledonen werden für 5 Minuten in Flüssig-KCMS-Agrobacteriumsuspension getaucht. Zwischen 20 und 25 Cotyledonen werden dann mit der abaxialen Seite aufwärts auf die gleichen Feederzellplatten überführt und in Dunkelheit für zwei bis drei Tage kultiviert.
5. Selektion transformierter Cotyledonen und Petiolen und Regenerierung transformierter Pflanzen
Die Cotyledonen und Petiolenfragmente werden zwei bis drei Tage nach der Inoculierung mit Agrobacterium bei Licht auf Selektionsmedium TSM-1 (4,3 g/l MS-Salze, 1 × B5-Vitamine, 2% Saccharose, 1% Glucose, 1 μg/ml Zeatin, 0,05 μg/ml IAA, 5 μg/ml Hygromicin und 250 μg/ml Carenicillin, pH 5,8) überführt. Die Cotyledonen und Petiolensegemente, die embryogene Calli produzieren, werden auf TSM-2-Medium (MS-Salze 4,3 g/l, 1 × MS-Vitamine, 2% Saccharose, 1 μg/ml Zeatin, 5 μg/ml Hygromycin und 250 μg/ml Carbenicillin, pH 5,8) überführt. Überlebende Calli, die Pflänzchen bilden, werden in Magenta GA-7-Kästen überführt (Magenta Corp, Chicago III.), welche TRM-Medium (4,3 g/l MS-Salze, 1 × MS-Vitamine, 2% Saccharose, pH 5,8) enthalten und bei Licht gezüchtet. Nach der Wurzelbildung werden die primären Transformanten in Boden überführt.
Beispiel 22: Fluorimetrischer Test mit grün fluoreszierendem Protein (GFP)
Zum Nachweis der synGFP-Genexpression wird ein fluorimetrischer Test durchgeführt.
Blattscheibchen stabil transformierten Maises und Tomaten werden auf Trockeneis eingefroren. Die gefrorenen Gewebe werden gut gemahlen und mit 300 μl GFP-Extraktionspuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 0,1% Sarcosyl) gemischt. Die Extrakte werden von den Blatt-Trümmern durch Zentrifugieren getrennt, gefolgt vom Transfer in eine 96 Well Black-Plate mit durchsichtigem Boden (Costar 3615). Die relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) werden durch einen Spectra Fluor Plus Plate Reader bei 465 nm Anregung und 512 nm Emission gemessen. Die GFP-Aktivität wird anhand des Gesamtproteins normalisiert, welches mit Hilfe des BCA-Tests (gemäß Pierce) gemessen wird.
Beispiel 23: Expressionsanalyse von stabil transformiertem Mais und Tomatenpflanzen
1. Transgene Zea-Mais To-Pflanzen
GFP-Expression ist unter Kontrolle des CmpS-Promotors (NOV4215, NOV4216) verglichen mit dem ZmUbi-Promotor (NOV2110) 10 bis 20 Mal höher. Diese Ergebnisse werden aus Blattproben von 42 unabhängigen To-Linien gewonnen, die insgesamt 93 To-Pflanzen darstellen.
2. GFP Elisa-Test

Ein quantitativer Sandwich-Immunassay wird zum Nachweis von grün fluoreszierendem Protein (GFP) durchgeführt. Zwei kommerziell verfügbare polyklonale Antikörper werden verwendet. Der Ziege-Anti-GFP IAP (Rockland, #600-1-1-215) ist immunaffinitäts-gereinigt und der Kaninchen-Anti-GFP- Antikörper (Torreg Pines Biolabs, #TP401) ist Protein A gereinigt. Das GFP-Protein in dem Pflanzenextrakt wird mit Hilfe des Kaninchen-Antikörpers auf die Festphase der Microtiterplatte gefangen. Dann wird ein „Sandwich" zwischen dem Festphasen-Kaninchenantikörper, dem GFP-Protein und dem sekundären Ziegenantikörper gebildet, welche in dem Well vorhanden sind. Nach einem Waschschritt, wodurch nicht gebundener Sekundär-Antikörper entfernt wird, wird der gebundene Antikörper unter Verwendung eines mit Alkalischer Phosphatase markierten Antikörpers nachgewiesen. Das Substrat für das Enzym wird hinzugegeben und die Farbentwicklung wird durch Ablesen der Absorption jedes Wells gemessen. Die Ablesung wird dann an eine Standardkurve angepasst, um die GFP-Konzentration gegenüber der Absorption aufzutragen. synGFP Reportergen

Kassette im binären Vektor	GFP-Aktivität (Durchschnitt) RFU/mf Protein	ELISA (Durchschnitt) ng GFP/mg Protein
NOV4215 (CmpS)	4722,3	657,1
NOV4216 (CmpS)	2795,8	246,1
NOV2110 (ZmUbi)	272,0	41,4

2. Lycopersicon esculentum To-Pflanzen
Das CmpS-Fragment von CmYLCV-Promotor (NOV 4217) führt zu einem synGFP-Expressionsniveau, das wesentlich höher ist, als das Expressionsniveau des Ubq3-Promotors von Arabidopsis (NOV4209).
synGFP-Reportergen

Die Ergebnisse werden durch das Untersuchen der Intensität der synGFP-Fluoreszenz durch Mikroskopie in dem Callus und den primären Schösslingen 5 unabhängiger stabiler transformierter Callus-Linien, die mit der NOV4217-Kassette transformiert sind, und 2 unabhängig stabil transformierten Callus-Linien, die mit der NOV4209-Kassette transformiert sind, gewonnen.

Kassette im binären Vektor (Promotor)	Callus ID	GFP Fluoreszenz-Intensität
NOV4217 (CmpS)	NOV4217-1	+++++
NOV4217 (CmpS)	NOV4217-2	++++
NOV4217 (CmpS)	NOV4217-3	++++
NOV4217 (CmpS)	NOV4217-4	+++
NOV4217 (CmpS)	NOV4217-5	+++
NOV4209 (Ubq3 (At))	NOV4209-1	+
NOV4209 (Ubq3 (At))	NOV4290-2	+

Gus-Intron GUS-Reportergen

Die Ergebnisse, die aus der Untersuchung der Intensität der GUS-Färbung in 11 unabhängigen stabil transformierten Callus-Linien gewonnen werden, welche die CmpS-Promotor-Reporterkassetten (Linien NOV4220-1 bis NOV4220-11) enthalten. Zwei stabil transformierte Callus-Linien, die CmpC-Promotorfragment von CmYLCV-Promotor (NOV4224-1, NOV4224-2) werden untersucht. Zum Vergleich werden zwei stabil transformierte Callus-Linien, die den Arabidopsis Ubiquitin 3 (Ubq3)-Promotor (NOV4208-1, NOV4208-2) enthalten, untersucht.

Kassette im binären Vektor (Promotor	Callus ID	GFP Fluoreszenz-Intensität
NOV4220 (CmpS)	NOV4220-1	++++
NOV4220 (CmpS)	NOV4220-2	+++
NOV4220 (CmpS)	NOV4220-3	++++
NOV4220 (CmpS)	NOV4220-4	+++++
NOV4220 (CmpS)	NOV4220-5	+++++
NOV4220 (CmpS)	NOV4220-6	+++
NOV4220 (CmpS)	NOV4220-7	++++
NOV4220 (CmpS)	NOV4220-8	+++++
NOV4220 (CmpS)	NOV4220-9	++++
NOV4220 (CmpS)	NOV4220-10	+++
NOV4220 (CmpS)	NOV4220-11	++++
NOV4224 (CmpC)	NOV4224-1	++++
NOV4224 (CmpC)	NOV4224-2	+++
NOV4208 (Ubq3 (At))	NOV4208-1	+
NOV4208 (Ubq3 (At))	NOV4208-2	++

Beispiel 24: Transiente Expressionsexperimente in Mais
1. Embryonengewinnung
Unreife Embryonen von A188 oder anderen geeigneten Maisgenotypen werden aus 8–12 Tage alten Kolben in Flüssigkeit 2DG4 + 0,5 d (Duncan's D Medium modifiziert, damit es 20 mg/l Glucose enthält, ergänzt durch 10 g/l Mannose) ausgeschnitten und für 1 bis 2 Tage kultiviert.
2. Plasmolyse
Die unreifen Embryonen werden in 12% Saccharoselösung für 3–4 Stunden vor der Bombardierung inkubiert. Die Embryonen werden in 8–10 mm Abständen auf einer Platte arrangiert.
3. Bombardierung
Die Transfektion mittels Partikelbombardierung von Maisembryonen wird in Gegenwart von 5 μg Plasmid-DNA bei 650 psi durchgeführt, wie beschrieben (Wright et al., 2001, Plant Cell Reports, im Druck). Im Falle, dass die Referenz „im Druck" nicht ausreicht, sind hier die aus dem Artikel entnommenen Details:
Das DNA-Fragment wird auf Gold-Mikroträger (< 1 μm) präzipitiert, wie im DuPont Biolistics Manual beschrieben. Die Gene werden unter Verwendung des PDS-1000He-Biolistic- Geräts in die Zellen des Zielgewebes verabreicht. Die Einstellungen des Geräts sind wie folgt: 8 mm zwischen der Rupture-Disk und dem Macrocarrier, 10 mm zwischen dem Macrocarrier und dem Stopping-Screen und 7 cm zwischen dem Stopping-Screen und dem Ziel. Die Platten werden zweimal mit DNA beschichteten Partikeln unter Verwendung von 650 psi-Rupture-Disks beschossen. Um die Gewebeschäden der Schockwelle des Heliumblasts zu minimieren, wird ein Edelstahlnetz, mit 200 Öffnungen pro linearem horizontalen und vertikalen Inch (McMaster-Carr, New Brunswick, NJ) zwischen den Stopping-Screen und das Zielgewebe gegeben. Die Embryonen werden auf den Platten für 48 Stunden in Dunkelheit bei 25°C kultiviert. Proteinextrakte werden durch Lysieren von Zellen in GUS-Lysispuffer hergestellt und mittels Zentrifugieren geklärt.
Beispiel 25: GUS-Tests
Zur Durchführung der GUS-Genexpression werden histochemische und Chemilumineszenztests durchgeführt.
1. Histochemische β-Glucuronidase (GUS)-Test
Maisembryonen und Tomaten der in vitro Callus-Linien werden in den GUS-Tests verwendet. Entweder werden gesamte Embryonen oder kleine Teile eines Callus in die GUS-Färbelösung getunkt. Die GUS-Färbelösung enthält 1 mM 5-Brom-4-chlor-3-indolylglucuronid (X-Gluc, Duchefa, 20 mM Stock in DMSO), 100 mM Na-Phosphatpuffer pH 7,0, 10 mM EDTA pH 8,0 und 0,1% Triton X100. Die Gewebeproben werden bei 37°C für 1–16 Stunden inkubiert. Falls notwendig, werden die Proben mittels mehrerer Waschschritte mit 70% EtOH geklärt, um Chorophyll zu entfernen.
2. β-Glucuronidase (GUS) Chemillumineszenz-Test
Für die quantitative Analyse der GUS-Expression wird der GUS-Chemilumineszenz-Test unter Verwendung des GUS-Light-Kit (Tropix. Inc) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Aktivität wird mit einem Luminometer gemessen.
Die GUS-Ergebnisse mit dem Konstrukt pCmpS und pCmpMG (Beispiel 17) werden mit einem Vergleichsklon-Wert (pNOV3612, Beispiel 19) normalisiert. Die Ergebnisse, die aus zwei verschiedenen Experimenten gewonnen werden, zeigen, dass die 8 bp Deletion des CmYLCV-Promotors (pCmpMG, Beispiel 17) verglichen mit pCmpS, nicht signifikant die Expressionsniveaus der GUS-Reporter beeinflusst. Transiente Expression in Z. Mais-Embryonen GUS-Aktivität 48 bzw. 72 Stunden nach der Transfektion

Konstrukt ID GUS Aktivität RFU/mg Protein

48 h 72 h

pCmpS 103,7 51,7

pCmpMG 81,4 70,8

ZmUbi (pNOV3612) 52,6 70,2
SEQUENZLISTE

Claims

DNA-Sequenz umfassend (a) eine Nucleotidsequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 19 und SEQ ID Nr. 20 besteht, oder (b) das Komplement einer DNA-Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit irgendeiner von SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 hybridisiert, wobei dieses Komplement als Promotor zur Transkription einer damit verbundenen Nucleotidsequenz dient, (c) eine DNA-Sequenz, die eine konsekutive Abfolge von mindestens 50 Nt der SEQ ID Nr. 1 umfasst, wobei die DNA-Sequenz als Promotor zur Transkription einer damit verbundenen Nucleotidsequenz dient.
Die DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz eine Nucleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 20 besteht, und wobei die DNA-Sequenz zusätzlich an ihrem 3'-Ende die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID Nr. 5 wiedergegeben ist, umfasst.
DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 und Anspruch 2, welche zusätzlich an ihrem 5'-Ende die in SEQ ID Nr. 6 wiedergegebene Nucleotidsequenz umfasst.
Rekombinantes DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, operativ verbunden mit einer Nucleotidsequenz von Interesse, umfasst.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 4, wobei die Nucleotidsequenz von Interesse eine kodierende Sequenz umfasst.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 5, wobei die kodierende Sequenz ein gewünschtes phänotypisches Merkmal kodiert.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 6, wobei die kodierende Sequenz ein Protein kodiert, welches Zellen einen positiven Selektionsvorteil verleiht, die mit dieser kodierenden Sequenz transformiert worden sind.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 6 oder 7, wobei die kodierende Sequenz ein Protein kodiert, welches einen metabolischen Vorteil an Zellen verleiht, die mit dieser kodierenden Sequenz transformiert worden sind, was darin besteht, dass es in der Lage ist, eine Verbindung zu metabolisieren, wobei die Verbindung (i) Mannose oder Xylose oder ein Derivat oder Vorläufer hiervon ist, oder (ii) ein Substrat des Proteins oder (iii) in der Lage ist, von Zellen, die mit dieser kodierenden Sequenz transformiert worden sind, in ein solches Substrat metabolisiert zu werden.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 8, wobei die kodierende Sequenz ein Enzym kodiert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Xylosiomerasen, Phosphomanno-isomerase, Mannose-6-phosphatisomerase, Mannose-1-phosphatisomerase, Phosphomannomutase, Mannoseepimerase, Mannose- oder Xylosephosphatase, Mannose-6-phosphatase, Mannose-1-phosphatase und Mannose- oder Xylosepermease.
Rekombinantes Molekül nach Anspruch 9, wobei die kodierende Sequenz eine Phosphomannoisomerase kodiert.
Rekombinante DNA gemäß Anspruch 5, wobei die kodierende Region nicht translatierbar ist.
Rekombinante DNA gemäß Anspruch 11, wobei die nicht translatierbare kodierende Region aus einem viralen Gen stammt.
Rekombinante DNA gemäß Anspruch 12, wobei das virale Gen von TSWV stammt, insbesondere vom TSWV NP-Gen.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 5, wobei die kodierende Sequenz in Gegensinn-Richtung vorliegt.
DNA-Expressionsvektor umfassend eine DNA-Sequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, oder ein rekombinantes DNA-Molekül irgendeines der Ansprüche 4 bis 14.
DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 15, umfassend eine erste DNA-Sequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, operativ verbunden mit einer Nucleotidsequenz von Interesse und eine zweite DNA-Sequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, welche mit einer Nucleotidsequenz von Interesse verbunden ist.
DNA-Expressionsvektor gemäß Anspruch 16, welcher in der Lage ist, die Expression eines viralen Genoms zu verändern.
DNA-Expressionsvektor gemäß Anspruch 17, umfassend eine erste DNA-Sequenz, die in der Lage ist, ein Sinn-RNA-Fragment dieses viralen Genoms oder einen Teil davon zu exprimieren, und eine zweite DNA-Sequenz, die in der Lage ist, in einer Zelle ein Gegensinn-RNA-Fragment dieses viralen Genoms oder eines Teils davon zu exprimieren, wobei dieses Sinn-RNA-Fragment und dieses Gegensinn-RNA-Fragment in der Lage sind, eine doppelsträngige RNA zu bilden.
DNA-Expressionsvektor gemäß Anspruch 18, wobei das Virus aus der Gruppe, bestehend aus Tospoviren, Potyviren, Potexviren, Tobamoviren, Luteoviren, Cucumoviren, Bromoviren, Closteoviren, Tombusviren und Furoviren, ausgewählt ist.
DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 19, wobei die DNA-Sequenzen eine Nucleotidsequenz umfassen, die von einem viralen Hüllproteingen, einem viralen Nucleocapsidproteingen, einem viralen Replicasegen oder einem viralen Bewegungsproteingen oder Teilen davon stammt.
DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 20, wobei diese DNA-Sequenz aus dem Tomatenbronzefleckenvirus (TSWV) stammt.
DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 21, wobei diese DNA aus einem Nucleocapsidproteingen stammt.
Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, oder einem rekombinanten DNA-Molekül nach irgendeinem der Ansprüche 4 bis 14 oder einem DNA-Expressionsvektor gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 22 stabil transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 23, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
Pflanze oder Nachkommen davon, die mit einer DNA-Sequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem rekombinanten DNA-Molekül nach irgendeinem der Ansprüche 4 bis 14 oder einem DNA-Expressionsvektor gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 22 stabil transformiert sind.
Pflanze nach Anspruch 25, wobei diese Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Mais, Weizen, Hirse, Roggen, Hafer, Rasengras, Reis, Gerste, Sojabohnen, Baumwolle, Tabak, Zuckerrüben und Ölsaatraps besteht.
Verwendung der DNA-Sequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, um eine Nucleotidsequenz von Interesse zu exprimieren.
Verfahren zum Herstellen einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, wobei die DNA durch eine Polymerase-Kettenreaktion hergestellt wird, worin mindestens ein Oligonucleotid, das verwendet wird, eine Sequenz aus Nucleotiden umfasst, welche ein konsekutive Abfolge von 15 oder mehr Basenpaaren der SEQ ID Nr. 1 darstellen.