EA006761B1 - Промоторные последовательности вируса желтого скручивания листьев цестровых и способы их применения - Google Patents

Abstract

В патенте описаны новые последовательности ДНК, функционирующие в качестве промоторов транскрипции связанных с ними нуклеотидных последовательностей. В частности, описаны последовательности ДНК, которые обеспечивают конститутивную экспрессию связанной с ними нуклеотидной последовательности. Описаны также рекомбинантные последовательности, включающие такие промоторные последовательности. Указанные рекомбинантные последовательности ДНК можно применять для создания трансгенных растений и прежде всего растений, экспрессирующих представляющую интерес нуклеотидную последовательность во все моменты времени и в большинстве тканей и органов.

Description

Настоящее изобретение относится к новым последовательностям ДНК, которые функционируют в качестве промоторов транскрипции связанных с ними нуклеотидных последовательностей в растениях. Более конкретно, изобретение относится к новым промоторам, которые обеспечивают конститутивную экспрессию связанных с ними представляющих интерес последовательностей.

В области сельского хозяйства постоянно существует необходимость в модификации растений в соответствии с определенными потребностями. Одним из путей решения этой задачи является применение современных методов генной инженерии. Например, в результате введения в растение представляющего интерес гена растение можно специфически модифицировать таким образом, чтобы оно приобрело требуемый фенотипический признак. Для этого, как правило, растения трансформируют гетерологичным геном, который включает промоторную область, кодирующую область и терминирующую область. При генетическом конструировании гетерологичного гена, предназначенного для экспрессии в растениях, решающим фактором является выбор промотора. В то время как для некоторых генов целесообразно, чтобы их экспрессия происходила только в ответ на воздействие определенных стимулов или была сосредоточена в определенных типах клеток или тканях, для других генов более предпочтительной

ДНК, включающая

ДНК, включающая

ДНК, включающая

ДНК, включающая

ДНК, включающая нуклеотидную нуклеотидную нуклеотидную нуклеотидную нуклеотидную последовательность, последовательность, последовательность, последовательность, последовательность, представленную представленную представленную представленную представленную является конститутивная экспрессия, т.е. экспрессия, которая происходит в растении постоянно и в большей части тканей и органов. Ранее для конститутивной экспрессии гетерологичных генов в растениях широко использовали промотор 358 вируса мозаики цветной капусты (промотор 358 СаМУ). Однако существуют ситуации, когда требуется применять альтернативные промоторы. В соответствии с этим основной задачей настоящего изобретения является создание таких альтернативных промоторов для экспрессии в растениях представляющей интерес нуклеотидной последовательности. В изобретении предложены также рекомбинантные молекулы ДНК, экспрессионные векторы и трансгенные растения, содержащие промоторы по настоящему изобретению.

В соответствии с вышеизложенным в изобретении предложена последовательность ДНК, обладающая способностью осуществлять экспрессию связанной с ней нуклеотидной последовательности, где указанную последовательность ДНК можно получать из генома вируса желтого скручивания листьев цестровых (СшУЪСУ). Предпочтительной является последовательность ДНК, которую можно получать из промотора первичного транскрипта СшУЪСУ и которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ N0:1.

В частности, предложены следующие последовательности ДНК:

- последовательность

8ЕО ΙΌ N0:2,

- последовательность

8ЕО ΙΌ N0:3,

- последовательность

8ЕО ΙΌ N0:4,

- последовательность

8ЕО ΙΌ N0:5,

- последовательность

8ЕО ΙΌ N0:6,

- последовательность ДНК, которая гибридизуется в строгих условиях с любой из последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ N0:1, 8Е0 ΙΌ N0:2, 8Е0 ΙΌ N0:3, 8Е0 ΙΌ N0:4, 8Е0 ΙΌ N0:5 или 8Е0 ΙΌ N0:6, в частности, когда указанная выше последовательность ДНК включает нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0:19 или 8Е0 ΙΌ N0:20.

Изобретение относится также к последовательностям ДНК, включающим фрагмент, включающий по меньшей мере 50 последовательных нуклеотидов, предпочтительно включающий от примерно 400 оснований до примерно 650 оснований, более предпочтительно от примерно 200 оснований до примерно 400 оснований и наиболее предпочтительно примерно 350 оснований 8Е0 ΙΌ N0:1, при этом последовательности ДНК обладают способностью обеспечивать экспрессию связанных с ними нуклеотидных последовательностей.

Согласно одному из конкретных вариантов осуществления последовательность фрагмента, включающего по меньшей мере 50 последовательных нуклеотидов, предпочтительно включающая от примерно 400 оснований до примерно 650 оснований, более предпочтительно от примерно 200 оснований до примерно 400 оснований и наиболее предпочтительно примерно 350 оснований, по меньшей мере на 75%, предпочтительно на 80%, более предпочтительно на 90% и наиболее предпочтительно на 95% идентична последовательности фрагмента, включающего по меньшей мере 50 последовательных нуклеотидов, предпочтительно включающего от примерно 400 оснований до примерно 650 оснований, более предпочтительно от примерно 200 оснований до примерно 400 оснований и наиболее предпочтительно примерно 350 оснований 8Е0 ΙΌ N0:1.

Изобретение относится также к рекомбинантным молекулам ДНК, которые включают область промотора первичного транскрипта, выделенную из вируса желтого скручивания листьев цестровых. Кроме того, в изобретении предложены рекомбинантные молекулы ДНК и кассеты экспрессии ДНК, которые включают последовательность ДНК по изобретению, функционально связанную с представляющей ин

- 1 006761 терес нуклеотидной последовательностью. Изобретение относится также к экспрессионным векторам ДНК, которые включают рекомбинантную ДНК и кассеты экспрессии соответственно.

В частности, предложены рекомбинантные молекулы ДНК и кассеты экспрессии ДНК, в которых представляющая интерес нуклеотидная последовательность включает кодирующую область, прежде всего

- кодирующую последовательность, которая кодирует требуемый фенотипический признак,

- кодирующую последовательность, которая кодирует ген селектируемого или пригодного для скрининга маркера,

- кодирующую последовательность, которая кодирует протеин, обусловливающий устойчивость к антибиотикам, устойчивость к вирусам, устойчивость к насекомым, устойчивость к болезням или устойчивость к другим вредителям, толерантность к гербицидам, повышенную питательную ценность, улучшенные характеристики при промышленной переработке или измененную репродуктивную способность,

- кодирующую последовательность, которая кодирует протеин, придающий позитивное избирательное преимущество клеткам, трансформированным указанной кодирующей последовательностью,

- кодирующую последовательность, которая кодирует протеин, придающий метаболическое преимущество клеткам, трансформированным указанной кодирующей последовательностью, которое заключается в способности осуществлять метаболизм соединения, где соединение представляет собой маннозу или ксилозу или их производное или предшественник, или субстрат протеина, или который может метаболизироваться клетками, трансформированными кодирующей последовательностью, с образованием такого субстрата,

- кодирующую последовательность, которая кодирует фермент, выбранный из группы, включающей ксило-изомеразы, фосфоманно-изомеразу, маннозо-6-фосфат-изомеразу, маннозо-1-фосфатизомеразу, фосфоманно-мутазу, маннозо-эпимеразу, маннозо- или кислозо-фосфатазу, маннозо-6фосфатазу, маннозо-1-фосфатазу и маннозо- или ксилозо-пермеазу,

- кодирующую последовательность, которая кодирует фосфоманнозо-изомеразу,

- кодирующую область, которая является нетранслируемой,

- нетранслируемую кодирующую область из вирусного генома, в частности из Τδ\νν (вируса пятнистого увядания томатов), более предпочтительно из ΝΡ-гена Т8^У,

- кодирующую последовательность, которая кодирует в растениях важные с коммерческой точки зрения ферменты или метаболиты,

- кодирующую последовательность, которая находится в антисмысловой ориентации.

Изобретение относится также к экспрессионным векторам ДНК, которые включают указанные выше последовательность ДНК или рекомбинантную молекулу ДНК. В конкретном варианте осуществления изобретения экспрессионный вектор ДНК представляет собой ρΝ0ν2819 или ρΝ0ν2819. Кроме того, изобретение относится к экспрессионным векторам ДНК, которые включают первую последовательность ДНК по изобретению, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, и вторую последовательность ДНК по изобретению, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения указанные выше экспрессионные векторы ДНК обладают способностью изменять экспрессию вирусного генома.

Согласно еще одному конкретному варианту осуществления указанный выше экспрессионный вектор ДНК включает первую последовательность ДНК, которая обладает способностью обеспечивать экспрессию в клетке фрагмента смысловой РНК вирусного генома или его часть, и вторую последовательность ДНК, которая обладает способностью обеспечивать экспрессию в клетке фрагмента антисмысловой РНК вирусного генома или его часть, причем фрагмент смысловой РНК и фрагмент антисмысловой РНК обладают способностью образовывать двухцепочечную РНК.

В изобретении предложены экспрессионные векторы, отличающиеся тем, что

- вирус выбирают из группы, включающей тосповирусы, потивирусы, потексвирусы, тобамовирусы, лутеовирусы, кукумовирусы, бромовирусы, клостеорвирусы, томбусвирусы и фуровирусы,

- последовательности ДНК включают нуклеотидную последовательность, происходящую из гена протеина вирусной оболочки, гена вирусного нуклеокаспидного протеина, гена вирусной репликазы или гена протеина, обеспечивающего движение вируса, или их частей,

- последовательность ДНК получают из вируса пятнистого увядания томатов (Τδ^ν),

- последовательность ДНК получают из гена нуклеокапсидного протеина.

Изобретение относится также к клеткам-хозяевам, стабильно трансформированным последовательностью ДНК, рекомбинантной молекулой ДНК или экспрессионным вектором ДНК по изобретению. В частности, где

- клетка-хозяин представляет собой бактерию,

- клетка-хозяин представляет собой растительную клетку,

- клетка-хозяин представляет собой растительную клетку, выбранную из группы, включающей клетки риса, кукурузы, пшеницы, ячменя, ржи, сладкого картофеля, сахарной кукурузы, бобов, гороха, цикория, салата, капусты, цветной капусты, брокколи, турнепса, редиса, шпината, спаржи, лука, чеснока,

- 2 006761 перца, сельдерея, тыквы крупноплодной, тыквы пепо, конопли, цуккини, яблони, груши, айвы, дыни, сливы, вишни, персика, нектарина, абрикоса, земляники, винограда, малины, ежевики, ананаса, авокадо, папайи, манго, банана, сои, томатов, сорго, сахарного тростника, сахарной свеклы, подсолнечника, рапса, клевера, табака, моркови, хлопчатника, люцерны, картофеля, баклажана, огурца, ЛгаЫбор818 Шайапа и древесных растений, таких как хвойные и лиственные деревья, но прежде всего, риса, кукурузы, пшеницы, ячменя, капусты, цветной капусты, перца, тыквы крупноплодной, дыни, сои, томатов, сахарной свеклы, подсолнечника или хлопчатника, предпочтительно риса, кукурузы, пшеницы, Зотдйит Ыео1от, ежи сборной, сахарной свеклы и сои,

- клетка-хозяин представляет собой растительную клетку двудольного растения,

- клетка-хозяин представляет собой растительную клетку двудольного растения, выбранного из группы, включающей сою, хлопчатник, табак, сахарную свеклу и масличный рапс,

- клетка-хозяин представляет собой растительную клетку однодольного растения,

- клетка-хозяин представляет собой растительную клетку однодольного растения, выбранного из группы, включающей кукурузу, пшеницу, сорго, рожь, овсы, газонную траву, рис и ячмень.

Кроме того, изобретение относится к растениям и их потомству, включая семена, стабильно трансформированным последовательностью ДНК, рекомбинантной молекулой ДНК или экспрессионным вектором ДНК по изобретению. В частности, где

- растения выбирают из группы, включающей рис, кукурузу, пшеницу, ячмень, рожь, сладкий картофель, сахарную кукурузу, бобы, горох, цикорий, салат, капусту, цветную капусту, брокколи, турнепс, редис, шпинат, спаржу, лук, чеснок, перец, сельдерей, тыкву крупноплодную, тыкву пепо, коноплю, цуккини, яблоню, грушу, айву, дыню, сливу, вишню, персик, нектарин, абрикос, землянику, виноград, малину, ежевику, ананас, авокадо, папайю, манго, банан, сою, томаты, сорго, сахарный тростник, сахарную свеклу, подсолнечник, рапс, клевер, табак, морковь, хлопчатник, люцерну, картофель, баклажан, огурец, ЛгаЫбор818 Лайапа и древесные растения, такие как хвойные и лиственные деревья, но прежде всего рис, кукурузу, пшеницу, ячмень, капусту, цветную капусту, перец, тыкву крупноплодную, дыню, сою, томаты, сахарную свеклу, подсолнечник или хлопчатник, предпочтительно рис, кукурузу, пшеницу, Зотдйит Ыео1от, ежу сборную, сахарную свеклу и сою.

В изобретении описано также

- применение последовательности ДНК по изобретению для экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности,

- способ получения последовательности ДНК по изобретению, где ДНК получают с помощью полимеразной цепной реакции, причем по меньшей мере один из применяемых олигонуклеотидов включает последовательность нуклеотидов, представляющую собой фрагмент, включающий 15, 18, 20, 22, 24 или более последовательных пар оснований 8ЕО ΙΌ N0:1.

С целью более ясного и правильного понимания описания и формулы изобретения ниже представлены следующие определения:

СтУЪСУ: вирус желтого скручивания листьев цестровых.

Перестройка ДНК: перестройка ДНК представляет собой метод, предназначенный для быстрой, простой и эффективной интродукции перераспределений, предпочтительно случайным образом, в молекулу ДНК или для получения обменов последовательностями ДНК между двумя или большим количеством молекул ДНК, предпочтительно случайным образом. Молекула ДНК, полученная в результате перестройки ДНК, является перестроенной молекулой ДНК, которая представляет собой не встречающуюся в естественных условиях молекулу ДНК, полученную на основе по меньшей мере одной молекулы ДНКматрицы.

Экспрессия: обозначает транскрипцию и/или трансляцию эндогенного гена или трансгена в растениях. В случае, например, антисмысловых конструкций понятие экспрессия может относиться к транскрипции только антисмысловой ДНК.

Функционально эквивалентная последовательность: обозначает последовательность ДНК, которая обладает промоторной активностью, практически аналогичной активности промотора первичного транскрипта СтУЪСУ или его части и которая гибридизуется в строгих условиях с указанными промоторными последовательностями.

Ген: обозначает кодирующую последовательность и связанную с ней регуляторную последовательность, причем кодирующая последовательность транскрибируется с образованием РНК, такой как мРНК, рРНК, тРНК, зпРНК (М.я.РНК), смысловая РНК или антисмысловая РНК. Примерами регуляторных последовательностей являются промоторные последовательности, 5'- и З'-нетранслируемые последовательности и терминирующие последовательности. Могут присутствовать другие элементы, например, интроны.

Представляющий интерес ген: обозначает любой ген, который при переносе в растение придает растению требуемое свойство, такое как устойчивость к антибиотикам, устойчивость к вирусам, устойчивость к насекомым, устойчивость к болезням или устойчивость к другим вредителям, толерантность к гербицидам, повышенную питательную ценность, улучшенные характеристики при промышленной переработке или измененную репродуктивную способность. «Представляющий интерес ген» может также представлять собой ген, который переносят в растения для получения в них ценных с коммерческой точки зрения ферментов или метаболитов.

Гетерологичный: в контексте настоящего описания обозначает отличный от встречающегося в естественных условиях или синтетического происхождения. Например, если клетку-хозяина трансформируют нуклеотидной последовательностью, которая не встречается в нетрансформированной клеткехозяине, то считается, что нуклеотидная последовательность является гетерологичной относительно клетки-хозяина. Применяемая для трансформации нуклеиновая кислота может содержать гетерологичный промотор, гетерологичную кодирующую последовательность или гетерологичную терминирующую последовательность. В другом варианте применяемая для трансформации нуклеиновая кислота может являться полностью гетерологичной или может включать любую возможную комбинацию гетерологичных и эндогенных нуклеотидных последовательностей.

Лидерная область: область гена между сайтом инициации транскрипции и сайтом инициации трансляции.

Маркерный ген: относится к гену, который кодирует селектируемый признак или признак, который можно выявлять путем скрининга.

Фукционально связан/соединен с: считается, что регуляторная последовательность ДНК «функционально связана с» или «соединена с» последовательностью ДНК, кодирующей РНК или протеин, если две последовательности расположены так, что регуляторная последовательность ДНК оказывает воздействие на уровень экспрессии кодирующей последовательности ДНК.

Растение: относится к любому растению, в частности к семенному материалу растений.

Растительная клетка: структурная и физиологическая единица растения, включающая протопласт и клеточную оболочку. Растительная клетка может находиться в форме выделенной отдельной клетки или культивируемой клетки или представлять собой часть высокоорганизованной единицы, такой, например, как ткань растения или орган растения.

Растительный материал: относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветков, плодам, пыльце, пыльцевым трубкам, семяпочкам, зародышевым мешкам, яйцеклеткам, зиготам, зародышам, семенам, отводкам, культурам клеток или тканей или любой другой части или продукту растения.

Промотор: обозначает последовательность ДНК, которая инициирует транскрипцию связанной с ней последовательности ДНК. Промоторная область может также включать элементы, которые действуют в качестве регуляторов экспрессии гена, такие как активаторы, энхансеры и/или репрессоры, и может включать всю 5'-нетранслируемую лидерную последовательность или ее часть.

Рекомбинантная молекула ДНК: комбинация последовательностей ДНК, которые соединены вместе с помощью метода рекомбинатной ДНК.

Метод рекомбинатной ДНК: процедуры, применяемые для объединения последовательностей ДНК, описанные, например, у ЗатЬтоок и др., Со1й Зрттд НатЬот, ΝΥ: Со1й Зртшд НатЬот ЬаЬота1огу Ргс55. 1989.

Маркерный ген, который можно выявлять путем скрининга (пригодный для скрининга маркерный ген): относится к гену, экспрессия которого не придает избирательное преимущество трансформированной клетке, но экспрессия которого приводит к фенотипическому отличию трансформированной клетки от нетрансформированных клеток.

Селектируемый маркерный ген: обозначает ген, экспрессия которого в клетке растения придает клетке избирательное преимущество. Избирательное преимущество, которое имеют клетки, трансформированные селектируемым маркерным геном, по сравнению с нетрансформированными клетками может заключаться в их способности расти в присутствии отрицательного агента селекции, такого как антибиотик или гербицид. Избирательное преимущество, которое имеют трансформированные клетки по сравнению с нетрансформированными клетками, может заключаться в их усиленной или вновь приобретенной способности использовать добавленное соединение в качестве питательного вещества, фактора роста или энергетического источника. Понятие селектируемый маркерный ген относится также к гену или к комбинации генов, экспрессия которых в растительной клетке в присутствии селективного агента по сравнению с отсутствием селективного агента, оказывает положительное воздействие на трансформированную растительную клетку и отрицательное воздействие на нетрансформированную растительную клетку, например, в отношении роста, что придает трансформированной растительной клетке положительное избирательное преимущество.

Идентичность последовательностей: процент идентичности последовательностей определяют с использованием компьютерных программ, основанных на алгоритмах динамического программирования. Компьютерные программы, которые являются предпочтительными для применения в рамках настоящего изобретения, включают комплекс поисковых программ ВЬА8Т (Ваис Ьоса1 АНдитеи! 8саге11 Тоо1), предназначенных для исследования любых доступных баз данных о последовательностях независимо от того, представляет ли собой рассматриваемая последовательность аминокислотную последовательность протеина или последовательность ДНК. Версию ВЬА8Т 2.0 (версия ВЬА8Т, в которой учитываются бреши) этого комплекса программ можно получить по Интернет (функционирующий в настоящее время

- 4 006761 сайт: 1Шр://\\л\л\'.псЫ.п1т.ш11.до\7ВЕА8Т/). Этот комплекс программ основан на эвристическом алгоритме, предназначенном для локального поиска в отличие от алгоритмов глобального сравнения, и поэтому позволяет устанавливать связь между последовательностями, имеющими только изолированные области. Баллы, получаемые с использованием поисковых программ ВЬА8Т, хорошо поддаются статистической интерпретации. Для таких программ в качестве необязательных параметров предпочтительно используют задаваемые по умолчанию параметры.

Трансформация: относится к интродукции нуклеиновой кислоты в клетку. В частности, понятие относится к стабильной интеграции молекулы ДНК в геном представляющего интерес организма. Т8\УУ: вирус пятнистого увядания томатов.

Настоящее изобретение относится к последовательностям ДНК, получаемым из генома вируса желтого скручивания листьев цестровых (СтУЬСУ). Предпочтительными являются последовательности ДНК, которые получают из промотора первичного транскрипта СтУЬСУ, обладающего способностью обеспечивать экспрессию связанной с ним представляющей интерес нуклеотидной последовательности. Под объем изобретения подпадают также функциональные и/или структурные эквиваленты последовательностей ДНК. Таким образом, изобретение относится к последовательностям ДНК, которые функционируют в качестве промоторов транскрипции связанных с ними нуклеотидных последовательностей. Промотороная область может включать также элементы, которые действуют в качестве регуляторов экспрессии генов, такие как активаторы, энхансеры и/или репрессоры, и могут включать 5'нетранслируемую лидерную последовательность транскрибируемой мРНК.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения последовательность ДНК обеспечивает конститутивную экспрессию связанной с ней нуклеотидной последовательности. Понятие «конститутивная экспрессия» обозначает, что экспрессия представляющей интерес нуклеотидной последовательности происходит во все моменты времени и практически во всех тканях и органах. При анализе кратковременной экспрессии при использовании в качестве связанной последовательности репортерного гена СИ8 или САТ установлено, что последовательность ДНК по изобретению обеспечивает высокий уровень экспрессии репортерного гена СИ8 или САТ. Таким образом, последовательность ДНК по изобретению можно применять для обеспечения высокого уровня экспрессии связанной с ней представляющей интерес нуклеотидной последовательности, которая предпочтительно представляет собой кодирующую последовательность. Как очевидно специалисту в данной области, представляющую интерес связанную кодирующую последовательность можно экспрессировать в смысловой и антисмысловой ориентации. Кроме того, представляющая интерес кодирующая последовательность может быть гетерологичной или гомологичной по отношению к растению, подлежащему трансформации. В случае гомологичной кодирующей последовательности последовательность ДНК по изобретению можно применять для эктопической экспрессии указанной последовательности. Согласно одному из конкретных вариантов осуществления изобретения экспрессия представляющей интерес кодирующей последовательности под контролем последовательности ДНК по изобретению подавляет собственную экспрессию и исходную копию гена путем процесса, называемого косупрессией.

Промоторы по настоящему изобретению можно получать из геномной ДНК вируса желтого скручивания листьев цестровых (СтУЬСУ), которую можно выделять, например, из зараженных растений

С.’с51гшп рагс.|ш. Пораженные СтУЬСУ растения Сс51гпт ращш выявляют по наличию листовой мозаики и уродливых морщинистых листьев. Затем эту ДНК секвенируют и анализируют. Сравнение последовательности с последовательностями в базе данных позволило установить, что геномная организация СтУЬСУ соответствует одному из других представителей семейства Саийтоупик. СтУЬСУ содержит 8 открытых рамок считывания. Сравнение последовательности продуктов гена СтУЬСУ выявило, что продукт гена I участвует в движении внутри клетки; ген А кодирует небольшой протеин неизвестной функции; ген В кодирует фактор, необходимый для переноса вируса тлями; ген С кодирует протеин, связанный с вирионом; ген ГУ кодирует основной капсидный протеин; ген У кодирует обратную транскриптазу и ген УГ активирует в транс-ориентации трансляцию первичного транскрипта вирусных генов. Наибольший интерес представляет так называемый промотор первичного транскрипта СтУЬСУ.

Как очевидно специалисту в данной области, согласно изобретению можно применять различные области промотора первичного транскрипта СтУЬСУ. Одним из конкретных вариантов осуществления изобретения является область промотора первичного транскрипта СтУЬСУ, представленная в 8Еф ГО N0:1, обозначенная как промотор СтрЭ. Эта область включает 350 пар оснований промотора первичного транскрипта СтУЬСУ и 320 пар оснований 5'-нетранслируемой лидерой последовательности первичного транскрипта СтУЬСУ. Эту последовательность получают секвенированием геномной ДНК СтУЬСУ. Проморную и лидерную последовательности соответственно идентифицируют путем сравнения с последовательностями базы данных. Вариант 8Е0 ГО N0:1, обозначенный как СтрЕ, в котором 5'нетранслируемая лидерая последовательность первичного транскрипта СтУЬСУ включает 318 пар оснований вместо 320 пар оснований, приведен в 8Е0 ГО N0:19.

Одним из предпочтительных объектов изобретения является последовательность ДНК, представленная в 8Е0 ГО N0:2, обозначенная как промотор СтрС. Промотор СтрС представляет собой фрагмент последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0:1, и включает 346 пар оснований промотора первичного

- 5 006761 транскрипта СтУЬСУ, соответствующих основаниям 5-350 8Еф ГО N0:1. Эту последовательность ДНК получают с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК вируса желтого скручивания листьев цестровых или зараженных вирусом желтого скручивания листьев цестровых растений СсДгиш рагсри с помощью прямого праймера Стр1 (8Еф ГО N0:13) и обратного праймера СтрС2 (8Е0 ГО N0: 14) . Предполагаемый ТАТА-бокс промотора СтрС простирается от основания 308 до основания 315 8Е0 ГО N0:2. Промотор СтрС включает по меньшей мере 3 предполагаемые энхансерные области. Энхансерная область 1, имеющая нуклеотидную последовательность СААТ, простирается от основания 232 до основания 235 8Е0 ГО N0:2, а энхансерная область 2, которая также имеет нуклеотидную последовательность СААТ, простирается от основания 243 до основания 246 8Е0 ГО N0:2. Энхансерная область 3 простирается от основания 246 до основания 253 8Е0 ГО N0:2 и имеет нуклеотидную последовательность ТОАСОТАА.

Еще одним предпочтительным объектом изобретения является ДНК, приведенная в 8Е0 ГО N0:3, обозначенная как промотор Стр8. Промотор Стр8 также представляет собой фрагмент последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0:1, и включает 346 пар оснований 8Е0 ГО N0:2 плюс 54 пары оснований лидерной области промотора первичного транскрипта СтУЬСУ. Лидерная область представляет собой нуклеотидную последовательность, расположенную перед кодирующей последовательностью, которая транскрибируется, но не транслируется с образованием протеина. Специалисту в данной области известно, что лидерная область может содержать регуляторные элементы, обладающие важными функциями при экспрессии гена. Промотор Стр8 получают с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК вируса желтого скручивания листьев цестровых или из зараженных вирусом желтого скручивания листьев цестровых растений СсДгиш рагсри с помощью прямого праймера Стр1 (8Е0 ГО N0:13) и обратного праймера Стр82 (8Е0 ГО N0: 15). Промотор Стр8 включает по меньшей мере 2 предполагаемые энхансерные области в лидерной области. Энхансерная область 4 (ОАОАОА) простирается от основания 354 до основания 359 8Е0 ГО N0:3, а энхансерная область 5 (0А6А6А0А) простирается от основания 368 до основания 375 8Е0 ГО N0:3.

Еще одним из предпочтительным объектом изобретения является последовательность, представленная в 8Е0 ГО N0:4, обозначенная как промотор СтрЬ. Как и предыдущий промотор, промотор СтрЬ представляет собой фрагмент последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0:1, и включает 346 пар оснований 8Е0 ГО N0:2 плюс 288 пар оснований 5'-лидерной последовательности первичного транскрипта СтУЬСУ. Промотор СтрЬ получают с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК вируса желтого скручивания листьев цестровых или зараженных вирусом желтого скручивания листьев цестровых растений СсДгит рагсри с помощью прямого праймера Стр1 (8Е0 ГО N0:13) и обратного праймера СтрЬ2 (8Е0 ГО N0: 16) . Вариант 8Е0 ГО N0:4, обозначенный как СтрЕ, в котором 5'-нетранслируемая лидерая последовательность первичного транскрипта СтУЬСУ включает 286 пар оснований вместо 288 пар оснований, приведен в 8Е0 ГО N0:12.

Как известно специалисту в данной области, нуклеотидные последовательности, представленные в 8Е0 ГО N0:1, 2, 3, 4, 19 и 20, можно удлинять на их 5' и 3'-концах с помощью гомологичных или гетерологичных нуклеотидных последовательностей. Например, 5' -конец 8Е0 ГО N0:1, 2, 3, 4, 19 и 20 можно удлинять с помощью всей или части нуклеотидной последовательности 8Е0 ГО N0:6. 8Е0 ГО N0:6 в естественных условиях расположена против хода транскрипции относительно 8Е0 ГО N0:2, 3, 4 и 20 и включает часть ОРС У1 СтУЬСУ (основания 1-100 8Е0 ГО N0:6), а также часть промотора первичного транскрипта СтУЬСУ (основания 101-104 8Е0 ГО N0:6). Аналогично этому 3'-концы 8Е0 ГО N0:2, 3, 4 и 20 можно удлинять с использованием всей или части нуклеотидной последовательности 8Е0 ГО N0:5, представляющей собой нуклеотидную последовательность, которая в естественных условиях встречается на 3' 8Е0 ГО N0:4 и 20 и включает лидерную последовательность первичного транскрипта СтУЬСУ.

Как указано выше, последовательности ДНК по изобретению можно, например, получать с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК вируса желтого скручивания листьев цестровых или зараженных вирусом желтого скручивания листьев цестровых растений СсДгиш рагсри. Альтернативно этому последовательности ДНК по изобретению можно получать из любого другого вируса семейства Саийιηονίπίδ. имеющего последовательности, гомологичные последовательности ДНК по изобретению, с помощью специфичных для последовательности праймеров. Как очевидно специалисту в данной области, основываясь на нуклеотидных последовательностях, представленных в 8Е0 ГО N0:1- 8Е0 ГО N0:6 и 8Е0 ГО N0:19 и 20, можно выбрать любую представляющую интерес комбинацию праймеров для ПЦРамплификации фрагментов ДНК различной длины, которые можно применять согласно изобретению. Таким образом, изобретение включает фрагменты, полученные из промоторов первичного транскрипта СтУЬСУ, которые обладают требуемой функцией по изобретению, т.е. обладают способностью обеспечивать экспрессию связанных с ними нуклеотидных последовательностей.

Это можно тестировать путем создания таких промоторных фрагментов, слияния их с селектируемым маркерным геном или пригодным для скрининга маркерным геном и анализа слитых конструкций в отношении сохранения промоторной активности. Такие анализы находятся в компетенции специалиста в данной области. Предпочтительные фрагменты ДНК по изобретению включают по меньшей мере 50 оснований, предпочтительно от примерно 400 оснований до примерно 650 оснований, более предпочти

- 6 006761 тельно от примерно 200 до примерно 400 оснований и наиболее предпочтительно примерно 350 оснований.

Как также очевидно специалисту в данной области, последовательности 8ЕО ΙΌ N0:1, 2, 3, 4, 5 и 6 или их более длинные или короткие фрагменты, выведенные на основе информации о последовательности, с помощью методов, известных в данной области, можно изменять с помощью мутации, инсерции, делеции и/или замены одного или нескольких нуклеотидов или более длинных или более коротких фрагментов. Кроме того, немодифицированную или модифицированную нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению можно изменять путем перестройки последовательности по изобретению. Для оценки функциональной активности вариантов последовательностей ДНК по изобретению представляющую интерес последовательность функционально связывают с селектируемым маркерным геном или пригодным для скрининга маркерным геном и оценивают экспрессию маркерного гена путем анализов кратковременной экспрессии с использованием протопластов или стабильно трансформированных растений.

Как очевидно специалисту в данной области, последовательности ДНК, обладающие способностью обеспечивать экспрессию связанных с ними нуклеотидных последовательностей, функционируют различным образом. Так, уровни экспрессии при использовании более коротких фрагментов ДНК могут отличаться от уровней экспрессии, обеспечиваемых более длинным фрагментом, и могут отличаться друг от друга. Например, делеция обладающего понижающей регуляцией расположенного против хода транскрипции элемента может приводить к повышению уровней экспрессии связанной нуклеотидной последовательности, в то время как делеция обладающего повышающей регуляцией элемента может приводить к понижению уровней экспрессии связанной нуклеотидной последовательности. Как также очевидно специалисту в данной области, делеция специфичного для определенной стадии развития или тканеспецифичного элемента может приводить к изменению временного или пространственного профиля экспрессии связанной нуклеотидной последовательности.

Под объем настоящего изобретения подпадают также функциональные эквиваленты промоторов по настоящему изобретению, т. е. нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются в строгих условиях с любой из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:1, 8Е0 ΙΌ N0:2, 8Е0 ΙΌ N0:3, 8Е0 ΙΌ N0:4, 8Е0 ΙΌ N0:5 или 8Е0 ΙΌ N0:6, например, последовательности, представленные в 8Е0 ΙΌ N0:19 и 8Е0 ΙΌ N0:20. Гибридизацию в строгих условиях осуществляют при температуре 65°С, предпочтительно при 60°С и наиболее предпочтительно при 55 °С, в забуференном цитратом физиологическом растворе (880) двойной крепости (2Х), содержащем 0,1% ДСН, с последующей отмывкой подложки при такой же температуре, но с использованием буфера с пониженной концентрацией 88С. Такие буферы с пониженной концентрацией, как правило, представляют собой 88С 1/10 крепости (0,1Х88С), содержащий 0,1% ДСН, предпочтительно 0,2Х 88С, содержащий 0,1% ДСН и наиболее предпочтительно 88С половинной крепости (0,5Х88С), содержащий 0,1% ДСН. Фактически функциональные эквиваленты всего промотора первичного транскрипта СшУЪСУ или его части из других организмов можно создавать путем гибридизации любой из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:1, 8Е0 ΙΌ N0:2, 8Е0 ΙΌ N0:3, 8Е0 ΙΌ N0:4, 8Е0 ΙΌ N0:5, 8Е0 ΙΌ N0:6, 8Е0 ΙΌ N0:19 или 8Е0 ΙΌ N0:20 с геномной ДНК, выделенной из представляющего интерес организма, прежде всего другого представителя семейства СаиНтоуйнх. Специалисту в данной области известны методы, с помощью которых можно выявлять такие последовательности, поскольку существует много известных методик идентификации гомологичных последовательностей в других организмах. Такие вновь выявленные молекулы ДНК затем можно секвенировать и их последовательность сравнивать с любой из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:1, 8Е0 ΙΌ N0:2, 8Е0 ΙΌ N0:3, 8Е0 ΙΌ N0:4, 8Е0 ΙΌ N0:5, 8Е0 ΙΌ N0:6, 8Е0 ΙΌ N0:19 или 8Е0 ΙΌ N0:20 и оценивать промоторную активность. Под объем настоящего изобретения подпадают молекулы ДНК, последовательность которых по меньшей мере на 75%, предпочтительно на 80%, более предпочтительно на 90% и наиболее предпочтительно на 95% идентична любой из нуклеотидных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:1, 8Е0 ΙΌ N0:2, 8Е0 ΙΌ N0:3, 8Е0 ΙΌ N0:4 или 8Е0 ΙΌ N0:6 длиной по меньшей мере 50 нуклеотидов. Процент идентичности последовательностей определяют с использованием компьютерных программ, основанных на алгоритмах динамического программирования. Компьютерные программы, которые являются предпочтительными для применения в рамках настоящего изобретения, включают комплекс поисковых программ ВЬА8Т (Вайс Ьоса1 Айдитеи! 8сагс11 Тоо1), предназначенных для исследования любых доступных баз данных о последовательностях независимо от того, представляет ли собой рассматриваемая последовательность аминокислотную последовательность протеина или последовательность ДНК. Версию ВЬА8Т 2.0 (версия ВЬА8Т, в которой учитываются бреши) этого комплекса программ можно получить в Интернете (функционирующий в настоящее время сайт: 1Шр://\\л\лу.псЫ.п1т.ш11.до\7ВЕА8Т/). Этот комплекс программ основан на эвристическом алгоритме, предназначенном для локального поиска в отличие от алгоритмов глобального сравнения и поэтому позволяет устанавливать связь между последовательностями, имеющими только изолированные области. Баллы, получаемые с использованием поисковых программ ВБА8Т, хорошо поддаются статистической интерпретации. Для таких программ в качестве необязательных параметров предпочтительно использовать задаваемые по умолчанию параметры.

Еще одним объектом настоящего изобретения являются рекомбинантные молекулы ДНК, содер

- 7 006761 жащие последовательность ДНК по изобретению, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Представляющая интерес нуклеотидная последовательность может, например, кодировать рибосомную РНК, антисмысловую РНК или любой другой тип РНК, которые не транслируются с образованием протеина. Согласно другому предпочтительному объекту изобретения представляющая интерес нуклеотидная последовательность транслируется с образованием продуктапротеина. Нуклеотидная последовательность, связанная с промоторной последовательностью, может быть гомологичной или гетерологичной относительно подлежащего трансформации растения. Последовательность может также быть полностью или частично синтетической. Независимо от происхождения, связанная последовательность ДНК должна экспрессироваться в трансформированном растении в зависимости от экспрессионных свойств промотора, с которым она связана. В случае гомологичных нуклеотидных последовательностей, связанных с промоторной последовательностью, промотор по изобретению можно применять для эктопической экспрессии указанных гомологичных последовательностей. Понятие «эктопическая экспрессия» обозначает, что связанная с промотором нуклеотидная последовательность экспрессируется в тканях и органах и/или в моменты времени, в которых/когда она не может экспрессироваться под контролем собственного промотора. Согласно предпочтительному варианту осуществления экспрессия связанной с промотором нуклеотидной последовательности подавляет ее собственную экспрессию и экспрессию исходной копии гена путем процесса, называемого косупрессией.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения связанная нуклеотидная последовательность может кодировать протеин, экспрессия которого в растении должна происходить в любое время и в большинстве тканей и органов. Такие нуклеотидные последовательности предпочтительно кодируют протеины, обусловливающие требуемый фенотипический признак у трансформированных растений. Примерами являются нуклеотидные последовательности, кодирующие протеины, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, устойчивость к вирусам, устойчивость к насекомым, устойчивость к болезням или устойчивость к другим вредителям, толерантность к гербицидам, повышенную питательную ценность, улучшенные характеристики при промышленной переработке или измененную репродуктивную способность. Связанная нуклеотидная последовательность может также представлять собой последовательность, которую переносят в растения для получения в них ценных с коммерческой точки зрения ферментов или метаболитов. Под объем настоящего изобретения подпадают также селектируемые маркерные гены или пригодные для скрининга маркерные гены, т. е. гены, включающие последовательность ДНК по изобретению, функционально связанную с кодирующей областью, которая кодирует селектируемый признак или признак, который можно выявлять путем скрининга.

Примеры селектируемых маркерных геном или пригодных для скрининга маркерных генов описаны ниже. Для определенных видов-мишеней предпочтительными могут быть различные маркеры для селекции по признаку устойчивости к антибиотику или гербициду. Обычно применяемые для трансформации маркеры для селекции включают ген пр!11, который придает устойчивость к канамицину, паромомицину, генетицину и родственным антибиотикам (У1егга и Меккшд , Оепе, 19: 259-268 (1982); Веуап и др., №т.1ге 304: 184-187 (1983)), бактериальный ген аабЛ, который кодирует аминогликозид-3'аденилтрансферазу и обусловливает устойчивость к стрептомицину или спектиномицину (ОоИксйтМ!С1егшоп1 М., №с1. Асйк Век. 19: 4083-4089 (1991)), ген Ιιρίι. который придает устойчивость к антибиотику гигромицину (В1осЫпдег и П1дде1тапп, Мо1. Се11 Вю1., 4: 2929-2931, 1984)), и ген 4Ыг, который придает устойчивость к метотрексату (Воигошк и др., ЕМВО 1., 2(7): 1099-1104 (1983)). Другие маркеры, которые можно использовать, включают ген фосфинотрицин-ацетилтрансферазы, обусловливающий устойчивость к гербициду фосфинотрицину (^Ы1е и др., №с1. Астбк Век. 18: 1062 (1990); 8репсег и др., Тйеог. Арр1. Оепе!. 79: 625-631 (1990)), мутантный ген ЕР8Р-синтазы, кодирующий устойчивость к глифосату (Нтсйее и др., Вю/Тесйпо1оду 6: 915-922 (1988)), мутантный ген ацетолактатсинтазы (АЬ8), обусловливающий устойчивость к имидазолиону или сульфонилмочевине (Ьее и др., ЕМВО 1., 7: 1241-1248 (1988)), мутантный ген ркЬА, обусловливающий устойчивость к атразину (8теба и др., Р1ап! Рйукю1. 103: 911-917 (1993)), или мутантный ген протопорфириногеноксидазы, описанный в ЕР 769059. Идентификацию трансформированных клеток можно осуществлять также с помощью экспрессии пригодных для скрининга маркерных генов, таких как гены, кодирующие хлорамфениколацетилтрансферазу (САТ), □ глюкуронидазу (ОИ8), люциферазу и зеленый флуоресцентный протеин (СЕР) или любой другой протеин, обусловливающий фенотипически различимый признак у трансформированных клеток. Можно применять также маркеры для селекции, позволяющие осуществлять позитивный отбор, такие как ген фосфоманнозо-изомеразы, описанный в заявке на патент \УО 93/05163. Другие гены, которые можно применять для позитивного отбора, описаны в XVО 94/20627, они кодируют ксило-изомеразы и фосфоманноизомеразы, такие как маннозо-6-фосфат-изомераза и маннозо-1-фосфат-изомераза; фосфоманномутазу; маннозо-эпимеразы, которые превращают углеводы в маннозу или маннозу в углеводы, такие как глюкоза или галактоза; фосфатазы, такие как маннозо- или ксилозо-фосфатаза, маннозо-6-фосфатаза и маннозо-1-фосфатаза, и пермеазы, которые участвуют в транспорте маннозы, или их производные или предшественники в клетке. Агент, который может снизить токсичность соединения в клетках, как правило, является производным глюкозы, таким как метил-3-О-глюкоза или флоридзин. При их применении трансформированные клетки выявляют, не повреждая или уничтожая при этом нетрансформированные клетки

- 8 006761 в популяции, и без одновременной интродукции генов, обусловливающих устойчивость к антибиотикам или гербицидам. Как описано в \νϋ 93/05163, помимо того, что устраняется необходимость в генах, обусловливающих устойчивость к антибиотикам или гербицидам, было установлено, что метод позитивного отбора часто является существенно более эффективным, чем традиционный метод негативного отбора.

Таким образом, промоторы по настоящему изобретению предпочтительно функционально связывают с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует протеин, включающей область, которая: (а) кодирует протеин, участвующий в метаболизме соединения, и/или (б) регулирует активность гена, кодирующего протеин, где соединение представляет собой маннозу или ксилозу или их производное или предшественник или субстрат протеина, или оно в результате метаболизма трансформированными клетками может превращаться в такой субстрат. Указанная нуклеотидная последовательность может кодировать маннозо-6-фосфат-изомеразу и соединение может представлять собой маннозу. В другом варианте нуклеотидная последовательность кодирует фосфосахароизомеразу, фосфосахаромутазу, такую как фосфоманномутаза, фосфатазу, такую как маннозо-6-фосфатаза, сахароэпимеразу, сахаропермеазу, фосфосахаропермеазу или ксилозо-изомеразу, а соединение может представлять собой маннозу, маннозо-6фосфат, Ό-маннозеамин или ксилозу.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения промоторы по изобретению функционально связывают с кодирующей областью гена тапА Е. сой ЦоегаЬо и 0ккек, Р1ап1 Се11 Рсрой8, 16: 219-221 (1996), Ыедтойо и др. Р1ап1 Се11 ВерогК 19: 798-803 (2000)), кодирующей фосфоманнозо-изомеразу (РМ1), и терминатором Ыок (нопалин-синтетаза), полученным из Т-ДНК АдгоЬас1етшт !итеГааещ (Оер1скег и др., 1. Мо1. Арр1. Сеиег. ,1 (6), 561-573 (1982)). Специалисту в данной области известно, что терминатор Ыоз можно заменять любым другим терминатором, функционирующим в растениях. Промотор по изобретению может представлять собой СтрО, СтрС, Стр8, СтрЬ, СтрВ, СтрА, СтрЕ или СтрЕ, которые представлены в 8ЕО ГО N0:1-6 и 19-20, или любой другой выведенный из них промотор. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления промотор представляет собой промотор Стр8, приведенный в 8ЕО ГО N0:3.

Промоторы по настоящему изобретению можно применять для придания устойчивости или толерантности к вирусам путем функционального связывания промоторов по изобретению с кодирующими областями генов вирусов, подлежащих уничтожению.

Для борьбы с вирусами можно использовать отрицательную цепь вирусов, таких как вирус пятнистого увядания томатов (Т8ТСУ), последовательности генов вирусного нуклеокапсидного протеина (ΝΡ), протеина, обеспечивающего движение вируса (МР), а для вирусов, принадлежащих к альфа-подобной супергруппе вирусов, таких как ТМУ (вирус табачной мозаики) и СМУ (вирус огуречной мозаики), можно применять последовательности генов РНК-зависимой РНК-полимеразы (РзРп) и гена протеина, обеспечивающего движение вируса (МР). Для вирусов, принадлежащих к Рюогпа-подобной супергруппе вирусов, включая потивирусы, любую последовательность вируса можно связывать с промоторами по изобретению. Наконец, для всех других вирусов, включая ДНКовые вирусы, можно применять последовательности генов РНК-зависимой РНК-полимеразы (РзРп) или связанные с репликазой последовательности генов. Примеры таких конструкций, предназначенных для борьбы с вирусами, приведены в примере 8 и примере 9 ν0 00/68374. Специалисту в данной области должно быть очевидно, как заменять промоторы, описанные в ν0 00/68374, на промоторы по настоящему изобретению. На основе сведений, приведенных в ν0 00/68374, специалисту в данной области также должно быть ясно, как создавать конструкции, включающие промоторы по изобретению, функционально связанные с указанными выше вирусными последовательностями с целью придания устойчивости или толерантности к этим вирусам.

Вместо экспрессии в трансгенных растениях двухцепочечной вирусной РНК, что описано в ν0 00/68374, вирусную РНК можно также экспрессировать в виде конструкции: нетранслируемая РНК плюс молекула смысловой вирусной РНК, как это описано, например, в патенте США 558302 или в примерах 12 и 13 настоящего описания.

Еще одним объектом изобретения являются рекомбинантные экспрессионные векторы, содержащие последовательность ДНК по изобретению, слитую со связанной с ней представляющей интерес последовательностью. В этих векторах чужеродную ДНК можно встраивать в область полилинкера таким образом, чтобы эти экзогенные последовательности можно было экспрессировать в приемлемой клеткехозяине, которая например, может иметь бактериальное или растительное происхождение. Например, плазмида рВ1101, выведенная из бинарного вектора АдгоЬас1епит ШтеГааепсе рВГО19, позволяет клонировать и тестировать промоторы с помощью сигнала экспрессии бета-глюкуронидазы (СИ8) (1еГГег5оп и др., ЕМВ0 1., и др., 6: 3901-3907 (1987)). Размер вектора составляет 12,2 т.п.н. Он включает сайт инициации репликации плазмиды с малым количеством копий РК2 и обусловливает устойчивость к канамицину как у бактерий, так и у растений. Специалисту в данной области известны многочисленные другие экспрессионные векторы, которые можно применять согласно изобретению.

Еще одним объектом настоящего изобретения являются трансгенные растения, содержащие рекомбинантные последовательности ДНК по изобретению. Изобретение относится также к растительным клеткам, растениям, полученным из таких клеток, растительному материалу, потомству и семенам, полученным от таких растений, и к сельскохозяйственным продуктам, отличающимся улучшенными свойст

- 9 006761 вами, которые получают с помощью любого из описанных ниже методов трансформации. Растения, трансформированные согласно изобретению, могут представлять собой однодольные или двудольные растения и включают (но не ограничиваясь ими) рис, кукурузу, пшеницу, ячмень, рожь, сладкий картофель, сахарную кукурузу, бобы, горох, цикорий, салат, капусту, цветную капусту, брокколи, турнепс, редис, шпинат, спаржу, лук, чеснок, перец, сельдерей, тыкву крупноплодную, тыкву пепо, коноплю, цуккини, яблоню, грушу, айву, дыню, сливу, вишню, персик, нектарин, абрикос, землянику, виноград, малину, ежевику, ананас, авокадо, папайю, манго, банан, сою, томаты, сорго, сахарный тростник, сахарную свеклу, подсолнечник, рапс, клевер, табак, морковь, хлопчатник, люцерну, картофель, баклажан, огурец, АгаЬ14орз1з Факапа и древесные растения, такие как хвойные и лиственные деревья. Предпочтительными подлежащими трансформации растениями являются рис, кукуруза, пшеница, ячмень, капуста, цветная капуста, перец, тыква крупноплодная, дыня, соя, томаты, сахарная свекла, подсолнечник или хлопчатник, и особенно предпочтительно рис, кукуруза, пшеница, 8огдЬит Ысо1ог, ежа сборная, сахарная свекла и соя. Рекомбинантные последовательности ДНК по изобретению можно интродуцировать в растительную клетку многочисленными известными в данной области путями. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что выбор метода должен зависеть от типа подлежащего трансформации растения (т.е. однодольного или двудольного). Пригодные методы трансформации растительных клеток включают микроинъекцию (Сгозз^ау и др., ВюТес11пк.|иез 4: 320-334 (1986)), электропорацию (Кгддз и др., Ргос. №111. Лсаб. δα, И8А 83:5602-5606 (1986)), опосредуемую АдгоЬас1егшт трансформацию (ΗίηсЬее и др., Вю1есЬпо1о§у 6: 915-921 (1988); ЕР 0853675), непосредственный перенос гена (Разхко\\'зк1 и др., ЕМВ0 1. 3: 2717-2122 (1984)), и метод баллистического ускорения частиц с использованием устройств, выпускаемых фирмами ЛдгасеШз, 1пс., Мэдисон, штат Висконсин и Эироп!. 1пс., Вилмингтон, штат Делавар (см., например, патент США 4945050; и МсСаЬе и др., Вю1есЬпо1о§у 6: 923-926 (1988)). Подлежащие трансформации клетки могут представлять собой дифференцированные клетки листьев, эмбриогенные клетки или любые другие типы клеток. При непосредственной трансформации протопластов поглощение экзогенного генетического материала в протопласт можно увеличить с помощью химического агента или электрического поля. Экзогенный материал затем может интегрироваться в ядерный геном. В предыдущих исследованиях использовали двудольное растение - табак, для этих растений установлено, что чужеродная ДНК включается в геном и переносится в потомство растений (Разхко\\'зк1 и др., ЕМВ0 I. 3:2712-2722 (1984); РоНукиз и др., Мо1. Пеп. Пепе! 199:169-177 (1985)). С помощью этой процедуры можно трансформировать протопласты таких однодольных растений, например, как Тпйсит топососсит, Ьо1шт тиШПогит (итальянская рожь), кукуруза и черная мексиканская сахарная кукуруза. Еще одним предпочтительным вариантом является способ трансформации кукурузы, описанный в ЕР 0292435, а также в ЕР 0846771. Методы трансформации кукурузы описаны также у 1<о/1е1 и др., Вю/ТесЬпо1о§у 11:194-200 (1993). Трансформацию риса можно осуществлять с помощью методов прямого переноса генов с использованием протопластов или бомбардировки частицами. Опосредуемая протопластом трансформация описана для японских и индийских типов риса (Ζΐκπίβ и др., Р1ап! Се11 Вер., 7:379-384 (1988); 81нтато1о и др., №11иге 338:274-276 (1989); ЭаПа и др., Вю/ТесЬпо1о§у 8:736-740 (1990)). Оба указанных выше типа риса, как правило, можно трансформировать бомбардировкой частицами (СЬпзЮи и др., Вю/ТесЬпо1о§у 9:957-962 (1991)). В ЕР 033281 описаны методы получения, трансформации и регенерации протопластов РооНеае. С помощью этих методов можно трансформировать всех представителей РооИеае, включая Эас1у11з и пшеницу. Методы трансформации пшеницы описаны также в ЕР 0674715; и у ХУеекз и др., (Р1ап! РЬузю1. 102:1077-1084 (1993)). Сконструированные таким образом растительные экспрессионные векторы можно применять, например, для трансформации с помощью общепринятых методов каллюсов риса и тем самым индуцировать дифференциацию корней и листьев и после этого переносить в цветочные горшки, получая трансформированные растения риса.

В растениях, полученных в результате трансформации с помощью последовательностей ДНК или векторов по настоящему изобретению, экспрессия представляющей интерес нуклеотидной последовательности должна происходить во всем растении и в большинстве его тканей и органов.

Генетические особенности, сконструированные в описанных выше трансгенных растениях, передаются с помощью полового размножения или вегетативного роста и, таким образом, могут сохраняться и передаваться по наследству потомству растений. Обычно указанное сохранение и передачу потомству осуществляют с использованием известных сельскохозяйственных методов, разработанных для конкретных целей, таких как обработка почвы, посев или сбор урожая. Также можно применять специализированные методы, такие как гидропоника или выращивание в закрытом грунте. Кроме того, дающие преимущества генетические особенности трансгенных растений по изобретению можно использовать при селекции растений с целью выведения растений с улучшенными свойствами, такими как толерантность к вредителям, гербицидам или стрессу, с улучшенной питательной ценностью, повышенной урожайностью или улучшенным строением, способствующим уменьшению потерь от полегания или осыпания. Для различных стадий селекции характерно целенаправленное вмешательство человека, такое как отбор линий, подлежащих скрещиванию, непосредственное опыление родительских линий или отбор соответствующего потомства растений. В зависимости от требуемых свойств выбирают различные методы селекции. Соответствующие методы хорошо известны в данной области и включают (но не ограничиваясь ими)

- 10 006761 гибридизацию, инбридинг, возвратное скрещивание, многолинейное скрещивание, смешивание сортов, межвидовую гибридизацию, методы анэуплодии и т.д. Методы гибридизации также включают стерилизацию растений с целью получения мужских или женских стерильных растений с помощью механических, химических или биохимических способов. Перекрестное опыление мужского стерильного растения пыльцой различных линий гарантирует, что геном мужского стерильного, но фертильного женского растения будет равным образом приобретать свойства обеих родительских линий. Таким образом, трансгенные растения по настоящему изобретению можно применять для селекции улучшенных линий растений, что, например, позволяет увеличить эффективность обычных методов, таких как обработка гербицидом или пестицидом, или дает возможность обойтись без этих методов благодаря модифицированным генетическим особенностям этих растений. Кроме того, можно получать новые культурные растения с улучшенной толерантностью к стрессу благодаря оптимизации генетического аппарата, что позволяет получать урожай продуктов лучшего качества по сравнению с продуктами, полученными от растений, которые не обладают способностью сопротивляться аналогичным вредным условиям в процессе их развития.

И еще одним объектом настоящего изобретения являются последовательности ДНК, которые можно применять для экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности в требуемом организме. Этот организм может представлять собой бактерию, растение или любой другой представляющий интерес организм.

Кроме того, описание 8ЕО ГО N0:1-6 дает возможность специалистам в данной области создавать олигонуклеотиды для полимеразных цепных реакций, которые могут обеспечивать амплификацию фрагментов ДНК при использовании в качестве матриц последовательности нуклеотидов, характеризующейся наличием любой из непрерывных последовательностей, включающих 15 и предпочтительно 20 - 30 или более пар оснований 8Е0 ГО Νο: 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Такие нуклеотиды представляют собой последовательность нуклеотидов, состоящую из 15 и предпочтительно 20 - 30 или более пар оснований 8Е0 ГО Νο:1, 2, 3, 4, 5 или 6. Полимеразные цепные реакции осуществляют с использованием по меньшей мере одного такого олигонуклеотида, полученный в результате продукт амплификации является еще одним объектом настоящего изобретения.

Краткое описание последовательностей, приведенных в перечне последовательностей

8ЕЕ) ГО N0:1 СтрЭ

8ЕЕ) ГО N0:2 СтрС

8ЕЕ) ГО N0:3 Стр8

8ЕЕ) ГО N0:4 СтрЬ

8ЕЕ) ГО N0:5 СтрВ

8ЕЕ) ГО N0:6 СтрА

8Е0 ГО N0:7 прямой праймер 81

8Е0 ГО N0:8 обратный праймер 82

8Е0 ГО N0:9 прямой праймер 0И8

8Е0 ГО N0: 10 обратный праймер 0И8

8Е0 ГО N0: 11 прямой праймер САТ

8Е0 ГО N0: 12 обратный праймер САТ

8Е0 ГО N0:13 прямой праймер Стр1

8Е0 ГО N0:14 обратный праймер СтрС2

8Е0 ГО N0: 15 обратный праймер Стр82

8Е0 ГО N0:16 обратный праймер СтрЬ2

8Е0 ГО N0: 17 прямой праймер РА

8Е0 ГО N0: 18 обратный праймер РА

8ЕЕ) ГО N0:19 СтрЕ

8ЕЕ) ГО N0:20 СтрЕ

8Е0 ГО N0:21 прямой праймер терминатора N08

8Е0 ГО N0:22 обратный праймер терминатора N08

8Е0 ГО N0:23 прямой праймер гена № Т8\УУ

8Е0 ГО N0:24 обратный праймер гена № Т8\УУ

8Е0 ГО N0:25 прямой праймер промотора СтУЪСУ

8Е0 ГО N0:26 обратный праймер промотора СтУЪСУ

8Е0 ГО N0:27 сайт множественного клонирования АСЪЕЛК

8Е0 ГО N0:28 сайт множественного клонирования ВЮЪШК

8Е0 ГО N0:29 праймер СтрЕ-В

8ЕЕ) ГО N0:30 праймер Стр8-В 8ЕЕ) ГО N0:31

8Е0 ГО N0:31 рN0У2804; бинарный вектор, содержащий лишенную промотора кассету экспрессии ΡΜΙ-терминатор поз

8Е0 ГО N0:32 рN0У3604; вектор для биобаллистической трансформации, содержащий лишенную промотора кассету экспрессии ΡΜΙ-терминатор поз

- 11 006761

8ЕЦ ΙΌ N0:33 обратный праймер СтрМг

8ЕЦ ΙΌ N0:34 прямой праймер СтрМЕ

8ЕЦ ΙΌ N0:35 обратный праймер СтрМгк

8ЕЦ ΙΌ N0:36 прямой праймер СтрМй

8ЕЦ ΙΌ N0:37 δνηΟΕΡΙ: оптимизированный для применения в растениях ген СЕР с интроном

8ЕЦ ΙΌ N0:38 СЮ; ген СИ8 с интроном

8ЕС ΙΌ N0:39 обратный праймер Стр-С

8ЕС ΙΌ N0:40 кассета экспрессии Стр8-8уηСΕРI-ηо8

8ЕС ΙΌ N0:41 кассета экспрессии Стр8-СЮ-по§

8ЕС ΙΌ N0:42 кассета экспрессии СтрС-купСЕРЕпок

8ЕС ΙΌ N0:43 кассета экспрессии СтрС-СЮ-пок

8ЕС ΙΌ N0:44 вектор рЫ0У21Г7

8ЕС ΙΌ N0:45 вектор рЫ0У4200

8ЕС ΙΌ N0:46 кассета экспрессии 2тИЫ-СЕР-358 1сгт

8ЕС ΙΌ N0:47 кассета экспрессии 2тиЫ-СЮ-по5

8ЕС ΙΌ N0:48 кассета экспрессии υЬ^3(Αΐ)-8уηСΕРI-ηо8

8ЕС ΙΌ N0:49 кассета экспрессии иЬс|3(А1)-СЮ-по5

Примеры

В настоящем описании применяли стандартные методы рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования, хорошо известные в данной области и изложенные, например, у 8атЬгоок и др. Мо1еси1аг С1ошпд, Со1б 8ргтд НагЬог, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬогаФгу Рге§8, ИУ, 1989 и у Ан5нЬе1 и др. Сштеп! ргоЮсок ίη то1еси1аг Ью1оду, 1о1т \УПеу апб 8оп§, №\ν Уогк, 1994.

Пример 1. Клонирование вирусов.

1. Экстракция ДНК.

Вирусную геномную ДНК экстрагируют из зараженных вирусом желтого скручивания листьев цестровых растений СеЧгит рагс.|т. Пять граммов зараженных листьев гомогенизируют в 30 мл буфера для измельчения (0,2М Трис, рН 7,0, 0,02М ЭДТК, 2М мочевина) в течение 60 с при максимальной скорости в гомогенизаторе типа Вгтктап Ро1у1гоп с использованием в качестве зонда РТ10 и осторожно встряхивают при 4°С в течение ночи в присутствии Тгбоп Х-100 (конечная концентрация 2%). Вирус выделяют из неочищенного гомогената с помощью центрифугирования при низкой скорости вращения (10000 об/мин в течение 20 мин в роторе типа 8огуа11 88-34 ), и далее из полученного супернатанта с помощью центрифугирования при высокой скорости вращения (27000 об/мин в течение 2 ч в роторе типа Весктап 8\У-28 ) в градиенте сахарозы (3 мл 15%-ной сахарозы). Затем содержащий вирус дебрис ресуспендируют в 0,1М Трис, рН 7,4, 2,5мМ МдС1₂. Добавляют ДНКазу Ι (фирма 81дта) и РНКазу А (фирма 81дта) до концентрации 10 мг/мл каждой. После инкубации в течение 30 мин при 37°С реакцию прекращают, добавляя ЭДТК до концентрации 10мМ. Вирусную ДНК выделяют из содержащих СтУЕСУ частиц с помощью обработки протеазой К (фирма Е. Мегск, конечная концентрация 0,5 мг/мл) в присутствии 1% ДСН при 65°С в течение 15 мин. Затем вирусную ДНК очищают экстракцией фенолом и осаждением этанолом. Вирусную ДНК, содержащуюся в конечном осадке, полученную путем осаждения этанолом, растворяют в воде.

2. Амплификация и клонирование ДНК.

100 нг полученной ДНК используют в качестве матрицы для ПЦР-амплификации в 50 мкл реакционной смеси, содержащей по 10мкМ каждого праймера, 25мМ каждого дНТФ, 5 мкл реакционного буфера РЕи (фирма 81га1адепе) и 2,5 ед. ДНК-полимеразы РЕи 1игЬо (фирма 81га1адепе). Для ПЦР используют прямой праймер 81 (дассасаааса1садаад, 8ЕЦ ΙΌ N0:7) и обратный праймер 82 (сааасбайддд1аа1:с, 8ЕЦ ΙΌ N0:8). ПЦР осуществляют с использованием следующих циклов: 1х (94°С в течение 1 мин); 30х (94°С в течение 1 мин, 50°С в течение 1 мин, 72°С в течение 1 мин); 1х (72°С в течение 10 мин). Каждый отдельный фрагмент ДНК клонируют в плазмиде рРСР-8спр1 Атр 8К(+) (фирма 81га1адепе) согласно инструкциям производителя.

Пример 2. Секвенирование ДНК.

Секвенирование ДНК вирусных клонов осуществляют с помощью автоматического секвенатора ДНК типа ΑΒΙ ΕΡΙ8Μ 377 (фирма Регкт Е1тег) и набора для циклического секвенирования терминатора типа ΑΒΙ РК18М бРНобатте (фирма Регкт Е1тег) согласно инструкциям производителя. Для реакций секвенирования используют описанные выше праймер 81 и праймер 82 (пример 1), а также универсальный праймер М13-20 и обратные праймеры.

Пример 3. Конструирование плазмид для кратковременной экспрессии.

Все ПЦР осуществляют с использованием полимеразы РЕи (фирма 81га1адепе), согласно методу, описанному в примере 1.

1. Амплификация репортерных генов.

Амплифицируют репортерные гены бета-глюкуронидазы (СИ8) и хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ). Для амплификации гена СИ8 используют прямой олигонуклеотидный СИ8

- 12 006761 праймер (саддд1ассас!аааа1сасс, 8Е0 ΙΌ N0:9) и обратный олигонуклеотидный 0И8-праймер (адддда!ссссаайсссс, 8Е0 ΙΌ N0:10) при температуре отжига 60°С. Прямой олигонуклеотидный САТпраймер (адддд1асса!сда1а1ддад, 8Е0 ΙΌ N0:11) и обратный олигонуклеотидный САТ-праймер (йадда1ссдссс1дссас. 8Е0 ΙΌ N0: 12) отжигают при 62°С. Прямые праймеры создают так, чтобы они включали сайт, распознаваемый Крп!, а обратные - сайт, распознаваемый ВатШ .

2. Амплификация промотора СтУЪСУ.

Для исследования выбирают три различных промоторных фрагмента, т.е. СтрС (8Е0 ΙΌ N0:2), Стр8 (8Е0 ΙΌ N0:3) и СтрЪ (8Е0 ΙΌ N0:4). Прямой праймер Стр1 (сйс1адасааад£ддсадас, 8Е0 ΙΌ N0:13) используют во всех трех случаях для амплификации при температуре отжига 52°С. Он отличается (выделено жирным шрифтом) от исходной последовательности наличием сайта, распознаваемого ХЬаЕ Обратный праймер СтрС2 (йдд!ассйаасаа!даддд, 8Е0 ΙΌ N0:14) применяют для амплификации СтрС-фрагмента, а обратный праймер Стр82 (с!асйс1адд1ассйдс1с, 8Е0 ΙΌ N0:15) применяют для амплификации Стр8-фрагмента. Оба эти праймеры модифицированы и отличаются наличием сайта, распознаваемого Крик Обратный праймер СтрЪ2 (йдд!ассйаасаа1даддд, 8Е0 ΙΌ N0:16) используют для амплификации СтрЪ-фрагмента, и он модифицирован и отличается наличием сайта рестирикции С1аЕ

3. Амплификация сигнала полиаденилирования.

Фрагменты сигнала полиаденилирования амплифицируют из клона, зараженного вирусом мозаики цветной капусты (СаМУ) (Егапск и др., Се11 21 (1), 285-294 (1980)). Для ПЦР-амплификации используют прямой олигонуклеотидный праймер РА (ро1уайепу1айоп 81дпа1 атрШлсайоп-амплификация сигнала полиаденилирования) (дддда1ссссад1с!с1с1с, 8Е0 ΙΌ N0:17) и обратный олигонуклеотидный праймер РА (д!даайсдадс1сдд1а, 8Е0 ΙΌ N0:18), и отжиг производят при температуре 60°С. Прямой праймер создают так, чтобы он включал сайт, распознаваемый ВатШ, а обратный - сайт ЕсоКЪ

4. Полученные конструкции.

рСтрСО (промоторный фрагмент СтрС + ген 0И8 + ро1уА) рСтр80 (промоторный фрагмент Стр8 + ген 0И8 + ро1уА) рСтрСС (промоторный фрагмент СтрС + ген САТ + ро1уА) рСтр8С (промоторный фрагмент Стр8 + ген САТ + ро1у А) рСтрЪС (промоторный фрагмент СтрЪ + ген САТ + ро1у А)

Кассеты, содержащие промоторный фрагмент, репортерные гены и сигнал полиаденилирования, встраивают в вектор рИС19 (фирма 81га!адепе), расщепленный с помощью XЬаI и ЕсоКЪ

5. Конструкции, применяемые для сравнительного анализа рСарО (промоторный фрагмент Сар + ген 0И8 + ро1у А) рСар80 (промоторный фрагмент Сар8 + ген 0И8 + ро1уА) рСарС (промоторный фрагмент Сар + ген САТ + ро1уА).

Содержащие эти конструкции промоторные фрагменты получают из СаМУ (Егапск и др., Се11 21 (1), 285-294 (1980), см. регистрационный номер ОепВапк У00141). Фрагменты 6И8, САТ и ро1уА идентичны фрагментам, применяемым для СтУЪСУ-конструкций. Сар соответствует фрагменту, простирающемуся от основания -227 до основания + 33 ТАТА-бокса (основания 7175-7438 генома СаМУ, см. регистрационный номер ОепВапк У00141), а Сар8 соответствует фрагменту, простирающемуся от основания -227 до основания + 82 ТАТА-бокса (основания 7175-7486 генома СаМУ, см. регистрационный номер ОепВапк У00141). Эти положения примерно соответствуют положениям, выбранным для СтУЪСУ-фрагментов.

Пример 4. Эксперименты по кратковременной экспрессии.

1. Получение суспензионных культур и протопластов.

0гусйорйгадти8 ую1асеи§.

Суспензионные культуры поддерживают в 40 мл М8-среды (МигакЫде и 8коод, Рйу8ю1 Р1ап1 15, 474-497 (1962)), включающей 100 мг/мл инозита, 2% сахарозы и 0,1 мг/мл 2,4-Д. Протопласты выделяют из 4-5-дневных культур. Клеточные стенки расщепляют, выдерживая при 26°С в течение 1 ч в смеси, содержащей 0,1% пектолиазы Υ23 (фирма 8еЫип Рйагтасеийса1 Со., Япония), 1% целлюлазы 0похика К10 (фирма ΥакиЙ Нотка Со., Япония), 0,4М Ό-маннит и 0,1% МЕ8, рН 5,5. Протопласты фильтруют через сито с размером пор 50 мкм и дважды промывают раствором для электропорации (ЭП) (10мМ НЕРЕ8, 150мМ №С1, 5мМ СаС1₂, 0,2М маннит, рН 7,1).

Мсойапа р1итЬад1ш£о11а.

Растения поддерживают в асептических условиях в среде КРМ2 (В1оп51ет и др., Мо1 Оеп Сепе1 211, 252-259 (1988)), дополненной 7 г/л бакто-агара, рН 5,6. Для получения протопластов отрезают листья и инкубируют в течение ночи при 26°С в растворе, содержащем 0,5% дризелазы (фирма Ийка), 0,25мМ ПВП 10 (поливинилпирролидон ММ 10000), 3,85мМ СаС1₂, 6 мг/л НУК (нафталинуксусная кислота), 2 мг/л ВАР (щелочная фосфатаза бактерий) и 0,5М сахарозу, рН 5,7. Протопласты фильтруют через сито с размером пор 100 мкм. Для осуществления первой стадии очистки к протопластам добавляют раствор сахарозы (0,6М сахароза, 0,1% МЕ8 и 15мМ СаС1₂, рН 5,7) и суспензию дополняют №5-раствором (150 мМ №С1, 125мМ СаС1₂, 5мМ КС1, 6мМ глюкоза; Мепсхе1 и др., Тйеог Арр1 Сене! 59, 191-195 (1981). Затем протопласты однократно промывают №5-раствором и, наконец, ЭП-раствором.

- 13 006761

Огуха кайуа.

Протопласты получают из суспензионной культуры морфогенетического риса, созданной из О. кайуа су. МрропЬаге согласно известному методу (Иайа и др., Вю/Тесйпо1оду 8:736-740 (1990)).

2. Эксперимент по кратковременной экспрессии.

Трансфекцию с помощью электропорации 2х10⁶ протопластов Огусйорйгадтик ую1асеик в 0,66 мл ЭП-буфера осуществляют путем разряда конденсатора емкостью 960 мкФ через слой суспензии протопластов толщиной 4 мм. Конденсатор заряжают при напряжении 450 В. Электропорацию осуществляют в присутствии 5-10 мкг плазмидной ДНК, затем протопласты культивируют в течение 16-24 ч при 25°С. Трансфекцию 2х10⁶ протопластов Мсойапа р1итЬадшИойа в 0,3 мл суспензии осуществляют в присутствии 0,3 мл ПЭГ (40% полиэтиленгликоль 6000) и 5-10 мкг плазмидной ДНК. Протопласты культивируют в 0,4 мл КЗ-среды (6ойа11 и др., Ме1йойк Епхуто1 181, 148-161 (1990)) в течение 16-24 ч при 25°С и дополняют 10 мл ^5-буфера перед сбором. Протеиновые экстракты получают с помощью по меньшей мере трех циклов замораживания и оттаивания и осветляют центрифугированием.

Пример 5. Анализы САТ и Ουδ.

Для обнаружения экспрессии гена САТ используют двойной иммуносэндвич (ПА8)-ЕЫ8А и набор САТ ЕЫ8А (фирма Воейппдег) согласно инструкциям производителя. Активность САТ оценивают с помощью устройства типа Эупех ΜΚΧΙΙ. Для осуществления анализа активности Ουδ образцы растворяют в Ουδ-буфере (0,05М NаΡО₄, рН 7, 0,01М ЭДТК, 0,1% Тгйоп-Х-100, 0,1% саркозила). Реакцию осуществляют в присутствии равного количества реакционного Ουδ-буфера (100 мл/л 10х Ουδ-буфера, 200 мг/л БСА, 705 мг/л 4-метилумбеллиферилглюкуронида) при 37°С и прекращают, добавляя 2М аммедиол. Для оценки активности используют устройство типа Тйейек Ииогоккап II.

Результаты по оценки активности САТ и Ουδ нормализуют по отношению к соответствующему значению для стандартного клона. Результаты, полученные в 10 различных экспериментах, свидетельствуют о том, что различные промоторные фрагменты СтΥ^СV обладают высокой промоторной активностью.

Кратковременная экспрессия в протопластах Ν. р1итЬад1ш£ойа Репортерный ген Ουδ______

СтрСО	100
СтрЗС	86,9	+/-20%
СарС	9	+/-20%
Сар8С	38,9	+/-15%

Репортерный ген СЛТ

СтрСС	100
СтрЗС	78	+/-20%
СарЗС	89,5	+/-15%
СтрЬС	9	+/-20%

Кратковременная экспрессия в протопластах О.ую1асеи8 Репортерный ген Ουδ

СтрСС	100
Стр8С	84,6	+/-15%
СарО	9,6	+/-15%
СарБС	40,7	+/-15%

Репортерный ген САТ

СтрСС	100
СтрЗС	255	+/-20%
СарЗС	546	+/-15%
СтрЬС	10	+/-20%

- 14 006761

Кратковременная экспрессия в протопластах О. 8айуа Репортерный ген СИ8

СшрСС	100
Стр8С	84,6	+/-15%
СарС	9,6	+/-15%
Сар8С	40,7	+/-15Т0

Пример 6. Приготовление растворов и сред для регенерации и трансформации растений.

Культуральные среды СМ, С1М и 8ΙΜ представляют собой среды, описанные у УаВекепз и др. (Ргос. №111. Асай. 8с1. И8Л. 85: 5536-5540 (1988)). Культуральная среда СМ содержит минеральные соли Мурасига и Скуга (Мигазй1де и 8коод , Рйузю1. Р1ап1. 15:473-497 (1962)), 1,0 мг/л тиамина (маточный раствор, 1 мг/мл), 0,5 мг/л пиридоксин -НС1 (маточный раствор, 1 мг/мл), 0,5 мг/л никотиновой кислоты (маточный раствор, 1 мг/мл), 0,5 г/л 2-(Ы-морфолино)этансульфоновой кислоты (МЕ8), 10 г/л сахарозы, 8 г/л агара, значение рН доводят до 5,8 с помощью 1н. КОН. Среда С1М содержит минеральные соли и витамины В5-среды (СатЬогд и др., Ехр. Се11 Вез. 50:151-158 (1968)), 0,5 г/л 2-(Ы-морфолино) этансульфоновой кислоты (МЕ8), 20 г/л глюкозы, 0,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) (маточный раствор, 10 мг/мл в ДМСО), 0,05 мг/л кинетина (маточный раствор, 5 мг/мл в ДМСО), рН 5,8. Твердая С1М-среда содержит 8 г/л агара. Среда 81М содержит минеральные соли и витамины В5-среды (СатЬогд и др., выше), 0,5 г/л 2-(Ы-морфолино)этансульфоновой кислоты (МЕ8), 20 г/л глюкозы, 5 мг/л Ы6-(2-изопентенил)аденина (21Р) (маточный раствор, 20 мг/мл в ДМСО), 0,15 мг/л индол-3-уксусной кислоты (ИУК) (маточный раствор, 1,5 мг/мл в ДМСО), 8 г/л агара, рН 5,8. Среда 81М У750 К100 представляет собой 81М-среду, дополненную 750 мг/л ванкомицина и 100 мг/л канамицина. Среда 81М У500 К100 представляет собой 81М-среду, дополненную 500 мг/л ванкомицина и 100 мг/л канамицина. Среда СМ К50 представляет собой СМ-среду, дополненную 50 мг/л канамицина.

Все культуральные среды стерилизуют автоклавированием (20 мин, 121^о С). Витамины растворяют в воде и добавляют к средам перед автоклавированием. Гормоны растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО). Антибиотики растворяют в воде и стерилизуют фильтрацией (0,22 мкм). Гормоны и антибиотики добавляют после автоклавирования и охлаждения сред до 65^оС. Во всех случаях используют 9сантиметровые чашки Петри (фирма Га1соп, 3003) за исключением сред СМ и СМ К50, которые, как правило, разливают в 15-сантиметровые чашки Петри (фирма Га1соп, 3025).

Пластины с твердыми средами сушат перед применением в ламинарном потоке для удаления конденсата.

Пример 7. Штамм АгаЫйорз1з и условия его выращивания.

Семена АгаЫйорз1з 1йайапа экотипа Со1итЫа (Со1-0) дикого типа получают от фирмы Ьей1е 8еейз, США (1102 8ои!й 1пйиз1йа1 В1уй. 8ш1е Ό, Воипй Воск ТХ 78681, США). Растения выращивают при 22^о С при световом цикле 16 ч света/8 ч темноты в цветочный горшках в смеси, содержащей 4 части песка, 4 части садовой почвы и 1 часть агриллита.

Пример 8. Штамм и культура АдгоЬас1егшт.

Векторные плазмиды интродуцируют в реципиентный штамм АдгоЬас1егшт 1ите£ас1еп ЬВА4404 (фирма С1оп1есй) путем трехродительского скрещивания согласно протоколу, описанному у \Уа1кегреасй и Уейеп (АдгоЬас1егшт-тей1а1ей депе 1гапз£ег 1о р1ап! се11з: Сот1едга1е апй Ьшагу уес!ог зуз!етз, ίη: Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1оду Мапиа1, В1: 1-19, 1994, ред-ры.: 8.В. СеМп, В.А., 8сЫ1регоой, К1цуегз Асай. РиЬйзйегз.). В качестве мобилизующего штамма используют штамм Е. сой НВ101, несущий конъюгированную плазмиду рВК2013 (ЭШа и др. Вгоай йоз! гапде ΌΝΛ с1ошпд зуз!ет £гот Сгат-педайуе Ьас1ейа. Сопз1гис!юп о£ депе Ьапк о£ ВЫхойшт теШой. Ргос. №И. Асай. 8ск И8А 77: 7347-7351 (1980)). Применяемые для трансформации корня агробактерии выращивают в ЬВ-среде (8атЬгоок и др., Мо1еси1аг С1оптд, Со1й 8рппд НагЬог, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргезз, ΝΥ, 1989) без антибиотиков при 28^о С и 200 об/мин.

Пример 9. Стерилизация семян.

Семена помещают в смесь 70% ЕЮН/0,05% Т\сееп 20 на 1 мин в пробирке Эппендорфа объемом 2 мл. Смесь 70% ЕЮН/0,05% Т\сееп 20 удаляют с помощью пипетки и заменяют смесью 5% №1ОС.’1/0.05%₁ Тетееп 20, в которой семена выдерживают 15 мин. Семена регулярно встряхивают. Раствор удаляют в стерильных условиях и семена промывают стерильной дистиллированной водой трижды каждый раз по 10 мин. После последней промывки семена выдерживают в 0,5 - 1 мл воды. Семена можно использовать немедленно или хранить при 4^о С в течение 2-3 недель. Стерилизованные семена (20-30 штук) переносят пинцетом на СМ-среду в 15-сантиметровые чашки Петри. Ростки выращивают в вертикальном положении в планшетах в вегетационной камере (22^о С; световой цикл 16 ч света/8 ч темноты).

Пример 10. Трансформация эксплантатов корня АгаЬ1йорз1з 1йайапа.

- 15 006761

Для трансформации используют корни трехнедельных проростков. Корни не должны быть ни зелеными, ни коричневыми. Зеленые части проростков удаляют с помощью скальпеля и пинцета. Отбирают оставшиеся корни и приблизительно по 5 полных корневых систем помещают на планшет с твердой С1М-средой. Корни осторожно прижимают к поверхности планшета для того, чтобы обеспечить полный контакт со средой, однако они не должны быть погружены в агар. Корни инкубируют в течение трех дней в вегетационной камере (22^О С; световой цикл 16 света/8 ч темноты). Затем корни переносят в стерильную чашку Петри с фильтровальной бумагой, смоченной жидкой С1М-средой, и разрезают скальпелем на кусочки длиной 0,5-1 см. После этого эксплантаты корня переносят в стерильную пробирку Фалкона объемом 50 мл, содержащую 10 мл жидкой С1М-среды. В нее добавляют 0,5 мл культуры АдгоЬас1егшт, выращенной в течение ночи (оптическая плотность ОП 0,6-1) и инкубируют в течение 1-2 мин при осторожном встряхивании. Жидкость сливают из пробирки через стерильные металлические сита (размер ячеек 50 меш, фирма 3фта, сита типа 3-0895), которые удерживают с помощью пинцета. Корни обычно остаются на стенке пробирки вблизи ее края. Затем эксплантаты корня переносят в стерильную чашку Петри с фильтровальной бумагой и быстро промокают для удаления избытка жидкости. Эксплантаты корня помещают на планшеты с твердой С1М-средой и инкубируют в вегетационной камере в течение 2 дней при слабом освещении (1,5-2 клк). После периода совместного культивирования можно наблюдать небольшие проявления разрастания ЛдгоЬае1егшт. Затем эксплантаты корня переносят в стерильную пробирку Фалкона объемом 50 мл, содержащую 20 мл жидкой С1М-среды, дополненной 1000 мг/л ванкомицина. После этого пробирки Фалькона осторожно встряхивают для удаления АдгоЬас1епа. Жидкость сливают из пробирки как описано выше и эксплантаты быстро промокают с помощью фильтровальной бумаги. Затем эксплантаты переносят на планшеты, содержащие среду 31М У750 К100. Корни должны находиться в плотном контакте со средой. Эксплантаты инкубируют в вегетационной камере в стандартных условиях в течение одной недели и затем переносят в среду 31М У750 К100 и инкубируют в течение еще одной недели. После этого концентрацию ванкомицина уменьшают до 250 мг/л. Появление первых проростков следует ожидать в конце третьей недели культивирования на 31М-среде. Проростки вырезают после того, как они достигают размера 0,3-0,5 см, удаляют весь оставшийся каллюс и проростки переносят на 15-сантиметровые планшеты, содержащие среду ОМ К50. На один планшет помещают максимум 3 проростка. Для получения большего количества проростков можно переносить оставшиеся эксплантаты еще на две недели на планшеты со свежей 31М-средой, дополненной 125 мг/л ванкомицина и 100 мг/л канамицина. Проростки, имеющие корни, можно переносить в почву с целью получения семян. Проростки, не имеющие корней, переносят в контейнеры типа Мадеп1а (по одному на контейнер), содержащие ОМ-среду, для получения семян ίη νίίΓΟ.

Семена отдельных трансгенных растений проращивают на среде ОМ К50 в вегетационной камере в течение 2 недель. Для дальнейшего анализа отбирают устойчивые к канамицину проростки с нормальным фенотипом, которые имеют зеленые настоящие листья и разветвленную корневую систему.

Пример 11. Гистохимический анализ β-глюкуронидазы (ОИ3).

Для анализов ОИ3 применяют выращенные ίη νίίΓΟ проростки или растения, выращенные в почве. Целые проростки или разрезанные на части органы погружают в раствор для окрашивания ОИ3. Раствор для окрашивания ОИ3 содержит 1мМ 5-бром-4-хлор-3-индолилглюкуронид (Х-О1ис, фирма ЭисйеГа. 20 мМ маточный раствор в ЭМ3О), 100 мМ Ыа-фосфатный буфер, рН 7,0, 10 мМ ЭДТК, рН 8,0, и 0,1% Тпίοη Х100. Образцы ткани инкубируют при 37°С в течение 1-16 ч. При необходимости образцы можно очищать путем нескольких промывок с использованием 70% ΕίΟΗ для удаления хлорофилла.

Пример 12. Конструирование трансформирующего вектора ρΖυ627 для табака.

Все ПЦР осуществляют с использованием ДНК-полимеразы Р1абпит РГх (фирма ЫГе ТесйгкИощеЦ согласно инструкциям производителя.

1. Амплификация терминатора N03 и клонирование полученного продукта.

Терминатор N03 амплифицируют из ρΒΙΝ19 (Βеνаη и др. 1984) с использованием прямого праймера для терминатора N03 (3Εφ ΙΌ N0:21) и обратного праймера для терминатора N03 (3Εφ ΙΌ N0:22). Прямой праймер модифицируют таким образом, чтобы он содержал сайт Рб11, а обратный праймер модифицируют таким образом, чтобы он содержал сайт ΗίηάΙΙΙ. Продукт амплификации терминатора N03 клонируют в виде ΡδΐΙ/ΗίηάΙΙΙ-фрагмента в тех же сайтах вектора рВ1ие8Спр1 (фирма 31га1адепе), получая плазмиду ρΖυ400Α.

2. Амплификация и клонирование гена нуклеокапсидного протеина вируса пятнистого увядания томата (№ Т3\УУ).

При получении с помощью амплификации нетранслируемого гена КР Т3\УУ используют модифицированные праймеры для гена № Т3\УУ. В прямой праймер для гена НР Т3\УУ встраивают сайты ВатШ, 3рЫ, инициирующий и терминирующий кодоны (3Εφ ΙΌ N0:23). Обратный праймер модифицируют таким образом, чтобы он содержал сайт РкП (3Εφ ΙΌ N0:24). Амплифицированный продукт клонируют в виде ВатШ/РШ-фрагмента в сайте ВатШ/РкП плазмиды ρΖυ400Α против хода транскрипции и том же направлении, что и терминатор N03. В полученном клоне ρΖυ400Ь сайт РкН, расположенный между геном № Т3\УУ и терминатором N03, удаляют путем обработки ДНК-полимеразой фага Т4 (фирма ЫГе Тес1то1още5) согласно инструкциям производителя. Ген № Т3\УУ и терминатор N03 из

- 16 006761 полученного клона, обозначенного как ρΖυ400ϋ, клонируют в виде 8рЫ/НтбШ-фрагмента в сайте 8рЫ/Н1ибШ челночного вектора ρΖΟ1560, получая плазмиду ρΖυ400. ρΖΟ1560 является производным вектора ρΒΙ^δοηρί, в котором исходный сайт множественного клонирования заменен сайтом множественного клонирования ΆΟΟΝΚ (8ЕО ΙΌ N0:27).

3. Амплификация и клонирование промотора вируса СтУЬСУ.

Промотор вируса СтУЬСУ амплифицируют с использованием прямого праймера для промотора вируса СтУЬСУ (8Е0 ΙΌ N0:25) и обратного праймера для промотора вируса СтУЬСУ (8Е0 ΙΌ N0:26). Прямой праймер модифицируют таким образом, чтобы он содержал сайт 8§ΐΙ, а обратный праймер таким образом, чтобы он содержал сайт РкН. Амплифицированный промотор вируса СтУЬСУ клонируют в виде ЗкП/РкП-фрагмента в сайте Зкб/Ркб плазмиды ρΖυ400 в том же направлении и против хода транскрипции относительно гена ΝΡ Т8АУ. В результате получают клон ρΖυ625, который содержит кассету вирусного гена, позволяющую получать нетранслируемую РНК гена ΝΡ Т8АУ.

4. Клонирование кассеты вирусного гена в ρΧίοΙΟΓΗίΝΚ.

Кассету вирусного гена клонируют в виде Ак^/РасЬфрагмента плазмиды ρΖυ625 в сайте ΛδοΙ/ΡαοΙ вектора ρΖυ494 в плазмиде ρΧίοΙΟΓΗίΝΚ. В результате получают растительный трансформирующий вектор ρΖυ627. ρΧίοΙΟΓΗίΝΚ представляет собой бинарный вектор, который содержит сайт инициации репликации (0К1), выделенный из плазмиды ρУδ1 Ркеиботопак аегцдшока, в отношении которого известно, что он обладает высокой стабильностью в А. ЩшеГааепк (ПоП и др., Р1акт1б 11:206-220 (1984); ΙΐοΠ и Наак, Сепе 36;27-36 (1985)). 0ΒΙ ρУδ1 функционирует только в АдгоЬас!егшт и его можно мобилизировать в А. ШтеГааепк с помощью плазмиды-хелпера ρΚΚ2013, происходящей из Е. сой, с использованием процедуры трехродительского скрещивания (ЛШа и др., Ргос. №И. Асаб. 8с1. υδΛ 77:7347-7351 (1980)).

Этот бинарный вектор содержит также сайт инициации репликации СоГЕф выделенный из ρυί.Ί9 (Уапшксй-Реггоп и др., Сепе 33:103-119 (1985)), который функционирует в Е. сой.

Для сохранения в Е.сой и А. 1птеГас1епк этот вектор содержит бактериальный ген устойчивости к спектомицину и стрептомицину, который кодируется геном транспозона Тп7, имеющим длину 0,93 т.п.н. (Бйпд и др., №с1. Ас1б Век. 13:7095 (1985)), который функционирует в качестве маркера для селекции по признаку наличия вектора в Е. сой и А. ЩшеГааепк. Для повышения эффективности бактериальной экспрессии ген сливают с промотором 1ас (Аттап и др., Сепе 25: 167-178 (1983)).

Правый и левый пограничные фрагменты Т-ДНК длиной 1,9 т.п.н. и 0,9 т.п.н. соответственно, содержащие пограничные повторы длиной 24 пары оснований, получают из Т1-плазмиды штаммов А. !ишеГааепк нопалинового типа ρΤίΙ37 (Уабеу и др., Ргос. №И. Асаб. ЗсЕ ЬЗА. 79:6322-6326 (1982)). Затем область Т-ДНК, расположенную между пограничными последовательностями, модифицируют путем удаления последовательностей, происходящих из М13, и для увеличения вариантов его клонирования встраивают сайт множественного клонирования ВЮЫЫК (δΕΟ ΙΌ N0:28), получая ρУ^сΐο^Н^NΚ.

РУю1огН|М< содержит генную кассету ИРТП для отбора трансформантов в процессе трансформации растений. Эта генная кассета содержит промотор N03, ген ИРТП и терминатор N03, полученный из А. ШшеГааепк.

Пример 13. Трансформация растений и скрининг по признаку устойчивости.

1. Трансформация растительного материала с помощью бинарных векторов.

Методы переноса бинарных векторов в растительный материал хорошо разработаны и известны специалисту в данной области. Имеются различия в процедурах, обусловленные, например, тем, что применяют различные штаммы АдгоЬас!егшт, различные источники получения эксплантатов, различные системы регенерации, которые зависят как от сорта, так и от вида используемого растения. Бинарный вектор ρΖυ627 в экспериментах по трансформации растений применяют согласно описанной ниже процедуре. ΡΖυ627 переносят путем трехродительского скрещивания в штамм-акцептор АдгоЬас!епит ШтеГааепк, после чего методом саузерн-блоттинга осуществляют анализ экс-конъюгантов для проверки правильного переноса конструкции в штамм-акцептор, инокуляцию и совместное культивирование стерильного эксплантата с рекомбинантным штаммом АдгоЬас!епит ШтеГааепк, селективное уничтожение штамма АдгоЬас!епит ШтеГааепк с использованием соответствующих антибиотиков, селекцию трансформированных клеток путем выращивания на средах для селекции, содержащих канамицин, перенос проростков в почву, оценку методом саузерн-блотинга степени интактности интегрированной Т-ДНК с помощью анализа выделенной хромосомной ДНК растения.

2. Устойчивость растений к инфекциям, вызываемым ТЗАУ.

Трансформированные растения выращивают в теплице в стандартных карантинных условиях для того, чтобы не допустить никакой инфекции, вызываемой патогенами. На стадии четырех листьев растения заражают ТЗАУ путем механической инокуляции. Ткань растений, системно инфицированных ТЗАУ, измельчают в 5 объемах охлажденного на льду буфера для инокуляции (10мМ фосфатный буфер, дополненный 1% №ι₂δ0₃) и натирают ею в присутствии карборундового порошка два первые полностью распустившиеся новые листа. В течение трех недель после инокуляции осуществляют наблюдение развития симптомов заболевания у инокулированных растений. У растений, которые содержат последовательности ρΖυ627, не выявлено симптомов заболевания, вызываемого ТЗАУ, в то время как у нетрансформированных контрольных растений в течение 7 дней после инокуляции проявляются серьезные сим

- 17 006761 птомы системного заболевания, вызываемого Τ8\νν. Устойчивые растения подвергают самоопылению и собирают семена. Потомство растений анализируют в отношении сегрегации встроенного гена и затем подвергают повторному скринингу по признаку устойчивости к Т8^У-инфекции согласно описанной выше процедуре.

Пример 14. Создание конструкций Стр8-фосфоманнозо-изомераза-по§ для трансформации растений.

Промотор Стр8 амплифицируют с помощью ПЦР с использованием праймеров СтрГ-В (сдс дда !сс сад аса аад !дд сад а; 8ЕО ГО N0:29) и Стр8-В (сдс дда !сс !ас !!с 1ад дс! ас! !д, 8Е0 ГО N0:30), имеющих фланкирующие сайты ВатН1. Образовавшийся РСК-фрагмент клонируют в сайте ВатН1 рВ1исьсг1р! К8 (+), получая ρΝ0ν4211.

Для создания бинарного вектора, предназначенного для трансформации с использованием АдгоЬас!егшт !нтсГас1СП5. промотор Стр8 выделяют из ρΝ0ν4211 путем отщепления с помощью ВатН1 и встраивают в расщепленный с помощью ВатН1 вектор ρN0V2804 (8Е0 ГО N0:31) против хода транскрипции относительно гена РМ1, образовавшийся вектор обозначают как ρN0V2819. ρN0V2804 (8Е0 ГО N0:31) представляет собой бинарный вектор, содержащий сайт инициации репликации ν81, копию гена νίτΟ ЛдгоЬас!егшт в каркасной области и лишенную промотора кассету экспрессии РМ1-терминатор по§ между левой и правой пограничными последовательностями Т-ДНК. РМ1 (фосфоманнозо-изомераза) представляет собой кодирующую область гена тапА Е.соН (1оегаЬо и 0кке1§, Р1ап! Се11 Керогй 16:219221 (1996), №дго!!о и др., Р1ап! Се11 Керогк 19:798-803 (2000)). Терминатор по§ (нопалинсинтазы) выделяют из Т-ДНК АдгоЬас!егшт !итеГас1еп8 (Иерккег и др., 1. Мо1. Арр1. Оепе!. 1 (6), 561-573 (1982)). Кодирующая область фосфоманнозо-изомеразы и терминатор по§ простираются от нуклеотида 290 до нуклеотида 1465 и от нуклеотида 1516 до нуклеотида 1789 соответственно ρN0V2804 (8Е0 ГО N0:31).

Для создания вектора, предназначенного для биобаллистической трансформации, промотор Стр8 отщепляют от ρN0V4211 с помощью ВатН1 и встраивают в расщепленный с помощью ВатН1 вектор ρN0V3604 (8Е0 ГО N0:32) получая ρN0V2820, в результате чего создается кассета экспрессии РМ1, находящаяся под контролем промотора Стр8. ρN0V3604 представляет собой вектор для получения предназначенных для биобаллистической доставки фрагментов, созданный на основе рИС19, содержащий сайт инициации репликации Со1Е1 и ген бета-лактамазы, обусловливающий устойчивость к ампициллину. Так же как и ρN0V2804, ρN0V3604 содержит лишенную промотора кассету экспрессии РМ1терминатор по§ (см. выше). Кодирующая область фосфоманнозо-изомеразы и терминатор по§ простираются от нуклеотида 42 до нуклеотида 1217 и от нуклеотида 1268 до нуклеотида 1541 соответственно ρN0V3604 (8ЕО ГО N0:32).

Бинарный вектор ρN0V2819 применяют для трансформации с использованием АдгоЬас!егшт !итеГаскпк, а вектор ρN0V2820 применяют для биобаллистической трансформации.

Пример 15. Конструирование СтрС-ОИ8-плазмид для стабильной экспрессии ш р1ап!а.

1. Конструирование бинарного вектора.

Для экспериментов был выбран вектор рСатЫа 1302 (СатЫа, СапЬегга, АийгаНа; КоЬегК С.8., Ка)адора1, 8., 8тйй, Ь., Nдиуеη, Т., Уапд, ^., №дгойо, 8., Κπνί, К.8. Сао, М.Ь., ^ауасйапйга, К., и др. А сотргейепкке §е! оГ тойи1аг \^гес!ог5 Гог аШапсей татри1а!юп апй еГГккп! йапГогтайоп оГ р1ап!§. Рге§еп!ей а! !1е КоскеГе11ег Боипйайоп Меейпд оГ !1е 1п!ета!юпа1 Ргодгат оп Кке Вю!есйпо1оду, Ма1асса, Ма1ау81а, 8ер!етЬег 15-19 (1997)) и его модифицируют следующим образом: промотор 358 СаМ^ расположенный перед геном ОБР, удаляют путем расщепления в положении 9788 с помощью эндонуклеазы НшйШ и в положении 1 с помощью эндонуклеазы №о1, и вектор повторно сшивают путем лигирования по двум совместимым концам. Путем расщепления с помощью эндонуклеазы Х1ю1 в положении 7613 и с помощью В§!Х1 в положении 9494 удаляют ген устойчивости к гигромицину и находящийся перед ним промотор 358 СаМV. Последовательности промотора 358 удаляют из вектора для того, чтобы исключить любой возможный риск того, что вследствие гомологии ген окажется молчащим.

Ген Ьаг, находящийся под контролем промотора 1' (Мепдк!е и др., Р1ап! 1, 12(4): 945-948 (1997)), встраивают в сайт ЕсоК1 в положении 9737 в качестве селектируемого маркера. Полученный вектор обозначают как рСатВаг.

2. Полученные конструкции.

Кассеты СтрСО и СарО, описанные в примере 3, встраивают в вектор рСатВаг между сайтом ХЬа1 в положении 9764 и сайтом ЕсоК1 в положении 9737, получая плазмиды рСатВагСтрСО и рСатВагСарО соответственно. Обе конструкции используют для трансформации клеток АдгоЬас!егшт !итеГаскпк.

Пример 16. Стабильная экспрессия в АгаЬкоркк ШаНапа.

1. Получение и трансфекция растений.

Высевают семена АгаЫйоркЕ !йайапа (Со1итЫа 0) дикого типа, которые выдерживали в течение 3 дней в холодных условиях при а! 4°С в темноте для синхронизации прорастания, и переносят в вегетационную камеру (22°С/освещение в течение 24 ч). Проросшие растения подвергают инфильтрации, когда у них образуется максимальное количество нераскрытых почек. Инфильтрацию осуществляют согласно протоколу, описанному у С1оид1 и Веп!, Р1ап! 1. 16: 735-743 (1987).

- 18 006761

2. Отбор трансгенных растений.

Осуществляют отбор проростков из семян поколения Т1, опрыскивая их гербицидом ВА8ТА (фирма Р1и88-81аи£ег АО/8А) (150 мг/л) три раза через каждые пять дней. Путем отбора получают двадцать устойчивых к рСатВагСтрСО и девять устойчивых к рСатВагСарО растений. Их выращивают в описанных условиях, получая семена поколения Т2. Эти семена подвергают процедуре, описанной выше для растений дикого типа, отбирают проростки поколения Т2 с использованием опрыскивания гербицидом ВА8ТА и осуществляют анализ устойчивых мутантов в отношении экспрессии гена ОИ8.

3. Гистохимическое исследование экспрессии гена ОИ8 в стабильно трансформированных растениях ЛгаЫБор818.

Гистохимическое окрашивание для выявления ОИ8 осуществляют согласно методу, описанному в примере 11. Анализ проводят в пробирках с культурой объемом 15 мл путем погружения трансформированных проростков в раствор Х-О1ис, выдерживания в течение 10 мин при давлении 130 мбар и инкубации в течение ночи при 37°С. Результаты, полученные для растений АгаЫ4ор818, трансформированных с помощью рСатВагСтрСО, свидетельствуют о наличии во всех вегетативных органах конститутивной экспрессии репортерного гена ОИ8, которая осуществляется под контролем промотора СтрС.

4. Количественный ферментативный анализ ОИ8 в стабильно трансформированных растениях АгаЫ4ор818.

А. Получение образцов.

Для исследования отбирают по четыре растения для каждой трансгенной линии и с каждого из этих растений берут по одному листу. Четыре листа вносят в одну пробирку Эппендорфа, замораживают с помощью жидкого азота и размалывают с помощью соответствующих мельниц до получения тонкоизмельченного порошка. Порошок разбавляют 150 мкл ОИ8-буфера (0,05М ЫаРО₄, рН 7, 0,01М ЭДТК, 0,1% Тгйоп-Х-100, 0,1% саркозила), инкубируют в течение 5 мин при 37°С и продукт вращают в микроцентрифуге в течение 5 мин при максимальной скорости. Супернатант переносят в новую пробирку Эппендорфа и полученные образцы используют для ферментативного анализа.

Содержание протеина в указанных растительных экстрактах оценивают по методу Бредфорда (ВгабГогБ М.М., Апа1. Вюсйет. 72: 248-254 (1976)), используя в качестве стандарта БСА (бычий сывороточный альбумин). Присутствие промотора и гена ОИ8 в мутантных линиях подтверждают с помощью ПЦР-анализа, используя экстрагированные образцы в качестве матрицы.

Б. Флуорометрический анализ ОИ8.

Флуорометрический анализ ОИ8 проводят согласно методу, описанному в примере 5. Для обнаружения экспрессии гена ОИ8 образцы разбавляют ОИ8-буфером. Реакцию проводят при 37°С в присутствии одинаковых количеств ОИ8-буфера для реакции и прекращают путем добавления 2М аммедиола. Активность измеряют с помощью устройства типа Тйейек Ииогозкап II.

У пятнадцати из двадцати отобранных линий, трансформированных с помощью рСатВагСтрСО, и у восьми из девяти линий, трансформированных с помощью рСатВагСарО, выявлена ферментативная активность ОИ8 в листьях. Уровень активности для некоторых линий, трансформированных с помощью СтрСО, оказался сопоставимым с уровнем активности линий, трансформированных с помощью СарО. Однако результаты варьируются для различных трансгенных линий вследствие различий их генотипов (количество локусов и количество трансгенных вставок в каждый локус).

Пример 17. Конструирование вариантов промотора СтрС.

Все ПЦР осуществляют с использованием полимеразы РГи (фирма 81га!адепе) согласно методу, описанному в примере 1.

1. Амплификация и клонирование ДНК.

Получают два варианта плазмиды рСтрСО (пример 3), а именно рСтрМО и рСтрМзО. У первой в промоторе рСтрСО отсутствует последовательность ОТООТССС, а у последней указанная последовательность в результате мутации превращена в последовательность ОТОСТСОС.

Для получения рСтрМО амплифицируют три ПЦР-продукта:

СтрМ1 - с использованием прямого парймера Стр1 (см. пример 3, 8ЕО ΙΌ N0:13), обратного праймера СтрМг (ССАТСОТООТАТТТООТАТТО, 8ЕО ΙΌ N0:33) и плазмиды рСтрСО в качестве матрицы.

СтрМ2 - с использованием прямого праймера СтрМГ (СААТАССАААТАССАСОАТОО; 8Е0 ΙΌ N0:34), обратного праймера СтрС2 (см. пример 3; 8Е0 ΙΌ N0:14) и плазмиды рСтрСО в качестве матрицы.

СтрМ - с использованием прямого праймера Стр1, обратного праймера СтрС2 и эквимолярной смеси ПЦР-продуктов СтрМ1 и СтрМ2 в качестве матрицы.

Для получения рСтрМзО амплифицируют три ПЦР-продукта:

СтрМз1 - с использованием прямого праймера Стр1, обратного праймера СтрМгз (СОТООТАОСОАОсАсТТТООТ, 8Е0 ΙΌ N0:35) и плазмиды рСтрСО в качестве матрицы.

СтрМз2 - с использованием прямого праймера СтрМГз (ААОТОСТСОСТАССАСОАТОО, 8Е0 ΙΌ N0:36), обратного праймера Стр2 и плазмиды рСтрСО в качестве матрицы.

СтрзМ - с использованием прямого праймера Стр1, обратного праймера Стр2 и эквимолярной

- 19 006761 смеси ПЦР-продуктов СтрМк1 и СтрМк2 в качестве матрицы.

Для получения плазмид рСтрМС и рСтрМкС исходную плазмиду рСтрСС расщепляют с помощью эндонуклеаз ХЬаГ и ВатНГ для того, чтобы исключить фрагмент СтрС и вместо него встроить ПЦР-продукты СтрМ и СтрМк.

Пример 18. Эксперименты по осуществлению кратковременной экспрессии с использованием конструкций рСтрМ и рСтрМк.

1. Получение суспензионных культур и протопластов.

Суспензионные культуры и протопласты получают согласно процедуре, описанной в примере 4.

2. Анализ СИ8.

Трансфекцию и получение протеиновых экстрактов осуществляют согласно процедуре, описанной в примере 4, а анализ СИ8 проводят согласно процедуре, описанной в примере 5.

Результаты анализа СЬ8 представляют собой средние значения результатов десяти различных экспериментов и их нормализуют по отношению к значению для стандартного клона. Делеция последовательности СТССТССС в конструкции СтрСС приводит к снижению экспрессии репортерного гена СЬ8 под контролем СтрС приблизительно на 50% во всех типах протопласта (см. ниже). Эффект, вызываемый мутацией СТССТССС зависит от вида растения. В протопластах О. ую1асеик и О. карта уровень экспрессии гена СЬ8 понижается на 65,2% и 73,6% соответственно. В протопластах N. р1итЬащшГо11а активность промотора СтрМк близка к активности промотора СтрМ.

N. ркцпЬадйиГоКа

СтрСС	100
СтрМО	52	+/-12%
СтрМзО	53,7	+/-16%
СарО	28,3	+/-14%

О. ую1асеик

СтрСС	100
СтрМС	55,2	4- /-12%
СтрМзО	73,6	+/-10%
СарСг	5	+/- 1%

О. карта

СтрСС	100
СтрМС	9,6 +/-21%
СтрМзО	65,2 +/-20%
СарО	42,5 +/-16%

Пример 19. Конструирование растительных трансформирующих векторов, содержащих 5'- промоторные фрагменты, функционально связанные с репортерными генами СЕР или СИ8.

1. Амплификация и клонирование промотора.

Конструируют химерный ген, который содержит последовательность ДНК промотора первичного транскрипта СтУЬСУ (8Еф ΙΌ N0:1), слитую с оптимизированной для растения последовательностью СЕР, содержащей интрон (купСЕРГ, 8Еф ΙΌ N0:37), или с последовательностью репортерного гена СИ8, содержащей интрон (СГС; 8Еф ΙΌ N0:38). Ген СГС содержит интрон 8Т-Ь81 из 8о1апит ШЬегокит. простирающийся от нуклеотида 385 до нуклеотида 576 8Еф ΙΌ N0: 38 (получен от д-ра 81ап1оп СеМп, Ригкие Ишуегкйу, описан №1гакпп1и.11и и др., Р1ап1 Се11, 8: 873-886 (1996)). 8упСЕР1 представляет собой оптимизированный для растения ген СЕР, в который встроен интрон 8Т-Ь81 (от нуклеотида 278 до нуклеотида 465 8Еф ΙΌ N0:37). Для амплификации промоторов в качестве матрицы при осуществлении полимеразной цепной реакции (ПЦР) используют геномную ДНК СтУЬСУ. Для амплификации последовательности ДНК конструируют специфичные для гена праймеры. Фрагмент гена, соответствующий СтрС (8Еф ΙΌ N0:2) выделяют с использованием прямого праймера СтрГ-В (8Еф ΙΌ N0:29) в сочетании с 5' 3' праймером СССССАТТССТСССТТААСААТСАСС (8Еф ΙΌ N0:39) в качестве обратного праймера. Фрагмент гена, соответствующий Стр8 (8Еф ΙΌ N0:3) выделяют с использованием прямого праймера СтрГ-В (8Еф ΙΌ N0:29) в сочетании с обратным праймером Стр8-В (8Еф ΙΌ N0:30). Все три праймера содержат на своих 5'-концах сайт СССССА, распознаваемый рестриктазой ВатНЕ Все ПЦР осуществ

- 20 006761 ляют с использованием полимеразы РГи согласно рекомендациям производителя (фирма 8!га!адепе). Для амплификации промоторных фрагментов применяют термоячейку (типа ЭНЛ Епдте, фирма МЖехеагсй, Ис., Уолтем, штат Массачусетс, США) и используют следующие условия для ПЦР: [(94°С:10 с):(94°С:10 с/56°С:30 с/72^оС:1мин)х20]:(72°С:1,5мин)]. После расщепления рестриктазой ВатШ промоторные фрагменты сшивают путем лигирования в векторах, созданных на основе рИС, с геном СЮ или геном хупСΕΡΙ, в результате чего получают слияния промотор-репортерный ген, функционально связанные с терминатором ПО8.

2. Полученные кассеты промотор-репортерный ген промоторный фрагмент Стр8 + ген хуиСΕΡI + пох (8ЕС ΙΌ N0:40) промоторный фрагмент Стр8 + ген СЮ + пох (8ЕС ΙΌ N0:41) промоторный фрагмент СтрС + ген хуиСΕΡI + пох (8ЕС ΙΌ N0:42) промоторный фрагмент СтрС + ген СЮ + пох (8ЕС ΙΌ N0:43)__________________

5Е(} ГО ΝΟ	Промотор	Ген (яупОЕР1 или СЮ)	Терминатор
40	Нуклеотиды с 1 по 402	Нуклеотиды с 411 по 1331	Нуклеотиды с 1343 по 1618
41	Нуклеотиды с 1 по 405	Нуклеотиды с 425 по 2425	Нуклеотиды с 2479 по 2751
42	Нуклеотиды с 1 по 354	Нуклеотиды с 380 по 1292	Нуклеотиды с 1304 по 1577
43	Нуклеотиды с 1 по 354	Нуклеотиды с 399 по 2399	Нуклеотиды с 2453 по 2725

3. Субклонирование в бинарном векторе АдгоЬаскпит

Кассеты промотор-репортерный ген (8ЕС ΙΌ N0:40 - 43), содержащие промоторный фрагмент, репортерный ген и терминатор пох, встраивают в бинарный вектор рN0V2117, предназначенный для трансформации кукурузы, и в бинарный вектор рN0V4200, предназначенный для трансформации томатов. рN0V2117 (8ЕС ΙΌ N0:44) представляет собой бинарный вектор, содержащий в каркасной области сайт инициации репликации У81, копию гена у1гС АдгоЬаскпит, а также кассету экспрессии промотор убикитина кукурузы-ген ΡΜΙ-терминатор пох, расположенную между левой и правой пограничными последовательностями Т-ДНК. ΡΜΙ (фосфоманнозо-изомераза) представляет собой кодирующую область гена тапА Е.соН (1оегхЬо и 0кке1х, Р1ап! Се11 Керойх 16:219-221 (1996), №дгойо и др., Р1ап! Се11 Керойх 19:798-803 (2000)). Терминатор пох (нопалинсинтазы) выделяют из Т-ДНК АдгоЬаскпит 1птеГас1епх (Оерккег и др., 1. Мо1. Арр1. Сепе! 1 (6), 561-573 (1982)). Промотор убикитина кукурузы, кодирующая область фосфоманнозо-изомеразы и терминатор пох простираются от нуклеотида 31 до нуклеотида 2012, от нуклеотида 2109 до нуклеотида 3212 и от нуклеотида 3273 до нуклеотида 3521 соответственно рN0V2117 (8ЕС ΙΌ N0:44). Кассеты репортерный ген-промотор встраивают максимально близко к правой пограничной последовательности. Кассету экспрессии, содержащую селектируемый маркер, встраивают в бинарные векторы максимально близко к левой пограничной последовательности.

Для трансформации томатов в качестве бинарного вектора используют рN0V4200 (8ЕС ΙΌ N0:45), который содержит в каркасной области сайт инициации репликации У81, копию гена у1гС АдгоЬаскпит и кассету, содержащую селектируемый маркер по признаку устойчивости к гигромицину, расположенную между левой и правой пограничными последовательностями. Кассета с селектируемым маркером по признаку устойчивости к гигромицину содержит промотор убикитина 3 АгаЫборх1х (ИЬд3(А1), СаШх и др., 1. Вю1. С1ет. 265:12486-12493 (1990)), функционально связанный с геном, кодирующим устойчивость к гигромицину (в настоящем описании обозначен как НУС, синтетический ген гигромицин Вфосфотрансферазы из Е.соН, патент: ДР 1986085192-А 1 30-АРК-1986) и терминатор пох (Оер1скег и др.,

1. Мо1. Арр1. Сенек 1 (6), 561-573 (1982)). Промотор убикитина АгаЬ1борх1х, ген НУС и терминатор пох простираются от нуклеотида 162 до нуклеотида 11494, от нуклеотида 1897 до нуклеотида 2939 и от нуклеотида 2939 до нуклеотида 3236 соответственно рN0V4200 (8ЕС ΙΌ N0:45). Кассеты репортерный генпромотор (8ЕС ΙΌ N0:40 - 43) встраивают максимально близко к правой пограничной последовательности. Кассеты экспрессии, содержащие селектируемый маркер, встраивают в бинарные векторы максимально близко к левой пограничной последовательности.

Ниже приведены ориентации селектируемого маркера и кассет промотор-репортерный ген в конструкциях бинарных векторов.

4. Конструкции бинарных векторов:

N0V4215 (примыкающий к правой пограничной последовательности промоторный фрагмент (КВфрагмент) Стр8 + ген хуиСΕΡI + пох - 2тИЬ1 + ген ΡΜI + пох, примыкающий к левой пограничной последовательности (ЬВ-иох)) N0V4216 (КВ-пох + ген хуиСΕΡI + промоторный фрагмент Стр8 - 2тИЬ1 + ген ΡΜI + ЬВ-пох)

N0V4217 (КВ-промоторный фрагмент Стр8 + ген хуиСΕΡI + пох - ИЬд3(А1) + ген НУС + ЬВ-пох)

N0V4220 (КВ-промоторный фрагмент Стр8 + ген СЮ + пох - ИЬд3(А1) + ген НУС + ЬВ-пох)

N0V4224 (КВ-промоторный фрагмент СтрС + ген СЮ + пох - 2тИЬ1 + ген НУС + ЬВ-пох)

- 21 006761

N0У4226 (КВ-промоторный фрагмент СтрС + ген §уп6ЕР1 + пок - 2тИЫ + ген ΡΜΙ + ЬВ-пок)

С целью сравнения конструируют дополнительные кассеты с использованием известных промоторов. Для этого создают также содержащую промотор кассету 2тИЬ1-СЕР-358 1сгт (8Еф ΙΌ N0:46), содержащую промотор убикитина кукурузы (Сйпк1епкеп и др. Р1ап1 Мо1ес. Βίοΐ.12: 619-632 (1989)), функционально связанный с купСЕР, и терминатором 358 (358 1егт), и промоторную касету, содержащую промотор убикитина, функционально связанный с геном СЮ, и терминатором пок (И0У 3612, 8Еф ΙΌ N0:47). Промотор 2тиЫ, ген СЕР и терминатор 358 простираются от нуклеотида 1 до нуклеотида 2019, от нуклеотида 2020 до нуклеотида 2751 и от нуклеотида 2876 до нуклеотида 2949 соответственно 8Еф ΙΌ N0:46. Промотор 2тиЫ, ген С1С и терминатор пок простираются от нуклеотида 1 до нуклеотида 1982, от нуклеотида 2015 до нуклеотида 4015 и от нуклеотида 4069 до нуклеотида 4341 соответственно 8Еф ΙΌ N0:47. Кассету 2тиЬ1-СЮ-пок (8Еф ΙΌ N0: 47) клонируют в векторе, созданном на основе рИС. Кассету 2тИЬ1-СЕР-пок (8Еф ΙΌ N0:46 ) клонируют в бинарном векторе рN0У2117, предназначенном для трансформации кукурузы, согласно описанному выше методу. Конструируют промоторные кассеты, содержащие промотор убикитина 3 АгаЫйормк (иЬц3(А1)), функционально связанный с купСЕРЕ и терминатор пок (8Еф ΙΌ N0:48), промотор убикитина 3 АгаЫйоркщ, функционально связанный с геном СЮ, и терминатор пок (8Еф ΙΌ N0:49). Промотор убикитина 3, купСЕΡI и терминатор пок простираются от нуклеотида 1 до нуклеотида 1332, от нуклеотида 1738 до нуклеотида 2658 и от нуклеотида 2670 до нуклеотида 2943 соответственно 8Еф ΙΌ N0: 48. Промотор убикитина 3, ген СЮ и терминатор пок простираются от нуклеотида 1 до нуклеотида 1335, от нуклеотида 1746 до нуклеотида 3746 и от нуклеотида 3800 до нуклеотида 4072 соответственно 8Еф ΙΌ N0: 49. Как описано выше, включающией промотор кассеты клонируют в бинарном векторе рN0У4200, включающем кассету, которая включает селектируемый по признаку устойчивости к гигромицину маркер, предназначенную для трансформации томатов. Ниже приведены ориентации селектируемого маркера и кассет промотор-репортерный ген в конструкциях бинарных векторов.

5. Конструкции бинарных векторов:

N0У2110 (КВ-промотор 2тИЬ1 + ген купСЕР + 358 1егт - 2тИЬ1 + ген ΡΜI + ЬВ-пок) N0У4209 (КВ-промотор иЬц3(А1) + ген купСЕΡI + пок - иЬц3(А1) + ген НУС + ЬВ-пок) N0У4208 (КВ-промотор ЬЬс|3(А1) + интрон СИ8 - ген СИ8 + пок - ЬЬс|3(А1) + ген НУС + ЬВ-пок) Пример 20. Трансформация растений кукурузы, опосредуемая АдгоЬас1егп.пп.

Трансформацию незрелых зародышей кукурузы осуществляют в основном согласно методу, описанному у №дго11о и др., Р1ап1 Се11 Керойк 19: 798-803 (2000). В рассматриваемом примере в качестве всех компонентов, входящих в состав сред, использовали компоненты, описанные у №дгойо и др., см. выше. Следует иметь ввиду, что различные компоненты сред, указанные в литературе, можно заменять другими.

1. Трансформирующие плазмиды и селектируемый маркер.

Гены, которые используют для трансформации, клонируют в векторе, пригодном для трансформации кукурузы, согласно методу, описанному в примере 19. Применяемые векторы содержат ген фосфоманнозо-изомеразы (РМЦ (№дгойо и др. Р1ап1 Се11 Керойк 19: 798-803 (2000)).

2. Получение штамма АдгоЬас1егшт ШтеГааепк.

Штамм АдгоЬас1егшт ЬВА4404 (р8В1), содержащий плазмиду для трансформации растений, выращивают в течение 2-4 дней при 28°С в твердой среде УЕР (дрожжевой экстракт (5 г/л), пептон (10 г/л), №1С1 (5 г/л), агар (15 г/л), рН 6,8). Приблизительно 0,8 х 10⁹ агробактерий суспендируют в среде Ь8-1пГ, дополненной 100мкМ ацетосирингоном (Ак) (№дгойо и др., Р1ап1 Се11 Кер 19: 798-803 (2000)). Бактерии подвергают предварительной индукции в этой среде в течение 30-60 мин.

3. Инокуляция.

Незрелые зародыши линии А188 или другого пригодного генотипа кукурузы вырезают из 8 - 12дневных початков и помещают в жидкую среду Ь8-шГ + 100мкМ Ак. Зародыши промывают один раз свежей инфицирующей средой. Затем добавляют раствор, содержащий АдгоЬас1егшт, зародыши перемешивают в течение 30 с, после чего дают осадиться на них бактериям в течение 5 мин. Затем зародыши помещают в Ь8Ак-среду так, чтобы щиток располагался сверху, и культивируют в темноте в течение 2-3 дней. Затем зародыши переносят (по 20-25 зародышей на чашку Петри) в Ь8Ос-среду, дополненную цефотаксимом (250 мг/л) и нитратом серебра (1,6 мг/л) и культивируют в темноте при 28 С в течение 10 дней.

4. Отбор трансформированных клеток и регенерация трансформированных растений.

Незрелые зародыши, продуцирующие эмбриогенный каллюс, переносят в среду Ь8О1М0.58. Культуры подвергают селекции в этой среде в течение 6 недель, осуществляя стадии пересева через 3 недели. Выжившие каллюсы переносят либо в среду Ь8О1М0.58 для увеличения их объема, либо в среду Кед1. После культивирования на свету (световой режим: 16 ч света/8 ч темноты), зеленые ткани переносят в среду Кед2, не содержащую регуляторов роста, и инкубируют в течение 1-2 недель. Проростки переносят в коробки типа МадеШа СА-7 (фирма Мадеп!а Согр, Чикаго, штат Иллинойс), содержащие среду Кед3, и выращивают на свету. Растения, у которых выявлен позитивный ответ при проведении ПЦР на наличие кассеты промотор-репортерный ген, переносят в почву и выращивают в теплице.

- 22 006761

Пример 21. Стабильная трансформация томатов.

Трансформацию томатов осуществляют, практически следуя методу, описанному у Ме1ззпег и др., Тйе Р1ап! 1оигпа1 12: 1465-1472 (1997).

1. Трансформирующие плазмиды и селектируемый маркер.

Гены, которые используют для трансформации, клонируют в бинарном векторе, пригодном для трансформации томатов, согласно методу, описанному в примере 19. Векторы содержат ген устойчивости к гигромицину, предназначенный для селекции.

2. Получение штамма АдгоЬайегшт !ите£ас1епз.

Штамм АдгоЬас!егшт СУ3101, содержащий плазмиду для трансформации растений, культивируют в течение 2 дней при 22°С в жидкой среде ЬВ (дрожжевой экстракт (5 г/л), пептон (10 г/л), №1С1 (5 г/л), агар (15 г/л), рН 6,8). Приблизительно 0,8 х 10⁹ агробактерий суспендируют в среде КСМ8 для инокуляции (М8-соли (4,3 г/л), Муо-инозит, тиамин (1,3 мкг/мл), 2,4-Д (0,2 мкг/мл), кинетин (0,1 мкг/мл) и 3% сахарозы, рН 5,5), дополненной 100мкМ ацетосирингоном. Бактерии подвергают предварительной индукции в этой среде в течение 30-60 мин.

3. Стерилизация и проращивание семян.

Семена томатов сорта Мюго-Тот (Ме1ззпег и др., Тйе Р1ап1 1оита1 12: 1465-1472 (1997)) и сортов 2ТУ-840 пропитывают в течение 20 мин 20%-ным раствором хлорной извести, содержащим Тетееп. Затем семена трижды промывают стерильной водой и высевают для проращивания на среду Т8С (М8-соли половинной крепости, 1% сахарозы, 1% фитоагара, рН 5,8) в коробки типа Мадейа (фирма Мадейа Согр, Чикаго, штат Иллинойс). Через 7-10 дней после прорастания вырезают семядоли и черешки семядолей разрезают на сегменты длиной 5 мм.

4. Инокуляция.

7-10-дневные семядоли и сегменты черешков семядолей перед осуществлением инокуляции с использованием АдгоЬайегшт инкубируют в течение 24 ч на планшетах, содержащих в качестве питающих клеток клетки табака линии ВУ-2 (М8-соли, Муо-инизит (0,1 мг/мл), гидролизат казеина (0,2 мг/мл), тиамин-НС1 (1,3 мкг/мл), 3% сахарозы, рН 5,5).

Семядоли погружают на 5 мин в жидкую суспензию КСМ8, содержащую АдгоЬайегшт. Затем 2025 семядолей помещают абаксиальной стороной вверх на те же самые планшеты, содержащие питательные клетки, и культивируют в темноте в течение 2-3 дней.

5. Отбор трансформированных семядолей и черешков и регенерация трансформированных растений.

Семядоли и фрагменты черешков переносят на среду для селекции Т8М-1 (4,3 г/л М8-солей, витамины В5 (1х), 2% сахарозы, 1% глюкозы, 1 мкг/мл зеатина, 0,05 мкг/мл ИУК, 5 мкг/мл гигромицина и 250 мкг/мл карбенициллина, рН 5,8) через 2-3 дня после инокуляции с использованием АдгоЬайегшт и выращивают на свету. Семядоли и сегменты черешков, продуцирующие эмбриогенный каллюс, переносят на среду Т8М-2 (М8-соли (4,3 г/л), М8-витамины (1х), 2% сахарозы, 1 мкг/мл зеатина, 5 мкг/мл гигромицина и 250 мкг/мл карбенициллина, рН 5,8). Выжившие проростки, образующие каллюс, переносят в коробки типа СА-7 (фирма Мадейа Согр, Чикаго, штат Иллинойс) со средой ТЕМ (4,3 г/л М8-соли, М8-витамины (1х), 2% сахарозы, рН 5,8) и выращивают на свету. После формирования корней первичные трансформанты переносят в почву.

Пример 22. Флуорометрический анализ зеленого флуоресцентного протеина (СЕР).

Для обнаружения экспрессии гена зупСЕР осуществляют флуорометрический анализ.

Диски листьев стабильно трансформированных растений кукурузы и томатов замораживают с помощью сухого льда. Замороженную ткань тщательно измельчают и смешивают с 300 мкл буфера для экстракции СЕР (10мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 100мМ №С1, 1мМ МдС1₂, 10мМ ДТТ (дитиотреитол) и 0,1% саркозила). Экстракты отделяют от дебриса листьев путем центрифугирования, после чего переносят в 96-луночный планшет черного цвета с прозрачным дном (типа Соз!аг 3615). Относительные единицы флуоресценции (ВЕИ) измеряют с помощью планшет-ридера типа 8рейга Е1иог Р1из при длине волны возбуждения 465 нм и длине волны испускания 512 нм. Активность СЕР нормализуют по отношению к активности общего протеина, измеренной на основе анализа с использованием ВСА (согласно методу Пирса (Р1егсе)).

Пример 23. Анализ экспрессии в стабильно трансформированных растениях кукурузы и томатов.

1. Трансгенные растения 2еа тауз линии То.

Экспрессия СЕР, осуществляемая под контролем промотора Стр8 Щ0У4215, N0У4216), в 10-20 раз превышает экспрессию, осуществляемую под контролем промотора Ζιηυόί Щ0У2110). Эти результаты были получены с использованием образцов листьев 42 независимых линий То, взятых от 93 растений линий То.

2. Анализ СЕР с помощью метода ЕЫ8А.

Для обнаружения зеленого флуоресцентного протеина (СЕР) осуществляют количественный сэндвич-иммуноанализ. Используют два поступающих в продажу поликлональных антитела. С помощью иммунноаффинной хроматографии очищают козлиное антитело к СЕР 1АР (фирма Воск 1апй. №600-1-1215), а кроличье антитело к СЕР (фирма Тоггеу Ртез Вю1аЬз, №ТР401) очищают с использованием про

- 23 006761 теина А. Протеин СЕР в растительных экстрактах захватывают кроличьим антителом, иммобилизованным на твердой подложке в титрационном микропланшете. Затем образуется «сэндвич», состоящий из кроличьего антитела, иммобилизованного на твердой подложке, протеина СЕР и второго козлиного антитела, присутствующего в лунке. После стадии промывки, во время которой удаляют несвязанное второе антитело, проводят обнаружение связанного антитела с использованием антитела, меченого с помощью щелочной фосфатазы. Добавляют субстрат для фермента и в каждой лунке оценивают изменение окраски путем измерения уровня поглощения. Затем данные аппроксимируют стандартной кривой и строят график зависимости концентрации СЕР от уровня поглощения.

Репортерный ген куп СЕР

Кассета бинарного вектора	Активность СЕР (средняя) КРЬ/мг протеина	ЕЫ8А (среднее значение) нг СРР/мг протеина
ЛОУ4215 (Стр8)	4722,3	657,1
ИОУ4216 (Стр8)	2795,8	246,1
Νθν2110(ΖιηυΒί)	272,0	41,4

2. Растения Ьусорегкюоп екси1еп!ит линии То.

Присутствие промоторного фрагмента Стр8 СтУЬСУ (ЛОУ 4217) приводит к уровню экспрессии купСЕР, существенно превышающему уровень экспрессии в присутствии промотора ЬЬс.|3 АгаЬИоркй (ЛОУ 4209).

Репортерный ген купСЕР.

Результаты были получены путем оценки с помощью микроскопа интенсивности флуоресценции купСЕР в каллюсе и первичных проростках для 5 независимых стабильно трансформированных линий каллюса, для трансформации которых использовали кассету ЛОУ4217, и 2 независимых стабильно трансформированных линий каллюса, для трансформации которых использовали кассету ЛОУ4209.

Кассета бинарного вектора (промотор)	Каллюс №	Интенсивность флуоресценции ΟΡΡ
Νθν4217 (Стр8)	Ν0ν4217-1	+++++
Ν0ν4217 (Стр8)	Νθν4217-2	++++
ΝΟΎ4217 (Стр8)	Νθν4217-3	++++
Νθν4217 (Стр8)	Ν0ν4217-4	+++
Νθν4217 (Стр8)	ΝΟΎ4217-5	+++
Νθν4209 (иЬцЗ (АО)	Νθν4209-1	+
ΝΟΎ4209 (иЬдЗ (Δ0)	ΝΟΥ4209-2	+

Кассета Сик-интрон-репортерный ген СИ8.

Результаты получают путем оценки интенсивности окрашивания Си8 для 11 независимых стабильно трансформированных линий каллюса, содержащих кассеты промотор Стр8-репортерный ген (линии ЛОУ4220-1 - ЛОУ4220-11). Исследуют две стабильно трансформированные линии, содержащие промоторный фрагмент СтрС промотора СтУЬСУ (ЛОУ4224-1, ЛОУ4224-2). Для сравнения используют две стабильно трансформированные линии каллюса, содержащие промотор убикитина 3 (ЬЬс.|3) АгаЬИоркщ, (ЛОУ4208-1, ЛОУ4208-2).____________________________________

Кассета бинарного вектора (промотор)	Каллюс Кв	Окрашивание ου8
ЛОУ4220 (Стр8)	Νθν4220-Ι	++++
Νθν4220 (Стр8)	Νθν4220-2	+++
Νθν4220 (Стр8)	Νθν4220-3	++++
Νθν4220 (Стр8)	ΝΟΥ4220-4	+++++
Νθν4220 (Стр8)	Νθν4220-5	+++++
Νθν4220 (Стр8)	Νθν4220-6	+++
Νθν4220 (Стр8)	N03/4220-7	++++
Νθν4220 (Стр8)	Νθν4220-8	+++++
ЛОУ4220 (Стр8)	Νθν4220-9	++·++
N0X74220 (Стр8)	Νθν4220-10	+++
Νθν4220 (Стр8)	Νθν4220-11	++++
Νθν4224 (СтрС)	Νθν4224-1	4-+++
ЛОУ4224 (СтрС)	Ν0ν4224-2	+++
N0374208 (иЪчЗ (Αί))	Νθν4208-1	+
ΝΟΥ4208 (иЬчЗ(А())	ΝΟΥ4208-2	+4-

Пример 24. Эксперименты по кратковременной экспрессии в растениях кукурузы.

1. Получение зародышей.

Незрелые зародыши вырезают из 8-12-дневных початков растений кукурузы, имеющих генотип А188 или другой пригодный генотип, и помещают в жидкую среду 2ЭС4 + 0,5ά (модифицированная среда Дункана Ό, содержащая 20 мг/л глюкозы и дополненная 10 г/л маннозы) и культивируют в течение 1-2

- 24 006761 дней.

2. Плазмолиз.

Незрелые зародыши инкубируют в 12%-ном растворе сахарозы в течение 3-4 ч до начала бомбардировки. Зародыши располагают на пластине по окружностям диаметром 8-10 мм.

3. Бомбардировка.

Трансфекцию зародышей кукурузы путем бомбардировки частицами осуществляют в присутствии 5 мкг плазмидной ДНК при давлении 650 фунтов/кв. дюйм согласно методу, описанному у \Упд1Ц и др, 2001, Р1ап! Се11 ЯерогК в печати. Поскольку работу, находящуюся в печати, нельзя использовать в качестве ссылки, ниже приводятся некоторые сведения, почерпнутые из статьи.

Фрагмент ДНК осаждают на золотые микроносители (<1 мкм) согласно инструкциям, изложенным в руководстве ОиРоп1 ВюНкйск Мапиа1. Гены вводят в клетки ткани-мишени с помощью биобаллистического устройства типа ΡΌδ-1000^ В1о11811ск. Устанавливают следующие регулировочные параметры: расстояние 8 мм между разрушаемым диском и макроносителем, расстояние 10 мм между макроносителем и задерживающим экраном и расстояние 7 мм между задерживающим экраном и мишенью. Пластины обстреливают дважды частицами, покрытыми ДНК, используя диски, разрушающиеся при давлении 650 фунтов/кв. дюйм. Для уменьшения повреждения ткани от ударной волны при выбросе гелия между задерживающим экраном и тканью-мишенью помещают сетку из нержавеющей стали, имеющей по вертикали и по горизонтали по 200 отверстий на дюйм (фирма МсМак1ег-Сагг, Нью Брунсвик, штат Нью Джерси).

Зародыши выращивают на планшетах в течение 48 ч в темноте при 25°С. Протеиновые экстракты получают путем лизиса клеток в лизирующем Ουδ-буфере и осветляют путем центрифугирования.

Пример 25. Анализ Ουδ.

Для обнаружения экспрессии гена Ουδ осуществляют гистохимический и хемилюминисцентный анализы.

1. Гистохимический анализ β-глюкуронидазы (Ουδ).

При проведении анализа Ουδ используют зародыши кукурузы и линии каллюса томатов, выращенные в условиях ίπ νίΙΐΌ. В раствор для окрашивания Ουδ погружают либо зародыши целиком, либо небольшие кусочки каллюса. Раствор для окрашивания Ουδ содержит 1мМ 5-бром-4-хлор-3индолилглюкуронид (Χ-Ο1ι.κ, фирма ПисйеГа, 20мМ маточный раствор в ДМСО), 100мМ №1-фосфатный буфер, рН 7,0, 10мМ ЭДТК, рН 8,0, и 0,1% Тгйоп Х100.

Образцы ткани инкубируют при 37^о С в течение 1-16 ч. При необходимости образцы осветляют путем нескольких промывок 70% Е1ОН для удаления хлорофилла.

2. Хемилюминисцентный анализ β-глюкуронидазы (Ουδ).

Для количественного анализа экспрессии Ουδ осуществляют хемилюминисцентный анализ Ουδ с использованием набора типа Ουδ-Εφίιΐ (фирма Тгор1х. 1пс.) согласно инструкциям производителя. Активность измеряют с помощью люминометра.

Результаты измерений экспрессии Ουδ для образцов, в которых присутствуют конструкции рСтрδ и рСтрΜΟ (пример 17) нормализуют по отношению к соответствующему значению, полученному для клона, с которым проводится сравнение (рNОV3612, пример 19). Результаты, полученные в двух различных экспериментах, свидетельствуют о том, что делеция длиной 8 пар оснований в промоторе СтΥ^СV (рСтрΜΟ, пример 17) не оказывает существенного влияния на уровни экспрессии репортерного гена Ουδ по сравнению с в присутствии промотора рСтрδ.

Кратковременная экспрессия в зародышах Ζ.ιικκκ Активность Ουδ через 48 и 72 ч после трансфекции

Конструкция №	Активность СИ8 (КГи/мг протеина)
48 ч	72 ч
рСтрЗ	103,7	51,7
РСтрМО	81,4	70,8
ΖιπΙΛί (ρΝΟΥ3612)	52,6	70,2

- 25 006761 <110>

<120>

Перечень последовательностей

Зупдепка Рагк1с1рак1опз АС

Промоторы вируса желтого скручивания листьев цестровых <130>

3-31359А <140>

<141>

<150>

СВ 0007427.8 <151>

2000-03-27 <150>

СВ 0010486.9 <151>

2000-04-28 <150>

ЕР 01101802.5 <151>

2001-01-26 <150>

из <151>

2001-02-28 <160>

<170>

РакепкТп Уег. 2.2 <210>

<211>

670 <212>

ДНК <213>

Вирус желтого скручивания листьев цестровых <400>

аккаскддса	дасааадкдд	садасакаск	дксссасааа	кдаадакдда	акскдкаааа	60
даааасдсдк	дааакаакдс	дкскдасааа	ддккаддксд	дскдссккка	аксаакасса	120
аадкддкссс	кассасдакд	даааааскдк	дсадксддкк	кддскккккс	кдасдаасаа	180
акаадакксд	кддссдасад	дкдддддксс	ассакдкдаа	ддсаксккса	даскссаака	240
акддадсаак	дасдкааддд	сккасдааак	аадкаадддк'	адкккдддаа	акдкссаскс	300
асссдксадк	скакааакас	ккадсссскс	ссксаккдкк	аадддадсаа	ааксксадад	360
адакадксск	ададададаа	адададсаад	кадсскадаа	дкадксаадд	сддсдаадка	420
кксаддсадд	дкддссадда	адаадаааад	ссаадасдас	даааасаддк	аададскаад	480
сккксксакс	ксааадакда	кксккдакда	кккккдкскс	сасддкссдк	акаддаксса	540
скдааккдак	ааакаксака	кддкккдкак	аааасссдак	акккааакск	дкаксаккск	600
дкккдаакаа	аасккдакас	Ьккдккддад	ксдкккдкаа	ааасакааас	ааккакаакс	660
кдккааааас						670

<210>

<211>

346 <212>

ДНК <213>

Вирус желтого скручивания листьев цестровых <400>

скддсадаса аадкддсада сакаскдксс сасааакдаа дакддаакск дкаааадааа асдсдкдааа каакдсдкск дасаааддкк аддксддскд сскккаакса акассааадк

120 ддкссскасс асдакддааа ааскдкдсад ксддкккддс кккккскдас даасааакаа

180 дакксдкддс сдасаддкдд дддкссасса кдкдааддса кскксадаск ссаакаакдд

240 адсаакдасд каадддскка сдааакаадк аадддкадкк кдддааакдк ссасксассс

300 дксадкскак ааакасккад сссскссскс аккдккаадд дадсаа

346

- 26 006761 <210> 3 <211> 400 <212> ДНК <213> Вирус желтого скручивания листьев цестровых <400> 3 сСддсадаса аадСддсада сабасЪдбсс сасааакдаа даСддаабсб дбаааадааа60 асдсдВдааа ВаабдсдбсС дасаааддТГ аддбсддсСд ссЪЪбааВса аВассааадб120 ддСсссВасс асдаРддааа аасбд£дсад ЬсддЬббддс МЛЪРсВдас даасаааВаа180 даССсдВддс сдасаддСдд дддВссасса ВдВдааддса ьсССсадасР ссаабааСдд240 адсааСдасд ЬаадддсРРа сдааабаадб аадддРадСЬ СдддаааРдб ссасбсассс300 дСсадЬсбаб аааЬасРЪад ссссбсссВс аССдССаадд дадсааааЬс ЪсадададаР360 адВссВадад ададааадад адсаадСадс сВадаадСад400 <210> 4 <211> 634 <212> ДНК <213> Вирус желтого скручивания листьев цестровых <400> 4

сРддсадаса	аадрддсада	саРасРдРсс	сасаааРдаа	даРддааРсР	драааадааа	60
асдсдрдааа	РааРдсдРсР	дасаааддРР	аддРсддсРд	ссРРРааРса	аРассааадР	120
ддРсссРасс	асдаРддааа	аасРдРдсад	РсддРРРддс	РРРРРсРдас	даасаааРаа	180
даррсдрддс	сдасаддрдд	дддрссасса	рдрдааддса	РсРРсадасР	ссааРааРдд	240
адсааРдасд	РаадддсСРа	сдаааРаадР	аадддРадРР	рдддааардр	ссасРсассс	300
дРсадРсРаР	аааРасРРад	ссссРсссРс	аСРдРСаадд	дадсааааРс	РсадададаР	360
адРссРадад	ададааадад	адсаадРадс	сРадаадРад	Рсааддсддс	даадРаРРса	420
ддсадддрдд	ссаддаадаа	даааадссаа	дасдасдааа	асаддРаада	дсРаадсРСС	480
сРсаРсРсаа	адаРдаРРсР	РдаРдаРРРР	РдРсРссасд	дРссдРаРад	даРссасРда	540
аРрдаРаааР	аРсаРаРддР	РРдРаРаааа	сссдаРаРРР	аааРсРдРаР	саРРсРдРРР	600
дааРаааасР	РдаРасРРРд	РРддадРсдР	РРдР			634

<210> 5 <211> 32 <212> ДНК <213> Вирус желтого скручивания листьев цестровых <400> 5 ааааасаВаа асааРВаСаа ВсбдМаааа ас 32 <210> 6 <211> 104 <212> ДНК <213> Вирус желтого скручивания листьев цестровых <400> 6 ддсасадсРд ВсадССдбдс аааВссдадЪ саВсСддасс асааасаСса даададддбс 60 Сасаададбс адаадасдаа дасббВЪсдд бдсбадСРЪа аРРа 104 <210> 7 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 27 006761 <22 3> Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид <400> 7 дассасааас а!садаад 18 <210> 8 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание икусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 8 сааасИаС! дддСааЬс 18 <210> 9 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 9 садддГасса сЬаааа!сас с 21 <210> 10 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид <400> 10 адддда^ссс сааНсссс 19 <210> 11 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 11 аддддСасса 1сда£а1дда д 21 <210> 12 <211> 19 <212> ДНК

- 28 006761 <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 12

ССаддаСссд сссбдссас 19 <210> 13 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 13 сССсСадаса аадбддсада с 21 <210> 14 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 14

ЪСддСассЪС аасааСдадд д 21 <210> 15 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 15 сбасббсбад дбассССдсЕ с 21 <210> 16 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 16

ЪСддСассСС аасааСдадд д 21 <210> 17 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 29 006761 <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400>

ддддаСсссс адСсСсСсЕс <210>

<211>

<212>

ДНК <213>

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400>

дЬдааССсда дсСсддСа <210>

<211>

668 <212>

ДНК <213>

Вирус желтого скручивания листьев цестровых <400>

аЬЪасЬддса	дасааадЕдд	садасаСасС	дЬсссасааа	ТдаадаСдда	аЕсСдСаааа	60
даааасдсдЕ	даааТааЕдс	дСсСдасааа	ддСЕаддЪсд	дсЕдссСССа	аЪсааЕасса	120
аадЕддЪссс	ЪассасдаЕд	дааааас£д£	дсадТсддТО	£ддс£ССССс	Ъдасдаасаа	180
аЕаадаЪТсд	Ьддссдасад	дбдддддЬсс	ассаЪдЕдаа	ддсаСсССса	дасЬссаа1:а	240
аГддадсаа!;	дасд£ааддд	сТСасдааа^	аадЬаадддС	адЫЪдддаа	аСдСссасСс	300
асссд£сад£	сСаЕаааЕас	ГСадссссСс	ссСсаТСдТС	аадддадсаа	аа£с£садад	360
адабадТссЬ	ададададаа	адададсаад	ЪадссЪадаа	дСадСсаадд	сддсдаадЕа	420
Ъ^саддсадд	Сддссаддаа	даадаааадс	саадасдасд	аааасаддСа	ададсЕаадс	480
ТТЬс^саГс!:	сааадагда!:	£сС£даСдаС	ТЪЕЬд^сЬсс	асддЪссдЪа	Ъадда£сасЕ	540
дааоъдаЕаа	аЕаЪсаЬаЬд	дЪЪЪдСаСаа	аасссдабаЕ	Ъ£ааа£с(:д£	аТсаЕЕсЪдЪ	600
ЬТдааТаааа	сСЬдаЬасЫ;	'Ьд'ЬЪддадСс	дСССдГаааа	асабааасаа	И^аЕааЕсЬд	660
ГСааааас						668

<210>

<211>

632 <212>

ДНК <213>

Вирус желтого скручивания листьев цестровых <400>

сЬддсадаса аадГддсада са£ас£д£сс сасааа^даа дасддааЬсС дСаааадааа асдсдодааа

ЕааЪдсдТсЕ дасаааддЕЕ аддТсддсЬд ссЬЪЕааЕса аСассааад£

120 дд6.сссЬасс асдаГддааа аас^д^дсад

Осдд£С£ддс ^СЁЁХсЬдас даасаааЕаа

180 да^СсдЕддс сдасаддЕдд ддд^ссасса

ЕдЪдааддса

ЕсЕЕсадасЕ ссааЕааЪдд

240 адсааЕдасд

ЕаадддсЕЕа сдаааЕаадЕ ааддд£ад1Л

ТдддаааЕдЕ ссас£сассс

300 дЕсадЕсСаЬ ааа£ас££ад ссссСссс£с аЕСдЕГаадд дадсааааЕс

ГсадададаЪ

360 ад£ссЕадад ададааадад адсаадЕадс сГадаадбад

Ссааддсддс даад£а££са

420 ддсаддСддс саддаадаад аааадссаад асдасдаааа садд£аадад с^аадсЕЪЕс

480

ЕсаСсСсааа да£да££с££ даСда£££ТЛ д£с£ссасдд

1ссдСа£адд аЕсасЪдааС

540

- 30 006761

ЕдаВаааСаВ сакакддккк дкакаааасс сдакакЛкаа аЪсСдЪаЕса ЪксВдВДВда 600 акаааасккд акаскккдкк ддадксдккХ д£ 632 <210> 21 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 21 сссдсСдсад аксдкксааа сасскддс 28 <210> 22 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 22 сссдаадсЫ СсСададаЪс ГадГаас 27 <210> 23 <211> 41 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 23 дддсддаСсс дсаЕдсаВдВ сГСааддВаа дс£сас£аад д 41 <210> 24 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 24 ссдсдсЕдса ддсСдсСЬЬс аадсаадСЁс Вдсд 34 <210> 25 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид

- 31 006761 <400> 25

СВдададсСс дСССааЕРас Бддсадасаа адСдд 35 <210> 26 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 26 сьдасБдсад дТСТаСдССС РРасааасда сСсс 34 <210> 27 <211> 137 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: сайт множественного клонирования АСЫИК <400> 27 дсддссдсЕс сддаССсдаа ССааЕЕаасд СасдаадсББ дсаСдссСдс адБдаСсасс 60 аГддЛсдасС сЕададдаСс сссдддРасс дадсЛсдааБ бсддсдсдсс сааЬЕдаВРЪ 120 аааЪддссдс Сдсддсс 137 <210> 28 <211> 216 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: сайт множественного клонирования В1СЫЫК <400> 28 ддссдсадсд дссаРСРааа БсааЪЪдддс дсдссдааРБ сдадсРсддБ асссдддда!60 ссСсСададЬ сдассаСддЕ даЛсасЕдса ддсаСдсаад сСЕсдБасдЪ ЪааСбааРБс120 дааРссддад сддссдсасд сдЪдддсссд £Р1ааассЪс дададаБсРд сБадсссСдс180 аддаааВРСа ссддВдсссд ддсддссадс аЕддсс216 <210> 29 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 29 сдсддаСссС ддсадасааа дБддсада 28 <210> 30 <211> 26 <212> ДНК

- 32 006761 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 30 сдсддаБссБ асББсБаддс БасББд 26 <210> 31 <211> 7195 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

вектор рЫОУ2804 <400> 31

дБПБасссдс	сааБаБаБсс	БдБсааасас	БдаБадБББа	аасСдааддс	дддааасдас	60
ааБсБдаБса	Бдадсддада	аББаадддад	БсасдББаБд	асссссдссд	аЕдасдсддд	120
асаадссдББ	ББасдБББдд	аасБдасада	ассдсаасдс	БдсаддааББ	ддссдсадсд	180
дссаБЕБааа	БсааББдддс	дсдБасдБад	сасБадБдсд	сдаБсдсББа	аББаадсддс	240
дсдссБааад	сББдсаБдсс	БдсаддБсда	сБсБададда	БссссдаБса	БдсааааасБ	300
саББаасБса	дБдсаааасБ	аБдссБдддд	садсаааасд	дсдББдасБд	аасБББаБдд	360
БаБддааааБ	ссдБссадсс	адссдаБддс	сдадсБдБдд	аБдддсдсас	аЕссдаааад	420
садББсасда	дБдсадааБд	ссдссддада	БаБсдБББса	сБдсдБдаБд	БдаББдадад	480
БдаБаааБсд	асБсБдсБсд	дададдссдБ	Бдссааасдс	БББддсдаас	БдссБББссБ	540
дББсааадса	ББаБдсдсад	сасадссасБ	сБссаББсад	дББсаБссаа	асааасасаа	600
ББсБдаааБс	ддББББдсса	аадааааБдс	сдсаддБаБс	ссдаБддаБд	ссдссдадсд	660
БаасСаБааа	даБссБаасс	асаадссдда	дсБддБББББ	дсдсБдасдс	сБББссББдс	720
даБдаасдсд	БББсдБдааБ	БББссдадаБ	БдБсБсссБа	ссссадссдд	БсдсаддБдс	780
асаБссддсд	аББдсБсасБ	ББББасааса	дссБдаБдсс	даасдПББаа	дсдаасБдББ	840
сдссадссБд	ББдааБаБдс	адддБдаада	ааааБсссдс	дсдсБддсда	ББББааааБс	900
ддсссБсдаБ	адссадсадд	дПдаассдБд	дсааасдаББ	сдБББааБББ	сБдааБББСа	960
сссддаадас	адсддБсБдБ	БсБссссдсБ	аББдсБдааБ	дБддБдаааБ	БдаасссБдд	1020
сдаадсдаБд	ББссБдББсд	сБдааасасс	дсасдсББас	сБдсааддсд	БддсдсБдда	1080
адБдаБддса	аасБссдаЕа	асдБдсБдсд	ЕдсдддБсБд	асдссБаааБ	асаББдаБаБ	1140
БссддаасБд	дББдссааБд	БдаааББсда	адссааассд	дсБаассадБ	БдББдассса	1200
дссддБдааа	сааддСдсад	аасБддасББ	сссдаСБсса	дБддаБдаББ	ББдссББсБс	1260
дсБдсаБдас	сББадБдаБа	аадааассас	саББадссад	сададБдссд	ссаБББЕдББ	1320
сБдсдБсдаа	ддсдаБдсаа	сдББдБддаа	аддББсБсад	садББасадс	БЕааассддд	1380
БдааБсадсд	БББаББдссд	ссаасдааБс	ассддБдасБ	дБсаааддсс	асддссдБББ	1440
адсдсдБдББ	Басаасаадс	БдБаададсБ	БасБдааааа	аББаасаБсБ	сББдсБаадс	1500
БдддадсБсБ	адаЬссссда	аБББссссда	БсдББсааас	аБББддсааБ	ааадБББсББ	1560
аадаББдааБ	ссБдББдссд	дБсББдсдаБ	даББаБсаСа	БааБББсБдБ	БдааББасдБ	1620
БаадсаБдБа	аБааББааса	БдБааБдсаБ	дасдББаБСБ	аБдадаБддд	БББББаБдаБ	1680
БададБсссд	сааББаБаса	БББааБасдс	даБадаааас	ааааБаБадс	дсдсааасБа	1740
ддаБаааББа	Бсдсдсдсдд	БдБсаБсБаБ	дББасСадаБ	сдддааББдд	дБассаБдсс	1800
сдддсддсса	дсаБддссдБ	аБссдсааБд	БдББаББаад	ББдБсБаадс	дБсааБББдБ	1860
ББасассаса	аБаБаБссБд	ссассадсса	дссаасадсБ	ссссдассдд	садсБсддса	1920

- 33 006761

сааааТсасс	асбсдабаса	ддсадсссаб	садааббааб	ЬсксаЪдЬЬЕ	дасадс££а£	1980
саЕсдасбдс	асддСдсасс	ааЕдсЕСсЬд	дсдбсаддса	дссабсддаа	дсбдбддба!;	2040
ддсбдбдсад	дбсдбааабс	асбдсабааб	бсдбдбсдсб	сааддсдсас	бсссдЪЪсбд	2100
дабаабдббб	бьсдсдссда	сабсабаасд	дббсбддсаа	аЪаЬЪсЬдаа	аСдадскдкк	2160
дасаабкааб	сабссддсбс	дбабаабдбд	Ьддаакбдбд	адсддабаас	аабббсасас	2220
аддааасада	ссабдаддда	адсд£Сдабс	дссдаадбаЪ	сдасбсаасЪ	аСсададдТа	2280
д£6ддсд£са	Есдадсдсса	Есксдаассд	асдббдсСдд	ссдбасаббб	дьасддсбсс	2340
дсадбддабд	дсддссбдаа	дссасасадб	дакаЬЬдакк	СдсСдд£6ас	ддбдассдЕа	2400
аддсббдабд	ааасаасдсд	дсдадсбььд	абсаасдасс	Ъбббддааас	ббсддсббсс	2460
ссСддадада	дсдадаббсб	ссдсдсбдба	даадЬсасса	ббдССдбдса	сдасдасабс	2520
асьссдСддс	дббабссадс	Ьаадсдсдаа	сЪдсааМЛд	дадаабддса	дсдсааЬдас	2580
абХсббдсад	дСаЕсббсда	дссадссасд	аЕсдасаббд	абсбддсбаЬ	сббдсЕдаса	2640
ааадсаадад	аасабадсдб	бдссббддба	ддбссадсдд	сддаддаасб	сбббдабссд	2700
д16ссбдаас	аддабсбабб	ЪдаддсдсЕа	аабдааассЪ	баасдсбабд	даасбсдссд	2760
сссдасбддд	сбддсдабда	дсдаааЕдба	дСдсббасдб	бдбсссдсаб	ббддбасадс	2В20
дсадСаассд	дсаааабсдс	дссдааддаЕ	дЪсдсЕдссд	асбдддсааб	ддадсдссбд	2880
ссддсссадб	абсадсссдС	сабасббдаа	дсбаддсадд	сЕЕабсббдд	асаадаадаб	2940
сдсббддссб	сдсдсдсада	бсадббддаа	даабббдббс	асбасдбдаа	аддададабс	3000
ассааадбад	бсддсаааба	аадсбсбадб	ддабсбссдб	асссссдддд	дабсбддсбс	3060
дсддсддасд	сасдасдссд	дддсдадасс	аЪаддсдаЬс	Сссбааабса	аьадбадсбд	3120
баассбсдаа	дсдбббсасб	бдбаасаасд	аЕЪдадаабб	ЫЪдЬсаЪаа	ааккдааака	3180
сЬСддСЕсдс	аитдкса	Ессдсддбса	дссдсааббс	кдасдаассд	сссаЪЪЪадс	3240
ЪддадабдаТ	ЬдбасабссЪ	бсасдбдааа	абббсЪсаад	сдсбдбдаас	аадддббсад	3300
аЪЕббадабб	даааддСдад	ссд(Лдааас	асдССсбТсб	бдбсдабдас	дасдбсдсба	3360
Сдсддсабсб	баббаЬЬдаа	бассббасда	бссасдссСб	сааад£дасс	дсддбадссд	3420
асадсассса	дЬЪсасаада	дбасСсбсбб	ссдсдасддГ	сдаСдбсдСд	дббдббдабс	3480
СаааЬССадд	Гсдбдаадаб	дддсСсдада	бсдббсдбаа	бсбддсддса	аад£с£да£а	3540
ЬЪссаабсаб	аа£Са£сад£	ддсдассдсс	£6даддадас	ддабааадбб	дбТдсасбсд	3600
адсбаддадс	аадЁдаСНЕЕ	аСсдс£аадс	сдббсадЬаб	садададббб	сЪадсасдса	3660
ЬСсдддССдс	сббдсдсдбд	сдссссаасд	ббдбссдсбс	сааадассда	сддбсбЪЪбб	3720
дбгббасбда	скддасаси	аабсбсаддс	аасдбсдсбб	дабдбссдаа	дсЬддсддЬд	3780
аддбдааасб	Ьасддсаддб	дадььсааЬс	ЪЪсбссбсдс	д6.6666.адад	ааассссдсд	3840
асдббсбабс	дсдсдадсаа	скбсбсаТбд	ссадбсдадб	асдсдасдад	даддбЪбабд	3900
асаддад^аЕ	адабдббсбс	аЪЬЬкдаддс	бдсдссдсаа	асббдаддса	дабссдбсаа	3960
дсссбсаасб	дабаааааСЭ	дсаададдЪд	ссддббабМ;	сЕЫдасдсд	дасдбдсадд	4020
ЪТксдсасдд	ддддасдабд	дсадссбдад	ссааЕЕссса	дабссссдад	дааЕсддсдС	4080
дадсддбсдс	ааассабссд	дсссддЪаса	аабсддсдсд	дсдсбдддбд	аЕдассСддЪ	4140
ддадаадббд	ааддссдсдс	аддссдссса	дсддсаасдс	абсдаддсад	аадсасдссс	4200
сддбдааТсд	Еддсаадсдд	ссдсбдабсд	аабссдсааа	даабсссддс	аассдссддс	4260
адссддбдсд	ссдбсдабба	ддаадссдсс	саадддсдас	дадсаассад	аееСккСсдС	4320
СссдаЬдсЕс	бабдасдбдд	дсасссдсда	ЪадЬсдсадс	абсабддасд	СддссдЪЕЕЕ	4380
ссдбсбдбсд	аадсдбдасс	дасдадсбдд	сдаддЬдабс	сдсгасдадс	ССссадасдд	4440
дсасдбадад	дкккссдсад	ддссддссдд	сабддссадб	дЪдСдддаЪЪ	асдассСдд£	4500
асСдаСддсд	д£Ъ£ссса£с	ЕаассдааЕс	сабдаассда	Ьассдддаад	ддаадддада	4560
саадсссддс	сдсд£д££сс	д£ссасасд£	Едсддасдба	сСсаадЕЪск	дссддсдадс	4620
сдабддсдда	аадсадааад	асдассСддЬ	адааассЪдс	аббсддбЪаа	асассасдса	4680

- 34 006761

сдСЪдссаЬд	садсдСасда	адааддссаа	даасддссдс	сСддСдасдд	СаСссдаддд	4740
СдаадссССд	аССадссдсС	асаадаСсдС	ааададсдаа	ассдддсддс	сддадСасаС	4800
сдадаСсдад	сСадсСдаСС	ддаСдСассд	сдадаСсаса	дааддсаада	асссддасдГ	4860
дсСдасддСС	сассссдаСС	асСШСдаС	сдаСсссддс	аСсддссдСС	ССсСсСассд	4920
ссСддсасдс	сдсдссдсад	дсааддсада	адссадаСдд	ССдССсаада	сдаСсСасда	4980
асдсадСддс	адсдссддад	адССсаадаа	дССсСдСССс	ассдСдсдса	адсСдаСсдд	5040
дСсаааСдас	сСдссддадС	асдаСГСдаа	ддаддаддсд	дддсаддсСд	дсссдаСссС	5100
адСсаСдсдс	Сассдсаасс	СдаСсдаддд	сдаадсаСсс	дссддССссС	ааСдСасдда	5160
дсадаСдсСа	дддсаааССд	сссСадсадд	ддаааааддС	сдааааддСс	СсСССссСдС	5220
ддаСадсасд	СасаССддда	асссааадсс	дСасаССддд	аассддаасс	сдСасаССдд	5280
даасссааад	ссдСасаССд	ддаассддСс	асасаСдСаа	дСдасСдаСа	Саааададаа	5340
ааааддсдаС	ССЛСссдссС	аааасГсССС	аааасССаСС	аааасСсГСа	ааасссдссС.	5400
ддссСдСдса	СаасСдСсСд	дссадсдсас	адссдаадад	сСдсааааад	сдссГасссС	5460
СсддСсдсСд	сдсСсссЪас	дссссдссдс	ССсдсдСсдд	ссСаСсдсдд	ссдсСддссд	5520
сСсаааааСд	дсСддссСас	ддссаддсаа	СсСассаддд	сдсддасаад	ссдсдссдСс	5580
дссасСсдас	сдссддсдсС	даддЬсСдсс	СсдСдаадаа	ддГдССдсСд	асСсаСасса	5640
ддссСдааСс	дссссаСсаЪ	ссадссадаа	адСдадддад	ссасддССда	СдададсССС	5700
дССдСаддСд	дассадССдд	СдаССССдаа	сСШдсССС	дссасддаас	ддСсСдсдСС	5760
дСсдддаада	СдсдгдаСсС	даСссССсаа	сСсадсаааа	дССсдаСССа	ССсаасааад	5820
ссдссдСссс	дСсаадСсад	сдСааСдсСс	СдссадСдСС	асаассааСС	аассааССсС	5880
даССадаааа	асСсаСсдад	саСсаааСда	аасСдсааСС	СаССсаСаСс	аддаССаГса	5940
аСассаСаСС	СЬСдааааад	ссдССЬсСдС	ааСдааддад	аааасЬсасс	даддсадССс	6000
саСаддаСдд	саадаСссСд	дСаСсддСсС	дсдаССссда	сСсдСссаас	аСсааСасаа	6060
ссСаССааСС	СссссСсдСс	аааааСаадд	ССаСсаадСд	адаааСсасс	аСдадСдасд	6120
асСдааЬссд	дСдадааСдд	саааадсСсС	дсаССааСда	аСсддссаас	дсдсддддад	6180
аддсддСССд	сдСаССдддс	дсСсССссдс	ССссСсдсСс	асСдасСсдс	СдсдсСсддС	6240
сдССсддсСд	сддсдадсдд	СаСсадсСса	сЪсаааддсд	дСааГасддС	саСссасада	6300
аСсаддддаС	аасдсаддаа	адаасаСдСд	адсааааддс	садсаааадд	ссаддаассд	6360
Саааааддсс	дсдСГдсСдд	сдСССССсса	СаддсСссдс	сссссСдасд	адсаСсасаа	6420
аааСсдасдс	СсаадЪсада	ддСддсдааа	сссдасадда	сСаСааадаС	ассаддсдСС	6480
СсссссСдда	адсГсссСсд	СдсдсСсГсс	СдССссдасс	сЪдссдсССа	ссддаГассС	6540
дСссдссССС	сСсссССсдд	даадсдсддс	дсСССсСсаГ	адсСсасдсС	дГаддСаГсС	6600
садсссддСд	СаддГсдССс	дсСссаадсС	дддсСдСдСд	сасдаасссс	ссдССсадсс	6660
сдассдсЪдс	дссССаСссд	дСаасСаСсд	СсССдадСсс	аасссддГаа	дасасдассс	6720
аСсдссасСд	дсадсадсса	сСддГаасад	даССадсада	дсдаддСаСд	ГаддсддГдс	6780
ЪасададГСс	ССдаадСддС	ддссСаасСа	сддсСасасС	адаадаасад	гаСССддГаС	6840
сСдсдсСсСд	сЪдаадссад	ССассССсдд	ааааададСС	ддСадсСсСС	даСссддсаа	6900
асааассасс	дсЪддЪадсд	дСддСССССС	СдСССдсаад	садсадаССа	сдсдсадааа	6960
ааааддаСсС	саадаадабс	сСССдаЬсСС	ССсСасдддд	СсСдасдсСс	адСддаасда	7020
ааасСсасдС	СаадддаССС	ГддСсасдад	аССаСсаааа	аддаГсССса	ссСадаСссС	7080
ТСГдаСссдд	ааССааССсс	СдСддССддс	аСдсасаГас	аааСддасда	асддаСааас	7140
сГГССсасдс	ссССССаааС	аСссдаССаС	ГсСаасааас	дсСсССССсС	сЪСад	7195

<210> 32 <211> 4224 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 35 006761 <220>

<22 3> Описание искусственной последовательности:

вектор ρΝθν3604 <400>

адсЕЕдсаЕд	ссЕдсаддЕс	дасЕсЕадад	даЕссссдаЕ	саЕдсааааа	сЕсаЕЕаасЕ	60
садЕдсаааа	сЕаЕдссЕдд	ддсадсаааа	сддсдЕЕдас	ЕдаасЕЕЕаЕ	ддЕаЕддааа	120
аЕссдЕссад	ссадссдаЕд	дссдадсЕдЕ	ддаЕдддсдс	асаЕссдааа	адсадЕЕсас	180
дадЕдсадаа	Едссдссдда	даЕаЕсдЕЕЕ	сасЕдсдЕда	ЕдЕдаЕЕдад	адЕдаЕаааЕ	240
сдасЕсЕдсЕ	сддададдсс	дЕЕдссааас	дсЕЕЕддсда	асЕдссЕЕЕс	сЕдЕЕсааад	300
ЕаЕЕаЕдсдс	адсасадсса	сЕсЕссаЕЕс	аддЕЕсаЕсс	ааасааасас	ааЕЕсЕдааа	360
ЕсддЕЕЕЕдс	сааадааааб	дссдсаддЕа	ЕсссдаЕдда	Едссдссдад	сдЕаасЕаЕа	420
аадаЕссЕаа	ссасаадссд	дадсЕддЕЕЕ	ЕЕдсдсЕдас	дссЕЕЕссЕЕ	дсдаЕдаасд	480
сдЕЕЕсдЕда	аЕЕЕЕссдад	аЕЕдЕсЕссс	ЕасЕссадсс	ддЕсдсаддЕ	дсасаЕссдд	540
сдаЕЕдсЕса	сЕЕЕЕЕасаа	садссЕдаЕд	ссдаасдЕЕЕ	аадсдаасЕд	ЕЕсдссадсс	600
ЕдЕЕдааЕаЕ	дсадддЕдаа	даааааЕссс	дсдсдсЕддс	даЕЕЕЕаааа	ЕсддсссЕсд	660
аЕадссадса	дддЕдаассд	Еддсааасда	ЕЕсдЕЕЕааЕ	ЕЕсЕдааЕЕЕ	Еасссддаад	720
асадсддЕсЕ	дЕЕсЕссссд	сЕаЕЕдсЕда	аЕдЕддЕдаа	аЕЕдаасссЕ	ддсдаадсда	780
ЕдЕЕссЕдЕЕ	сдсЕдаааса	ссдсасдсЕЕ	ассЕдсаадд	сдЕддсдсЕд	даадЕдаЕдд	840
сааасЕссда	ЕаасдЕдсЕд	сдЕдсдддЕс	ЕдасдссЕаа	аЕасаЕЕдаЕ	аЕЕссддаас	900
ЕддЕЕдссаа	ЕдЕдаааЕЕс	даадссааас	сддсЕаасса	дЕЕдЕЕдасс	садссддЕда	960

ЕЕсссдаЕЕс

ЕсдсЕдсаЕд аасааддЕдс адаасЕддас садЕддаЕда

ЕЕЕЕдссЕЕс

1020 ассЕЕадЕда

Еааадааасс ассаЕЕадсс адсададЕдс сдссаЕЕЕЕд

ЕЕсЕдсдЕсд

1090 ааддсдаЕдс аасдЕЕдЕдд аааддЕЕсЕс адсадЕЕаса дсЕЕааассд ддЕдааЕсад

1140 сдЕЕЕаЕЕдс сдссаасдаа

ЕсассддЕда сЕдЕсааадд ссасддссдЕ

ЕЕадсдсдЕд

1200

ЕЕЕасаасаа дсЕдЕаадад сЕЕасЕдааа аааЕЕаасаЕ сЕсЕЕдсЕаа дсЕдддадсЕ

1260 сЕадаЕсссс дааЕЕЕсссс даЕсдЕЕсаа асаЕЕЕддса аЕааадЕЕЕс

ЕЕаадаЕЕда

1320 аЕссЕдЕЕдс сддЕсЕЕдсд аЕдаЕЕаЕса

ЕаЕааЕЕЕсЕ дЕЕдааЕЕас дЕЕаадсаЕд

1380

ЕааЕааЕЕаа саЕдЕааЕдс аЕдасдЕЕаЕ

ЕЕаЕдадаЕд ддЕЕЕЕЕаЕд аЕЕададЕсс

1440 сдсааЕЕаЕа саЕЕЕааЕас дсдаЕадааа асааааЕаЕа дсдсдсааас

ЕаддаЕаааЕ

1500

ЕаЕсдсдсдс ддЕдЕсаЕсЕ аЕдЕЕасЕад аЕсдддааЕЕ дддЕассдаа

ЕЕсасЕддсс

1560 дЕсдЕЕЕЕас аасдЕсдЕда сЕдддаааас ссЕддсдЕЕа сссаасЕЕаа

ЕсдссЕЕдса

1620 дсасаЕсссс саасадЕЕдс сЕЕЕсдссад дсадсСЕдаа сЕддсдЕааЕ

ЕддсдааЕдд адсдаададд сссдсассда сЕдЕдсддЕа

ЕЕЕсасассд саЕаЕддЕдс

ЕадЕЕаадсс адссссдаса сссдссааса сЕсссддсаЕ ссдсЕЕасад асаадсЕдЕд

ЕЕЕЕсассдЕ саЕсассдаа асдсдсдада

ЕаддЕЕааЕд

ЕсаЕдаЕааЕ ааЕддЕЕЕсЕ дЕдсдсддаа ссссЕаЕЕЕд

ЕЕЕаЕЕЕЕЕс адасааЕаас ссЕдаЕаааЕ дсЕЕсааЕдд аддаададЕа

ЕдадЕаЕЕса асаЕЕЕссдЕ сдссЕдаЕдс асЕсЕсадЕа сссдсЕдасд ассдЕсЕссд сдааадддсс

ЕадасдЕсад

ЕаааЕасаЕЕ сдсдссдсдд дЕсдсссЕЕа ддЕаЕЕЕЕсЕ сааЕсЕдсЕс сдсссЕдасд ддадсЕдсаЕ

ЕсдЕдаЕасд дЕддсасЕЕЕ саааЕаЕдЕа ссдсЕЕаада

ЕсссЕЕЕЕЕ

ЕдссЕЕссЕд

ЕЕЕЕЕдсЕса сссадааасд сЕддЕдааад

ЕаааадаЕдс

ЕЕдддЕдсас дадЕдддЕЕа саЕсдаасЕд даЕсЕсааса дсддЕаадаЕ

ЕЕЕсдссссд аадаасдЕЕЕ

ЕссааЕдаЕд адсасЕЕЕЕа аадЕЕсЕдсЕ дЕаЕЕаЕссс дЕаЕЕдасдс сдддсаадад саасЕсддЕс дссдсаЕаса ааЕдасЕЕдд

ЕЕдадЕасЕс ассадЕсаса даааадсаЕс

ЕЕасддаЕдд

ЕсдсссЕЕсс ссЕЕасдсаЕ

ЕдаЕдссдса ддсЕЕдЕсЕд дЕдЕсададд ссЕаЕЕЕЕЕа

ЕсддддаааЕ

ЕссдсЕсаЕд аЕаЕЕдаааа

ЕдсддсаЕЕЕ

ЕдаадаЕсад ссЕЕдададЕ аЕдйддсдсд сЕаЕЕсЕсад саЕдасадЕа

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

- 36 006761

ададаа££а1:	дсад£дс£дс	са^аассаЪд	адГдабааса	сЕдсддссаа	сССасССсСд	2580
асаасдабсд	даддассдаа	ддадсеаасс	дсЪЕСШдс	асаасаСддд	ддаЬсаСдЪа	2640
асСсдссГГд	аЪсдГГддда	ассддадс^д	ааЕдаадсса	Сассааасда	сдадсдьдас	2700
ассасдаЪдс	с£д1адсааб	ддсаасаасд	ЬГдсдсааас	СаМаасСдд	сдаасСасЪЕ	2760
асСсСадс££	сссддсааса	а£Ьаа1адас	ЕддаЕддадд	сддаЕааад!	Сдсаддасса	2820
сИсЕдсдсС	сддсссЪЕсс	ддсГддсСдд	СС£а£Едс1д	аСаааГсСдд	адссддСдад	2880
сдбдддЬсбс	дсддСаСсаЬ	1дсадсасбд	дддссадабд	д!аадссс£с	ссд£аСсдГа	2940
деьаСссаса	сдасддддад	бсаддсаасб	абддаСдаас	дааабадаса	дабсдсбдад	3000
аЬаддЪдссС	сасСдаССаа	дсаЪСдд^аа	сбдбсадасс	аадШасГс	аСабабасСС	3060
ЬадаЬГда££	СаааасИса	ПСССааШ	ааааддаЪсС	аддСдаада!	ссМСМдаЕ	3120
ааЪсбсаГда	ссааааСссс	Маасдбдад	«МсдИсс	асСдадсд£с	адассссдба	3180
даааадаИса	ааддаСсССс	ИдадаСссС	СШЬЬсЪдс	дсд!ааСс£д	с£дсС£дсаа	3240
асааааааас	сассдсбасс	адсддеддМ	бдЪЬСдссдд	абсаададс!	ассаасСсГС	3300
бббссдаадд	СаасЬддсЬГ	садсададсд	садабассаа	аЕасЕдИссС	ЮСадИдГад	3360
ссдбадСГад	дссассасСС	саадаасесь	дСадсассдс	с£аса1ассС	сдсбс1дс6а	3420
аСссбдЬСас	садЪддсЪдс	Сдссад^ддс	дабаадСсд!	дбсббассдд	дЬСддас^са	3480
адасдаСадС	СассддаСаа	ддсдсадсдд	Ссдддсбдаа	сддддддССс	дСдсасасад	3540
сссадсССдд	адсдаасдас	сСасассдаа	сЬдада1;асс	басадсдбда	дсбабдадаа	3600
адсдссасдс	Гбсссдаадд	дадаааддсд	дасаддИаЕс	сддбаадсдд	садддбсдда	3660
асаддададс	дсасдаддда	дсСЕссаддд	ддааасдссЪ	дд!а£сШа	1адСсс£дЕс	3720
дддШсдсс	асс£с£дас£	СдадсдГсда	СГМГдСдаЪ	дс£сд£садд	ддддсддадс	3780
сСаСддаааа	асдссадсаа	сдсддссМГ	МасддЬГсс	СддссССГХд	сСддссИ£1Ь	3840
дсСсаса£дС	ШШссСдс	д£саЪсссс£	даИсбдЪдд	аСаассдИаТ:	СассдссШ	3900
дадЬдадсЬд	абассдсСсд	ссдсадссда	асдассдадс	дсадсдадбс	адЪдадсдад	3960
даадсддаад	адсИаадсд	дссдсддсдс	дссдсссаа!	асдсааассд	сс£с£ссссд	4020
сдсдССддсс	даШаШаа	ЕдсадсСддс	асдасаддС!	СсссдасСдд	ааадсдддса	4080
дЕдадсдсаа	сдсааЕЪааГ	дИдадССадс	ЕсасСса££а	ддсассссад	дс1ЪЪасас£	4140
МаСдсЕесс	ддсЪсдЪаЪд	ССдСдЕддаа	ЕбдЬдадсдд	абаасааЕ££	сасасаддаа	4200

асадс1:аСда ссаСдаЕНас дсса 4224 <210> 33 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 33 ссаЬсдСддС аСССддСаСС д 21 <210> 34 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 34

- 37 006761

саабассааа ЬассасдаЬд д	21
<210>	35
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Описание искусственной последовательности:
	олигонуклеотид
<400>	35

сдЕддСадсд адсасЬЬЬдд С 21 <210> 36 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

олигонуклеотид <400> 36 аадСдсЕсдс ЕассасдаСд д21 <210>37 <211> 912.

<212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственная последовательность синтетического гена ОГР, содержащая интрон <400> 37

аСдадсаадд	дсдаддадсЕ	дЪЕсассддс	дЕддЕдссаа	ЬссбддЕдда	дсСддасддс	60
дасд£даасд	дссасаадЕС	садсдСдадс	ддсдадддсд	адддсдасдс	дассЕасддс	120
аадс£дассс	ГдаадССсаС	сЬдЪассасс	ддсаадсСсс	сддЪсссдСд	дссдасссЕд	180
дПдассассЕ	Ьсассбасдд	сдбдсадЬдС	ббсадссдсЬ	асссддасса	саЕдаадсдс	240
сасдасЕ!сЕ	Есаададсдс	саЬдссддад	ддсбасдбаа	д-СЬСсбдсСб	сГассСССда	300
СаСаСаЕаЕа	а^ааЕЬаЪса	ССааС-СадЕа	дЕааЪаЪааС	аСЕЕсаааСа	ЫгСССССсаа	360
ааСаааадаа	СдСадЕаЕаЕ	адсааббдсС	ИЬсЕдЕадб	ЪЕаЬаадЕд!	дСабаСРРба	420
аСЕСаСаасб	СС(:с£аа£аЕ	аЕдассаааа	ЪССдЪЪдабд	Ъдсаддбдса	ддадсдсасс	480
аЕсадсССса	аддасдасдд	саасСасаад	асссдсдссд	аддбдаадЬЕ	сдадддсдас	540
асас£ад£да	ассдсаСсда	дсСдаадддс	абсдасССса	аддаддасдд	саасаЕссЕд	600
ддссасаадс	ЬддадСасаа	сСасаасадс	сасаасдбдб	асабсассдс	ддасаадсад	660
аадаасддса	Ъсааддсдаа	сССсаадабс	сдссасааса	Есдаддасдд	садсдбдсад	720
сЕддссдасс	асЕассадса	даасассссд	аСсддсдасд	дСссСдСдсС	дсЕдссддас	780
аассасЕасс	бдадсассса	дадсдсссЕд	адсааддасс	сдаасдадаа	дсдсдассас	840
аЕддЕдсбдс	СддадССсдС	дассдссдсс	ддсаЬсассс	асддсаСдда	сдадсСдЬас	900
ааддРРаасС	ад					912

<210> 38 <211> 2001 <212> ДНК

- 38 006761 <213> Искусственная <22О>

<22 3> Искусственная последовательность гена сиз, содержащая интрон <400> 36

абддбссдЬс	сЕдСадааас	сссаасссдС	даааСсаааа	аасЕсдасдд	ссЕдЕдддса	60
ЕЕсадбсЬдд	абсдсдаааа	сРдСддааЪЪ	даЬсадсдЕЪ	ддГдддааад	сдсдИЕасаа	120
дааадссддд	сааССдсСдС	дссаддсад^	£££аасда6с	адЕЕсдссда	ЪдсадабаЕЪ	180
сд^ааССаЕд	сдддсаасдЕ	сЕддЕаЕсад	сдсдаадбсЕ	СбаЬассдаа	аддЬЬдддса	240
ддссадсдСа	ЪсдбдсЕдсд	ЕЕЕсдабдсд	дСсасЕсаЕб	асддсаааде	дЕдддЕсааЕ	300
ааЕсаддаад	Сдабддадса	Есадддсддс	ЬаЕасдссаС	ЪЕдаадссда	СдЪсасдссд	360
бабдССаббд	ссдддаааад	СдЬасдбаад	ЪбЕсбдсССс	бассСССдаб	абабабаЬаа	420
£аахХаЕсаб	гааЕЕадЬад	ЕааЬабааЪа	ΕΐίοΗΒβΐΗΈ	ЪбХЪЪЪсааа	аЕаааадаар	480
дЬадСаЕаса	дсааШдсЕЕ	ССсСдЬадсь	£аСаадЪдСд	ьабаСЕббаа	£1;Са1аасЬб	540
ЬЬсСаа^аба	Ъдассаааае	££д£6да£дб	дсаддбаЬса	ссдЫзбдбд!:	даасаасдаа	600
сСдаасбддс	адасЕаЬссс	дссдддааЪд	дбдаЪЬассд	асдаааасдд	саадааааад	660
садсс£1ас£	ессаЪдаЬЬЬ	сигаас1а1	дссддаабсс	а^сдсадсдС	аа6дс1с£ас	720
ассасдссда	асассЕдддЕ	ддасдаТабс	ассдЕддбда	сдсаЕдЕсдс	дсаадасбдб	780
аассасдсдр	сЪдбЬдасбд	дсаддбдд£д	дссааСддРд	абдбсадсдЪ	ЪдаасЕдсд!;	840
даСдсддаЕс	аасаддСддС	£дсаасбдда	сааддсасЕа	дсдддасЕЕС	дсаадСддбд	900
аабссдсасс	ЪсСддсаасс	дддЬдааддб	РаЪсСсЪаЕд	аасСдЕдсдС	сасадссааа	960
адссадасад	адбдбдабаС	сбасссдсбб	сдсдСсддса	бссддРсадб.	ддсадбдаад	1020
ддсдаасадр	Ьссбдаббаа	ссасааассд	ЪбсбасЕССа	сЬддсСССдд	РсдРсаРдаа	1080
даРдсддасЕ	1:дсд1:ддсаа	аддаЬЕсдаъ	аасдбдсбда	СддЕдсасда	ссасдсаЬЕа	1140
абддасЪдда	СЕддддссаа	сбссРассдб	ассЕсдсабб	асссНЕасдс	£даадада6д	1200
с^сдасЕддд	садаЕдааса	ЕддсаЕсдЕд	дЬдаСРдаСд	ааасбдсбдс	ЬдбсддсЕСС	1260
аассГсСсЕЪ	ЪаддсаЕЕдд	бббсдаадсд	ддсаасаадс	сдааадаасР	драсадсдаа	1320
даддсадбса	асддддааас	Псадсаадсд	сасЕЪасадд	сдаЪЬааада	дсЪдабадсд	1380
сдрдасаааа	ассасссаад	сдЬддЬдаЕд	ЪддадРаСЁд	ссаасдаасс	ддабасссд!:	1440
ссдсааддСд	сасдддааЕа	ЕССсдсдсса	с£ддсддаад	саасдсдбаа	асЕсдасссд	1500
асдсдхссда	бсассЬдсдЪ	сааЬдЪааЕд	ЬЕсГдсдасд	сЕсасассда	т.асса!.садс	1560
даРсЕсббЪд	аРдбдсбдбд	ссбдаассдб	ЪаССасддаЪ	ддЪаСдСсса	аадсддсдаб	1620
СЬддааасдд	сададааддб	асбддааааа	даасССсСдд	ссРддсадда	дааасбдсаб	1680
садссдаМа	Ъсабсассда	аСасддсдбд	даСасдббад	ссдддссдса	с£саа£д6ас	1740
ассдасаСдЪ	ддадрдаада	д£а6сад£д£	дсабддсЬдд	асабдСаСса	ссдсд6с£££	1800
даРсдсд^са	дсдссдЪсдЕ	сддбдаасад	дЕаРддааЪЬ	СсдссдаСГС	£дсдассбсд	1860
сааддсаЕаЕ	ЪдсдсдСЕдд	сддЕаасаад	ааадддаЕсС	бсасСсдсда	ссдсааассд	1920
аадЕсддсдд	сРМРсРдсТ	дсааааасдс	Сддасбддса	СдаасЕЪсдд	Ъдааааассд	1980
садсадддад	дсааасааСд	а				2001

<210> 39 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственная последовательность праймера для РСК <400> 39

- 39 006761 сдсддаВГдс СсссЮааса аЪдадд 26 <210> 40 <211> 1618 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственная последовательность кассеты экспрессии СтрЗ-зупСГР1-по5 <400> 40

ЪссЬддсада	сааадСддса	дасаСасЪдЬ	сссасаааЪд	аадаСддааЬ	сСдСаааада	60
ааасдсд£да	ааПааЬдсдЪ	с£дасааадд	ΐίаддСсддс	ЬдссОПаа!	сааЪассааа	120
д1дд1ссс&а	ссасда^дда	аааасСдСдс	адЬсддШд	дсСЬШсЬд	асдаасаааЪ	180
аада16сд£д	дссдасаддЪ	ддддд^ссас	са£д£даадд	саЪсС'Ьсада	сЪссаагаа!:	240
ддадсаабда	сд£аадддсС	ЪасдаааЪаа	д-ЬаадддСад	тдддаааЬ	дСссас£сас	300
ссд1сад1с£	а£ааа1ас£1	адссссЬссс	ОсаПдЫаа	дддадсаааа	ЪсЕсададад	360
аЪадСссСад	адададааад	ададсаад^а	дссЪадаадб	аддаЪссасс	аЬдсСдсада	420
Ьдадсааддд	сдаддадсГд	£1сассддсд	£дд£дссааС	сссддСддад	сЪддасддсд	480
асдСдаасдд	ссасаадЬСс	адсдГдадсд	дсдадддсда	дддсдасдсд	ассСасддса	540
адсЬдасссЬ	даадЬЬсаЬс	Сд£ассассд	дсаадс1ссс	ддЪсссд!дд	ссдасссСдд	600
ЪдассассСЬ	сассСасддс	д£дсад£д££	Ьсадссдс1а	сссддассас	аЬдаадсдсс	660
асдас££ссс	саададсдсс	аЬдссддадд	дсГасдСаад	ССЬсЬдсИс	£асс£££да£	720
аЬаСаЬаГаа	Ъаа1Ьа(:са£	СааНадСад	ХааЪаСааЬа	СС£сааа£а(:	е-ее-е исааа	780
аСаааадаас	дЬадСаСа^а	дсаа£Ъдс(:(:	ИсОдСадЫ:	саЪаад^дСд	£аСа£€£баа	840
£££а1аасМ	ЕСс1аа1а£а	Ъдассаааа£	ИдССдаГдГ	дсаддЪдсад	дадсдсасса	300
ЬсадсЫсаа	ддасдасддс	аасГасаада	сссдсдссда	ддСдаадЬЬс	дадддсдаса	960
сасСад!даа	ссдсабсдад	сбдаадддса	•бсдасЬЪсаа	ддаддасддс	аасаЪссСдд	1020
дссасаадсС	ддад^асаас	Сасаасадсс	асаасд£д£а	саЪсассдсд	дасаадсада	1080
адаасддса^	сааддсдаас	ИсаадаСсс	дссасааса!	сдаддасддс	адсд£дсадс	1140
£ддссдасса	сСассадсад	аасассссда	1сддсдасдд	£сссд1:дс1д	сЕдссддаса	1200
ассасгассь	дадсасссад	адсдсссЕда	дсааддассс	даасдадаад	сдсдассаса	1260
ЪддЬдсСдсЬ	ддадСЬсд^д	ассдссдссд	дса£сассса	сддса£ддас	дадс^д'Ьаса	1320
аддЬбаасба	дадсбсаада	6 с с с с еда а С	ббссссдабс	дСЬсааасаС	ббддсаасаа	1380
ад(й£с1£аа	даЬСдааСсс	СдССдссдд!	сЫдсдаОда	СГаСсаГсСа	аСССсСд1£д	1440
ааЬ£асд1£а	адсаХдСаа!	ааЕСаасаЪд	ЬааДдсаЪда	сдССа£Г£аС	дадаСддд££	1500
ЫХа'Ьда'ЬГа	дадСсссдса	а! ЬаГасаП	ЪааЪасдсда	1адаааасаа	аа£а£адсдс	1560
дсааасОадд	а£аааЪЪаЕс	дсдсдсддЕд	1саСс£а1д1	Ьас£адаСсс	дддааНд	1618

<210> 41 <211> 2730 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственная последовательность кассеты экспрессии СшрЗ-СЮ-поа <400> 41 аддабссбдд садасааадС ддсадасаСа сбдЪсссаса аабдаадабд дааЪсЬд£аа 60

- 40 006761

аадаааасдс	дСдаааЕааг	дсдБсгдаса	ааддггаддЬ	сддсбдссбб	£аа6саа6ас	120
сааадкддкс	ссбассасда	кддаааааск	дбдсадбсдд	Ебкддсбббб	ЪсСдасдаас	180
аааБаадагг	сдЬддссдас	аддЕдддддС	ссассаЬдкд	ааддсакс1:Ъ	садасгссаа	240
Ьаабддадса	а^дасдкаад	ддсЫзасдаа	акаадкаадд	дбадбббддд	ааабдгссас	300
ЬсасссдСса	дгскаСаааЕ	асЕБадсссс	СсссСсаБЕд	ЬЪаадддадс	аааагсгсад	360
ададабадбс	сбадададад	ааадададса	адбадсскад	аад^аддаСс	сссЪсдаддЪ	420
сдассаБддЪ	ссдЪссбдба	дааассссаа	сссдЪдаааЕ	саааааасЕс	дасддссЪдЬ	480
дддсаггсад	ЕсЪддаЪсдс	даааасСдгд	дааСкдагса	дсдЪЪддбдд	дааадсдсдБ	540
касаадааад	ссдддсааСг	дсБдЬдссад	дсадЬкккаа	сдаСсадССс	дссдаЪдсад	600
агаЕЪсдЪаа	гбаСдсдддс	аасдБсСддЕ	аЬсадсдсда	адгсгггаСа	ссдаааддЪЪ	660
дддсаддсса	дсдбабсдбд	сЪдсдггБсд	аЬдсддбсас	ЪсаЪЬасддс	ааадкдгддд	720
гсаабааЪса	ддаадЬдагд	дадсабсадд	дсддсгагас	дссагггдаа	дссдагдЪса	780
сдссдБаБдС	ба'Ьбдссддд	аааадкдбас	дЪаадШсг	дсБСсБассг	ггдаЪаЪаЪа	840
гаЕааЪаагг	аСсаССааББ	адСадгааЪа	ЪааСагггса	аагаггггсг	гсааааЪааа	900
дааЪдЪадЪ <	аЪакадсааг ЕдсСБСгсЕд 1	ЬадИгаЪаа дгдСд£аСа£ МХааЕбгаб	960
аасггЕЪсЪа	акаСаБдасс	аааагггдгг	даЬдЪдсадд	СаЬсассдСЪ	Ъдгдгдааса	1020
асдаасбдаа	с£ддсадас£	аСсссдссдд	даагддЬдаС	гассдасдаа	аасддсаада	1080
аааадсадбс	ггасггссак	дагггсЬЬЪа	асбабдссдд	аакссаксдс	адсдЪааСдс	1140
бсБасассас	дссдаасасс	гдддЪддасд	агаЪсассдб	ддгдасдсаЪ	дбсдсдсаад	1200
асбдбаасса	сдсдЬскдгг	дасСддсадд	ЪддЪддссаа	СддСдаБдСс	адсдЪЬдаас	1260
гдсдгдагдс	ддаЪсаасад	дЪддБгдсаа	сгддасаадд	сасбадсддд	асССГдсаад	1320
гддЪдааЪсс	дсассСсСдд	саассдддЕд	ааддСГаСсС	сСаСдаасСд	гдсдЪсасад	1380
ссаааадсса	дасададСдг	даЬаСсЕасс	сдсПСсдсдБ	сддсаБссдд	гсадЪддсад	1440
Ьдаадддсда	асадСЕссСд	агкаассаса	аассдггсСа	сСССасЪддс	гггддгсдьс	1500
аСдаадабдс	ддасббдсдб	ддсаааддаБ	Бсдагаасдб	дсЬдагддЬд	сасдассасд	1560
саЬЬаагдда	сБддаббддд	дссаасБссг	ассдБассбс	дсабБасссг	ЬасдсЪдаад	1620
адаЬдсЪсда	сЪдддсадаЪ	даасабддса	Ъсдбддбдаг	СдаСдааасг	дсЪдсЪдЪсд	1680
дсЬЬЬаассг	сЬсгггаддс	аЪЪддгггсд	аадсдддсаа	саадссдааа	даасЬдСаса	1740
дсдаададдс	адСсаасддд	дааасБсадс	аадсдсасБС	асаддсдаБЬ	ааададсЪда	1800
ЪадсдсдЕда	сааааассас	ссаадсдЪдд	ЪдаЪдЬддад	Таккдссаас	даассддаба	1860
сссдбссдса	аддБдсасдд	дааЬаггЬсд	сдссасБддс	ддаадсаасд	сдСааасСсд	1920
асссдасдсд	гссдагсасс	гдсдБсааЕд	Саа^дггсЪд	сдасдсЪсас	ассдагасса	1980
Ссадсдабсг	сЕкгдаЪдЬд	сбдЪдссбда	ассдСеабЛа	сддаЪддЕаЪ	дЪссааадсд	2040
сдагггдда аасддсадад ааддбасЬдд ааааадаасС Осбддссбдд саддадааас	2100
ЬдсаЪсадсс	даггагсакс	ассдааЪасд	дсдЪддаСас	дгсадссддд	ссдсасгсаа	2160
ьдЬасассда	сабдбддадС	даададгаЪс	адГдгдсаЪд	дсЪддаЪагд	гаСсассдсд	2220
гсбббдаСсд	сдЬсадсдсс	дбсдЪсддЪд	аасаддСаБд	даагггсдсс	дагчгдсда	2280
ссбсдсаадд	сагаьгдсдс	дггддсддЪа	асаадааадд	дабсбЪсасб	сдсдассдса	2340
аассдаадгс	ддсддсЪЪЪЪ	сЪдсЪдсааа	аасдсСддас	ЕддсаБдаас	ггсддЬдааа	2400
аассдсадса	дддаддсааа	сааБдааСса	асаасЬсЪсс	Ъддсдсасса	ЕсдгсддсБа	2460
садссЬсддд	ааЪЪадаСсс	ссдааССБсс	ссдаСсдЬБс	ааасабббдд	сааСааадгс	2520
Ъсббаада^Б	дааЪссЪдЬЬ	дссддбсбгд	сдаСдаккак	сабабааЕбб	сгдсгдаагг	2580
асдббаадса	гдСаабааБб	аасаБдкааг	дсакдасдеь	аЬкгаЬдада	гдддгггсга	2640
СдаСБададБ	сссдсааЕЕа	БасагггааЕ	асдсдаСада	ааасаааа!а	!адсдсдсаа	2700
асгаддакаа	аббабсдсдс	дсддСдгсаЪ				2730

- 41 006761 <210> 42 <211> 1577 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственная последовательность кассеты экспрессии СтрС-зупСГЯ-поз <400>42

кддсадасаа	адкддсадас	акаскдкссс	асааакдаад	акддаакскд	каааадаааа	60
сдсдкдааак	аакдсдкскд	асаааддкка	ддксддскдс	скккааксаа	кассааадкд	120
дкссскасса	сдакддаааа	аскдкдсадк	сддкккддск	ккккскдасд	аасааакаад	180
акксдкддсс	дасаддкддд	ддкссассак	дкдааддсак	скксадаскс	саакаакдда	240
дсаакдасдк	аадддсккас	дааакаадка	адддкадккк	дддааакдкс	сасксасссд	300
ксадкскака	аакасккадс	ссскссскса	ккдккааддд	адсаасдакс	сдсдаадддс	360
даакксдккк	ааасскдсад	акдадсаадд	дсдаддадск	дкксассддс	дкддкдссаа	420
ксскддкдда	дскддасддс	дасдкдаасд	дссасаадкк	садсдкдадс	ддсдадддсд	480
адддсдасдс	дасскасддс	аадскдассс	кдаадкксак	скдкассасс	ддсаадсксс	540
сддксссдкд	дссдассскд	дкдассасск	ксасскасдд	сдкдсадкдк	кксадссдск	600
асссддасса	сакдаадсдс	сасдасккск	ксаададсдс	сакдссддад	ддскасдкаа	660
дкккскдскк	скасскккда	какакакака	акааккакса	ккааккадка	дкаакакаак	720
аккксааака	ккккккксаа	аакаааадаа	кдкадкакак	адсааккдск	кккскдкадк	780
ккакаадкдк	дкакакккка	акккакааск	кккскаакак	акдассаааа	кккдккдакд	840
кдсаддкдса	ддадсдсасс	аксадсккса	аддасдасдд	сааскасаад	асссдсдссд	900
аддкдаадкк	сдадддсдас	асаскадкда	ассдсаксда	дскдаадддс	аксдасккса	960
аддаддасдд	саасаксскд	ддссасаадс	кддадкасаа	скасаасадс	сасаакдкдк	1020
асаксассдс	ддасаадсад	аадаасддса	ксааддсдаа	скксаадакс	сдссасаака	1080
ксдаддасдд	садсдкдсад	скддссдасс	аскассадса	даасассссд	аксддсдасд	1140
дксскдкдск	дскдссддас	аассаскасс	кдадсассса	дадсдссскд	адсааддасс	1200
сдаасдадаа	дсдсдассас	акддкдскдс	кддадкксдк	дассдссдсс	ддсаксассс	1260
асддсакдда	сдадскдкас	ааддккааск	ададскскад	акссссдаак	ккссссдакс	1320
дкксааасак	ккддсаакаа	адккксккаа	даккдааксс	кдккдссддк	сккдсдакда	1380
ккаксакака	акккскдккд	ааккасдкка	адсакдкаак	ааккаасакд	каакдсакда	1440
сдккакккак	дадакдддкк	кккакдакка	дадксссдса	аккакасакк	каакасдсда	1500
кадаааасаа	аакакадсдс	дсаааскадд	акаааккакс	дсдсдсддкд	ксакскакдк	1560
каскадаксд	ддааккд					1577

<210>43 <211>2725 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственная последовательность кассеты экспрессии СтрС-61С-поз <400> 43

акаскдкссс аакдсдкскд асааакдаад акддаакскд каааадаааа

сдсдкдааак асаааддкка ддксддскдс скккааксаа кассааадкд

120 дкссскасса сдакддаааа аскдкдсадк сддкккддск ккккскдасд аасааакаад

180 акксдкддсс дасаддкддд ддкссассак дкдааддсак скксадаскс саакаакдда

240 дсаакдасдк аадддсккас дааакаадка адддкадккк дддааакдкс сасксасссд

300

- 42 006761

есадбсЪаба	аа6ас1:еадс	сссбсссбса	ЪбдИааддд	адсаасда£с	сдсдаадддс	360
дааСЬссЪдс	адсссддддд	аСссссесда	ддТсдассаЪ	ддЁссдЬсс!	дсадааассс	420
саасссдЕда	ааТсаааааа	сЕсдасддсс	ЕдбдддсаЬб	садТсбддаб	сдсдаааасЕ	480
д£ддаа11:да	бсадсдббдд	Ъдддааадсд	сд!Тасаада	аадссдддса	аГТдсЬдЁдс	540
саддсадЪЕТ	наасдаЕсад	ЕЕсдссдаЕд	садаЕаЕЬсд	СааЕСаСдсд	ддсаасдЕсЕ	600
ддЕаЪсадсд	сдаадТ ст	аСассдааад	д£1дддсадд	ссадсдЬаЪс	дГдсСдсдСС	660
ГсдаЕдсддЕ	сасбсаЕЪас	ддсааадбдь	дддСсааЕаа	1саддаадЕд	аЕддадсаСс	720
адддсддсЪа	басдссаЬЬЬ	даадссдаСд	ЕсасдссдЕа	1дЕ6аЧдсс	дддаааадСд	780
СасдЪаадЕЕ	ЕсЕдсЧсЕа	сс1:1;(даЬаЪ	аСаИаЕаа^а	аЕЕаЕсаЕЕа	аСЕадТадЬа	840
абаЪааЬаСС	СсаааЕаЕЕЬ	ЪТЪЪсааааГ	аааадааЬдЬ	адЬа^а'Ьадс	ааЕЕдсЕСЕЕ	900
сТдЕадГЬЬа	ЬаадСдСдЕа	ЕаЕМЕааЫ:	СабаасЕЬЫ	сЕааЪаЪаЬд	ассааааСЕЕ	960
д1Гда!дЕдс	аддЕаЪсасс	дЕЕЕд^дЕда	асаасдаасЕ	даасЕддсад	асЕаЕсссдс	1020
сдддаа£дд£	даЬТассдас	даааасддса	адааааадса	д£с66асЕ6с	са£даЬ£1с£	1080
ЕЕаасЕаЬдс	сддааЪсса!:	сдсадсдбаа	ЪдсСсЕасас	сасдссдаас	ассбдддбдд	1140
асдаСаЬсас	сдГддСдасд	саЕдбсдсдс	аадасбдЬаа	ссасдсдЕсЬ	дбСдасЕддс	1200
аддСддСддс	саабддбдаб	дтсадсдЕЕд	аасЬдсдсда	гдсддассаа	саддТддСТд	1260
сааседдаса	аддсас^адс	дддасЪМдс	аадСдд1:даа	ОссдсассЪс	Сддсаассдд	1320
д£дааддЪЬа	Ьсбсбабдаа	сЪдбдсдбса	садссаааад	ссадасадад	Ьд£да£а£с£	1380
асссдсССсд	сдЬсддсаЬс	сддЬсадбдд	садЬдааддд	сдаасад££с	сЬдаЪЪаасс	1440
асааассд6£	сеасемасе	ддсЪГТддТс	дбсабдаада	ЬдсддасЪЪд	сдбддсааад	1500
даЪЕсда£аа	сд(сдсЬда£д	дЬдсасдасс	асдса11:аа£	ддас^ддаСС	ддддссаасЕ	1560
ссСассдТас	сЕсдсаМас	ссббасдсЕд	аададабдсЕ	сдас1дддса	даЕдаасаЬд	1620
дсаСсдСддЕ	даЕСдаЕдаа	асЕдсЕдсЕд	ЕсддсЕЪЕаа	ссЕсЕсб^Еа	ддсаЪЬддЕЪ	1680
£сдаадсддд	саасаадссд	ааадаасЕдС	асадсдаада	ддсадЕсаас	ддддааасЪс	1740
адсаадсдса	сЕЕасаддсд	аЬЕааададс	ЕдаЕадсдсд	1дасааааас	сасссаадсд	1800
ТддЕдаЪдИд	дадТаТГдсс	аасдаассдд	аГасссдЕсс	дсааддЕдса	сдддаа^аЕЕ	1860
ЕсдсдссасТ	ддсддаадса	асдсдЕааас	£сдасссдас	дсдЕссдаЕс	ассЕдсдЕса	1920
аЕдТааТд!;^	сЕдсдасдсЕ	сасассдаЕа	ссаЕсадсда	СсЬсТЪТдаС	дЪдсСдСдсс	1980
ТдаассдТТа	ЬЪасддаЕдд	СаСдГссааа	дсддсдаСГЕ	ддааасддса	дадааддТас	2040
Ъддааааада	асТТсЬддсс	Ьддсаддада	аас^дсаСса	дссда£1аес	абсассдааС	2100
ЪсддсдСдда	ЕасдЕЕадсс	дддсбдсас!	сааЕдбасас	сдасаЪдЬдд	адСдаададь	2160
аЬсадедЪдс	аСддс£дда£	агдгагсасс	дсдЪсСГХда	есдсдбсадс	дссдСсдтсд	2220
дТдаасадде	аеддааТ££с	дссдаг^есд	сдассбсдса	аддсабабТд	сдсд££ддсд	2280
дбаасаадаа	адддабсТбс	асесдсдасс	дсааассдаа	дбсддсддсб	ЬЬЪсЪдсСдс	2340
ааааасдсЬд	дасЬддсаЪд	аасГАсддед	ааааассдса	дсадддаддс	ааасааСдаа	2400
ЬсаасаасЬс	6сс1ддсдса	ссабсдбсдд	сЬасадссЬс	дддааЬЪада	ЪссссдааСЬ	2460
Гссссда1:сд	ТЪсааасаЪб	ЬддсааСааа	дЬЫсТЛаад	аТТдааСсс):	дСЪдссддбс	2520
ЬЕдсда^даЬ	СаСсаТабаа	ТТТсЪдеТда	аЬЬасд1^аа	дса£дСаа£а	аС1:ааса1:д1:	2580
ааЬдсаЕдас	дЬЕаЕЪЕаЕд	адаЬдддбХЪ	ЕЬаТдаТеад	адЪсссдсаа	ТСабасаЕЕЬ	2640
ааСасдсдаЕ	адаааасааа	аЕаЕадсдсд	сааасГадда	ЕаааЕСаЕсд	сдсдсддЕдЕ	2700
саЪсЕа^дЬС	асЕадаЕсдд	дааЕЪ				2725

<210> 44 <211> 9172 <212> ДНК <213> Искусственная

- 43 006761 <220>

<223> Искусственная последовательность вектора ρΝ0ν2117 <400> 44

аадсБСддсд	сдссддСасс	адсИдсаСд	сс^дсадбдс	адсдСдассс	ддСсдБдссс	60
сбсЬсСадад	аРааРдадса	СРдсаЬдБсР	аад^СаЬааа	аааЕРассас	аРаСЛССГЛР	120
ЬдСсасасЕБ	дШдаадСд	садГЕСаРсБ	аЛсЕЬЬаРас	аРаСаСБЕаа	асСРЕасЁсЛ	180
асдааРааЕа	£ааЕсРа£ад	ЪасЕасааЕа	аБаБсадЪдР	ЕЕ^ададааЕ	саЕаЪаааБд	240
аасадИада	саЪддГсЛаа	аддасааРЪд	адЬаСГЛЛда	саасаддасБ	сЕасадСЕБС	300
аБсШЪЕад	ЬдЕдсаРдЪд	ГГсСссРББЪ	ГЕЫЛдсааа	БадсЕЕсасс	ЛаЬаСааЕас	360
рРсаГссаСЕ	ЬЕаЪЪадРас	аЕссаШад	ддббРадддЛ	СааЕддСРЬС	СаЕадасГаа	420
СЬСЕЕССадС	асаСсЛаЪ!;!:	СаРРсбаИСС	ЬадссБсЕаа	аССаадаааа	сРаааасЕсР	480
а^ьссадЬЕР	БЕЕЪаЪЪЛаа	ЕааССбадал	аЕаааа^ада	аСааааСааа	дРдасРаааа	540
аБЪааасааа	ГасссРРЬаа	даааСЕаааа	ааасСаадда	аасаЪЪЪЪЪс	РЪдРБСсдад	600
ЬадаРааРдс	садссРдРГа	аасдссдБсд	асдадБсРаа	сддасассаа	ссадсдаасс	660
адсадсдЕсд	сдСсдддсса	адсдаадсад	асддсасддс	аЕсБсБдЬсд	сБдссЬсРдд	720
ассссЕсЕсд	ададБСссдс	СссассдЫд	дасБСдсСсс	дсБдБсддса	ЛссадаааРР	780
дсдСддсдда	дсддсадасд	ЬдадссддБса сддсаддсдд ссСссСссРс сБсБсасддс	840
ассддсадсЕ	асдддддаБЪ	ссЕББсссас	сдсРссББод	сБЬБсссРРс	сБсдсссдсс	900
дСааСааала	дасасссссБ	ссасасссБс	СРЪссссаас	сСсдСд^РдР	Ьсддадсдса	960
сасасасаса	ассадаЬсЬс	ссссаааСсс	асссд!сддс	ассбссдсГЪ	сааддСасдс	102.0
сдс!сд1ссЬ	сссссссссс	сссСсСсбас	сССсСсСада	РсддсдГГсс	дд-ЬссаСддк	1080
Гадддсссдд	бадбЛсСасС	ЬсЪдССсаЪд	бббдЛдЪСад	аСссдСдЬЫ:	дбдЪЬадаЪс	1140
сдСдс£дс!:а	дсдЛЬсдЪас	асддаьдсда	ссЪдЬасдЬс	адасасдМс	ЬдаИдсРаа	1200
сЬЬдссадЛд	СССсСсССЬд	дддааЬсс^д	ддаРддсЬсВ	адссдРВссд	садасдддар	1260
даРРЪсаЕд аРГЛМзСЬРд 11:1сдЪ6дса СадддИСдд ЪЬБдсссБЕЪ ЪссБГЬаЬЬЬ	1320
саа^аЕаЪдс	сдГдсасССд	СГЛдЬсдддб	сабсРГСЬса	СдсРРСРССС	РдБсЕЪддкЕ	1380
дЪдаБдаЪдГ	ддРсРддСЬд	ддсддРсдЪС	сЬадаГсдда	дРадааЕРсС	дрбЕсааасЪ	1440
ассРдд^дда	ЕЪБаЪРааГЛ	ЪЪддаСсРдс	аЕдБдбдРдс	саГасаЕаСС	саБадСРасд	1500
ааТЛдаадаЬ	даЛддаСдда	ааРаРсдаЬс	СаддаЪаддС	аРасаЕдРСд	аРдсдддРЕЕ	1560
ЛасБдаРдса	СаСасадада	БдсБЫРСдЕ	1сдсЪБддГР	дРдаСдаРдС	ддСдСддИд	1620
ддсддСсдБЕ	саБЬсдРРсЬ	адаЬсддадб	адааСасрдС	ЪРсааасРас	сБддСдСаЕР	1680
СаЕСааСССС	ддаасРдРаГ	дЕдЕд-рдБса	ЕасаБсЬРса	надЕСасдад	ЛСБаадаРдд	1740
аСддааа^аЕ	сдаСсРадда	ЕаддЪаРаса	СдРБдаРдЪд	ддГГССасЬд	аЪдсаСаСас	1800
асдаРддсаб	аСдсадсаСс	СаССсагаЕд	сесРаасс^р	дадРассба^	сЪаСРаРааС	1860
ааасаадбав	дЬЬЬРаВаар	СаССРГдаЬс	ССдаРаЬасЬ	ЕддаРдаРдд	саВаРдсадс	1920
адсРабаГдС	ддабЬЪЪШ	адсссбдссВ	ЬсабасдсЬа	СРСаЬЬЬдсГ	ЪддСасЪдСС	1980
рсьвррдрсд	абдсЪсассс	СдСРдГСРдд	СдСЛасЬСсС	дсаддда1сс	ссдаЛсабдс	2040
ааааасбсаЬ	СаасСсадВд	саааас£а1д	сссддддсад	саааасддсд	ЬбдасЁдаас	2100
ЪРСаЛддСаС	ддааааСссд	Ьссадссадс	сдаРддссда	дсГдВддаЪд	ддсдсасаСс	2160
сдаааадсад	РРсасдадРд	садаабдссд	ссддадабаб	сдбССсасЕд	сдРдаСдрда	2220
МдададЕда	ЛаааСсдасС	сБдсЪсддад	аддссдРРдс	сааасдсГГР	ддсдаасБдс	2280
сЕБРссБдРЪ	сааадРаБЕа	Сдсдсадсас	адссасРсСс	саБРсаддЪБ	саСссаааса	2340
аасасааЕЪс	РдаааСсддР	Шдссааад	аааабдссдс	аддраРсссд	аСддаБдссд	2400
ссдадсдЕаа	сЕаЕааадаР	ссРаассаса	адссддадсЪ	ддБСССЕдсд	сБдасдссББ	2460
ЬссЪЪдсдаР	даасдсдЕЬЬ	сдРдааСЪбб	ссдадаССдр	сРсссЕасРс	садссдд£сд	2520
саддЕдсаса	ЬссддсдаРС	дсБсасСЕСР	Басаасадсс	СдаСдссдаа	сдбББаадсд	2580

- 44 006761

аасРдРРсдс	садссРдРРд	аарардсадд	дрдаадаааа	аРсссдсдсд	сРддсдаРРР	2640
РааааРсддс	ссРсдаРадс	садсадддрд	аассдрддса	аасдаРРсдР	РРааРРРсРд	2700
ааРРРРассс	ддаадасадс	ддРсРдРРсР	ссссдсРаРР	дсРдааРдрд	дрдаааррда	27 60
асссрддсда	адсдаРдРРс	срдррсдсрд	ааасассдса	сдсРРассРд	сааддсдРдд	2820
сдсРддаадР	даРддсааас	РссдаРаасд	РдсРдсдРдс	дддРсРдасд	ссРаааРаса	2880
РРдаРаРРсс	ддаасРддРР	дссаардрда	ааРРсдаадс	сааассддср	аассадРРдР	2940
Рдасссадсс	ддрдааасаа	ддрдсадаас	РддасРРссс	даРРссадРд	даРдаРРРРд	3000
ссРРсРсдсР	дсаРдассРР	адрдарааад	ааассассар	Радссадсад	адрдссдсса	3060
ррррдррсрд	сдРсдааддс	даРдсаасдр	рдрддааадд	РРсРсадсад	РРасадсРРа	3120
аассдддрда	аРсадсдРРР	аРРдссдсса	асдааРсасс	ддРдасРдРс	аааддссасд	3180
дссдРРРадс	дсдРдРРРас	аасаадсРдР	аададсРРас	РдааааааРР	аасаРсРсРР	3240
дсРаадсРдд	дадсРсдаРс	сдРсдассРд	садаРсдРРс	ааасаРРРдд	сааРааадРР	3300
рсрраадарр	даарссрдрр	дссддРсРРд	сдардаРРаР	саРаРааРРР	сРдРРдааРР	3360
асдРРаадса	РдРааРааРР	аасаРдРааР	дсардасдрр	аРРРаРдада	рдддррррра	3420
рдаррададр	сссдсааРРа	РасаРРРааР	асдсдарада	ааасааааРа	Радсдсдсаа	3480
асРаддаРаа	аРРаРсдсдс	дсддРдРсаР	срардрраср	адаРсРдсРа	дсссРдсадд	3540
аааРРРассд	дрдсссдддс	ддссадсаРд	дссдРаРссд	саардрдрра	рраадррдрс	3600
Ъаадсдрсаа	РРРдРРРаса	ссасаарара	РссРдссасс	адссадссаа	садсрссссд	3660
ассддсадсР	сддсасаааа	РсассасРсд	аРасаддсад	сссаРсадаа	ррааррсрса	3720
рдрррдасад	сРРаРсаРсд	асРдсасддР	дсассааРдс	РРсРддсдРс	аддсадссаР	3780
сддаадсрдр	ддРаРддсРд	РдсаддРсдР	аааРсасРдс	аРааРРсдРд	РсдсРсаадд	3840
сдсасРсссд	РРсРддаРаа	РдРРРРРРдс	дссдасаРса	РаасддРРсР	ддсаааРарр	3900
сРдаааРдад	сРдРРдасаа	РРааРсаРсс	ддсРсдРаРа	ардрдрддаа	РРдРдадсдд	3960
аРаасааРРР	сасасаддаа	асадассаРд	адддаадсдр	РдаРсдссда	адРаРсдасР	4020
саасРарсад	аддРадРРдд	сдРсаРсдад	сдссаРсРсд	аассдасдРР	дсРддссдРа	4080
сарррдрасд	дсрссдсадр	ддарддсддс	сРдаадссас	асадРдаРаР	рдаРРРдсРд	4140
дРРасддРда	ссдРааддсР	РдаРдаааса	асдсддсдад	сРРРдаРсаа	сдассРРРРд	4200
дааасРРсдд	сРРссссРдд	адададсдад	аРРсРссдсд	сРдРадаадР	сассаРРдРР	4260
дрдсасдасд	асаРсаРРсс	дРддсдРРаР	саадсРаадс	дсдаасРдса	аРРРддадаа	4320
рддсадсдса	аРдасаРРсР	РдсаддРаРс	ррсдадссад	ссасдаРсда	саРРдаРсРд	4380
дсраРсРРдс	Рдасаааадс	аададаасаР	адсдррдсср	РддРаддРсс	адсддсддад	4440
даасРсРРРд	аРссддРРсс	РдаасаддаР	срарррдадд	сдсРаааРда	аассРРаасд	4500
сРаРддааср	сдссдсссда	сРдддсРддс	даРдадсдаа	аРдРадРдсР	РасдРРдРсс	4560
сдсаРРРддР	асадсдсадр	аассддсааа	аРсдсдссда	аддардрсдс	рдссдасрдд	4620
дсаарддадс	дссРдссддс	ссадРаРсад	сссдРсаРас	РРдаадсРад	дсаддсРРаР	4680
сРРддасаад	аадаРсдсРР	ддссРсдсдс	дсадаРсадР	рддаадаарр	РдРРсасРас	4740
дрдаааддсд	адаРсассаа	адРадРсддс	аааРааадсР	сРадРддаРс	РссдРасссс	4800
сдддддаРсР	ддсРсдсддс	ддасдсасда	сдссддддсд	адассаРадд	сдаРсРссРа	4860
ааРсааРадР	адсРдРаасс	РсдаадсдРР	рсасррдраа	саасдаРРда	дааРРРРРдР	4920
саРааааРРд	аааРасРРдд	РРсдсаРРРР	РдРсаРссдс	ддрсадссдс	ааРРсРдасд	4980
аасРдсссаР	РРадсРддад	аРдаРРдРас	аРссРРсасд	РдааааРРРс	РсаадсдсРд	5040
рдаасааддд	РРсадаРРРР	адаРРдааад	дрдадссдрр	дааасасдРР	сРРсРРдРсд	5100
аРдасдасдР	сдсРаРдсдд	саРсрраРРа	РРдааРассР	РасдаРссас	дссРРсааад	5160
РдассдсддР	адссдасадс	асссадРРса	саададРасР	сРсРРссдсд	асддРсдаРд	5220
рсдрддррдр	РдаРсРаааР	РРаддРсдРд	аадаРдддсР	сдадаРсдРР	сдРааРсРдд	5280
сддсааадрс	РдаРаРРсса	аРсаРааРРа	РсадРддсда	ссдссррдад	дадасддаРа	5340

- 45 006761

аадгидигдс	асСсдадсСа	ддадсаадрд	аШЬаидс	1аадссд!Ъс	ад£а£садад	5400
адШ.сГадс	асдсаббсдд	дббдссббдс	дсдбдсдссс	саасдЪЬдРс	сдсбссааад	5460
ассдасддбс	иъъЕСдгъеъ	асбдасбдда	сас££аа£с£	саддсаасдб	сдсЪЬда£д£	5520
ссдаадсбдд	сддбдаддбд	ааасббасдд	саддСдадЫ	саа£с££с£с	сссдсд££££	5580
Сададааасс	ссдсдасд^С	сСаСсдсдсд	адсаас£6с£	са££дссад£	сдадьасдсд	5640
асдаддаддС	££а£дасадд	ад6а£ада£д	££с£са6£££	даддсЬдсдс	сдсааас££д	5700
аддсадаЬсс	д£саадссс£	саасГдаЕаа	ааасадсаад	аддбдссддЬ	Ьа£££с£££д	5760
асдсддасдб	дсаддСГСсд	сасдддддда	сдаБддсадс	сбдадссааб	ьсссадаЕсс	5820
ссдаддаабс	ддсдСдадсд	дБсдсааасс	аБссддсссд	д£асаааЬсд	дсдсддсдсБ	5880
дддЪдаГдас	сГддрддада	ад££дааддс	сдсдсаддсс	дсссадсддс	аасдсаГсда	5940
ддсадаадса	сдссссддбд	аабсдбддса	адсддссдсГ	дабсдаабсс	дсааадааЬс	6000
ссддсаассд	ссддсадссд	д£дсдссд£с	даБЕаддаад	ссдсссаадд	дсдасдадса	6060
ассадабЬЪЪ	££сд££ссда	ИдсИсЕаГда	сдПдддсасс	сдсдаЪадЬс	дсадса£са£	6120
ддасдрддсс	дЦЦссдЬс	бдбсдаадсд	бдассдасда	дсРддсдадд	£да£ссдс£а	6180
сдадсббсса	дасдддсасд	6ададд6££с	сдсадддссд	дссддсабдд	ссадЪдЪдЪд	6Ξ40
ддаРЬасдас	сЬддБасЕда	бддсддМСс	ссаБсЪаасс	даа£сса£да	ассдаСассд	6300
ддаадддаад	ддадасаадс	ссддссдсдр	дъсссдСсса	сасдББдсдд	асд£ас£саа	6360
дббсбдссдд	сдадссдабд	дсддааадса	дааадасдас	сЬддЬадааа	сс£дса££сд	6420
дГЪааасасс	асдсасдббд	ссаСдсадсд	Ьасдаадаад	дссаадаасд	дссдссбддб	6480
дасддСаРсс	дадддрдаад	сс££даС£ад	ссдсЕасаад	а£сд£ааада	дсдааассдд	6540
дсддссддад	£аса£сдада	бсдадсбадс	£да£Сдда£д	Ъассдсдада	Ъсасадаадд	6600
саадаасссд	дасдбдсбда	сдд££сассс	сдаЪРасЪГР	££да£сда£с	ссддсабсдд	6660
ссдЫЪЪсбс	бассдссбдд	сасдссдсдс	сдсаддсаад	дсадаадсса	да£дд££д££	6720
саадасдаЪс	Ъасдаасдса	д£ддсадсдс	сддададМс	аадаадССсЕ	д£££сассд£	6780
дсдсаадсбд	аСсдддСсаа	абдассбдсс	ддадсасдаъ	ббдааддадд	аддсддддса	6840
ддсбддсссд	аЁссРадРса	Ьдсдсбассд	саасс£да£с	дадддсдаад	сабссдссдд	6900
Ъ£ссСааСд1	асддадсада	бдсбадддса	аа££дссс£а	дсаддддааа	ааддЕсдааа	6960
аддгсссссг	ссгдгдда^а	дсасдрасаР	Гдддаассса	аадссдсаса	гбдддаассд	7020
даасссдбас	аббдддаасс	сааадссдЪа	сабЬдддаас	сддбсасаса	бдбаадбдас	7080
ЪдаЬаСаааа	дадаааааад	дсда££61£с	сдссЬаааас	£с£££аааас	££а£Ьаааас	7140
рсЬЬаааасс	сдссбддссб	д£дса£аас£	д£с£ддссад	сдсасадссд	аададсбдса	7200
аааадсдссб	асссббсддб	сдсбдсдсбс	сскасдсссс	дссдсббсдс	дбсддссбаб	7260
сдсддссдс£	ддссдсбсаа	ааа£ддс£дд	ссбасддсса	ддсаа£с£ас	садддсдсдд	7320
асаадссдсд	ссдбсдссас	ъсдассдссд	дсдсЬдаддР	сбдссбсдбд	аадаадд£д£	7380
ЪдсЪдас!са	£ассаддсс£	даабсдсссс	абсабссадс	садааадьда	дддадссасд	7440
дббдаРдада	дсЪЬ£д££д£	аддрддасса	дЬ^ддТдаРЪ	££даас££££	дс£££дссас	7500
ддаасддГсР	дсдЪЪдЪсдд	даадабдсдб	дабсЬдаСсс	££саас£сад	саааад££сд	7560
аББЬа-ггсаа	сааадссдсс	дбсссдбсаа	дбсадсдбаа	£дс£с£дсса	д£д£1:асаас	7620
сааНаасса	аЕБсЕдаСРа	дааааасЪса	ЪсдадсаБса	ааЪдааасСд	сааНЬаНс	7680
аСаРсаддак	£а£саа£асс	аиньида	аааадссд££	Сс£д£аа£да	аддадаааас	7740
Гсассдаддс	адббссабад	дабддсаада	бссбддбабс	дд£с£дсда£	ОссдасЬсдб	7800
ссаасабсаа	СасаассБаБ	£аа£££сссс	ЪсдГсааааа	£аадд££а£с	аадбдадааа	7860
Ъсассабдад	СдасдасГда	абссддбдад	ааГддсаааа	дс£с£дса££	аа£даа£сдд	7920
ссаасдсдсд	дддададдсд	д£££дсд£а£	бдддсдсбсб	£ссдс££сс(:	сдсЬсасЕда	7980
сЕсдсбдсдс	£сдд£сд£Ьс	ддсбдсддсд	адсддбабса	дс£сасСсаа	аддсдд£аа£	8040
асддббабсс	асадаабсад	дддабаасдс	аддааадаас	а£д£дадсаа	ааддссадса	8100

- 46 006761

аааддссадд	аассд£аааа	аддссдсдСЪ	дсОддсд*:!:^	1£сса1аддс	1ссдсссссс	8160
1дасдадсаб	сасаааааЪс	дасдсбсаад	ЪсададдЪдд	сдааасссда	саддасЪаЕа	8220
аадаСассад	дсдШсссс	с!ддаадс!с	ссСсдбдсдс	ГсЪссЪдСбс	сдасссСдсс	8280
дсПассдда	ТассСдТссд	СС££6С1ССС	ЪЕсдддаадс	дСддсдсССС	сЬсаЕадсЕс	8340
асдсЕдЕадд	^аЪсбсадМ	сдд£дб.аддЪ	сдЕЕсдсЪсс	аадсбдддсб	д!д£дсасда	8400
ассссссдСС	садсссдасс	дс!дсдсс11	аГссддГаас	1а1сдСсС1д	адГссаассс	8460
ддЕаадасас	дасМаЪсдс	сасЬддсадс	адссас!дд£	аасаддаЫа	дсададсдад	8520
дбаСдГаддс	дд!дс!асад	адИсидаа	дГдд!ддсс!	аасСасддс!	асасЕадаад	8580
аасадТаЬСС	ддЬаТсТдсд	сСсСдсЬдаа	д с сад Пасс	Ысддааааа	дадЬЕддЪад	8640
сГсИдаСсс	ддсааасааа	ссассдсодд	1адсдд1дд1	СЪЪСЪЬдССТ	дсаадсадса	8700
даССасдсдс	адааааааад	даСсОсаада	адаСссСЪЬд	аСсССЫсСа	сддддЕс^да	8760
сдсГсадОдд	аасдаааас!	сасд£1аадд	даЫМддСс	а£дада!1:а1	саааааддаЬ	8820
сЕСсассСад	аТссППда	СссддааПа	аССссЕдСдд	МддсаСдса	саСасаааЕд	8880
дасдаасдда	Сааасс11(:1	сасдсссСИ	ЕаааТаЬссд	а Ы а Ис! а а	ЬааасдсЕсС	8940
СИсЬсЬСад	дШасссдс	саа!а1а1сс	СдСсааасас	1да1ад111а	аасСдааддс	9000
дддааасдас	ааЪсбдаЬса	Ъдадсддада	аЪЪаадддад	ЪсасдЫаЪд	асссссдссд	9060
аЪдасдсддд	асаадссдЬС	НасдШдд	аасбдасада	ассдсаасдс	ЪдсаддааМ	9120
ддссдсадсд	дсса!ССааа	£сааШдддс	дсдссдааН	сдадсТсдд!	ас	9172

<210> 45 <211> 8849 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственная последовательность вектора рЫОУ4200 <400> 45

ддЬасссссд	ддддабссбс	Сададосдас	сабддбдабс	асбдсаддса	ЪдсаадсЪСс	60
дЕасдЪЬааб	ЬааНсдаа!	ссддадсддс	сдсасдсдЕд	ддсссдСЬЬа	аассЬсдада	120
даСсСдс1:ад	сссЪдсадда	ааШассдд	ЬдсссдЕасс	ддаШддад	ссаадСсЕса	180
бааасдссаС	СдГддаадаа	адСсССдадС	тддсддсаас	дсаасададг	адСаадааса	240
дадаададад	ададбдбдад	абасабдааб	бдбсдддсаа	сааааабссб	даасаЬсЪЬа	300
НЕбадсааа	дадааададВ	ЪссдадВсЬд	бадсадаада	дСдаддадаа	аССЪаадсбс	360
ЕЪддасЬ^дЬ	дааПдПсс	дссЕсСЕдаа	СасИсЫса	аЕссЪсаЬа!	аЕЪсСЪсЕЬс	420
СаЕдсгасс!	даааассддс	а1Маа1сЬс	дсдддСПаС	ГссддССсаа	саИДШ.И	480
дССИдадП	аГВаГсСддд	сСЬааГаасд	саддссбдаа	абааабХсаа	ддсссаасЪд	540
1ШШШ	СаадаадЪЪд	сЬдТВааааа	аааааааадд	дааббаасаа	саасаасааа	600
аааада^ааа	дааааЕааЪа	асааЫасЪЬ	КааГ^дСада	сСааааааас	аГ.адаЬЬССа	660
ЪсаЬдааааа	аададаааад	аааЕааааас	СбддаЬсааа	аааааасаЬа	садаТсССсЕ	720
ааГ1аС1аас	1«1с11ааа	ааТСаддТсс	кшсссаа	саанаддсс	^ададсгссд	780
дааНааасс	ааааадаЬОд	ЪЁсГаааааа	ЕасбсаааН	1ддСадаСаа	дСССссСЪаС	840
ГГСааСГадС	саабддЬада	ТасТВТЪВТС	ЬсПНсШ	аЪЬададбад	а1:£адаа(:с1	900
ШаСдссаа	дбаЫдаТаа	аНаааЪсаа	даадабааас	ЕаЕсаЪааЬс	ааса^дааа!	960
1аааадаааа	абсбсабаЬа	ЪадбаПадС	аЫс1сСа1а	1аСа££а£да	С£дсСЬа1:£с	1020
Наабдддбб	дддЫаасса	адасаГадСс	11аа1ддааа	дааСсПССС	СдаасССССС	1080
ссТЬаЬ'Ьда^	СаааНсСЪс	Еабадаааад	ааадаааМа	Шдаддааа	адСаСаСаса	1140
аааадааааа	ЪадаааааЬд	СсадЬдаадс	адабдбаабд	даСдассбаа	Ьссаассасс	1200
ассаСаддаС	дПЪсбасСЬ	дадЬсддЬс!	ЬЫааааасд	сасддбддаа	ааЕаЕдасас	1260

- 47 006761

дбабсаСаЬд	аЕСссЕЪссЬ	ССадЕИсдб	даЕаабаабс	сСсаасбдаг	абсЬСссССЕ	1320
	дсСааадаЪа	ЬЫЬаЬТсСс	аСЬааСадаа	аадасддООб	ОдддсОООбд	1380
дбббдсдаба	Ьааадаадас	сСГсдГдСдд	аадасаабаа	ЬЬсаЬссСЪГ	сдбсЪЬСЬКс	1440
ЬдасбсСЬса	аЬс1:с1:ссса	аадссбааад	сда1:с<:с±дс	аааЬсСсбсд	сдасбсСсСС	1500
ГТОсааддба	ЕаЪбЛСсбда	ЬЕсЕЕбМд'Ь	бЬСХдаЮсд	бабсбдаЬсЬ	ссааС1;ССЪд	1560
ПаСдОддаС	ОаОСдааСсС	ООбдОаСааа	гсдс1:гссда	саабаССдС!	сдСООсдОса	1620
аЬссадсОЬс	ЪааасГСГдЪ	ссбдаЪЪасб	аадабабсда	ьСсдСадбдб	бЪасабсбдб	1680
дГааСООсЫ:	дсСбдаМгдЪ	даааМадда	бЪСГсаадда	сдаЬсеабЪс	аа«ЕЪ£д1:д	1740
СЕЕСсЁССдЬ	СсдаССсЕсС	сСдМбЬадд	ГЪСсССаЕдЕ	МадаСссдГ	СИсЕсШйдд	1800
ЕдСЕдЕССЕд	аСССсСсСЕа	сддсЫТТда	ССЬддЪаСаИ	дЕЕсдсЕдаЕ	^ддОССсЕас	1860
СЬдССсЬа^С	дСбббабббс	адд1ддаЬсЪ	сдасбскадд	ддддсаабаа	даСабдаааа	1920
адссбдаасС	сассдсдасд	ЬсЬдЬсдада	адбббсбда-Ь	сдаааадОЬс	дасадсдбсб	1980
ссдассгдаС	дсадсЕсЕсд	дадддсдаад	ааЕсСсдбдс	бЬксадсЕСс	даЕдЕаддад	2040
ддсд^ддаСа	сдЬссЕдсдд	дЬаааСадсЬ	дсдссдаОдд	бЪСсЬасааа	даЕсдЕЕаЕд	2100
СЪЪаЬсддса	сЬОкдсабсд	дссдсдсЬсс	сдаЕбссдда	адЬдсСЕдас	а!СддддсаЬ	2160
Ьсадсдадад	ссСдассбаб	ЬдсаЬс^ссс	дссдСдсаса	дддбдбсасд	ГГдсаадасс	2220
Сдсс1:дааас	сдаас£дссс	дс1д£СсСдс	адссддбсдс	ддаддссаГд	да1дсда1сд	2280
сбдсддссда	ЁсЬСадссад	асдадсдддЬ	ГсддсссаГС	сддассдсаа	ддаа^сддЕс	2340
ааСасасСас	аСддсд^даС	ПсаСаСдсд	сдабодсрда	оссссабдСд	ба£сасбддс	2400
ааасЬдСдаС	ддасдасасс	дбсадЬдсдЬ	ссд^сдсдса	ддсбсСсдак	дадсбда^дс	2460
ССЪдддссда	ддасбдсссс	даадЪссддс	ассбсдЬдса	с дед дат с	ддс1:ссааса	2520
абдСссОдас	ддасаа£ддс	сдсабаасад	сдд6саС£да	сЬддадсдад	дсдаЪдЪЕсд	2580
дддаббссса	аСасдаддСс	дссаасабсъ	бсЬСсСддад	дссдСддССд	дсЪЪдБаЪдд	2640
адсадсадас	дсдсЛасССс	дадсддаддс	абссддадсЬ	ЕдсаддаСсд	ссдсддсЪсс	2700
дддсдЬаТаС	дсГссдсаСС	ддбсЬ!дасс	аасЬсЬаСса	дадсЕЕддЬЬ	дасддсааЬЬ	2760
ЬсдаЕдаЕдс	адсЕЕдддсд	садддСсдаЕ	дсдасдсааЪ	сдЪссдаЕсс	ддадссддда	2820
сОдОсдддсд	басасааабс	дсссдсадаа	дсдсддссдС	сСддассдаб	ддебдЬдЪад	2880
аадбасбсдс	сдабадбдда	аассдасдсс	ссадсасбсд	Ьссдадддса	ааддааЪада	2940
д£ада£дссд	ассдддаСсс	ссдааСССсс	ссдаИсдССс	ааасаЕГСдд	сааЕааадЪЬ	3000
ОсгсаадаЫ:	даа'ЬссбдОС	дссддТсССд	сдаСдаССа!	саСаСааббб	сЪдЬЪдааМ:	3060
асдМаадса	ЬдЬааЬааЫ;	аасаЬдОааО	дсаЬдасдГС	аййаЪдада	ЬдддЬЬСЬЬа	3120
ИдаГГададС	сссдсааЕЪа	СасаСЕЕааЕ	асдсдабада	ааасааааЕа	Садсдсдсаа	3180
асОаддаСаа	аСЬаСсдсдс	дсддбдбсаб	сОаЬдббасС	адаТедддаа	бСдддбасдд	3240
дсддссадса	ЬддссдЪаСс	сдсаабдбдЬ	ЬаЬбаадГЬд	беОаадедбе	ааГОЬдСбба	3300
сассасааСа	ЕаЕссЪдсса	ссадссадсс	аасадсбссс	сдассддсад	сСсддсасаа	3360
ааОсассасС	сдаЬасаддс	адсссаСсад	ааЬСааСОсС	сасд'ЬССдас	8901:1:31:031:	3420
сдасбдсасд	дСдсассааб	дсЪЬсЬддсд	Гсаддсадсс	аЪеддаадеХ	дбддбаЪддс	3480
Ьд^дсаддСс	дОаааРсасб	дсаЕааЫсд	ГдЕсдсСсаа	ддсдсасбсс	сдЫсЕддаЕ	3540
аа-ЕдГГСЬСС	дсдссдасао	сасаасддСГ	сСддсаааСа	госсдаааед	адсодьодас	3600
ааЪЬааСса!:	ссддсЬсдЬа	Саабдбдбдд	ааСЪдЬдадс	ддабаасааб	ьбсасасадд	3660
ааасадасса	Ьдадддаадс	дЫдаИсдсс	даадЕаЕсда	сбсаасбаСс	ададдЕадЕб	3720
ддсдСсагсд	адсдссаГсС	сдаассдасд	ггдссддссд	исаШдга	сддссссдса	3780
дбддаЬддсд	дссЬдаадсс	асасадЬда!:	аЬЪдаОбЬдс	бддЪЬаеддб	дассдбаадд	3840
сЁЪдабдааа	саасдсддсд	адсбббдабс	аасдассЫй	1ддааасЫс	ддсСЬссссЕ	3900
ддадададсд	адаССсЕссд	сдсЕдСадаа	дбсассаббд	бкдЬдсасда	сдасаОсаЫ:	3960
ссдЬддсдЪС	аСссадсбаа	дсдсдаасСд	саабОбддад	ааСддсадсд	саабдасабб	4020

- 48 006761

сББдсаддБа	БсББсдадсс	адссасдаБс	дасаББдаБс	БддсБаБсББ	дсБдасаааа	4080
дсаададаас	аБадсдББдс	сББддБаддБ	ссадсддсдд	аддаасБсББ	БдаБссддББ	4140
ссБдаасадд	аЕсБаБББда	ддсдсБаааБ	дааассББаа	сдсБаБддаа	сБсдссдссс	4200
дасБдддсБд	дсдаБдадсд	аааБдБадБд	сББасдЕБдЕ	сссдсаБББд	дБасадсдса	4260
дБаассддса	аааБсдсдсс	дааддаБдБс	дсБдссдасБ	дддсааБдда	дсдссБдссд	4320
дсссадБаБс	адсссдБсаБ	асББдаадсБ	аддсаддсББ	аБсББддаса	адаадаБсдс	4380
ББддссБсдс	дсдсадаБса	дьБддаадаа	БЕБдББсасБ	асдЕдааадд	сдадаБсасс	4440
ааадБадБсд	дсаааБааад	сБсБадБдда	БсБссдБасс	сссдддддаБ	сБддсБсдсд	4 500
дсддасдсас	дасдссдддд	сдадассаБа	ддсдаБсБсс	БаааБсааБа	дБадсБдБаа	4560
ссБсдаадсд	БББсасББдБ	аасаасдаББ	дадааБББББ	дБсаБааааБ	БдаааБасББ	4620
ддББсдсаББ	БББдБсаБсс	дсддБсадсс	дсааББсБда	сдаасБдссс	аБББадсьдд	4680
адаБдаББдБ	асаБссББса	сдБдааааББ	БсБсаадсдс	БдБдаасаад	ддББсадаББ	4740
ББадаББдаа	аддБдадссд	ББдааасасд	ББсББСББдБ	сдаБдасдас	дБсдсБаБдс	4800
ддсаБсББаБ	БаББдааБас	сББасдаксс	асдссББсаа	адБдассдсд	дБадссдаса	4860
дсасссадББ	сасаададБа	сБсБсББссд	сдасддБсда	БдБсдБддББ	дББдаБсБад	4920
аБЕБаддБсд	БдаадаБддд	сБсдадаБсд	ББсдБааБсБ	ддсддсааад	БсБдаБаББс	4980
сааБсаБааБ	БаБсадБддс	дассдссББд	аддадасдда	БааадББдББ	дсасБсдадс	5040
Баддадсаад	БдаББББаБс	дсБаадссдБ	БсадБаБсад	ададБББсБа	дсасдсаББс	5100
дддББдссББ	дсдсдБдсдс	сссаасдББд	БссдсБссаа	адассдасдд	БСБББББдББ	5160
ББасБдасБд	дасасББааБ	сБсаддсаас	дБсдсББдаБ	дБссдаадсБ	ддсддБдадд	5220
БдааасББас	ддсаддБдад	ББсааБсББс	БссБсдсдББ	БББададааа	ссссдсдасд	5280
ЬБсБаБсдсд	сдадсаасББ	сБсаББдсса	дБсдадЕасд	сдасдаддад	дБББаБдаса	5340
ддадБаБада	БдББсБсаББ	ББдаддсБдс	дссдсааасБ	БдаддсадаБ	ссдБсаадсс	5400
сБсаасБдаБ	ааааасадса	ададдЕдссд	дББаБББсББ	Бдасдсддас	дБдсаддБББ	5460
сдсасддддд	дасдаБддса	дссЬдадсса	аББсссадаБ	ссссдаддаа	БсддсдБдад	5520
сддБсдсааа	ссаБссддсс	сддБасаааБ	сддсдсддсд	сБдддБдаБд	ассБддБдда	5580
даадББдаад	дссдсдсадд	ссдсссадсд	дсаасдсаБс	даддсадаад	сасдссссдд	5640
БдааБсдБдд	саадсддссд	сБдаБсдааБ	ссдсааадаа	Бсссддсаас	сдссддсадс	5700
сддБдсдссд	БсдаББадда	адссдсссаа	дддсдасдад	саассадаББ	ББББсдББсс	57 60
даБдсБсБаБ	дасдБдддса	сссдсдаБад	БсдсадсаБс	аБддасдБдд	ссдББББссд	5820
БсБдБсдаад	сдБдассдас	дадсБддсда	ддБдаБссдс	БасдадсББс	садасдддса	5880
сдБададдББ	Бссдсадддс	сддссддсаБ	ддссадБдБд	БдддаББасд	ассБддБасБ	5940
даБддсддББ	БсссаБсБаа	ссдааБссаБ	даассдаБас	сдддааддда	адддадасаа	6000
дсссддссдс	дБдББссдБс	сасасдББдс	ддасдБасБс	аадББсБдсс	ддсдадссда	6060
Бддсддааад	садааадасд	ассБддБада	аассБдсаББ	сддББаааса	ссасдсасдБ	6120
БдссаБдсад	сдЕасдаада	аддссаадаа	сддссдссБд	дБдасддБаБ	ссдадддБда	6180
адссББдаББ	адссдсБаса	адаБсдБааа	дадсдааасс	дддсддссдд	адБасаБсда	6240
даБсдадсЕа	дсБдаББдда	БдБассдсда	даБсасадаа	ддсаадаасс	сддасдБдсБ	6300
дасддЕЕсас	сссдаБЕасБ	ББББдаБсда	БсссддсаБс	ддссдББББс	БсБассдссБ	6360
ддсасдссдс	дссдсаддса	аддсадаадс	садаБддББд	ББсаадасда	БсБасдаасд	6420
садБддсадс	дссддададБ	БсаадаадББ	сБдБББсасс	дБдсдсаадс	БдаБсдддБс	6480
аааЕдассЕд	ссддадБасд	аБББдаадда	ддаддсдддд	саддсБддсс	сдаБссСадБ	6540
саБдсдсБас	сдсаассБда	Бсдадддсда	адсаБссдсс	ддББссБааБ	дБасддадса	6600
даБдсБаддд	саааББдссс	Бадсадддда	ааааддБсда	аааддБсБсБ	ББссБдБдда	6660
ЕадсасдЕас	аББдддаасс	сааадссдБа	саББдддаас	сддаасссдБ	асаББдддаа	6720
сссааадссд	БасаББддда	ассддБсаса	саБдБаадЕд	асБдаБаБаа	аададааааа	6780

- 49 006761

аддсдакккк	кссдсскааа	аскскккааа	асккаккааа	асксккаааа	сссдсскддс	6840
скдкдсакаа	скдкскддсс	адсдсасадс	сдаададскд	сааааадсдс	скассскксд	6900
дксдскдсдс	кссскасдсс	ссдссдсккс	дсдксддсск	аксдсддссд	скддссдскс	6960
ааааакддск	ддсскасддс	саддсаакск	ассадддсдс	ддасаадссд	сдссдксдсс	7020
асксдассдс	сддсдскдад	дкскдссксд	кдаадааддк	дккдскдаск	сакассаддс	7080
скдааксдсс	ссаксаксса	дссадааадк	дадддадсса	сддккдакда	дадскккдкк	7140
дкаддкддас	садккддкда	ккккдааскк	ккдскккдсс	асддаасддк	скдсдккдкс	7200
дддаадакдс	дкдакскдак	сскксааскс	адсаааадкк	сдакккаккс	аасааадссд	7260
ссдксссдкс	аадксадсдк	аакдскскдс	садкдккаса	ассааккаас	сааккскдак	7320
кадаааааск	саксдадсак	сааакдааас	кдсаакккак	ксакаксадд	аккаксаака	7380
ссакаккккк	дааааадссд	кккскдкаак	дааддадааа	асксассдад	дсадккссак	7440
аддакддсаа	даксскддка	ксддкскдсд	аккссдаскс	дкссаасакс	аакасаасск	7500
аккааккксс	ссксдксааа	аакааддкка	ксаадкдада	ааксассакд	адкдасдаск	7560
даакссддкд	адаакддсаа	аадскскдса	ккаакдаакс	ддссаасдсд	сддддададд	7620
сддкккдсдк	аккдддсдск	сккссдсккс	сксдсксаск	дасксдскдс	дсксддксдк	7680
ксддскдсдд	сдадсддкак	садсксаскс	аааддсддка	акасддккак	ссасадаакс	7740
аддддакаас	дсаддааада	асакдкдадс	ааааддссад	сааааддсса	ддаассдкаа	7800
аааддссдсд	ккдскддсдк	ккккссакад	дскссдсссс	сскдасдадс	аксасааааа	7860
ксдасдскса	адксададдк	ддсдааассс	дасаддаска	кааадакасс	аддсдккксс	7920
ссскддаадс	ксссксдкдс	дсксксскдк	кссдассскд	ссдсккассд	дакасскдкс	7980
сдсскккскс	сскксдддаа	дсдкддсдск	кксксакадс	ксасдскдка	ддкаксксад	8040
кксддкдкад	дксдкксдск	ссаадскддд	скдкдкдсас	даассссссд	кксадсссда	8100
ссдскдсдсс	ккакссддка	аскаксдкск	кдадкссаас	ссддкаадас	асдасккакс	8160
дссаскддса	дсадссаскд	дкаасаддак	кадсададсд	аддкакдкад	дсддкдскас	8220
ададкксккд	аадкддкддс	скааскасдд	скасаскада	адаасадкак	ккддкакскд	8280
сдскскдскд	аадссадкка	сскксддааа	аададккддк	адсксккдак	ссддсаааса	8340
аассассдск	ддкадсддкд	дкккккккдк	ккдсаадсад	садаккасдс	дсадаааааа	8400
аддаксксаа	даадаксскк	кдаксккккс	касддддкск	дасдсксадк	ддаасдаааа	8460
сксасдккаа	дддаккккдд	ксакдадакк	аксааааадд	акскксасск	адаксскккк	8520
дакссддаак	каакксскдк	ддккддсакд	сасакасааа	кддасдаасд	дакааасскк	8580
кксасдссск	кккааакакс	сдаккаккск	аакааасдск	сккккскскк	аддкккассс	8640
дссаакакак	сскдксааас	аскдакадкк	каааскдаад	дсдддааасд	асаакскдак	8700
сакдадсдда	дааккааддд	адксасдкка	кдасссссдс	сдакдасдсд	ддасаадссд	8760
ккккасдккк	ддааскдаса	даассдсаас	дскдсаддаа	ккддссдсад	сддссаккка	8820
ааксааккдд	дсдсдссдаа	кксдадскс				8849

<210> 46 <211> 2949 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственная последовательность кассеты экспрессии Ζιηϋβϊ-6ΓΡ-353 кегт <400>46 дсакдсскдс адкдсадсдк дасссддксд кдсссскскс кададакаак дадсаккдса60 кдкскаадкк акаааааакк ассасакакк ккккккдкса сасккдкккд аадкдсадкк120 какскакскк какасакака кккааасккк аскскасдаа каакакаакс какадкаска180

- 50 006761

сааРааРаРс	адРдРРРРад	адааРсаРаР	аааРдаасад	РРадасаРдд	Рсраааддас	240
ааРРдадРаР	РРРдасааса	ддасРсРаса	дРРРРаРсРР	РРРадРдРдс	аРдРдРРсРс	300
сРРРРРРРРР	дсаааРадсР	РсассРаРар	ааРасРРсаР	ссаРРРРаРР	адРасаРсса	360
РРРадддРРР	адддРРааРд	дРРРРРаРад	асРааРРРРР	РРадРасаРс	раРРРРаРРс	420
РаРРРРадсс	РсРаааРРаа	даааасРааа	асРсРаРРРР	адРРРРРРРа	РРРааРааРР	480
РадаРаРааа	аРадааРааа	аРааадРдас	РаааааРРаа	асаааРассс	РРРаадаааР	540
РааааааасР	ааддааасаР	РРРРсРРдРР	РсдадРадаР	ааРдссадсс	РдРРааасдс	600
сдРсдасдад	РсРаасддас	ассаассадс	даассадсад	сдРсдсдРсд	ддссаадсда	660
адсадасддс	асддсаРсРс	РдРсдсРдсс	РсРддасссс	РсРсдададр	рссдсРссас	720
сдРРддасРР	дсРссдсРдР	сддсарссад	аааррдсдрд	дсддадсддс	адасдрдадс	780
сддсасддса	ддсддссРсс	РссРссРсРс	асддсасддс	адсРасдддд	даРРссРРРс	840
ссассдсРсс	РРсдсРРРсс	сРРссРсдсс	сдссдРааРа	ааРадасасс	сссРссасас	900
ссРсРРРссс	саассРсдРд	РРдРРсддад	сдсасасаса	сасаассада	РсРсссссаа	960
аРссасссдР	сддсассРсс	дсРРсааддР	асдссдсРсд	РссРсссссс	сссссссРсР	1020
срассРРсРс	РадаРсддсд	РРссддРсса	РддРРадддс	ссддРадРРс	РасРРсРдРР	1080
саРдРРРдРд	РРадаРссдР	дрррдрдрра	даРссдРдсР	дсРадсдРРс	драсасддар	1140
дсдассРдРа	сдРсадасас	дРРсРдаРРд	сРаасРРдсс	адРдРРРсРс	РРРддддааР	1200
ссРдддаРдд	сРсРадссдР	Рссдсадасд	ддаРсдаРРР	саРдаРРРРР	РРРдРРРсдР	1260
РдсаРадддР	РРддРРРдсс	сРРРРссРРР	аРРРсааРаР	ардссдрдса	сРРдРРРдРс	1320
дддРсаРсРР	РРсаРдсРРР	РРРРРдРсРР	ддРРдРдаРд	аРдРддРсРд	дррдддсддр	1380
сдррсрадар	сддадРадаа	РРсРдРРРса	аасРассрдд	РддаРРРаРР	ааРРРРддаР	1440
сРдРаРдРдР	дрдссараса	раРРсаРадР	РасдааРрда	адаРдаРдда	РддаааРаРс	1500
даРсРаддаР	аддРаРасаР	дррдардсдд	дРРРРасРда	РдсаРаРаса	дадаРдсРРР	1560
ррдррсдсрр	ддРРдРдаРд	ардрддрдрд	дррдддсддр	сдРРсаРРсд	РРсРадаРсд	1620
дадРадааРа	сРдРРРсааа	сРассРддРд	рарррарраа	РРРРддаасР	дрардрдрдр	1680
дРсаРасаРс	РРсаРадРРа	сдадРРРаад	аРддаРддаа	аРаРсдаРсР	аддаРаддРа	1740
РасаРдРРда	РдРдддРРРР	асРдаРдсаР	аРасаРдаРд	дсаРардсад	саРсРаРРса	1800
РаРдсРсРаа	ссРРдадРас	сРаРсРаРРа	РааРааасаа	дРаРдРРРРа	РааРРаРРРР	1860
даРсРРдаРа	РасРРддаРд	аРддсаРаРд	садсадсРаР	аРдРддаРРР	РРРРадсссР	1920
дссРРсаРас	дсРаРРРаРР	РдсРРддРас	РдРРРсРРРР	дРсдаРдсРс	асссРдРРдР	1980
РРддРдРРас	РРсРдсаддР	сдасРсРада	ддаРссасса	РдсРдсадаР	дадсаадддс	2040
даддадсРдР	РсассддсдР	ддРдссааРс	срддрддадс	Рддасддсда	сдрдаасддс	2100
сасаадррса	дсдрдадсдд	сдадддсдад	ддсдасдсда	ссРасддсаа	дсРдасссРд	2160
аадРРсаРсР	драссассдд	саадсРсссд	дрсссдрддс	сдасссРддР	дассассРРс	2220
ассРасддсд	РдсадРдРРР	садссдсРас	ссддассаса	Рдаадсдсса	сдасРРсРРс	2280
аададсдсса	Рдссддаддд	сРасдРдсад	дадсдсасса	РсадсРРсаа	ддасдасддс	2340
аасРасаада	сссдсдссда	ддРдаадРРс	дадддсдаса	сасРадрдаа	ссдсаРсдад	2400
сРдаадддса	РсдасРРсаа	ддаддасддс	аасаРссРдд	дссасаадсР	ддадРасаас	2460
Расаасадсс	асаасдРдРа	саРсассдсд	дасаадсада	адаасддсаР	сааддсдаас	2520
РРсаадаРсс	дссасаасаР	сдаддасддс	адсдРдсадс	Рддссдасса	сРассадсад	2580
аасассссда	Рсддсдасдд	РссРдРдсРд	сРдссддаса	ассасРассР	дадсасссад	2640
адсдсссРда	дсааддассс	даасдадаад	сдсдассаса	РддРдсРдсР	ддадРРсдРд	2700
ассдссдссд	дсаРсассса	сддсаРддас	дадсрдраса	аддРРаасРа	дадсРсаада	2760
РсРдРРсрдс	асааадрдда	дРадРсадРс	аРсдаРсадд	аассадасас	садасРРРРа	2820
РРсаРасадР	даадрдаадр	даадРдсадР	дсадРдадРР	дсРддРРРРР	дРасаасРРа	2880
дРаРдРаРРР	драрррдраа	ааРасРРсРа	РсааРааааР	РРсРаарРсс	Раааассааа	2940

- 51 006761 аЕссадЕдд2949 <210>47 <211>4341 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственная последовательность кассеты экспрессии 2тОВ1-С1С-поз <400> 47

ссЕдсадЕдс	адсдЕдассс	ддЕсдЕдссс	сЕсЕсЕадад	аЕааЕдадса	ЕЕдсаЕдЕсЕ	60
аадЕЕабааа	аааЕЕассас	аЕаЕЕЕЕЕЕЕ	ЕдЕсасасЕЕ	дЕЕЕдаадЕд	садЕЕЕаЕсЕ	120
аЕсЕЕЕаЕас	аЕаЕаЕЕЕаа	асЕЕЕасЕсЕ	асдааЕааЕа	ЕааЕсЕаЕад	ЕасЕасааЕа	180
аЕаЕсадЕдЕ	ЕЕЕададааЕ	саЕаЕаааЕд	аасадЕЕада	саЕддЕсЕаа	аддасааЕЕд	240
адЕаЕЕЕЕда	саасаддасЕ	сЕасадЕЕЕЕ	аЕсЕЕЕЕЕад	ЕдЕдсаЕдЕд	ЕЕсЕссЕЕЕЕ	300
ЕЕЕЕЕдсааа	ЕадсЕЕсасс	ЕаЕаЕааЕас	ЕЕсаЕссаЕЕ	ЕЕаЕЕадЕас	аЕссаЕЕЕад	360
ддЕЕЕадддЕ	ЕааЕддЕЕЕЕ	ЕаЕадасЕаа	ЕЕЕЕЕЕЕадЕ	асаЕсЕаЕЕЕ	ЕаЕЕСЕаЕЕЕ	420
ЕадссЕсЕаа	аЕЕаадаааа	сЕаааасЕсЕ	аЕЕЕЕадЕЕЕ	ЕЕЕЕаЕЕЕаа	ЕааЕЕЕадаЕ	480
аЕааааЕада	аЕааааЕааа	дЕдасЕаааа	аЕЕааасааа	ЕасссЕЕЕаа	даааЕЕаааа	540
ааасЕаадда	аасаЕЕЕЕЕс	ЕЕдЕЕЕсдад	ЕадаЕааЕдс	садссЕдЕЕа	аасдссдЕсд	600
асдадЕсЕаа	сддасассаа	ссадсдаасс	адсадсдЕсд	сдЕсдддсса	адсдаадсад	660
асддсасддс	аЕсЕсЕдЕсд	сЕдссЕсЕдд	ассссЕсЕсд	ададЕЕссдс	ЕссассдЕЕд	720
дасЕЕдсЕсс	дсЕдЕсддса	ЕссадаааЕЕ	дсдЕддсдда	дсддсадасд	Едадссддса	780
сддсаддсдд	ССЕССЕССЕС	сЕсЕсасддс	ассддсадсЕ	асдддддаЕЕ	ССЕЕЕсесас	840
сдсЕссЕЕсд	сЕЕЕсссЕЕс	сЕсдсссдсс	дЕааЕаааЕа	дасасссссЕ	ссасасссЕс	900
ЕЕЕссссаас	сЕсдЕдЕЕдЕ	Есддадсдса	сасасасаса	ассадаЕсЕс	ссссаааЕсс	960
асссдЕсддс	ассЕссдсЕЕ	сааддЕасдс	сдсЕсдЕссЕ	сссссссссс	сссЕсЕсЕас	1020
сЕЕсЕсЕада	ЕсддсдЕЕсс	ддЕссаЕддЕ	Еадддсссдд	ЕадЕЕсЕасЕ	ЕсЕдЕЕсаЕд	1080
ЕЕЕдЕдЕЕад	аЕссдЕдЕЕЕ	дЕдЕЕадаЕс	сдЕдсЕдсЕа	дсдЕЕсдЕас	асддаЕдсда	1140
ссЕдЕасдЕс	адасасдЕЕс	ЕдаЕЕдсЕаа	сЕЕдссадЕд	ЕЕЕсЕсЕЕЕд	дддааЕссЕд	1200
ддаЕддсЕсЕ	адссдЕЕссд	садасдддаЕ	сдаЕЕЕсаЕд	аЕЕЕЕЕЕЕЕд	ЕЕЕсдЕЕдса	1260
ЕадддЕЕЕдд	ЕЕЕдсссЕЕЕ	ЕссЕЕЕаЕЕЕ	сааЕаЕаЕдс	сдЕдсасЕЕд	ЕЕЕдЕсдддЕ	1320
саЕсЕЕЕЕса	ЕдсЕЕЕЕЕЕЕ	ЕдЕсЕЕддЕЕ	дЕдаЕдаЕдЕ	ддЕсЕддЕЕд	ддсддЕсдЕЕ	1380
сЕадаЕсдда	дЕадааЕЕсЕ	дЕЕЕсааасЕ	ассЕддЕдда	ЕЕЕаЕЕааЕЕ	ЕЕддаЕсЕдЕ	1440
аЕдсдЕдЕдс	саЕасаЕаЕЕ	саЕадЕЕасд	ааЕЕдаадаЕ	даЕддаЕдда	ааЕагсдаЕс	1500
ЕаддаЕаддЕ	аЕасаЕдЕЕд	аЕдсдддЕЕЕ	ЕасЕдаЕдса	ЕаЕасадада	ЕдсЕЕЕЕЕдЕ	1560
ЕсдсЕЕддЕЕ	дЕдаЕдаЕдЕ	ддЕдЕддЕЕд	ддсддЕсдЕЕ	саЕЕсдЕЕсЕ	адаЕсддадЕ	1620
адааЕасЕдЕ	ЕЕсааасЕас	сЕддЕдЕаЕЕ	ЕаЕЕааЕЕЕЕ	ддаасЕдЕаЕ	дЕдЕдЕдЕса	1680
ЕасаЕсЕЕса	ЕадЕЕасдад	ЕЕЕаадаЕдд	аЕддаааЕаЕ	сдаЕсЕадда	ЕаддЕаЕаса	1740
ЕдЕЕдаЕдЕд	ддЕЕЕЕасЕд	аЕдсаЕаЕас	аЕдаЕддсаЕ	аЕдсадсаЕс	ЕаЕЕсаЕаЕд	1800
сЕсЕаассЕЕ	дадЕассЕаЕ	сЕаЕЕаЕааЕ	ааасаадЕаЕ	дЕЕЕЕаЕааЕ	ЕаЕЕЕЕдаЕс	1860
ЕЕдаЕаЕасЕ	ЕддаЕдаЕдд	саЕаЕдсадс	адсЕаЕаЕдЕ	ддаЕЕЕЕЕЕЕ	адсссЕдссЕ	1920
ЕсаЕасдсЕа	ЕЕЕаЕЕЕдсЕ	ЕддЕасЕдЕЕ	ЕсЕЕЕЕдЕсд	аЕдсЕсассс	ЕдЕЕдЕЕЕдд	1980
ЕдЕЕасЕЕсЕ	дсадддаЕсс	ссЕсдаддЕс	дассаЕддЕс	сдЕссЕдЕад	ааассссаас	2040
ссдЕдаааЕс	аааааасЕсд	асддссЕдЕд	ддсаЕЕсадб	сЕддаЕсдсд	аааасЕдЕдд	2100
ааЕЕдаЕсад	сдЕЕддЕддд	ааадсдсдЕЕ	асаадааадс	сдддсааЕЕд	сЕдЕдссадд	2160
садЕЕЕЕаас	даЕсадЕЕсд	ссдаЕдсада	ЕаЕЕсдЕааЕ	ЕаЕдсдддса	асдЕсЕддЕа	2220
Есадсдсдаа	дЕсЕЕЕаЕас	сдаааддЕЕд	ддсаддссад	сдЕаЕсдЕдс	ЕдсдЕЕЕсда	2280

- 52 006761

1дсдд1сас1	саИасддса	аад!д1ддд!	саа1аа!сад	даад!да!дд	адсабсаддд	2340
сддс1а1асд	сса!Г1даад	ссда!д!сас	дссд!а1д11	аИдссддда	ааад!д1асд	2400
1аад1Ыс1д	с!1с1асс11	1да1а1а1а1	а!аа1аа11а	1са11аа11а	д1ад1аа1а!	2460
аа1а!11саа	а1а1111111	сааааСаааа	даа!д!ад1а	1а1адсаа11	дс1111с1д!	2520
адИСаСаад	1д1д1а1а11	ИааЬНаСа	асС111с1аа	1а1а1дасса	ааа111д11д	2580
а!д!дсадд1	а!сассд111	д!д!даасаа	сдаасбдаас	1ддсадас1а	бсссдссддд	2640
аа!дд1да11	ассдасдааа	асддсаадаа	ааадсад1с1	¢8016.00319	аШсШаа	2700
сбаСдссдда	а!сса1сдса	дсдсаасдс!	с1асассасд	ссдаасасс!	дддбддасда	2760
1а1сассд1д	д!дасдса1д	1сдсдсаада	с!д!аассас	дсд1с1д!1д	ас1ддсадд1	2820
ддеддссаа!	ддбда!д1са	дсдИдаас!	дсдбдабдсд	да!саасадд	1дд11дсаас	2880
бддасааддс	асЬадсддда	сШдсаад!	дд!даа!ссд	сасс!с1ддс	аассддд1да	2940
аддССаСсСс	1а1даас1д1	дсдЪсасадс	саааадссад	асадад!д!д	а1а1с1ассс	3000
дс!1сдсд!с	ддсабссдд!	садбддсад!	даадддсдаа	сад11сс1да	Наассасаа	3060
ассдИсбас	111ас1ддс1	ЫддЬсдСса	1даада1дсд	дас!1дсд1д	дсаааддаИ	3120
сда!аасд!д	С1да1дд1дс	асдассасдс	а11аа1ддас	1дда11дддд	ссаас!сс1а	3180
ссд!асс1сд	саиассси	асдссдаада	даСдсГсдас	1дддсада1д	аасаСддса!	3240
сд!дд!да11	да!дааас!д	с1дс1д!сдд	сШаасс! с	1с111аддса	ИддШсда	3300
адсдддсаас	аадссдааад	аас!д!асад	сдаададдса	дбсаасдддд	ааасбсадса	3360
адсдсасИа	саддсдаИа	аададсСда!	адсдсд!дас	ааааассасс	саадсдбдд!	3420
да!д1ддад!	аИдссаасд	аассддабас	ссдСссдсаа	ддбдсасддд	аа1аИ1сдо	3480
дссасбддсд	даадсаасдс	дСааасСсда	сссдасдсд!	ссда1сасс!	дсд!саа1д!	3540
аа!д11с1дс	дасдсбсаса	ссдабасса!	садсда!с!с	111да1д1дс	1д1дсс1даа	3600
ссд11а11ас	дда!дд!а1д	1ссааадсдд	сдаШддаа	асддсадада	адд!ас1дда	3660
аааадаасИ	с1ддсс1ддс	аддадааас!	дсаГсадссд	а€1а1са1са	ссдаа1асдд	3720
сд!дда!асд	Надссдддс	1дсас1саа1	дбасассдас	а1д!ддад!д	аадад!а1са	3780
д1д1дса1дд	ссддасагдс	а1сассдсд1	сСС1да1сдс	дГсадсдссд	1сд1сдд1да	3840
асаддбабдд	ааШсдссд	аИИдсдас	сбсдсааддс	а1а11дсдсд	11ддсдд1аа	3900
саадаааддд	аГсНсасГс	дсдассдсаа	ассдаадГсд	дсддс1111с	1дс1дсаааа	3960
асдс1ддас!	ддсабдаас!	1сдд1даааа	ассдсадсад	ддаддсааас	аа!даа1саа	4020
саас!с1сс1	ддсдсасса!	сд!сддс!ас	адссксддда	а11ада1ссс	сдааШссс	4080
сда1сд!1са	аасаШддс	аабааадШ	С11аада11д	аа!сс1д11д	ссддбсИдс	4140
да1да1Га1с	а!а1аа111с	1д11даа11а	сдИаадса!	д1аа1аа11а	аса!д!аа1д	4200
сабдасдИа	ί11а1дада1	дддШИа!	да11адад!с	ссдсааНа!	асаШааба	4260
сдсда!адаа	аасаааа1а!	адсдсдсааа	С1адда1ааа	11а1сдсдсд	сддСд!са1с	4320
1а1д11ас1а	дабсдддаа!	С				4341

<210> 46 <211> 2943 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственная последовательность кассеты экспрессии ОЬдЗ(А1)-зупСГР1 поз <400>46 ассддаШд дадссаад!с 1са1ааасдс са11д1ддаа дааад1с11д ад11дд1дд!60 аа1д1аасад ад!ад1аада асададаада дадададСд! дада!аса!д аа!1д1сддд120 саасааааа! сс!дааса!с ССаССИадс ааададааад адИссдад! с!д1адсада180

- 53 006761

ададкдадда	дааакккаад	сксккддаск	кдкдааккдк	кссдсскскк	даакасккск	240
ксааксскса	какакксккс	ккскакдкка	сскдаааасс	ддсакккаак	сксдсдддкк	300
каккссддкк	саасаккккк	кккдккккда	дккаккакск	дддсккаака	асдсаддсск	360
дааакааакк	сааддсссаа	скдккккккк	ккккаадаад	ккдскдккаа	аааааааааа	420
адддааккаа	саасаасаас	ааааааадак	ааадаааака	акаасаакка	скккааккдк	480
адаскааааа	аасакадакк	ккаксакдаа	ааааададаа	аадааакааа	аасккддакс	540
аааааааааа	сакасадакс	ккскааккак	каасккккск	каааааккад	дксскккккс	600
ссаасаакка	ддкккададк	кккддаакка	аассааааад	аккдккскаа	аааакаскса	660
аакккддкад	акаадккксс	ккаккккаак	кадксаакдд	кадакасккк	кккккскккк	720
скккаккада	дкадаккада	аксккккакд	ссаадкаккд	акаааккааа	ксаадаадак	780
аааскаксак	ааксаасакд	аааккаааад	ааааакскса	какакадкак	кадкаккскс	840
какакакакк	акдаккдскк	акксккаакд	ддккдддкка	ассаадасак	адксккаакд	900
дааадаакск	кккккдааск	ккккссккак	кдаккааакк	сккскакада	ааадааадаа	960
аккакккдад	даааадкака	касааааада	аааакадааа	аакдксадкд	аадсадакдк	1020
аакддакдас	скаакссаас	сассассака	ддакдкккск	асккдадксд	дксккккааа	1080
аасдсасддк	ддаааакакд	асасдкакса	какдакксск	ксскккадкк	ксдкдакаак	1140
аакссксаас	кдакаксккс	скккккккдк	кккддскааа	дакаккккак	ксксаккаак	1200
адаааадасд	дккккдддск	кккддкккдс	дакакааада	адасскксдк	дкддаадака	1260
акаакксакс	сккксдкскк	кккскдаскс	кксаакскск	сссааадсск	ааадсдакск	1320
скдсааакск	сксдсдаскс	ксксккксаа	ддкакакккк	скдакксккк	ккдкккккда	1380
кксдкакскд	акскссаакк	кккдккакдк	ддаккаккда	аксккккдка	каааккдскк	1440
ккдасаакак	кдкксдкккс	дксаакссад	сккскааакк	ккдксскдак	каскаадака	1500
ксдакксдка	дкдкккасак	скдкдкаакк	ксккдсккда	ккдкдааакк	аддаккккса	1560
аддасдакск	акксаакккк	кдкдккккск	ккдкксдакк	скскскдккк	каддкккскк	1620
акдкккадак	ссдкккскск	ккддкдккдк	кккдакккск	сккасддскк	ккдакккддк	1680
акакдкксдс	кдаккддккк	скасккдккс	каккдкккка	ккксаддкдд	акссассакд	1740
скдсадакда	дсаадддсда	ддадскдккс	ассддсдкдд	кдссааксск	ддкддадскд	1800
дасддсдасд	кдаасддсса	саадкксадс	дкдадсддсд	адддсдаддд	сдасдсдасс	1860
касддсаадс	кдассскдаа	дкксакскдк	ассассддса	адсксссддк	сссдкддссд	1920
ассскддкда	ссасскксас	скасддсдкд	садкдкккса	дссдскассс	ддассасакд	1980
аадсдссасд	асккскксаа	дадсдссакд	ссддадддск	асдкаадккк	скдсккскас	2040
скккдакака	какакаакаа	ккаксаккаа	ккадкадкаа	какаакаккк	сааакакккк	2100
ккксаааака	ааадаакдка	дкакакадса	аккдсккккс	кдкадкккак	аадкдкдкак	2160
аккккааккк	акаасккккс	каакакакда	ссаааакккд	ккдакдкдса	ддкдсаддад	2220
сдсассакса	дскксаадда	сдасддсаас	касаадассс	дсдссдаддк	даадкксдад	2280
ддсдасасас	кадкдаассд	саксдадскд	аадддсаксд	аскксаадда	ддасддсаас	2340
аксскдддсс	асаадскдда	дкасааскас	аасадссаса	акдкдкасак	сассдсддас	2400
аадсадаада	асддсаксаа	ддсдаасккс	аадакссдсс	асаакаксда	ддасддсадс	2460
дкдсадскдд	ссдассаска	ссадсадаас	ассссдаксд	дсдасддксс	кдкдскдскд	2520
ссддасаасс	аскасскдад	сасссададс	дссскдадса	аддасссдаа	сдадаадсдс	2580
дассасакдд	кдскдскдда	дкксдкдасс	дссдссддса	ксасссасдд	сакддасдад	2 64 0
скдкасаадд	ккааскадад	скскадаксс	ссдааккксс	ссдаксдккс	ааасакккдд	2700
саакааадкк	ксккаадакк	дааксскдкк	дссддксккд	сдакдаккак	сакакааккк	2760
скдккдаакк	асдккаадса	кдкаакаакк	аасакдкаак	дсакдасдкк	акккакдада	2820
кдддккккка	кдаккададк	сссдсаакка	касакккаак	асдсдакада	ааасаааака	2880
кадсдсдсаа	аскаддакаа	аккаксдсдс	дсддкдксак	скакдккаск	адаксдддаа	2940

- 54 006761

61:д2943 <210>49 <211>4072 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственная последовательность кассеты экспрессии иЬчЗ(А6)-61С-поз <400> 49

сддаСЬЬдда	дссаадЬсЬс	аЪааасдсса	ССдбддаада	аадЬсМдад	ϋίддбддЬаа	60
СдЬаасадад	Гадбаадаас	ададаадада	дададбд1да	даСасаЕдаа	1£д£сдддса	120
асаааааЬсс	Ьдаасабсеб	аЬЁС'Ьадсаа	ададааадад	6£ссдадСс1:	дСадсадаад	180
адбдаддада	ааШаадсб	с£1ддасЬ6д	гдааИдЦс	сдссесЕЕда	абасббсЬСс	240
аа£ссЬсаЬа	Ьа-ебсЬСсЬЬ	сбаЬдЬЬасс	Сдаааассдд	саЪЪЪааСсЬ	сдсдддЬЬЬа	300
££ссддссса	аса1Ь6£6се	£де£ебдад£	СаИаСсСдд	дсС£аа£аас	дсаддссОда	360
аа^ааэСОса	аддсссаасе	дИМЪЬЕЕС	ССаадаад££	дсЬдЪЪаааа	ааааааааад	420
ддааебааса	асаасаасаа	ааааадаСаа	адаааасаа!	аасаагСасе	Мааббдбад	480
асЪааааааа	саСадаЪССС	аЪсаСдаааа	ааададаааа	даааЬааааа	сббддаОсаа	540
аааааааса):	асадабсбЛс	ЪааббаЬбаа	сИЦсИав	ааабСаддбс	сббббЬссса	600
асааЁЁадд!:	СГадад£(:1:£	ддааЬСааас	сааааадаЪЪ	дЬЪсбааааа	аСасбсаааб	660
ЪЪдд£ада£а	ад6Щ.сс!Л.а	ЪЪЪ^ааССад	£сааЕдд1:ад	а! асЪИг.тЛ	1ЛсЪ£к£с1Л	720
баЪЬададЬа	да£ЬадааЬс	ббббабдсса	ад€аЕ1;даГа	ааСбаааСса	адаадабааа	780
сбаЪсаСааС	саасаЪдааа	ССаааадааа	аа-СсЪса!аЬ	абадЬа^ад	бабГсГсСаС	840
аба^асгаСд	аИдсССаСС	с£6аа6дддс	гдддССаасс	аадасаЕад!	сббаабддаа	900
адааЪсЪСС!	Мдаасбббб	ЪссСЁаббда	МаааМсЬЪ	сЬаСадаааа	дааадаааЪЪ	960
асьидаддаа	аадсасагас	ааааадаааа	асадаааааг	дбеадсдаад	садаГдСааС	1020
ддаЬдассЕа	аЬссаассас	сассаЬадда	Сд^ЪЬсСасЪ	^дадСсддбс	ЪбЪЬааааас	1080
дсасддЬдда	ааа1а6даса	сдСаСса!:а1:	даССссИсс	ЬЬ£адЁ££сд	СдаЬааЬааб	1140
ссЬсаасбда	ίβΐοίίοσΐΐ	ЪЪЬССдСССС	ддсЬааадаЪ	а6666а£6сЬ	саССаарада	1200
ааадасдд££	СЕдддсбСЁЁ	ддбббдсда'Ь	аЬааадаада	ссССсдбдбд	даадабааЪа	1260
а£Ьса(:сс££	ЬсдОсСЫЫ:	сбдасбсбЪс	ааЬсбсбссс	ааадссбааа	дсдабсбсЪд	1320
сааа^сЬс£с	дсдасбсбсб	сЪЬЪсааддС	аСаЫЫсСд	аЧсЕНСЪбд	ЬЕббЕдаЕСс	1380
дЬаСсЕдаСс	СссааССССИ	д£6а£дедда	сгаЬЕдаасс	66£ед£а£аа	аССдссьссд	1440
асаа6асгд£	ЪсдЪЬСсдЬс	аабссадс^Ъ	сСаааЫССд	СссЕда^ас	ЪаадаЬаЪсд	1500
аССсдСадЪд	£Маса1с£д	1д!аа111с!	бдсСедабЬд	ЬдаааЕЪадд	аССССсаадд	1560
асдаЪсЬабб	сааШИд!	дЫНсьид	бСсдаМсбс	ЬсЪдЫббад	дбббсббаЪд	1620
бееадагссд	егис1с1с1:д	дедССдСГЛС	даГССсСсГС	асддсее^бд	а£1:гдд£аеа	1680
бдЪЪсдсбда	ЬЬддШсба	сЪЬдЪЬсСаС	СдббССаббг	саддЪдда1:с	сссЬсдаддЕ	1740
сдассаеддС.	ссдгсс£д£а	дааассссаа	сссдСдаааб	саааааасСс	дасддсссдс	1800
дддсаСЪсад	Сс1дда8сдс	даааассдбд	даа6Ьда1са	дсдСЬддЪдд	дааадсдсдС	1860
тасаадааад	ссдддсааМ	дс£д£дссад	дсадШШ	сдаСсадЕЕс	дссдабдсад	1920
абаССсдСаа	Ъ^аЬдсдддс	аасдСседдЪ	а£садсдсда	адСс^ЬЪаба	ссдаааддЪЬ	1980
дддсаддсса	дсдЬа1сд£д	сЬдсдССесд	а!дсддбсас	ЬсаССасддс	ааад£дЪддд	2040
СсааСаабса	ддаад1даСд	дадсабсадд	дсддс£а!ас	дссаОЪЪдаа	дссдаЬдГса	2100
сдссдСаЪде	Са^бдссддд	аааадбдЬас	дбаадСИсС	дсССсеассе	ЕСдабаСаСа	2160
ЪаСааСаа^С	аСсаЫааН	адСадбааОа	СаабаССГса	ааеасссхсс	Есаааа^ааа	2220
адааЪдбадЪ	абаЬадсаа!.	СдсССССсЬд	бадбЫа^аа	дЬдЬдСаЪаб	ШааСОЪаЬ	2280

- 55 006761

аасЕЕЕЕсЕа	аЕаЕаЕдасс	ааааЕЕЕдЕЕ	даЕдЕдсадд	ЕаЕсассдЕЕ	ЕдЕдЕдааса	2340
асдаасЕдаа	сЕддсадасЕ	аЕсссдссдд	дааЕддЕдаЕ	Еассдасдаа	аасддсаада	2400
аааадсадЕс	ЕЕасЕЕссаЕ	даЕЕЕсЕЕЕа	асЕаЕдссдд	ааЕссаЕсдс	адсдЕааЕдс	2460
ЕсЕасассас	дссдаасасс	ЕдддЕддасд	аЕаЕсассдЕ	ддЕдасдсаЕ	дЕсдсдсаад	2520
асЕдЕаасса	сдсдЕсЕдЕЕ	дасЕддсадд	ЕддЕддссаа	ЕддЕдаЕдЕс	адсдЕЕдаас	2580
ЕдсдЕдаЕдс	ддаЕсаасад	дЕддЕЕдсаа	сЕддасаадд	сасЕадсддд	асЕЕЕдсаад	2640
ЕддЕдааЕсс	дсассЕсбдд	саассдддЕд	ааддЕЕаЕсЕ	сЕаЕдаасЕд	ЕдсдЕсасад	2700
ссаааадсса	дасададЕдЕ	даЕаЕсЕасс	сдсЕЕсдсдЕ	сддсаЕссдд	ЕсадЕддсад	2760
Едаадддсда	асадЕЕссЕд	аЕЕаассаса	аассдЕЕсЕа	сЕЕЕасЕддс	ЕЕЕддЕсдЕс	2820
аЕдаадаЕдс	ддасЕЕдсдЕ	ддсаааддаЕ	ЕсдаЕаасдЕ	дсЕдаЕддЕд	сасдассасд	2880
саЕЕааЕдда	сЕддаЕЕддд	дссаасЕссЕ	ассдЕассЕс	дсаЕЕасссЕ	ЕасдсЕдаад	2940
адаЕдсЕсда	СЕдддсадаЕ	даасаЕддса	ЕсдЕддЕдаЕ	ЕдаЕдааасЕ	дсЕдсЕдЕсд	3000
дсЕЕЕаассЕ	сЕсЕЕЕаддс	аЕЕддЕЕЕсд	аадсдддсаа	саадссдааа	даасЕдЕаса	3060
дсдаададдс	адЕсаасддд	дааасЕсадс	аадсдсасЕЕ	асаддсдаЕЕ	ааададсЕда	3120
ЕадсдсдЕда	сааааассас	ссаадсдЕдд	ЕдаЕдЕддад	ЕаЕЕдссаас	даассддаЕа	3180
сссдЕссдса	аддЕдсасдд	даасаЕЕЕсд	сдссасЕддс	ддаадсаасд	сдЕааасЕсд	3240
асссдасдсд	ЕссдаЕсасс	ЕдсдЕсааЕд	ЕааЕдЕЕсЕд	сдасдсЕсас	ассдаЕасса	3300
ЕсадсдаЕсЕ	сЕЕЕдаЕдЕд	сЕдЕдссЕда	ассдЕЕаЕЕа	сддаЕддЕаЕ	дЕссааадсд	3360
дсдаЕЕЕдда	аасддсадад	ааддЕасЕдд	ааааадаасЕ	ЕсЕддссЕдд	саддадааас	3420
ЕдсаЕсадсс	даЕЕаЕсаЕс	ассдааЕасд	дсдЕддаЕас	дЕЕадссддд	сЕдсасЕсаа	3480
ЕдЕасассда	саЕдЕддадЕ	даададЕаЕс	адЕдЕдсаЕд	дсЕддаЕаЕд	ЕаЕсассдсд	3540
ЕсЕЕЕдаЕсд	сдЕсадсдсс	дЕсдЕсддЕд	аасаддЕаЕд	дааЕЕЕсдсс	даЕЕЕЕдсда	3600
ссЕсдсаадд	саЕаЕЕдсдс	дЕЕддсддЕа	асаадааадд	даЕсЕЕсасЕ	сдсдассдса	3660
аассдаадЕс	ддсддсЕЕЕЕ	сЕдсЕдсааа	аасдсбддас	ЕддсаЕдаас	ЕЕсддЕдааа	3720
аассдсадса	дддаддсааа	сааЕдааЕса	асаасЕсЕсс	Еддсдсасса	ЕсдЕсддсЕа	3780
садссЕсддд	ааЕЕадаЕсс	ссдааЕЕЕсс	ссдаЕсдЕЕс	ааасаЕЕЕдд	сааЕааадЕЕ	3840
ЕсЕЕаадаЕЕ	дааЕссЕдЕЕ	дссддЕсЕЕд	сдаЕдаЕЕаЕ	саЕаЕааЕЕЕ	сЕдЕЕдааЕЕ	3900
асдЕЕаадса	ЕдЕааЕааЕЕ	аасаЕдЕааЕ	дсаЕдасдЕЕ	аЕЕЕаЕдада	ЕдддЕЕЕЕЕа	3960
ЕдаЕЕададС	сссдсааЕЕа	ЕасаЕЕЕааЕ	асдсдаЕада	ааасааааЕа	Еадсдсдсаа	4020
асЕаддаЕаа	аЕЕаЕсдсдс	дсддЕдЕсаЕ	сЕаЕдЕЕасЕ	адаЕсдддаа	ЕЕ	4072

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (34)

1. Последовательность ДНК вируса желтого скручивания листьев цестровых, обладающая способностью обеспечивать экспрессию связанной с ней представляющей интерес нуклеотидной последовательности, включающая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей последовательности 8ЕС) ΙΌ N0:1, 81 У) ΙΌ N0:2, 81 У) ΙΌ N0:3, 81 У) ΙΌ N0:4, 81 Б) ΙΌ N0:19 и 81 У) ΙΌ N0:20, как указано в Перечне последовательностей.

2. Последовательность ДНК по п.1, на 5' конце дополнительно содержащая все или часть нуклеотидов последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:6.

3. Последовательность ДНК по п.1, включающая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2, 8ЕЦ ΙΌ N0:3, 8ЕЦ ΙΌ N0:4, 8ЕЦ ΙΌ N0:19 и 8ЕЦ ΙΌ N0:20, причем указанная последовательность ДНК дополнительно содержит на 3' конце все или часть нуклеотидов последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:5.

4. Последовательность ДНК, которая гибридизуется в строгих условиях с последовательностью ДНК по любому из пп.1-3.

5. Последовательность ДНК, представляющая собой фрагмент по меньшей мере из 50 последовательно расположенных нуклеотидов, по меньшей мере на 70% идентичных фрагменту, состоящему по меньшей мере из 50 последовательно расположенных нуклеотидов 8ЕЦ ΙΌ N0:1, обладающая способностью обеспечивать экспрессию связанной с ней представляющей интерес нуклеотидной последовательности.

6. Последовательность ДНК по п.5 по меньшей мере из 50 последовательно расположенных нуклеотидов, на 100% идентичных фрагменту, состоящему по меньшей мере из 50 последовательно расположенных нуклеотидов 8ЕЦ ΙΌ N0:1.

- 56 006761

7. Рекомбинантная молекула ДНК, включающая последовательность ДНК по любому из пп.1-6.

8. Рекомбинантная молекула ДНК по п.7, где последовательность ДНК функционально связана с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью.

9. Рекомбинантная молекула ДНК по п.8, где представляющая интерес нуклеотидная последовательность включает кодирующую последовательность.

10. Рекомбинантная молекула ДНК по п.9, где кодирующая последовательность обеспечивает проявление требуемого фенотипического признака.

11. Рекомбинантная молекула ДНК по п.10, где кодирующая последовательность обеспечивает синтез белка, обусловливающего позитивное избирательное преимущество клеткам, трансформированным указанной кодирующей последовательностью.

12. Рекомбинантная молекула ДНК по п.11, где указанный белок является ферментом и обуславливает метаболическое преимущество клеток, заключающееся в способности метаболизировать соединение, представляющее собой (ί) маннозу или ксилозу, или их производное или предшественник, (ίί) субстрат фермента или (ш) соединение, способное метаболизироваться с образованием такого субстрата.

13. Рекомбинатная молекула ДНК по п.12, где указанный белок представляет собой фермент, выбранный из группы, включающей ксилоизомеразы, фосфоманно-изомеразы, маннозо-6-фосфатизомеразу, маннозо-1-фосфат-изомеразу, фосфоманномутазу, маннозоэпимеразу, маннозо- или кислозофосфатазу, маннозо-6-фосфатазу, маннозо-1-фосфатазу и маннозо- или ксилозопермеазу.

14. Рекомбинантная молекула по п.13, где указанный фермент представляет собой фосфоманноизомеразу.

15. Рекомбинатная молекула ДНК по п.9, в которой кодирующая область является нетранслируемой.

16. Рекомбинантная молекула ДНК по п.15, где нетранслируемая кодирующая область происходит из вирусного гена.

17. Рекомбинантная молекула ДНК по п.16, где вирусный ген происходит из вируса жёлтого скручивания листьев цестровых, в частности из гена нуклеокапсидного белка вируса жёлтого скручивания листьев цестровых.

18. Рекомбинатная молекула ДНК по п.9, где кодирующая последовательность находится в антисмысловой ориентации.

19. Экспрессионный ДНК-вектор, включающий последовательность ДНК по любому из пп.1-6 или рекомбинантную молекулу ДНК по любому из пп.7-18.

20. Экспрессионный ДНК-вектор по п.19, представляющий собой рN0У2819.

21. Экспрессионный ДНК- вектор по п.19, представляющий собой рN0У2820.

22. Экспрессионный ДНК-вектор, который включает первую последовательность ДНК по любому из пп.1-6, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, и вторую последовательность ДНК по любому из пп.1-6, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью.

23. Экспрессионный ДНК-вектор по п.22, который при экспрессии в клетке обладает способностью изменять экспрессию вирусного генома, который находится в той же клетке.

24. Экспрессионный ДНК-вектор по п.23, включающий (ί) первую последовательность ДНК по любому из пп.1-6, функционально связанную с представляющей интерес последовательностью, причем указанная представляющая последовательность является фрагментом смысловой РНК вирусного генома или его частью, (ίί) вторую последовательность ДНК по любому из пп.1-6, функционально связанную с представляющей интерес последовательностью, причем указанная представляющая интерес последовательность является фрагментом антисмысловой РНК вирусного генома или его частью, где фрагмент смысловой РНК и фрагмент антисмысловой РНК обладают способностью образовывать двухцепочечную РНК.

25. Экспрессионный ДНК-вектор по п.24, где вирус выбирают из группы, включающей тосповирусы, потивирусы, потексвирусы, тобамовирусы, лутеовирусы, кукумовирусы, бромовирусы, клостеорвирусы, томбусвирусы и фуровирусы.

26. Экспрессионный ДНК-вектор по п.25, где представляющая интерес последовательность содержит нуклеотидную последовательность, полученную из гена белка вирусной оболочки, гена вирусного нуклеокапсидного белка, гена вирусной репликазы или гена белка, обеспечивающего перемещение вируса, или его частей.

27. Экспрессионный ДНК-вектор по п.26, где указанную нуклеотидную последовательность получают из вируса пятнистого увядания томатов (Т8№У).

28. Экспрессионный ДНК-вектор по п.27, где указанную нуклеотидную последовательность получают из гена нуклеокапсидного протеина.

29. Клетка-хозяин, стабильно трансформированная последовательностью ДНК по любому из пп.1-6 или рекомбинантной молекулой ДНК по любому из пп.7-18 или экспрессионным вектором ДНК по лю

- 57 006761 бому из пп.19-28.

30. Клетка-хозяин по п.29, где клетка-хозяин представляет собой растительную клетку.

31. Растение и его потомство, стабильно трансформированные последовательностью ДНК по любому из пп.1-6 или рекомбинантной молекулой ДНК по любому из пп.7-18 или экспрессионным вектором ДНК по любому из пп.19-28.

32. Растение по п.31, выбранное из группы, включающей кукурузу, пшеницу, сорго, рожь, овес, газонную траву, рис, ячмень, сою, хлопчатник, табак, сахарную свеклу и масличный рапс.

33. Применение последовательности ДНК по любому из пп.1-6 для экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности.

34. Способ получения последовательности ДНК по любому из пп.1-6 путем полимеразной цепной реакции с использованием по меньшей мере одного олигонуклеотида, представляющего собой фрагмент, состоящий из 15 или более последовательно расположенных пар оснований нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1 при использовании в качестве мишени ДНК, полученной из транскрипта промоторной области полной длины вируса желтого скручивания листьев цестровых.