KR19990022728A - 아비딘의 고농도 발현에 의한 식물에서의 웅성생식불능의 유도 - Google Patents

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존 에이 하워드
마르크 시 앨버트선
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저비스 허버트 에이치
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Abstract

생식불능성 식물은 식물 조직에서의 아비딘의 내성 농도를 증가시켜 생산될 수 있다. 이 효과는, 아비딘을 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터에서 발현 벡터를 포함하는 트랜스제닉 식물을 생산함으로써 이루어 질 수 있다. 또한, 웅성 번식능력을 회복시키는 방법도 기술되어 있다.

Description

아비딘의 고농도 발현에 의한 식물에서의 웅성 생식불능의 유도
하이브리드 작물 생산에 있어서 화분의 수정능을 조절하는 것은 필수적인 사항이다. 예를 들어 문헌 [J. M. Poehlman, BREEDING FIELD CROPS, 3rd ed., Van Nostrand and Reinhold, New York, NY, 1987]을 참조할 수 있는데, 이 문헌의 내용은 본 명세서에 참고의 목적으로 포함되어 있다. 예를 들어 하이브리드 옥수수 생산에 있어서, 화분 수정능의 조절은 전형적으로 화분을 퍼트리기 전제 꽃 또는 수염(술)을 제거함으로써 달성한다. 수작업에 의해 옥수수의 수염을 제거하는 것은 매우 노동집약적인 작업이다. 기계에 의한 작업을 하는 경우 수작업보다는 노동력이 덜 필요하긴 하지만, 작업의 신뢰도가 떨어지며 그 이후에 작물을 검사하여야 하고, 경우에 따라 수작업에 의한 교정작업이 요구되기도 한다. 수염 제거를 위한 수작업 및 기계작업 모두 자성의 부모세대의 수율의 손실을 유발한다.
그러나, 대부분의 주요 작물들은 동일한 식물(flower)체 내에 기능성 웅성 및 자성 기관을 모두 갖고 있다; 따라서, 거세작업이 단순한 과정만은 아닌 것이다. 화분을 퍼트리기 전에 화분-형성 기관을 손으로 제거할 수 있긴 하지만, 이러한 형태의 하이브리드 생산은 고도로 노동이 집약된 형태이며 매우 고가의 작업이다.
화분 수정능은 웅성 생식체 박멸능(germicide)을 갖는 잎 스프레이(foliar spray)를 사용하므로써 조절할 수도 있다 [Cross et al., Sex Plant Reprod. 4:235 (1991)]. 예를 들어, 에트렐(ethrel)을 꽃밥에 사용하면 밀에서는 부가적인 화분 유사분열이 일어나고, 보리에서는 내면층 세포의 퇴화가 일어나며, 에라그로스티스(Eragrostis)에서는 변형되거나 또는 발육부전인 화분이 생성된다. [Bennet et al., Nature 240:566 (1972), Colhoun et al., Plant Cell Environ. 6:21(1983); Berthe et al., Crop Sci. 18: 35 (1978)]. 그러나 화학적 접근방법은 노동집약적이고, 화학물질이 환경에 유입되는 경우의 독성과 관련된 잠재적인 문제점이 제기된다.
또한, 생식체 박멸약을 이용한 하이브리드 종자의 상업적 생산은 비용 및 화학물질의 입수가능성에 의해 제한을 받으며, 나아가 사용된 약이 작용을 하는 기간 및 신뢰성에 의해서도 제한을 받는다. 생식체 박멸약의 심각한 한계점은 이들이 식물독성 작용을 갖는다는 것이며, 이 독성의 심각도는 유전자형에 따라 다르다. 또다른 한계점으로는 개화기간을 연장시킨 작물의 경우에는 이들 화학물질이 효과를 나타내지 못할 수 있다는 것인데, 이는 새로이 생산된 식물체는 영향을 받지 않을 수 있기 때문이다. 따라서, 화학물질을 반복해서 사용할 필요가 있다.
작물에 사용되는 것으로서 현재 상업적으로 시판되는 하이브리드 종자 생산 시스템 중 많은 것들은 화분 형성을 조절하는 유전학적 수단에 의존하고 있다. 자성으로 이용되는 식물체는 화분을 퍼트리지 못하거나 또는 생화학적으로 자기 수정(self-fertilization)을 하지 못하는 화분을 생산하거나, 또는 화분을 만들어내지 못한다. 자기 수정을 하지 못하는 식물체는 "자기-부적합(self-incompatible)"이라고 불리운다. 자기-부적합 시스템을 이용하는 것과 관련된 어려움에는 자기-부적합 자성 식물주를 입수하고 증식시키는 것의 어려움, 및 자기-부적합의 안정성에 관한 어려움이 포함된다. 어떤 경우에는, 자기 부적합을 화학적으로 극복하거나, 또는 화분이 활성화되는 것을 차단하는 생화학적 메카니즘보다 먼저 미성숙 싹을 손으로 가루받이할 수 있다. 불활성화될 수 있는 자기-부적합 시스템은 자기-가루받이를 생화학적으로 차단하는 작용의 효율성을 파괴하거나 감소시키는 스트레스성 기후 조건에 대해 종종 매우 민감하게 반응하곤 한다.
보다 광범위한 주목을 받고 있는 상업적 종자 생산법은 유전학적 화분-조절에 기초를 둔 웅성 생식불능 시스템이다. 이러한 시스템에는 두 가지 종류가 있다: (1) 핵성 웅성 생식불능(nuclear male sterility), 이것은 하나 또는 그 이상의 핵 유전자가 변이되므로써 화분의 형성이 되지 않는 기술이고, (2) 세포질-유전학적 웅성 생식불능(cytoplasmic-genetic male sterility), 이것은 흔히 "세포질 웅성 생식불능(CMS)"이라고 불리는데, 세포질의 소기관, 일반적으로는 미토콘드리아에서의 변화 때문에 화분 형성이 차단되거나 무산된 기술이다.
핵성 생식불능 기술은 우성이거나 열성일 수 있다. 우성의 생식불능 기술은 자성 식물주의 무성 번식이 가능하거나 클로닝에 의한 번식이 가능한 경우에 하이브리드 종자 형성을 위해서만 이용될 수 있다. 열성 생식불능 기술은 생식불능 식물체와 생식가능 식물체를 쉽게 구분할 수 있는 경우에 이용될 수 있다. 그러나 우성 및 열성 생식불능 시스템의 상업적 이용은 각각 클로닝 번식의 비용 및 자기-수정 식물체의 자성만을 골라내는 것의 어려움 때문에 제한을 받고 있다.
CMS의 이용을 포함하는 하이브리드화 공정이 있긴 하지만, 그의 상업적 가치에는 한계가 있다. CMS 시스템의 한 예는 세포질에 위치한 미토콘드리아에 특이적 변이를 일으키는 것인데, 이것은 적절한 핵 배경(nuclear background) 중에서 성숙한 화분이 형성되지 못하도록 할 수 있다. 경우에 따라, 핵 배경은 세포질 변이를 보상하여 정상적인 화분 형성이 이루어질 수 있도록 할 수 있다. 특정의 핵 "회복 유전자(restorer genes)"는 CMS 미토콘드리아를 갖는 식물체내에서 화분이 형성되도록 한다. 일반적으로, 상업적인 종자 생산을 위한 CMS의 이용은 세종류의 교배 주의 사용을 포함한다: 웅성 생식불능 주(자성 모주; female parent), 상기 웅성 생식불능 주와 동일한 유전자 계를 갖지만 그래도 완전히 기능을 하는 미토콘드리아를 포함하고 있는 유지 주, 및 웅성 모주. 웅성 모주는 세포질에 내에 특정한 회복 유전자를 갖거나 갖지 않을 수 있다.
하이브리드로부터 종자를 회수하는 것이 중요하지 않은 야채와 같은 작물에 있어서는, CMS 시스템은 회복의 기술 없이 사용될 수 있다. 시판되는 산물이 하이브리드의 열매 또는 종자인 작물에 있어서는, 하이브리드 종자의 수정능을 반드시 회복시켜야 되는데, 이는 웅성 모주에 있는 특정 회복 유전자를 이용하거나 또는 웅성-생식불능을 하이브리드를 꽃가루받이 해주므로써 행할 수 있다. 회복되지 않은 하이브리드의 꽃가루받이는 적은 비율의 웅성 번식성의 식물을 포함시켜 꽃가루받이를 하는 것에 의해 달성할 수 있다. 대부분의 종에 있어서, 모든 세포질 소기관이 난 세포에 의해서만 유전되기 때문에, CMS 특성은 모계를 통해 유전된다.
CMS 시스템은 웅성 생식불능 식물체를 생산하는 유일한 해결책이 아니란 점에서 한계를 갖는다. 예를 들면, 옥수수 중에 존재하는 하나의 특정 CMS 타입 (T-세포질)은 특정 진균에 감염되었을 때 생성되는 독소에 대한 민감성을 부여한다. 아직까지 수많은 작물에 응용되기는 하지만, CMS 시스템은 특정 환경 조건하에서는 쓸모가 없을 수 있다.
따라서 수작업, 기계 작업, 화학적 및 전통적인 유전자 방법에 의해서 화분 생산을 조절할 수 있는 방법이 강력하게 요구되어 왔다.
본 발명은 아비딘(avidin)을 코딩하는 DNA 분자를 이용하여 식물의 번식능력(fertility)을 조절하는 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 아비딘을 발현하는, 트랜스제닉(transgenic) 웅성 생식불능성(male-sterile) 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 웅성 생식불능 식물의 자손에게 웅성 번식능력을 회복시키는 방법에 관한 것이다.
도 1은 아비딘-코딩 플라스미드 PHI5168을 보여준다.
도 2는 bar 유전자를 코딩하는 플라스미드 PHI610을 보여준다.
본 발명의 목적은 아비딘의 이종(異種; heterologous) 발현에 의해 생식불능으로 되는, 웅성-생식불능성 식물체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 식물 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된(operably linked) 아비딘을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 아비딘의 발현에 의해 야기된 웅성 생식불능을 역전(reversal)시키는 방법에 관한 것이다.
이들 목적 및 기타 다른 목적들은, 본 발명의 한 구현예에 따르면, 식물 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 아비딘을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리 DNA 분자의 제공에 의해 달성된다. 바람직한 구현예에서는, 상기 분리 DNA 서열은 발현 벡터 내에 포함되어 있다. 또다른 바람직한 구현예에서는, 식물 프로모터 서열은 구성적(constitutive) 프로모터이며, 또다른 바람직한 구현예에서는, 구성적 프로모터는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 아비딘 유전자를 함유하는 이종 뉴클레오티드 서열을 함유하며, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 식물 조직중의 아비딘의 농도를 증가시켜 웅성 생식불능을 유발시키는 트랜스제닉 식물이 제공된다. 바람직한 구현예에서는, 트랜스제닉 식물은 옥수수, 콩, 또는 해바라기 식물체이다. 또 다른 바람직한 구현예에서는, 상기 이종 DNA 분자가 구성적 프로모터 서열을 더 포함하며, 바람직한 다른 구현예에서는 상기 프로모터 서열은 유비퀴틴 프로모터 서열이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 프로모터 및 아비딘 유전자를 포함하는 발현 벡터를 식물 세포 내에 도입시키는 단계를 포함하며, 상기 프로모터가 아비딘 유전자의 발현을 조절하며, 상기 아비딘 유전자의 발현이 웅성 생식불능을 유발하는 것을 특징으로 하는, 트랜스제닉 웅성 생식불능성 식물체를 생산하는 방법이 제공된다. 바람직한 구현예에서는, 트랜스제닉 식물은 식물 세포로부터 재생된(regenerate) 것이다. 또다른 바람직한 구현예에서는, 상기 프로모터는 유비퀴틴 퍼 또는 유도성 프로모터를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상술한 바와 같은 DNA 분자를 함유하는 제 1 웅성 생식불능성 모 식물체를 생산하는 단계, 이때 아비딘의 발현이 웅성 생식불능을 유발한다; 제 2 외래 유전자를 발현하는 제 2 트랜스제닉 모 식물체를 생산하는 단계; 및 상기 제 1 식물체와 상기 제 2 식물체를 교차-수정하여 상기 제 2 외래 유전자를 발현하는 하이브리드 식물체를 생산하는 단계, 이때 상기 제 2 외래 유전자의 산물이 하이브리드 식물내의 아비딘의 발현을 감소시켜 웅성 수정능(male firtile)의 하이브리드 식물체를 생산하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 아비딘 유전자를 이용하여 웅성 수정능의 하이브리드 식물체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 측면에 따른 한 바람직한 구현예에서는, 상기 제 2 외래 유전자가 안티센스 유전자, 리보짐 유전자 및 외부 가이드 서열 유전자(external guide sequence gene)로 이루어진 군에서 선택된 것이다. 다른 바람직한 구현예에서는, 안티센스 유전자는 아비딘 mRNA 서열을 포함하며, 더 바람직한 구현예에서는 상기 mRNA 서열은 유도성 프로모터의 조절하에 있다. 또다른 바람직한 구현예에서는, 상기 리보짐 유전자는 아비딘 mRNA 서열을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서는, 상기 제 1 모 식물체는 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 LexA 오퍼레이터이며, 상기 제 2 외래 유전자는 LexA 리프레서 유전자이다. 다른 바람직한 구현예에서는, 상기 프로모터 서열은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열; 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열; 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열; 및 이들의 기능성 단편 (functional fragment)으로 이루어진 군에서 선택된 꽃밥(anther) 박스(box)를 포함하는 꽃밥-특이적 프로모터 서열이다.
본 발명의 상기 측면에 따른 또다른 바람직한 구현예에서는, 상기 꽃밥 박스는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 꽃밥-특이적 프로모터는 CaMV 35S 코어 프로모터; 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열; 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열; 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열; 및 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군에서 선택된 코어 프로모터를 더 포함한다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면, 아비딘의 발현에 의해 웅성 생식불능으로 된 식물체의 수정능을 회복하는 방법으로서, 상기 식물체에 비오틴 용액을 분무하는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
1. 정의
본 명세서에는 아래에 표시한 다수의 용어가 광범위하게 사용되었다. 본 발명의 이해를 돕기 위하여 다음과 같은 정의를 제시한다.
구조 유전자(structural gene)는 전령 RNA (messenger RNA; mRNA)로 전사된 후 다시 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열로 해독되는 DNA 서열이다.
외래 유전자(foreign gene)는, 본 명세서에서는, 적어도 하나의 이종 조절 요소(heterologous regulatory element)에 작동가능하게 연결된(operably linked) DNA 서열을 의미한다. 예를 들어, 옥수수의 5126 구조 유전자 이외의 다른 모든 유전자는, 만약 이 유전자의 발현이 상기 5126 유전자의 꽃밥-특이적 조절 요소에 의해 조절된다면, 외래 유전자로 간주된다.
프로모터(promoter)는 구조 유전자, 안티센스 유전자, 리보짐 유전자 또는 외부 가이드 서열 유전자와 같은 유전자의 전사를 감독하는 DNA 서열이다. 전형적으로는 프로모터는 유전자의 5' 영역에서도 전사 개시 부위에 인접한 곳에 위치해있다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우에는, 전사율이 유도제에 반응하여 증가된다. 반대로, 프로모터가 구성적 프로모터인 경우에는, 전사율이 유도제에 의해 조절되지 않는다. 식물 프로모터는 식물 조직 내에서 유전자의 전사를 감독하는 프로모터 서열을 말한다.
코어 프로모터(core promoter)는 TATA 박스 및 전사의 개시를 포함하여 프로모터 기능을 수행하기 위해 필수적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이 정의에 의하면, 코어 프로모터는 조직 특이적 활성을 제공하거나 활성을 증강시킬 수 있는 특정 서열의 부재 하에서 검출 가능한 활성을 가질 수도 있고 또는 갖지 않을 수도 있다. 예를 들어, SGB6 코어 프로모터는 SGB6 유전자의 전사 개시 부위의 약 38 뉴클레오티드 5'쪽 서열로 이루어져 있는 반면, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 코어 프로모터는 35S 게놈의 전사 개시 부위의 약 33 뉴클레오티드 5' 쪽 서열로 이루어져 있다.
조직-특이적 프로모터(tissue-specific promoter)는 한 유전자에 작동가능하게 연결되었을 때, 특정 조직에서는 그 외 다른 모든 조직 또는 몇몇 조직에서와 비교하여 그 유전자가 보다 높은 수준으로(higher level) 전사되도록 감독하는 DNA 서열이다. 예를 들어, 꽃밥-특이적 프로모터는 식물의 꽃밥 조직에 관련 유전자의 전사가 높은 수준으로 이루어지도록 감독하는 DNA 서열이다. 예를 들어, SGB6 꽃밥-특이적 프로모터는 꽃밥 조직에서는 외래 유전자의 발현을 이룩할 수 있지만, 뿌리 조직이나 갑충류의 조직에서는 외래 유전자를 발현시킬 수 없다.
본 명세서에서 사용된 용어 "꽃밥-특이적 프로모터"는 두 개의 기능적 요소를 포함한다: 하나는 "꽃밥 박스"이고 다른 하나는 코어 프로모터이다. 특정 꽃밥 박스는 전통적인 인헨서(enhancer)의 기능적 특성을 가질 수 있다. 꽃밥 박스와 코어 프로모터를 결합시키므로써 코어 프로모터 단독의 경우에 비해 훨씬 높은 수준의 유전자 발현을 자극할 수 있다. 이는 서로 다른 유전자에서 유래된 코어 프로모터와 꽃밥 박스를 함유하는 키메릭 꽃밥-특이적 프로모터의 경우에도 동일하다. 이러한 키메릭 꽃밥-특이적 조절 요소는 아래에서 설명하였다.
오퍼레이터(operator)는 유전자의 5' 쪽에 위치하고 있으며, 리프레서 단백질에 의해 인식 및 결합되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자이다. 리프레서 단백질이 그의 동족(同族;cognate) 오퍼레이터에 결합하면 유전자의 전사가 억제되는 결과가 얻어진다. 예를 들어, LexA 유전자는 LexA 오퍼레이터에 결합하는 리프레서 단백질을 코딩한다.
분리 DNA 분자(isolated DNA molecule)는 생명체의 DNA로부터 분리된 DNA의 단편이다. 예를 들어, 아비딘 유전자를 코딩하는 클로닝된 DNA 분자는 분리 DNA 분자이다. 분리 DNA 유전자의 또다른 예는 화학적으로 합성된 DNA 분자 또는 효소학적으로 생산된 cDNA로서, 생명체의 게놈 DNA에 통합되어 있지 않은 것이다.
인헨서(enhancer)는 전사의 효율을 증가시킬 수 있는 DNA 조절 요소이다.
상보적 DNA(cDNA)는 역 전사효소에 의해 mRNA 주형으로부터 형성된 단일-가닥의 DNA 분자이다. 전형적으로, mRNA의 일부에 대해 상보적인 프라이머가 역 전사반응의 개시를 위하여 사용되었다. 당업계의 통상적인 지식을 가진 자들은 또한 이러한 단일-가닥 DNA 분자 및 그에 상보적인 DNA 가닥으로 이루어진 이중-가닥 DNA 분자를 가리키는데 "cDNA"를 사용하기도 한다.
용어 발현(expression)은 유전자 산물의 생합성을 의미한다. 예를 들어, 구조 유전자의 경우, 발현은 구조 유전자가 mRNA로 전사되고, 이 mRNA가 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드로 해독되는 것을 포함한다.
클로닝 벡터(cloning vector)는 숙주 세포 내에서 자기 복제할 수 있는 (autonomously replicable) 플라스미드, 코스미드 또는 박테리오파지와 같은 DNA 분자이다. 클로닝 벡터는 전형적으로 벡터의 필수적인 생물학적 기능의 손실 없이 외래 DNA 서열을 삽입할 수 있을 뿐만 아니라 이 클로닝 벡터로 형질전환된 세포를 확인 및 선택하기 위해 사용하기에 적절한 마커 유전자를 삽입할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 하나 또는 적은 개수를 함유한다. 마커 유전자는 전형적으로 테트라사이클린 내성 또는 암피실린 내성을 제공하는 유전자를 포함한다.
발현 벡터(expression vector)는 숙주 세포 내에서 발현되는 유전자를 포함하는 DNA 분자이다. 전형적으로 유전자 발현은 구성상 프로모터 또는 유도성 프로모터, 조직-특이적 조절 요소, 및 인헨서를 함유하는 특정 조절 요소의 통제하에 놓여있다. 이러한 유전자는 조절 요소에 "작동가능하게 연결"되어 있다.
재조합 숙주(recombinant host)는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 이 용어는 또한 숙주 세포의 염색체 또는 게놈에 클로닝된 유전자를 포함하도록 유전자적으로 조작된 원핵 또는 진핵 세포도 포함한다.
트랜스제닉 식물체(transgenic plant)는 외래 유전자를 포함하는 하나 또는 둘 이상의 식물 세포를 갖는 식물체이다.
진핵세포에서는, RNA 폴리머라제 II가 구조 유전자의 전사를 촉매하여 mRNA를 생성시킨다. DNA 분자는 RNA 전사체가 특정 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 갖는 RNA 폴리머라제 II 주형을 포함하도록 설계될 수 있다. RNA 전사체는 안티센스 RNA라고 불리며, 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열은 안티센스 유전자라고 불리운다.
리보짐(rybozyme)은 촉매 중심을 갖는 RNA 분자이다. 이 용어는 RNA 효소, 자기-스플라이싱 RNA 및 자기-절단 RNA를 포함한다. 리보짐을 코딩하는 DNA 서열은 리보짐 유전자라고 불리운다.
외부 가이드 서열(external guide sequence)은 내재성 리보짐인 RNase를 특정 종류의 세포내 mRNA에 작용하도록 하여 RNase P에 의해 그 mRNA가 절단되도록 하는 RNA 분자이다. 외부 가이드 서열을 코딩하는 DNA 서열은 외부 가이드 서열 유전자라고 불리운다.
2. 개괄
본 발명은 아비딘을 발현하는 트랜스제닉 식물체를 제조함으로써 웅성 생식불능의 식물체를 생산하는 방법을 제공한다. 아비딘은 비-조직 특이적 방식으로 구성적으로(constitutively) 발현시키거나, 또는 꽃밥-특이적 방식으로 발현시킬 수 있다. 웅성 수정능을 회복시키는 방법 역시 제공된다.
아비딘 유전자를 분리하여 식물체 조직에 도입시키기에 적절한 발현 벡터 내에 삽입한다. 발현 벡터는 프로모터를 더 포함하는데, 이 프로모터는 구성상의 프로모터, 유비퀴틴 프로모터와 같은 비-조직 특이적 프로모터, 꽃밥-특이적 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터, 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 발현 벡터를 표준 방법에 의해 식물체 조직 내에 도입시키고, 트랜스제닉 식물체를 선별하여 번식시킨다. 아비딘을 발현시키는 트랜스제닉 식물체는 웅성 생식불능이다. 아비딘 유전자의 전사를 억제하거나 또는 아비딘 mRNA의 해독을 억제하는 제 2 유전자를 트랜스제닉 식물체내에서 공동 발현시킴으로써 웅성 수정능을 회복시킬 수 있다. 또는, 자라나는 식물체에 비오틴 용액을 분무하므로 써 웅성 수정능을 회복할 수 있다.
3. 아비딘을 코딩하는 DNA 분자의 분리
아비딘을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 공지의 방법으로 분리할 수 있다. 예를 들어, 계란 흰자의 아비딘을 코딩하는 cDNA를 문헌 [Cope et al., Nucleic Acids Res., 15:3595 (1987)]에 기재된 방법에 따라 닭의 난관 cDNA 라이브러리로부터 분리해낼 수 있다. 상기 문헌의 내용은 본 명세서에 참조의 목적으로 삽입되어 있다.
또는 아비딘을 생산하는 것으로 알려진 생명체의 게놈 DNA로부터 아비딘 유전자의 게놈 클론을 얻을 수도 있다. 예를 들어, 문헌 [Keinanen et al., Eur. J. Biochem. 220: 615 (1994)]에 기재된 방법에 의해 닭 게놈 DNA로부터 닭 아비딘 유전자를 클로닝할 수 있다.
아비딘 유전자는 또한 표준 방법을 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 분리할 수도 있다. Erlich, PCR TECHNOLOGY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION (Stockton Press, NY, 1989) 및 Innis et al., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHOD AND APPLICATIONS (Academic Press, San Diego, 1990) 참조. 아비딘을 코딩하는 게놈 클론과 같이 보다 긴 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해서는, 긴 뉴클레오티드 서열의 PCR 증폭방법, 예를 들어 ELONGASETM시스템 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)을 이용할 수 있다. 예를 들어 Applied Biosystems, Foster City, CA에서 공급되는 제품과 같은 올리고뉴클레오티드 신테사이저를 이용하여 공지의 아비딘 유전자 서열의 5' 및 3' 말단에 상보적인 PCR 프라이머를 합성할 수 있다. 바람직한 구현예에서는, 이 프라이머는 제한효소 절단 부위를 포함하는 부가적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 이러한 부위를 존재시킴으로써, 적절한 제한효소로 처리한 후에 적절한 클로닝 벡터에 PCR 산물을 방향 특이적으로 클로닝해 넣을 수 있다. Finney, "Molecular Cloning of PCR Products" in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al., Eds. (John Wiley & Sons, New York, 1987), p. 15.7.1 참조.
PCR의 주형 DNA는 cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있으며, 당 기술분야에 주지된 방법을 이용하여 적절한 생명체로부터 얻을 수 있다. Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Ed., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989). 게놈 DNA는 트리아졸TM(TriazolTM; Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)와 같은 시판되는 시약을 이용하여 조류, 파충류 또는 양서류의 조직으로부터 직접 얻을 수 있다. 또는, 시판되는 키트 (Pharmacia, Piscataway, NJ)을 이용하여 닭의 난관 조직으로부터 추출한 mRNA를 이용하여 아비딘을 코딩하는 cDNA를 제작할 수 있다. 상기 mRNA는 표준 기술에 따라 수행하는 폴리(dT) 또는 랜덤 헥사머 프라이머를 이용하는 cDNA 합성을 위한 주형으로 사용된다. Sambrook et al., supra 참조. 이어 시판되는 키트 (Pharmacia)를 이용하여 cDNA 합성을 실시하고, cDNA는 문헌 [Saiki et al., Science 239: 487 (1988)]에 기재된 방법을 이용하는 PCR에 직접 사용된다.
상기에 언급한 방법에 따라 분리된 게놈 DNA 또는 cDNA 단편들은 공지의 기술에 따라 박테리오파지 또는 코스미드 벡터와 같은 벡터 내에 삽입될 수 있다. 여기에서 공지의 기술에는, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한효소 소화기술을 이용하는 것, DNA 분자가 불필요하게 연결(joining)되는 것을 방지하기 위해 알칼리성 포스파타제 처리법을 이용하는 것, 그리고 적절한 리가제를 이용하여 연결반응을 시키는 것들이 포함된다. 이러한 벡터를 조작하기 위한 기술은 공지되어 있다. 예를 들어, Ausubel et al. (eds), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, pages 3.0.5-3.17.5(1990)["Ausubel"].
또는, 아비딘을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상호 프라임성의(mutually priming) 긴 올리고뉴클레오티드를 이용하여 아비딘을 코딩하는 DNA 분자를 합성하므로써 얻을 수 있다. 예를 들어, Ausubel pages 8.2.8-8.2.13 및 Wosnick et al., Gene 60:115 (1987) 참조. 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하는 현재의 기술은 길이가 1.8 킬로베이스만큼 긴 유전자를 합성할 수 있다. Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131(1993); Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993). 합성된 아비딘 유전자의 뉴클레오티드 서열은 기존의 아비딘-코딩 DNA 분자중 어느 것에든지 기초를 둘 수 있다. 예를 들어, Gope et al., supra 참조.
이들 클론들은 제한 분석, 서던 분석, 프라이머 연장 분석 및 DNA 서열 분석과 같은 각종의 표준 기술을 이용하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 클로닝된 유전자에서 추정상의 전사 개시 부위의 위치를 정하기 위해서는 프라이머 연장 분석 또는 S1 뉴클레아제 보호 분석을 사용할 수 있다. Ausubel pages 4.8.1-4.8.5; Walmsley et al., "Quantitative and Qualitative Analysis of Exogenous Gene Expression by the Sq Nuclease Protection Assay." in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 7: GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS, Murray (ed.), pages 217-281 (Humana Press Inc. 1991).
4. 아비딘 유전자를 발현 벡터 내에 클로닝하기 및 트랜스제닉 식물체의 제작
일단 아비딘 유전자를 분리해내면, 이를 표준 방법을 이용하여 발현 벡터내에 집어넣는다. Sambrook et al., supra 참조. 적절한 발현 벡터의 선택은 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입시키는 방법에 따라 결정된다. 전형적으로는 발현 벡터는 (1) 세균성 복제 오리진을 코딩하는 원핵세포의 DNA 요소 및 세균 숙주 내에서 발현 벡터의 생육 및 선택을 할 수 있게 하는 항생물질 내성 유전자; (2) 외래 DNA 서열, 예를 들어 아비딘 유전자를 삽입하기 위한 클로닝 부위; (3) 외래 유전자의 전사의 개시를 조절하는 진핵세포 DNA 요소, 예를 들어 프로모터; (4) 전사체의 프로세싱을 조절하는 DNA 요소, 예를 들어 전사 종결/폴리아데닐화 서열; 및 (5) 마커 단백질을 코딩하는 유전자 (예, 리포터 유전자)로서, 상기 유전자가 전사 개시를 조절하는 DNA 요소에 작동가능하게 연결되어 있는 것을 포함한다. 식물 발현 벡터 및 리포터(reporter) 유전자에 대한 일반적인 설명은 문헌에 나와 있다 [Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation," in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al.(eds), pages 89-119 (CRC Press, 1993)].
본 발명의 바람직한 구현예에서는, 식물 유비퀴틴 프로모터 시스템이 사용된다. 식물 유비퀴틴 프로모터는 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어 유럽특허출원 0 342 926호를 참조할 수 있는데, 이의 내용은 본 명세서에 참조를 목적으로 삽입되어 있다. 유비퀴틴 프로모터는 구성상의 프로모터이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서는, 아비딘의 발현을 유도적으로 조절할 수 있도록 하기 위하여 유도성 프로모터가 이용된다. 이러한 유도성 프로모터의 한 예는 옥수수에 있는 글루타치온 S-트랜스퍼라제 시스템이다. Wiegand et al., Plant Mol. Biol. 7:235 91986) 참조. 이 방법은 웅성 생식불능을 가역적으로 유도한다. 따라서, 아비딘의 발현과 웅성 생식불능을 프로모터의 활성화에 의해 필요에 따라 동시에 조절할 수 있다. 즉, 프로모터가 활성화되지 않았을 때에는, 아비딘이 발현되지 않고 식물체는 웅성 수정능을 갖는다.
아비딘 유전자를 함유하는 발현 벡터는 미성숙 배(embryo) 또는 메리스템(meristem)과 같은 본래대로의(intact) 조직 또는 프로토플라스트에 도입할 수 있다. 바람직하게는, 발현 벡터는 본래대로의 조직에 도입시킨다. 식물 조직을 배양하는 일반적인 방법은 문헌 [예를 들어, Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants," in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al.(eds), pages 67-88 (CRC Press, 1993); Phillips et al., "Cell/Tissue Culture and In Vitro Manipulation," in CORN AND CORN IMPROVEMENT, 3rd Edition, Sprague et al., (eds), pages 345-387 (American Society of Agronomy, Inc. et al. 1988)]에 기재되어 있다.
발현 벡터를 식물 조직 내에 도입시키는 방법은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용하여 식물 조직에 공동-배양하거나 또는 직접 감염시키는 방법을 포함한다. Horsch et al., Science 227:1229 (1985) 참조. 바람직하게는, 비무장(disarmed) Ti-플라스미드를 외래 DAN 서열의 벡터로 사용한다. 형질전환은 예를 들어 유럽특허출원 116 718호(1984) 및 270 822호(1988)에 기재된 방법을 이용하여 행할 수 있다. 바람직한 Ti-플라스미드 벡터는 경계 서열 사이에 외래 DNA 서열을 포함하거나, 또는 적어도 오른쪽 경계의 상류에 위치한 것이다.
직접 유전자 전이(예를 들어 PCT 특허출원 WO 85/01856호 및 유럽특허출원 275 069호), 체외(in vitro) 프로토플라스트 형질전환 (예를 들어, 미국특허 4,684,611호), 식물 바이러스-중개 형질전환 (예를 들어, 유럽특허출원 067 553호 및 미국특허 제 4,407,956호), 및 리포좀-중개 형질전환 (예를 들어, 미국특허 4,536,475호)과 같은 절차를 이용하여 식물 세포를 형질전환하는데 다른 종류의 벡터를 사용할 수 있다. 옥수수 형질전환에 적합한 방법은 문헌에 기재되어 있다 [Fromm et al., Bio/Technology 8:833 (1990); Gordon-Kamm et al., The Plant Cell 2:603 (1990)]. 쌀의 형질전환에 적합한 표준 방법은 문헌에 기재되어 있다[Christou et al., Trends in Biotechnology 10: 239 (1992); Lee et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 6389 (1991)]. 밀은 옥수수나 쌀을 형질전환시키는 기술과 유사한 방법을 이용하여 형질전환시킬 수 있다. 나아가, Cases et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 11212 (1993)에는 수수를 형질전환시키는 방법이 기재되어 있으며, Wan et al., Plant Physiol. 104:37 (1994)에는 보리를 형질전환시키는 방법이 기재되어 있다.
일반적으로, 단자엽 식물, 특히 쌀, 옥수수, 수수, 보리 또는 밀과 같은 곡물을 형질전환시키는데는 직접 전이 방법이 유리하다. 적절한 직접 전이 방법에는 미세발사체-중개 전달(microprojectile-mediated delivery), DNA 주입, 전기천공법 등이 포함된다. 예를 들어, Gruber et al., supra; Miki et al., supra; klein et al., Bio/Technology 10: 268 (1992) 참조. 보다 바람직하게는, 바이오리스틱(biolistic) 기구를 이용한 미세발사체-중개 전달법을 적용하여 단자엽 식물의 조직에 발현 벡터를 도입시킨다.
5. 웅성 수정능의 조절
A. 웅성 생식불능성 식물체의 생산
본 발명에 따라 웅성 생식불능을 도입하기 위해서, 아비딘을 코딩하는 DNA 서열이 식물 조직 내에서 유전자 전사를 조절하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 벡터를 제작하였다. 발현 벡터에 일반적으로 요구되는 요건은 이미 위에서 설명한 바 있다. 아비딘의 발현에 의해 웅성 생식불능을 달성하기 위해서는, 아비딘이 단지 임시적인 방식으로 발현되어서는 안되고 대신 아비딘이 식물체 성체 내에서 후기 발달 단계에서도 발현되는 방식으로 발현 벡터가 식물 배 조직(embryonic tissue)에 도입되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 유사분열상의 안정성은 에피크로모좀성 복제를 제공하는 식물 바이러스 벡터를 이용하여 달성할 수 있다.
유사분열상의 안정성을 얻는 바람직한 방법은 발현 벡터 서열을 숙주 염색체에 통합시키는 것이다. 이러한 유사분열상의 안정성은 발현 벡터를 식물체 조직 내에 미세발사체 전달방법으로 도입하거나, 또는 상기에서 설명한 바 있는 다른 표준방법을 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, Fromm et al., Bio/Technology 8: 833 (1990); Gordon-Kamm et al., The Plant Cell 2: 603 (1990); 및 Walters et al., Plant Molec. Biol. 18: 189 (1992) 참조.
아비딘 유전자를 식물 조직에 도입시킨 후 전사시키는 것은 식물 조직 내에서 유전자 발현을 비특이적으로 자극하는 구성상의 프로모터를 이용하여 조절하는 것이 바람직하다. 이 목적에 적절한 구성상의 프로모터의 한 에는 상술한 바와 같이 유비퀴틴 프로모터이다.
아비딘 유전자의 전사는 조직-특이적 방식으로 유전자 발현을 자극하는 프로모터에 의해 조절될 수도 있다. 특히 바람직한 꽃밥-특이적 프로모터는 옥수수 동종교잡 B73 주(inbred B73 line)으로부터 분리한 5126 프로모터이다. 5126 프로모터는 사세포기(quartet)로부터 초기 단핵 미세포자-단계의 꽃밥에 이르는 동안 외래 유전자의 발현을 자극한다.
또 다른 적절한 꽃밥-특이적 프로모터는 SGB6인데, 이 역시 B73 주로부터 분리된 것이다. SGB6 프로모터는 그의 사세포기 단계로부터 중간 단핵 미세포자 발달 단계에 이르는 동안 꽃밥의 내면층 세포 중에서 외래 유전자의 발현을 유도할 수 있다.
또는, 꽃밥-특이적 유전자 발현은 꽃밥 박스와 코어 프로모터를 결합시켜 사용함으로써 달성할 수 있다. 특히 바람직한 꽃밥 박스는 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 5126 꽃밥 박스이다:
또 다른 적절한 꽃밥 박스는 SGB6 전사 개시 부위의 상류에 있는 뉴클레오티드 583 - 490에 의해 정의하는 94 염기쌍 DNA 단편 내에 존재한다. 이 94 염기쌍의 SGB6 꽃밥 박스의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
또는, 적절한 꽃밥 박스는 감수분열부터 발달이 사세포기 단계에 이르는 동안 유전자 발현을 자극하는 옥수수 G9 프로모터로부터 얻어진다. 이 G9 꽃밥 박스는 다음의 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
상기 5126, SGB6 및 G9 꽃밥 박스는 상술한 대로 올리고뉴클레오티드를 합성하므로써 얻을 수 있다. 당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 결실 분석을 실시하여 상술한 꽃밥 박스 내에 하나 또는 그 이상의 부가적인 꽃밥-특이적 조절 서열이 어디에 위치하는 지를 결정할 수 있다. 꽃밥 박스의 이러한 "기능성 단편 (functional fragments)"은 꽃밥-특이적 방식으로 아비딘 유전자의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다.
바람직한 코어 프로모터는 5126 코어 프로모터, SGB6 코어 프로모터, G9 코어 프로모터 및 콜리플라워 모자익 바이러스 35S 코어 프로모터로부터 유도된 것이다.
특히 바람직한 코어 프로모터는 다음의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5126 코어 프로모터이다:
SGB6 코어 프로모터는 SGB6 유전자의 전사 개시 부위 상류에 있는 약 38 뉴클레오티드로 이루어져 있다. 적절한 SGB6 코어 프로모터는 다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
적절한 G9 코어 프로모터는 다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
적절한 코어 프로모터는 또한 5126, SGB6 및 G9 코어 프로모터의 기능성 단편에 의해 제공되기도 한다. 이러한 기능성 단편을 얻는 방법은 이미 위에서 설명한 바 있다.
하나의 유전자로부터 얻은 꽃밥 박스 및 두 번째 유전자로부터 얻은 꽃밥-특이적 프로모터를 포함하는 키메릭 조절 요소를 이용하므로써 아비딘 유전자 발현의 발달 창(developmental window)을 확장시킬 수 있다. 예를 들어, SGB6 조절서열은 사세포기로부터 발달의 중간-단핵 단계에 이르는 기간동안 유전자 발현을 자극하는 한편, G9 조절 서열은 감수분열에서부터 발달의 사세포기에 이르는 기간동안 유전자 발현을 자극한다. SGB6 꽃밥 박스와 G9 프로모터를 결합한 것은 감수분열 동안, 그리고 발달의 중간-단핵 단계에 이르기까지 외래 유전자의 전사를 자극한다. 즉, 꽃밥 박스와 꽃밥-특이적 프로모터를 다양하게 결합시키는 것은 본 발명에 특히 유리하다.
바이러스 코어 프로모터도 사용할 수 있다. 적절한 바이러스 코어 프로모터의 예에는 콜리플라워 모자익 바이러스 (CaMV) 코어 프로모터, 피그워트 모자익 바이러스 코어 프로모터(Figwort Mosaic Virus core promoter) 등이 포함된다. Gruber et al., supra. 바람직하게는, 바이러스 코어 프로모터는 CaMV 35S 코어 프로모터, 또는 그의 변형체이다.
형질전환 세포를 선별하기 위해서는, 발현 벡터는 제초제 내성 유전자와 같은 선별가능한 마커 유전자를 포함한다. 예를 들어, 이런 유전자는 포스피노트리신, 글리포세이트, 설포닐우레아, 아트라진 또는 이미다졸리논에 대한 내성을 부여한다. 바람직하게는, 선별가능한 마커 유전자는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 bar 유전자 또는 pat 유전자이다. bar 유전자의 뉴클레오티드 서열은 문헌 [Leemans et al., 유럽특허출원 0-242-246호 (1987) 및 White et al., Nucleic Acids Res. 18: 1062 (1990)]에 기재되어 있다. Wohlleben et al., Gene 70: 25 (1988)는 pat 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기재하고 있다. Bar 또는 pat 유전자가 발현되면, 글루포시네이트(glufosinate; 여러 가지 제품중에서도 Bastar및 Igniter의 상표로 판매됨) 및 비알라포스(bialaphos; Herbi-acer및 Libertyr의 상표로 판매됨)와 같은 제초제에 대한 내성을 부여한다.
발현 벡터는 구성상의 프로모터 또는 꽃밥-특이적 프로모터의 조절하에 있는 아비딘을 코딩하는 DNA 서열 뿐만 아니라, 구성상의 프로모터의 조절 하에 있는 선택 가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 또는, 선택 가능한 마커 유전자는 배 조직의 "공동-형질전환"에 의해 별도의 선별 발현 벡터를 통해 숙주 세포에 전달될 수 있다.
B. F1 하이브리드 내에서의 웅성 수정능의 회복
동종교잡 세포주 간의 대규모 이종교배(cross)에서 F1 하이브리드의 생산을 위한 트랜스제닉 웅성 생식불능 식물체를 생산하기 위해 상술한 방법을 사용할 수 있다. 트랜스제닉 웅성 생식불능 식물체의 모든 난 세포가 재조합 아비딘 유전자를 포함하지 않는 경우에는, F1 하이브리드의 일부가 웅성 수정능을 갖는 표현형을 가질 수 있다. 한편, 재조합 아비딘 유전자가 트랜스제닉 웅성 생식불능 식물체의 모든 난 세포에 존재한다면, 에틸렌에 의해 유도된 생식불능은 우성이기 때문에 F1 하이브리드는 웅성 생식불능 표현형을 갖게 될 것이다. 따라서, 웅성 수정능의 F1 하이브리드를 생산하기 위해서는 웅성 수정능 회복 시스템을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 수정능 회복 시스템은 수확된 산물이 종자인 경우 자가 수정을 하는 식물에 있어 특히 값어치가 높다.
트랜스제닉 웅성 생식불능 식물체 주에서 수정능을 회복하기 위해 통상적으로 제안되는 접근법은 트랜스제닉 식물체의 제 2 "회복(restorer)" 주의 생산을 필요로 한다. 예를 들어, 바나제(barnase) 형질발현에 기인하여 웅성 생식불능으로 된 트랜스제닉 식물체는 바나제 억제물질을 발현하는 웅성 수정능의 식물과 이종교배시키게 된다. 상기에서 설명한 Mariani et al., Nature 357: 384 (1992) 참조.
본 발명의 경우에 있어서는, 상기와 유사한 접근법을 이용한다면, 안티센스 아비딘을 발현하거나 또는 아비딘 mRNA을 표적으로 하는 리보짐을 발현하는 트랜스제닉 식물체의 회복 주의 생산을 필요로 하게 될 것이다. 예를 들어, 리보짐을, mRNA 분자 내에 있는 특정 표적 서열에 대한 엔도뉴클레아제 활성을 발현하도록 설계할 수 있는 것이다. 예를 들어, 스타이네케 등 [Steinecke et al., EMBO J. 11:1525 (1992)]는 담배 프로토플라스트내에서 리보짐을 이용하여 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 발현을 100% 까지 억제할 수 있었다. 보다 최근에는, 페리만 등 [Perriman et al., Antisense Res. & Devel. 3:253 (1993)]은 변형된 해머헤드(hammerhead) 리보짐을 발현하는 벡터를 이용하여 담배 프로토플라스트중의 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 억제하였다. 본 발명과 관련해서는, 아비딘 mRNA는 리보짐을 위한 적절한 표적 RNA 분자를 제공한다.
비슷한 접근법에서, 안티센스 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용함으로써 수정능을 회복시킬 수 있다. 표적 mRNA 분자에 안티센스 RNA 분자가 결합하면 하이브리드화에 의해 해독이 억제 (hibridization arrest)된다. Paterson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 4370 (1987). 본 발명과 관련해서는, 적절한 안티센스 RNA 분자는 아비딘 mRNA에 상보적인 서열을 갖게 될 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서는, 안티센스 RNA는 유도성 프로모터의 조절 하에 있게 된다. 이 프로모터가 활성화되면 웅성 수정능이 회복된다.
또 다른 접근법에서는, 발현 벡터가 아비딘 mRNA 분자의 RNase P-중개 절단을 촉진할 수 있는 RNA 전사체를 코딩하도록 발현 벡터를 제작할 수 있다. 이 접근법에 따르면, 외부 가이드 서열을 내재성 리보짐인 RNase P를 아비딘 mRNA에 대해 맞게 (directed to) 제작할 수 있는데, 이는 후에 세포성 리보짐에 의해 절단되게 된다. Altman et al., 미국특허 제 5,168,053호; Yuan et al., Science 263: 1269 (1994). 바람직하게는, 외부 가이드 서열은 아비딘 mRNA에 상보적인 10 내지 15 염기쌍의 뉴클레오티드 서열, 및 3'-NCCA 뉴클레오티드 서열 (여기서, N은 바람직하게는 퓨린이다)을 포함한다. 상동. 외부 가이드 서열 전사체는 mRNA와 상보적인 외부 가이드 서열 사이에 염기쌍을 형성하므로써 표적 mRNA에 결합하는데, 이에 의해 염기쌍을 이룬 영역의 5'-쪽에 위치한 뉴클레오티드에서 RNase P에 의한 mRNA의 절단을 촉진하게 된다. 상동.
웅성 수정능을 회복시키는 또다른 방법에서는, 트랜스제닉 웅성 생식불능 식물체는 아비딘 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열에 덧붙여 원핵 조절 요소를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 프로모터의 조절 하에 원핵 폴리펩티드를 발현하는 트랜스제닉 웅성 수정능 식물체가 생산된다. F1 하이브리드에서는, 원핵 폴리펩티드가 원핵 조절 서열에 결합하고 아비딘의 발현을 억제한다.
예를 들어, LexA 유전자 / LexA 오퍼레이터 시스템을 사용하여 본 발명에 따라 유전자 발현을 조절할 수 있다. 미국특허 4,833,080호 ("'080 특허") 및 Wang et al., Col. Cell. Biol. 13:1805 (1993). 보다 구체적으로는, 웅성 생식불능 식물체의 발현 벡터는 LexA 오퍼레이터 서열을 포함하는 한편, 웅성 수정능 식물체의 발현 벡터는 LexA 리프레서의 코딩 서열을 포함하게 될 것이다. F1 하이브리드에서는, LexA 리프레서가 LexA 오퍼레이터 서열에 결합하여 아비딘 유전자의 전사를 억제할 것이다.
LexA 오퍼레이터 DNA 분자는 예를 들어 주지의 LexA 오퍼레이터 서열을 함유하는 DNA 단편을 합성하므로써 얻을 수 있다. 예를 들어, '080 특허 및 Garriga et al., Mol. Gen. Genet. 236:125 (1992). LexA 유전자는 LexA 리프레서를 코딩하는 DNA 분자를 합성하므로써 얻을 수 있다. 유전자 합성 기술은 위에서 논의된 바 있으며, LexA 유전자 서열은 예를 들어 상기에서 언급한 바 있는 Garriga et al.의 문헌에 기재되어 있다. 또는, LexA 리프레서를 코딩하는 DNA 분자는 플라스미드 pBR500 (American Type Culture Collection (ATCC) 수탁번호 67758호)로부터 얻을 수 있다.
수정능을 회복시키는 또다른 방법은, 비오틴 용액을 자라나는 식물체에 분무함으로써, 비오틴에 대한 아비딘의 높은 친화력을 이용할 수 있다. 이 비오틴 용액은 또한 비오틴의 완전한 용해를 확보하기 위하여, DMSO와 같은 유기 공동용매를 극소량 함유할 수 있다. 분무는 화분 발달의 감수분열 기(phase) 동안에 시작하여, 화분의 퍼트리기가 관찰될 때까지 규칙적인 간격으로 반복하여 행할 수 있다. 분무 간격은 1일 내지 7일의 기간동안에서 다양하게 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서는, 분무는 매 3 내지 5일마다 반복한다.
당 기수분야의 통상의 지식을 가진 자는 lac 리프레서/lac 오페론 시스템 또는 trp 리프레서/trp 오페론 시스템과 같은 원핵 조절 시스템을 이용하여 다른 웅성 수정능 회복 전략을 쉽게 짤 수 있다.
상기에서 전반적으로 기술된 본 발명은 다음의 실시예를 참고로 하여 보다 쉽게 이해될 수 있다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 목적으로 제시되었으며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1 : 아비딘의 구성적 고수준 발현에 의해 웅성 생식불능 트랜스제닉 식물체를 생산하기
트랜스제닉 옥수수 식물체를 생성하는 방법은 유럽특허출원 0 442 174A1호에 기재되어 있다. 이 문헌의 내용은 본 명세서에 참고의 목적으로 삽입되어 있으며, 이 방법을 아래에 간단히 설명한다.
트랜스제닉 옥수수 식물을 형성시키기 위하여 유비퀴틴 프로모터의 조절 하에 있는 아비딘 유전자를 보유하며, PINII 터미네이터 서열을 함유하는 벡터인 PHI5168을 사용하였다. PHI5168의 구조는 도 1에 도시되어 있다. 이중 35S 프로모터의 조절 하에 있는 bar 유전자를 보유하며 또한 PINII 터미네이터 서열을 보유하는 발현 벡터인 PHI610을 아비딘 구축물과 함께 공동형질전환시키므로써, 형질전환 혼합물을 비알로포스(bialophos)로 처리하는 것에 의해 트랜스제닉 식물체를 선별할 수 있게 하였다. PHI610의 구조는 도 2에 도시하였다. 문헌 [Green et al., Molecular Genetics of Plants and Animals, editors Downey et al., Academic Press, NY, 20, 147 (1983)]에 기재된 방법에 따라 타입 II 배형성 배양액으로부터 유도된 배형성 현탁 배양액(embryogenic suspension cultures)에 상기 두 개의 발현 벡터를 형질전환시켰다. 배양액은 2 mg/L의 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,3-D) 및 30 g/L의 수크로스를 보충한 무라시게 및 스쿠그 배지 [Murashige and Skoog; "MS" 배지; Murashige et al., Physio. Plant, Vol. 15, pp 453-497 (1962)]에서 유지하였다. 현탁 배양액을 실험 7일 전에 710 미크론 체에 거르고, 여액은 MS 배지에서 유지하였다.
부흐너 깔대기 (Whatman No. 614)를 이용하여 진공 여과를 행하므로써 현탁 배양액으로부터 세포를 수확하고, 100 ml (생체 중량)의 세포를 3.3 cm 페트리 플레이트에 놓았다. 세포를 0.5 mL의 신선한 배양배지에 분산시켜 얇은 세포 층을 형성하였다. 커버되지 않은 페트리 플레이트를 Biolistics Inc.사 (eneva, NY)에 의해 제작된 입자 총 장치(particle gun device)의 시료 챔버에 놓아두었다. 진공 펌프를 이용하여 챔버내의 압력을 0.1 기압으로 낮추어 공기 마찰에 의한 미세입자의 속도를 감소시켰다. 평균 입경이 약 1.2 마이크론인 텅스텐 입자 (GTE Sylvania Precision Materials Group, Towanda, Pennsylvania)를 세포에 쏘아대었다. 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 들어있는 증류수 1 ml당 50 mg의 텅스텐 입자의 현탁액 25 마이크로리터에 TE 완충액 (pH 7.7)에 용해시킨 DNA 용액 (100 람다 당 1 마이크로그램의 DNA) 5 마이크로리터를 가하므로써 PHI5168과 PHI610의 등량 혼합물을 미세입자에 로딩하였다. 입자가 점점 응집되어 튜브 내에 침전하였다.
외래 유전자를 함유하는 형질전환된 식물체 세포의 배양액을 560R (배지) (1 mg/ml 비알라포스가 첨가된 N6-기재 배지)에서 4-8주간 배양하였다. 이 배지는 bar 유전자를 발현하는 세포를 선별해낸다.
배형성 배양액(embryogenic culture) 중에서 배(embryo)의 형성을 유도하고, 세포를 발아시켜 식물로 키웠다. 캘러스 유지 배지에서 관찰되는 체세포 배를 발아시키기 위해 두 배양배지 순서를 적용하였다. 캘러스 증식이 계속되도록 하면서, 캘러스를 먼저 5.0 mg/L 인돌아세트산 (IAA)을 함유하는 배양 배지(숙성 배지; maturation medium)로 10-14일간 옮겼다. 캘러스 로딩은 재료 단위 중량당 회수율을 최적화하기 위하여 매 플레이트당 50 mg으로 하였다.
캘러스를 이어 "숙성" 배지로부터 첫 번째 배양 배지에 비해 적은 양의 IAA (1 mg/L)를 함유하는 두 번째 배양배지로 옮겼다. 이 시점에서는 배양물을 밝은 곳에 놓아두었다. 발아를 하는 체세포 배는 연결된 뿌리와 함께 연장되어 있는 초록색의 새싹(shoot)을 특징으로 한다. 이어 체세포 배를 배양 튜브(150 x 25 mm)에 들어있는 배지로 10 - 14일간 더 옮겼다. 이 시점에서, 식물체는 약 7-10cm로 성장하며, 온실에서 키울 수 있기에 충분한 크기와 생명력을 갖게 된다.
재생(regenerated) 식물체를 단단하게 하기 위해서, 성장실로 옮겨진 식물체로부터 무균 용기를 제거하고 뿌리로부터 고화 한천 배지를 씻어내었다. 어린 식물체를 시판되는 화분심기 믹스 (potting mix)에 심고, 이를 식물체의 뿌리를 지나치게 적시지 않도록 하면서 상대 습도를 거의 100%로 유지하기 위한 살포 장치가 구비된 성장실에 놓아두었다. 살포 실에서 3-4주간 성장시킨 후에는, 식물체는 야외에 이식하기에 충분한 정도로 튼튼하였다.
야외에 심어진 식물체의 웅성 생식불능을 관찰함으로써 분석을 행하였다. 선별된 식물체에 대해서는 PCR 및 서던 블롯팅을 이용하여 아비딘 유전자의 존재를 더 분석하고, 표준 방법에 의해 ELISA로 아비딘의 발현을 분석하였다.
94 개체의 식물체를 PCR로 분석하였는데, 이중 53 개체는 수정능을 갖는 것으로, 그리고 41 개체는 생식불능인 것으로 밝혀졌다. PCR에 의해 각 식물체의 수정능을 아비딘 유전자의 존재와 비교했을 때, 유전자의 존재와 식물체 생식불능 사이에 98%의 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 5개체의 식물에 대해, 서던 블롯팅에 의해 아비딘 유전자의 존재를 상세하게 분석하였다. 세 개체의 식물체는 서던 분석에 의해 아비딘 유전자를 갖는 것으로 밝혀졌다. 세 개체의 식물체 모두 생식불능의 문제를 안고 있었다. 아비딘 유전자를 갖지 않는 두 개체의 식물체는 완전하게 수정능을 갖고 있었다. 따라서, 아비딘 유전자의 존재와 생식불능의 문제 사이에는 100%의 상관관계가 있다.
실시예 2 : 웅성 생식불능 트랜스제닉 콩 식물체를 생산하기 위해 아비딘을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 바이너리 벡터를 갖는 아그로박테리움 균주를 이용하기
트랜스제닉 콩 식물체를 형성하는 방법은 미국특허출원 07/920,409호에 기재되어 있는데, 이 문헌의 내용은 본 명세서에 참고의 목적으로 삽입되어 있다. 파이어니어 변종 (Pioneer variety) 9341호의 콩 (Glycine max) 종자를 글라스 벨 항아리에 발생시킨 염소 가스에 노출시켜 표면을 살균하였다. 가스는 100 ml 차아염소산 나트륨 (5.25% w/w)에 3.5 ml의 염산 (34 - 37% w/w)을 가해서 발생시켰다. 염소 가스에 노출시켜 멸균하는 것은 부피가 대략 1 ft3인 용기에서 16-20시간동안 행하였다. 표면 살균된 종자는 실온에서 페트리 디쉬에 저장하였다. 종자를 갬보그 (Gambourg; 최소 유기물질을 포함하는 B5 기초 배지, Sigma Chemical Catalog No. G5893, 0.32 gm/L 수크로스; 0.2% 중량/부피 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (MES), (3.0 mM) )에 따른 1/10 스트랭쓰 한천 고화 배지 (식물 성장 조절제 무함유)에 심고 16시간의 낮 길이 및 차가운 백색 형광 조명하에 ( 20 μEm-2S-1) 28℃에서 배양하므로써 발아를 시켰다. 3일 또는 4일 후에, 공동-배양(co-cultivation)을 위한 종자를 준비하였다. 종자의 껍질(coat)을 제거하고 떡잎의 3-4 mm 아래에서 자라나는 뿌리를 제거하였다.
아비딘 유전자를 함유하는 변형 바이너리 플라스미드를 보유하는 아그로박테리움 투메파신엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 LBA4404를 밤새 배양한 배양액을 테트라사이클린 1㎍/㎖의 양으로 함유하는 최소 A 배지에서 로그 기까지 증식시킨 후 모아서 550 nm에서의 광학 밀도를 측정하였다. 충분한 부피의 배양액을 15 mL/원추형 원심분리 튜브에 넣어서 각 튜브에 109세포/ml의 농도로 1 내지 2 x 1010세포가 침강될 수 있도록 하였다. 6,000 x g에서 10분간 원심분리하여 세포를 침강시켰다. 원심분리후에, 상층액을 경사분리하여 버리고, 튜브를 종균이 필요할 때까지 실온에서 보관하지만 1시간을 넘지 않도록 한다.
접종은 각 종자 플레이트가 새로이 재현탁된 아그로박테리움 펠릿으로 처리될 수 있도록 배치마다 행한다. 세균 펠릿은 B5 염 (G5893) 3.2 g/L; 수크로스 2.0% w/v; 6-벤질아미노퓨린(BAP) 45μM; 인돌부티릭산(IBA) 0.5 μM; 아세토시린곤(AS) 100μM을 함유하고 MES 10 mM을 이용하여 pH 5.5로 완충시킨 20 ㎖ 접종 배지에 개별적으로 재현탁한다. 재현탁은 볼텍싱에 의해 달성된다. 이어 접종물을 미리 준비된 종자를 함유하는 페트리 디쉬에 쏟아붓고, 수술용 칼날을 이용하여 떡잎 마디(cotyledonary node)를 연하게 만들었다. 이것은 2개의 떡잎 마디를 보존하면서, 싹의 정점(shoot apex)을 통해 길이 방향으로 종자를 두쪽으로 분할함으로써 행할 수 있다. 이어 수술용 칼날을 이용하여 두 개의 반쪽의 싹의 정점으로부터 각각의 떡잎을 캐내어 제거하였다. 이어 대칭축을 따라 수술용 칼날을 이용하여 반복하여 눈금을 냄으로써 떡잎 마디를 연하게 만들었다. 축까지 들어가서 체외이식체 전체를 자르지 않도록 주의를 기울여야 한다. 대략 5분 이내에 체외이식체(explant)를 준비하고 교반을 하지 않으면서 세균과 함께 실온에서 30분간 보온하였다. 30분 후에, 겔라이트(Gelrite, Merck & Company Inc.) 0.2% w/v로 고화시킨 동일한 배지의 플레이트로 옮겼다. 식물체의 중심부를 위로 하여 체외식물체가 묻히되 배지의 표면과 동일한 높이를 갖게 하여 차가운 백색 형광 조명하에 (20 μEm-2S-1) 22℃에서 3일간 배양하였다.
3일 후에 식물체를, B5 염 (G5893) 3.2 g/L; 수크로스 2.0% w/v; BAP 5μM; IBA 0.5 μM; 반코마이신 200 ㎍/㎖; 세포탁심 500 ㎍/㎖을 함유하고 MES 3 mM을 이용하여 pH 5.7로 완충시킨 액체 역선별(counterselection) 배지로 옮겼다. 선별 배지는 세켐 아가로스(Seakem Agarose) 0.3% w/v를 이용하여 고화시켰다. 식물체의 중심부를 아래로 하여 체외식물체가 배지에 묻히게 하여 차가운 백색 형광 조명하에 (60 - 80 μEm-2S-1) 28℃에서 16시간동안 배양하였다.
선회운동을 하는 진탕기를 이용하여 2주 후에 체외식물체를 다시 액체 배지로 세척하였다. 세척은 가나마이신 설페이트 50 ㎍/㎖를 함유하는 역선별 배지중에서 밤새 행하였다. 그 다음 날에, 식물체를 아가로스/고화 선별 배지에 꽂았다. 이 식물체를 중간 중심부를 아래로 하여 배지에 묻히게 하고, 2주간 더 배양하였다.
선별 배지에서 1개월간 배양한 후에, 형질전환된 조직은 탈색된 건강하지않은 배경에 대하여 재생 조직의 녹색 부위로 육안으로 관찰된다. 녹색 부위가 없는 체외이식체는 버리고, 녹색 부위가 있는 체외이식체를 B5 염 (G5893) 3.2 g/L; 수크로스 2% w/v; BAP 5μM; IBA 3.3 μM; 지베렐린산 1.7 μM; 반코마이신 100 ㎍/㎖; 세포탁심 30 ㎍/㎖; 및 티멘틴 30 ㎍/㎖을 함유하고 MES 3 mM을 이용하여 pH 5.7로 완충시킨 성장(elongation) 배지로 옮겼다. 녹색 부위를 중심부가 위로 오게 하여 배지에 묻히도록 하고, 위에서와 같이 하여 배양한다. 매 2주마다 새로운 플레이트로 옮기면서 상기 배지를 이용하여 배양을 계속하였다. 싹의 길이가 0.5 cm로 되면, 이 싹을 기저부(base)에서 절단하여 발아(rooting) 배지 (13 x 100 ml 시험관)에 넣었다. 발아 배지는 B5 염 (G5893) 3.2 g/L; 수크로스 15 g/L; 니코틴산 20 μM; 피로글루탐산(PGA) 900 mg/L 및 IBA 10 μM을 함유한다. 이 발아 배지는 MES 3 mM을 이용하여 pH 5.7로 완충시켰다. 10일 후에, 싹을 IBA 또는 PGA가 들어있지 않은 동일한 배지로 옮겼다. 싹을 발아시키고, 위에서 설명한 것과 동일한 환경 조건하에서 상디 튜브내에 보존하였다.
뿌리 시스템이 잘 확립되면, 어린 식물체를 멸균 토양으로 옮겼다. 온도, 광 조사 기간 및 광 강도는 위에서 설명한 것과 동일하게 유지하였다.
트랜스제닉 콩 식물체내에서의 아비딘의 발현을 ELISA를 이용하여 확인 및 정량분석하고, 유전자의 존재는 PCR 및 서던 블롯팅을 이용하여 확인한다. 연이은 계대배양 후손에 대해 동일한 방법을 적용하여 발현의 안정성을 평가하였다. 안정성 문제는 콩에서의 아비딘의 발현과 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 3 : 아비딘의 발현에 의한 웅성 생식불능 해바라기 식물체의 생산
트랜스제닉 해바라기 식물체 및 종자를 생성하기 위하여 아비딘을 코딩하는 발현 카세트를 이용한다. 아비딘을 코딩하는 DNA 서열을 유비퀴틴 프로모터의 조절하에 있는 발현 카세트에 삽입하였다.
이어 이 발현 카세트를 EcoRI 부위를 이용하여 PHI 5765와 같은 바이너리 벡터에 서브클로닝하였다. 이어 바이너리 벡터를 아그로박테리움 투메파신엔스(Agrobacterium tumefaciens) 헬퍼 균주로 옮겼다.
문헌 [Bidney et al., Plant Mol. Bio.; Vol. 18; p.301 (1992)]에 기재된 방법에 따라, 미세입자 발사법을 적용하여 아그로박테리움 균주 LBA4404를 이용해 해바라기 식물체를 형질전환시켰다. 간단하게 설명하면, 파이오니어 해바라기 주 늘-3의 종자의 겉껍질을 벗기고 표면을 살균하였다. 종자를 26℃에서 18시간동안 어둠속에서 물을 적신 여과지 위에 놓아 물을 흡수하게 하였다. 떡잎과 뿌리를 제거하고, 메리스템(meristem) 체외식물체를 374BGA 배지 (MS 염, 세퍼드 비타민(Shephard vitamins), 40 mg/L 아데닌 설페이트, 3% 수크로스, 0.8% 피트아가(phytagar) pH 5.6 + 0.5 mg/L BAP, 0.25 mg/L IAA 및 0.1 mg/L GA)에서 배양하였다. 24시간 후에, 첫 번째 잎을 제거하여 정점의 메리스템을 노출시키고, 체외식물체를 정점 부위가 위를 바라보도록 하여 물 한천이 담겨 있는 60 mm x 20 mm 페트리 디쉬의 중심에 형성시킨 2 cm 원안에 놓아두었다. TE 완충액에 현탁시킨 텅스텐 입자를 이용하여 체외식물체에 발사법을 2회 실시하거나, 또는 아비딘 유전자를 함유하는 발현 플라스미드와 관련된 입자를 이용하여 발사법을 2회 실시하였다. 메리스템 체외식물체를 밝은 곳에서 26℃에서 374 BGA 배지에서 72시간동안 더 공동배양하였다.
72시간동안 공동배양한 후에, 아그로박테리움으로 처리한 메리스템을 배지 374 (1% 수크로스를 함유하고, BAP, IAA 및 GA3를 함유하지 않는 374 BGA 배지)에 옮기고, 250 ㎍/㎖ 세포탁심을 보강하였다. 어린 식물체를 16시간의 낮 시간 조건 및 26℃ 보온 조건하에 2주간 더 발육하도록 하여 녹색이 되거나 탈색이 되도록 하였다. 어린 식물체를 카나마이신을 함유하는 배지에 옮겨 성장하도록 하였다. 식물체내에 아비딘이 존재하는 것을 상기 실시예 2에 기재한 방법대로 확인하고 정량분석하였다. 웅성 생식불능의 존재는 식물체에 의한 아비딘의 발현과 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다.
상술한 기재 내용은 특정의 바람직한 구현예에 관한 것이지만, 본 발명은 여기에만 국한되는 것이 아니라는 것을 이해할 수 있을 것이다. 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 사람은 여기에 기재된 구현예에 대해 다양한 변형을 가할 수 있으며, 이러한 변형도 후술하는 청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위의 범주에 속한다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물과 특허출원은 본 발명이 속하는 기술분야의 수준을 시사하기 위한 것이다.
[서열목록]

Claims (26)

  1. 식물 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된(operably linked) 아비딘을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 분리 DNA 분자.
  2. 제 1항의 분리 DNA 분자를 함유하는 발현 벡터.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 식물 프로모터 서열은 구성적(constitutive) 프로모터임을 특징으로 하는 발현 벡터.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 구성적 프로모터 서열은 유비퀴틴 프로모터 서열임을 특징으로 하는 분리 DNA 분자.
  5. 아비딘 유전자를 함유하는 이종(heterologous) 뉴클레오티드 서열을 함유하는 트랜스제닉 식물체로서,
    상기 이종 뉴클레오티드 서열이 식물체 조직 중의 아비딘 농도를 증가시키고, 및
    상기 증가된 농도의 아비딘이 상기 식물체를 웅성 생식불능(male sterile)으로 만드는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 식물체.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 식물체가 옥수수 식물체임을 특징으로 하는 트랜스제닉 식물체.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 식물체가 콩 식물체임을 특징으로 하는 트랜스제닉 식물체.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 식물체가 해바라기 식물체임을 특징으로 하는 트랜스제닉 식물체.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 구성적 프로모터 서열을 더 포함함을 특징으로 하는 트랜스제닉 식물체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 구성적 프로모터 서열은 유비퀴틴 프로모터 서열임을 특징으로 하는 트랜스제닉 식물체.
  11. 트랜스제닉 웅성 생식불능 식물체를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 식물체 세포내에 프로모터와 아비딘 유전자를 함유하는 발현 벡터를 도입하고, 상기 프로모터가 상기 아비딘 유전자의 발현을 조절하며, 그리고 상기 아비딘 유전자의 발현이 웅성 생식불능을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 식물체 세포로부터 트랜스제닉 식물체를 재생(regenerating)하는 것을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 프로모터는 유비퀴틴 프로모터임을 특징으로 하는 방법.
  14. 다음 단계 (a) - (c):
    (a) 제 1항에 따른 DNA 분자를 함유하는 제 1 웅성 생식불능성 모 식물체(parent plant)를 생산하는 단계로서, 이때 아비딘의 발현은 웅성 생식불능을 유발하는 단계;
    (b) 제 2 외래 유전자를 발현하는 제 2 트랜스제닉 모 식물체를 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 제 1 모 식물체와 상기 제 2 모 식물체를 이종 수정시켜 (cross-fertilizing) 하이브리드 식물체를 생산하는 단계
    를 포함하며, 상기 하이브리드 식물체는 상기 제 2 외래 유전자를 발현하고, 상기 제 2 외래 유전자의 산물이 상기 하이브리드 식물체내의 아비딘의 발현을 감소시키므로써 웅성 수정능의 하이브리드 식물체를 생산하게 하는 것을 특징으로 하는, 아비딘 유전자를 이용하여 웅성 수정능의 하이브리드 식물체를 생산하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 제 2 외래 유전자는 안티센스 유전자, 리보짐 유전자 및 외부 가이드 서열 유전자로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 안티센스 유전자는 아비딘 mRNA 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 리보짐 유전자는 아비딘 mRNA 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 외부 가이드 서열 유전자는 아비딘 mRNA 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 14항에 있어서, 상기 제 1 모 식물체의 상기 DNA 분자는 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 LexA 오퍼레이터를 더 함유하며, 상기 제 2 외래 유전자는 LexA 리프레서 유전자임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 2항에 있어서, 상기 프로모터 서열은 다음 (a) - (d)로 이루어진 군에서 선택된 꽃밥 박스 (anther box)를 함유하는 꽃밥-특이적 프로모터 서열임을 특징으로 하는 발현 벡터:
    (a) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자;
    (b) 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자;
    (c) 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자; 및
    (d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 기능성 단편.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 꽃밥 박스는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 상기 꽃밥-특이적 프로모터는 하기 (a) - (e)로 이루어진 군에서 선택된 코어 프로모터를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터:
    (a) CaMV 35S 코어 프로모터;
    (b) 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자;
    (c) 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자;
    (d) 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자; 및
    (e) 상기 (b), (c) 또는 (d)의 기능성 단편.
  22. 제 20항에 있어서, 상기 꽃밥 박스는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 상기 꽃밥-특이적 프로모터는 하기 (a) - (e)로 이루어진 군에서 선택된 코어 프로모터를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터:
    (a) CaMV 35S 코어 프로모터;
    (b) 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자;
    (c) 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자;
    (d) 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자; 및
    (e) 상기 (b), (c) 또는 (d)의 기능성 단편.
  23. 제 20항에 있어서, 상기 꽃밥 박스는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 상기 꽃밥-특이적 프로모터는 하기 (a) - (e)로 이루어진 군에서 선택된 코어 프로모터를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터:
    (a) CaMV 35S 코어 프로모터;
    (b) 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자;
    (c) 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자;
    (d) 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자; 및
    (e) 상기 (b), (c) 또는 (d)의 기능성 단편.
  24. 아비딘의 발현에 의해 웅성 생식불능으로 된 식물체에 비오틴 용액을 분무함을 특징으로 하는, 상기 아비딘의 발현에 의해 웅성 생식불능으로 된 식물체의 수정능을 회복시키는 방법.
  25. 제 11항에 있어서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 15항에 있어서, 상기 안티센스 유전자는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있음을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837850A (en) * 1994-04-21 1998-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Regulatory element conferring tapetum specificity
US5962769A (en) * 1995-06-07 1999-10-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Induction of male sterility in plants by expression of high levels of avidin
US5767379A (en) * 1995-11-06 1998-06-16 John Howard Commercial production of avidin in plants
US7071384B2 (en) 1997-03-07 2006-07-04 Genencor International, Inc. Methods for commercial production of heterologous laccase in plant tissue and extraction of the laccase from plant seed
EP0975777A1 (en) 1997-03-07 2000-02-02 Prodigene, Inc. Methods of commercial production and extraction of protein from seed
AU2585297A (en) * 1997-03-20 1998-09-22 Prodigene, Inc. Methods of commercial production and extraction of protein from seed
US6046385A (en) * 1997-10-09 2000-04-04 Midwest Oilseeds, Inc. Mutant male sterile gene of soybean
CA2335093A1 (en) 1998-07-15 2000-01-27 The Horticulture And Food Research Institute Of New Zealand Limited Chimeric polypeptides allowing expression of plant-noxious proteins
IL125632A0 (en) * 1998-08-03 1999-04-11 Israel State Degeneration and restoration of plant tissue
CN1329009A (zh) * 2000-06-19 2002-01-02 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——抗生物素蛋白9和编码这种多肽的多核苷酸
EP1347678A4 (en) * 2001-01-04 2004-08-18 Yeda Res & Dev PROCESS FOR MAINTAINING A STERILE MALE-FEMALE GENE PARENTAL LINE FOR THE PRODUCTION OF HYBRID WHEAT
US20020129399A1 (en) * 2001-03-09 2002-09-12 Marc Albertsen Biotin-binding compounds for induction of sterility in plants
WO2002072817A1 (fr) 2001-03-12 2002-09-19 Japan Tobacco Inc. Nouvelle proteine, gene codant ladite proteine et procede d'utilisation correspondant
EP2004830B1 (en) * 2006-04-11 2010-10-06 State of Israel, Ministry of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (A.R.O.), Volcani Center Plant gene promoter and its use
WO2010046422A2 (en) 2008-10-22 2010-04-29 Basf Se Use of auxin type herbicides on cultivated plants
AR075465A1 (es) 2008-10-22 2011-04-06 Basf Se Uso de herbicidas de sulfonilurea en plantas cultivadas
AR093243A1 (es) 2012-10-01 2015-05-27 Basf Se Uso de compuestos de n-tio-antranilamida en plantas cultivadas
WO2014079820A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Use of anthranilamide compounds for reducing insect-vectored viral infections
WO2015161744A1 (zh) * 2014-04-22 2015-10-29 未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司 植物花药特异表达启动子pTaASG048的鉴定和应用
EP3028573A1 (en) 2014-12-05 2016-06-08 Basf Se Use of a triazole fungicide on transgenic plants
WO2016091674A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Basf Se Use of cyclaniliprole on cultivated plants
BR112017021450B1 (pt) 2015-04-07 2021-12-28 Basf Agrochemical Products B.V. Métodos de controle de pragas, método de melhoria da saúde vegetal e semente revestida
EP3338552A1 (en) 2016-12-21 2018-06-27 Basf Se Use of a tetrazolinone fungicide on transgenic plants

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2624470B2 (ja) * 1984-10-02 1997-06-25 バイオジェン インコーポレイテッド ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造
WO1994000992A1 (en) * 1992-07-10 1994-01-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Avidin and homologues as larvicides against insect pests
US5583210A (en) * 1993-03-18 1996-12-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for controlling plant development
US5633438A (en) * 1994-11-22 1997-05-27 Pioneer Hi-Bred International Microspore-specific regulatory element

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